Wytwarzanie mikrowzorzystego chipa o kontrolowanej grubości do wysokoprzepustowej kriogenicznej mikroskopii elektronowej
April 21st, 2022
Nowo opracowany mikro-wzorzysty chip z okienkami z tlenku grafenu jest wytwarzany przy użyciu technik systemów mikroelektromechanicznych, umożliwiając wydajne i wysokoprzepustowe obrazowanie kriogenicznej mikroskopii elektronowej różnych biomolekuł i nanomateriałów.
Protokół ten jest ważny dla regulacji grubości rozmiaru obrazu w skali nano, aby skutecznie obserwować białka i nanomateriały o różnych rozmiarach za pomocą cryo EM. Technika wytwarzania Mem pozwala na masową produkcję mikroprocesora. Umożliwia również wybór głębokości i wzorów studzienek mikrowzorcowych. W zależności od celów eksperymentalnych.
Technika ta może przyczynić się do zwiększenia wydajności wysokoprzepustowej analizy struktury 3D biomolekuł, która jest wykorzystywana do komercyjnego odkrywania leków, a następnie cienkie płytki i mikroczipy z krzemowymi membranami nitrowymi mogą być trudne. Ważne jest, aby nie zginać płytki ani nie przykładać sił prostopadłych do okienka azotanu krzemu. Rozpocznij tworzenie wzoru fotorezystu lub PR, pokrywając płytkę krzemową osadzoną azotkiem krzemu roztworem heksametylodylazanu, a następnie wiruj powlekanie płytki z prędkością 3000 obr./min przez 30 sekund na koderze spinowym.
Piecz powlekaną wafel w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 30 sekund na gorącej płycie, aby powierzchnia wody stała się hydrofobowa i zapewniła dobrą wydajność powlekania za pomocą PR. Następnie obtocz wafelek w dodatnim PR i piecz go w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 90 sekund. PR pokryty spinem ma grubość 500 nanometrów. Wystaw wafel pokryty PR na działanie światła ultrafioletowego przez pięć sekund przez maskę chromową za pomocą nakładek.
Rozwijaj PR przez jedną minutę za pomocą wywoływacza i spłucz dwukrotnie, zanurzając wafel w wodzie dejonizowanej. Następnie wysuszyć wafel z wzorem PR, wdmuchując gazowy azot na powierzchnię wody. Podążając za wzorcem PR. Użyj zbudowanego w laboratorium reaktywnego wytrawiacza jonowego o mocy 50 watów o częstotliwości radiowej i z sześciofluorkiem siarki o prędkości trzech standardowych centymetrów sześciennych na minutę.
Wytrawianie odsłoniętego azotku krzemu z szybkością sześciu angstremów na sekundę. Wyeliminuj PR, zanurzając wafel z wzorem azotku krzemu w acetonie w temperaturze pokojowej na 30 minut. Następnie dwukrotnie przepłukać wafel w wodzie dejonizowanej i wysuszyć wafel gazowym azotem.
Aby wytrawić odsłonięte si, zanurz płytkę z azotku krzemu w świeżo przygotowanym roztworze wodorotlenku potasu. Z ciągłym mieszaniem, aż będzie można zaobserwować wolnostojące okienka z azotku krzemu po przeciwnej stronie wzorzystej płytki. Oczyść wytrawioną płytkę, zanurzając ją kilkakrotnie w dejonizowanej kąpieli wodnej.
Następnie wysusz wafel na powietrzu. Aby wyeliminować pozostałości po trawieniu, lekko dociśnij granice układu wiórów pęsetą i uzyskaj układ wiórów do mikrowzoru. Następnie zanurz układ wiórów w świeżo przygotowanym roztworze wodorotlenku potasu na 30 sekund, a następnie dwukrotnie spłucz, przedmuchując wióry gazowym azotem i susząc je na powietrzu przez godzinę.
