Name: Indukowana światłem transmisyjna mikroskopia elektronowa in situ do obserwacji oddziaływania ciecz-miękka materia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 33 s
Description: Poznaj metodę transmisyjnej mikroskopii elektronowej z oświetleniem świetlnym do obserwacji zmian strukturalnych w bakteriach z fotouczulaczem. Technika umożliwia badanie interakcji bakterii z fotouczulaczem w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania były wspierane przez grant Miniatura (2019/03/X/NZ3/02100, Narodowe Centrum Nauki, Polska).

1. Modyfikacja transmisyjnego mikroskopu elektronowego
<ol>
	<li>Zmodyfikuj transmisyjny mikroskop elektronowy, podłączając światłowód (patrz Tabela materiałów) do kolumny mikroskopu w górnej części soczewki obiektywu. Pozostaw kilka centymetrów wolnej przestrzeni między soczewką obiektywu a soczewką kondensatora oraz wolną szczelinę na akcesoria. 
	UWAGA: Można również zastosować dedykowany uchwyt na próbki4 lub uchwyt do obserwacji katodowych w odwrotnej konfiguracji1.</li>
	<li>Sprawdź system pod kątem wycieków za pomocą pomp próżniowych. Jeśli system nie wykazuje wycieku podciśnienia, przetestuj system w wysokiej próżni.
	<ol>
		<li>Sprawdź, czy uruchomienie układu próżniowego nie odbiega od standardowego rozruchu mikroskopu z wentylacją. W przypadku problemów z wykonaniem, montażem lub uruchomieniem modułu należy skontaktować się z autoryzowanym serwisem lub producentem urządzenia. 
		UWAGA: Prawidłowo wykonany i zamontowany iluminator nie będzie zasłaniał wiązki elektronów. Jeśli wiązka przesuwa się kolejno podczas pracy mikroskopu, światłowód nieprzewodzący nie będzie wystarczająco pokryty metalową osłoną i będzie gromadził ładunek elektryczny. W takim przypadku wsuń światłowód głęboko w płaszcz przewodzący.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz natężenie światła za pomocą czujnika mocy fotodiody (patrz Tabela materiałów). Jeśli przestrzeń między biegunami soczewki obiektywu nie pozwala na pomiar wewnątrz mikroskopu, zmierz geometrię próbki i iluminatora i odtwórz te warunki w zewnętrznym zestawie pomiarowym.</li>
	<li>Jeśli mikroskop nie jest wyposażony w system pomiaru dawki elektronów, należy przeprowadzić kalibrację, mierząc prąd wiązki za pomocą kubka Faradaya (patrz Tabela materiałów) i obliczając numerycznie gęstość elektronów uderzających w próbkę27.</li>
</ol>
2. Enkapsulacja bakterii za pomocą fotosensybilizatora
<ol>
	<li>Umieść dwie nieobrobione siatki TEM pokryte amorficznym węglem między dwiema skrzyżowanymi pęsetami skierowanymi w stronę pokrytą węglem do góry. Trzymaj siatki jak najbliżej krawędzi. 
	UWAGA: W przypadku niektórych kombinacji substratów, roztworów i próbek korzystne może być użycie wyładowań jarzeniowych na jednej lub obu siatkach w celu usunięcia zanieczyszczeń fabrycznych i uzyskania maksymalnej powierzchni hydrofilowej28. Na przykładzie bakterii S. aureus i roztworu błękitu metylenowego stwierdzono, że najlepsze i najbardziej powtarzalne wyniki uzyskano na nowym, nieobrobionym węglu na siatkach miedzianych bez dodatkowego wyładowania jarzeniowego czy czyszczenia plazmowego6.</li>
	<li>Umieść 4 μl roztworu bakterii na jednej z kratek. Gęstość optyczna próbki musi mieścić się w zakresie 5-10, 
	UWAGA: Bakterie użyte w badaniu zostały oczyszczone z kultury i rozproszone w buforze PBS. Zdecydowanie zaleca się sprawdzanie stężenia bakterii w świeżej próbce za każdym razem, gdy jest ona używana, np. przy użyciu metod barwienia ujemnego, zgodnie z dostępnymi ustalonymi protokołami29,30,31.</li>
	<li>Odczekaj 60 s i ostrożnie osusz płyn za pomocą bibuły filtracyjnej. Podczas tego procesu spróbuj rozprowadzić płyn po całej powierzchni siatki.</li>
	<li>Umieść 4 μl fotosensybilizatora na tej samej siatce. 
	UWAGA: Jako fotouczulacz w niniejszym badaniu zastosowano błękit metylenowy w stężeniu 2 μg/ml.</li>
	<li>Po 5 s wytrzyj płyn. Pozostawić bardzo cienką warstwę płynu na podłożu.</li>
	<li>Szybko umieść suchą siatkę na tej pokrytej płynem.</li>
	<li>Delikatnie przesuń górną siatkę do krawędzi drugiej i ściśnij podłoża na krawędziach za pomocą pęsety. 