Aby uzyskać solidne podparcie, przygotuj czystą płytkę krzemową o grubości 525 mikrometrów z powłoką wirową, jak pokazano wcześniej. Przyczepiony do promienia rębaka na płytce krzemowej przed wypaleniem płytki krzemowej i postępuj zgodnie z procedurą opisaną wcześniej, aby uzyskać płytkę krzemową o mikrowzorze. Wyeliminuj PR, zanurzając zestaw chipów wzorcowych w jednym roztworze metylo dwóch czystych littanoli w temperaturze 60 stopni Celsjusza na noc.
Następnego dnia dwukrotnie przepłucz zestaw chipów wodą dejonizowaną. Po wysuszeniu zestawu chipów wzorcowych azotem, wyeliminuj pozostałości PR za pomocą procesu plazmy tlenowej przy użyciu 100 standardowych centymetrów sześciennych na minutę gazowego tlenu o mocy 150 watów o częstotliwości radiowej przez jedną minutę za pomocą wytrawiacza jonów reaktywnych. Później zanurz mikrowzorzyste wióry w roztworze wodorotlenku potasu na 30 sekund, aby całkowicie wyeliminować pozostałości PR.
Następnie spłucz i całkowicie wysusz zestaw chipsów. Rozcieńczyć 10 razy dwa miligramy na mililitr tlenku grafenu lub roztworu wodą dejonizowaną i sonikować rozcieńczony roztwór przez 10 minut, aby rozbić agregaty arkuszy. Następnie odwirować do rozcieńczonego roztworu o stężeniu 300 razy G przez 30 sekund w temperaturze pokojowej.
Użyj wyładowania jarzeniowego o natężeniu 15 milionów amperów, aby rozładować wytrawioną krzemem stronę chipa z mikrowzorem przez jedną minutę i wyrenderować powierzchnię chipa z ładunkiem dodatnim. Po zakończeniu upuść trzy mikrolitry roztworu na stronę wyładowania jarzeniowego chipa mikrowzoru. Po minucie zetrzyj nadmiar roztworu na chipie bibułą filtracyjną.
Umyj przeniesiony wiór kroplami wody dejonizowanej na folii parafinowej i osusz nadmiar bibułą filtracyjną. Powtórz procedurę odlewania kroplowego dwa razy po przenoszonej stronie i raz po przeciwnej stronie. Wysuszyć przeniesiony wiór w temperaturze pokojowej przez noc.
Podczas procedury fotolitografii manipulowano projektami chipów mikrowzoru przy użyciu różnych wzorów maski chromowej. Kontrolowano liczbę i wymiary wolnostojących membran z azotku krzemu. Zaobserwowano, że sfabrykowane mikrowzorzyste chipy mogą mieć do 25 000 zawieszonych otworów.
Widmo ramenu w oknie wyświetlało reprezentatywne piki Dodatkowo wielokrotnie zorientowane sześciokątne wzory defrakcji wskazywały, że okna składały się z wielowarstwowej Strukturę i głębokość mikrootworu z okienkami badano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej i mikroskopii sił atomowych. Na zdjęciach zaobserwowano strukturę typu studzienkowego mikrootworu z okienkiem, co potwierdza możliwość zaprojektowania chipa mikro wzoru z okienkami. Za pomocą mikrowzorzystego chipa zobrazowano kilka próbek biologicznych i nieorganicznych nanocząstek za pomocą kriomikroskopu elektronowego.
Ważna jest optymalizacja warunków, takich jak czysta grubość powłoki, wykorzystanie intensywności i czas rozwoju mikrowzorów w zależności od rozmiaru i projektu wzorów. Stosując techniki nano wzorcowania, takie jak FIB lub nawet litograf mniejszy, można uzyskać pewne wzory mikrometryczne, które mogą rozszerzyć zastosowania tego mikrourządzenia tam, gdzie jest ono używane z innymi technikami analitycznymi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Nowo opracowany układ mikro-wzórowany z oknami z tlenku grafenu poprawia obrazy mikroskopi elektronowo-kryogenicznej biomolekuł i nanomateriałów. Ta technologia pozwala na wydajną i przepływową analizę w skali nano.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biotechnologia
- Nanotechnologia
Tło
- Protokół reguluje grubość obrazów w skali nano.
- Masowa produkcja mikrochipów jest ułatwiona przez techniki produkcji MEMS.
- Projekty mikro-wzórowanych dołków mogą być dostosowane do określonych celów eksperymentalnych.
- Poprawia efektywność w analizie 3D struktur biomolekuł.
Cel badania
- Aby poprawić przepływowe obrazy biomolekuł.
- Aby umożliwić lepsze obserwowanie białek i nanomateriałów.
- Aby wspierać komercyjne wysiłki w zakresie odkrywania leków.
Stosowane metody
- Produkcja układów mikro-wzórowanych za pomocą technik MEMS.
- Zastosowanie roztworu heksametylodisilazanu do wytwarzania wzorów fotooporowych.
- Nanoszenie warstwy krzemionkowej na obrąbku krzemowym z prędkością 3000 RPM.
- Dbanie o bezpieczne manipulowanie oknami z azotku krzemu, aby uniknąć uszkodzeń.
Główne wyniki
- Sukces w produkcji mikro-wzórowanych układów z tlenkiem grafenu.
- Wykazana zdolność do przepływowego obrazowana.
- Ulepszona obserwacja biomolekuł w skali nano.
- Potencjalne zastosowania w odkrywaniu leków i analizie biomolekularnej.
Konkluzje
- Opracowany mikro-wzórowany układ znacznie poprawia efektywność obrazowań.
- Techniki MEMS umożliwiają skalowalną produkcję zaawansowanych narzędzi obrazowań.
- Ta technologia ma szerokie zastosowania w badaniach neuronaukowych i biotechnologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-throughput cryogenic electron microscopy (cryo-EM) is increasingly critical for structural biology and early-stage drug discovery, yet sample preparation bottlenecks limit its predictive value and scalability. The described micro-patterned chip with controlled ice thickness and graphene oxide windows directly addresses these challenges by enabling reproducible, nanoscale sample environments for diverse biomolecules and nanomaterials. This innovation enhances structural data quality and throughput, supporting more confident target validation and portfolio triage in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise structural interrogation of biomolecular targets under controlled conditions.
- Reduces ambiguity in target conformation and complex assembly for mechanistic de-risking.
- Supports predictive confidence in structure-based drug design and target selection.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of standardized, reproducible cryo-EM samples for downstream analysis.
- Improves assay reliability by controlling ice thickness and biomolecule localization.
- Enables scalable, high-throughput imaging workflows for compound screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by enabling imaging of both biological and inorganic nanomaterials.
- Aligns structural data with translational biomarker development when relevant.
- Provides risk-adjusted advancement by improving data quality for candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
This chip fabrication method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a robust platform for structural analysis, from early target validation through lead identification and translational research.
- Discovery Biology: Enhances hypothesis testing and pathway clarification via high-resolution structural data.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis of biomolecular states.
- Analytics: Supports statistical comparison of sample conditions through controlled micro-patterning and ice thickness.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical imaging needs for both biological and inorganic targets.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, mass-producible chip platform adaptable to evolving R&D requirements.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, improving reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in MEMS fabrication, photolithography, and cryo-EM sample handling.
- Demands access to specialized instrumentation for etching, coating, and imaging.
- Necessitates cross-team standardization of chip design and sample preparation protocols.
- Adaptable to various biomolecule sizes and experimental designs through mask customization.
- Careful handling is essential to avoid wafer damage and ensure membrane integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:55
Pattern the Photoresist and Silicon Nitride‐Deposited Si Wafer (SixNy)
2:31
Etching the Si and Eliminating the KOH Etching Residues
3:21
Prepare the Micro‐Patterned SixNy and Eliminate the PR
4:25
Transfer Graphene Oxide (GO) by the Drop‐Casting Method
5:30
Results: Analysis of the Micro‐Patterned Chip with GO Windows
6:35
Conclusion