	UWAGA: Na tym etapie z próbki może wypłynąć pewna ilość cieczy, co oznacza, że nie odsączono wystarczającej ilości płynu. Nie musi to jednak oznaczać, że tworzenie się płynnej komórki zakończy się niepowodzeniem.</li>
	<li>Ostrożnie powtórz ściskanie. 
	UWAGA: Łatwiej jest wykonać ten krok, obracając pęsetę o 90° tak, aby leżały prostopadle do stołu, a obie końcówki pęsety pozostawały na tej samej wysokości, niezależnie od pozycji otwarcia/zamknięcia.</li>
	<li>Pozostaw płynną komórkę między pęsetą na 1 minutę.</li>
	<li>Próbkę należy umieścić w uchwycie TEM zaraz po zakończeniu przygotowania. 
	UWAGA: Napięcie płyty/pierścienia montażowego uchwytu pomoże podłoża przylegać i utrzymać płyn w środku.
	<ol>
		<li>Jeśli to możliwe, przepompuj uchwyt próbki do zewnętrznej przepompowni, aby zmniejszyć zanieczyszczenie mikroskopu przez odparowanie cieczy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obserwacje in situ TEM komórek bakteryjnych w efekcie dawki ciekłych elektronów
<ol>
	<li>Włóż próbkę do mikroskopu.</li>
	<li>Rozpocznij obserwacje w trybie małego powiększenia, aby znaleźć odpowiedni obszar obserwacji. 
	UWAGA: Ciemniejsze obszary najprawdopodobniej są płynne z powodu rozpraszania wiązki elektronów.
	<ol>
		<li>Podczas obserwacji utrzymuj dawkę elektronów na jak najniższym poziomie. Wydłuż czas naświetlania (do 2 s dla napięcia przyspieszającego 150 kV i powiększenia 5 000x). Powiększenie 5 000x dla kamery montowanej od dołu (przybliżone pole widzenia to 10 μm) jest wystarczające do zobrazowania bakterii o średnicy ~1 μm. 
		UWAGA: Czasami nie jest łatwo odróżnić ciecz, dlatego na początku obserwacji pomocne jest skupienie wiązki elektronów w miejscu, w którym prawdopodobnie jest ona cieczą. Ciecz powinna poruszać się po skupionej wiązce elektronów, a pojawią się pęcherzyki. Po tej weryfikacji konieczne jest znalezienie kolejnego obszaru do dalszych obserwacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znajdź komórki otoczone cieczą w odpowiednim powiększeniu z wydłużonym czasem naświetlania i natychmiast uchwyć pierwszy obraz. Utrzymuj stałą dawkę elektronów i zbieraj obrazy co 30 sekund, aby zaobserwować zmiany.</li>
	<li>Dokładnie przyjrzyj się obrazom i oblicz całkowitą dawkę elektronów27, która odpowiada pierwszym widocznym zmianom w komórkach.</li>
</ol>
4. Obserwacje in situ TEM procesów wywołanych światłem między komórkami bakteryjnymi a fotosensybilizatorem
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu należy ustawić natężenie światła lasera, dostosowując aktualną wartość. Wybierz odpowiednią długość fali zgodnie z widmem absorpcji fotouczulacza. Zgodnie z poprzednim wykresem kalibracyjnym (krok 1.4.) należy wybrać aktualną wartość odpowiadającą najmniejszemu natężeniu światła. 
	UWAGA: Długość fali światła użyta w tym badaniu wynosiła 660 nm.</li>
	<li>Włóż próbkę do mikroskopu i znajdź obszar obserwacji, wykonując krok 3.2. w poprzednim rozdziale.</li>
	<li>Uchwyć pierwszy obraz komórki przed rozpoczęciem oświetlenia próbki i użyj wygaszacza wiązki, aby wyłączyć wiązkę elektronów, aby uniknąć skutków napromieniowania elektronów.</li>
	<li>Włącz laser. Zacznij od krótkiego czasu świecenia (tutaj 30 s), ponieważ światło lasera ma stosunkowo dużą intensywność. Po tym czasie wyłącz źródło światła.</li>
	<li>Wyłącz wygaszacz wiązki i natychmiast uchwyć obraz. Jeśli to możliwe, użyj automatycznego algorytmu, aby naświetlić próbkę tylko na czas potrzebny do wykonania obrazu. Dokładnie zmierz czas napromieniowania elektronów, aby obliczyć dawkę elektronów27 używaną do obrazowania.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.4 i 4.5, aby uzyskać oczekiwany czas oświetlenia światłem.</li>
</ol>

<ol><li>Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+observation+of+plasmon-controlled+photocatalytic+dehydrogenation+of+individual+palladium+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).</li>
<li>Weng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+light-induced+dynamic+structural+transformations+of+Au+clusters-based+photocatalyst+via+in+situ+TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Research%22%5BJournal%5D)">Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM.</a> Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).</li>
<li>Cao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+TEM+investigation+on+ultrafast+reversible+lithiation+and+delithiation+cycling+of+Sn%40C+yolk-shell+nanoparticles+as+anodes+for+lithium+ion+batteries%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Energy%22%5BJournal%5D)">In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries.</a> Nano Energy. 40, 187-194 (2017).</li>
<li>Cavalca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+transmission+electron+microscopy+of+light-induced+photocatalytic+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions.</a> Nanotechnology. 23 (7), 075705(2012).</li>
<li>Tung, C. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+activation+of+adaptive+junction+for+efficient+solar-driven+oxygen+evolution%3A+In+situ+unraveling+the+interfacial+metal-silicon+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Energy+Materials%22%5BJournal%5D)">Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction.</a> Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308(2019).</li>
<li>Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+in+situ+transmission+electron+microscopy%3A+Novel+approach+for+antimicrobial+photodynamic+therapy+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463(2021).</li>
<li>Shindo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+multifunctional+TEM+specimen+holder+equipped+with+a+piezodriving+probe+and+a+laser+irradiation+port%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port.</a> Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosensing+performance+of+branched+CdS%2FZnO+heterostructures+as+revealed+by+in+situ+TEM+and+photodetector+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests.</a> Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistically+analyzed+photoresponse+of+elastically+bent+CdS+nanowires+probed+by+light-compatible+in+situ+high-resolution+TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM.</a> Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).</li>
<li>Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+high-resolution+transmission+electron+microscopy+observation+of+photodecomposition+process+of+poly-hydrocarbons+on+catalytic+TiO2+films%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films.</a> Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).</li>
<li>Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+high-resolution+transmission+electron+microscopy+of+photocatalytic+reactions+by+excited+electrons+in+ionic+liquid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid.</a> Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).</li>
<li>Textor, M., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+preparing+graphene+liquid+cells+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy.</a> Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).</li>
<li>Ring, E. A., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).</li>
<li>Inayoshi, Y., Minoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+carbon+sandwich+environmental+cell+for+wet+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A carbon sandwich environmental cell for wet specimens.</a> Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).</li>
<li>Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+electron+microscopy+using+graphene+veils%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Live cell electron microscopy using graphene veils.</a> Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).</li>
<li>De Jonge, N., Peckys, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+electron+microscopy+is+probably+impossible%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Live cell electron microscopy is probably impossible.</a> ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).</li>
<li>Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+electron-beam-irradiated+bacteria+in+reply+to+%26%2334%3Blive+cell+electron+microscopy+is+probably+impossible.%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to &#34;live cell electron microscopy is probably impossible.&#34.</a> ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).</li>
<li>Alves, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+on+bacterial+cellular+targets+of+photodynamic+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation.</a> Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).</li>
<li>Cieplik, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+photodynamic+therapy-What+we+know+and+what+we+don%27t%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don't.</a> Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+and+Type+II+mechanisms+of+antimicrobial+photodynamic+therapy%3A+An+in+vitro+study+on+gram-negative+and+gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).</li>
<li>Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Escherichia+coli+photodynamic+inactivation+by+an+amphiphilic+tricationic+porphyrin+and+5%2C10%2C15%2C20-tetra%284-N%2CN%2CN-trimethylammoniumphenyl%29+porphyrin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+and+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).</li>
<li>Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-pot+synthesis+of+a+cyclic+antimicrobial+peptide-conjugated+phthalocyanine+for+synergistic+chemo-photodynamic+killing+of+multidrug-resistant+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria.</a> Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).</li>
<li>Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+fluorescence+imaging+to+evaluate+the+effect+of+antimicrobial+photodynamic+therapy+depth+on+P.+gingivalis+and+T.+denticola+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).</li>
<li>Maldonado-Carmona, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyrin-loaded+lignin+nanoparticles+against+bacteria%3A+A+photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+application%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 606185(2020).</li>
<li>Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grzęda, J., Matczyszyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-optic+sample+illuminator+design+for+the+observation+of+light+induced+phenomena+with+transmission+electron+microscopy+in+situ%3A+Antimicrobial+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy.</a> Ultramicroscopy. 230, 113388(2021).</li>
<li>Dinh, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+adsorption+mechanisms+of+methylene+blue+and+chromium%28III%29+from+aqueous+solution+onto+pomelo+fruit+peel%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel.</a> RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).</li>
<li>Żak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+to+controlling+the+electron+dose+to+improve+low-dose+imaging+of+sensitive+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples.</a> Micron. 145, 103058(2021).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).</li>
<li>Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+on+negative+stain+electron+microscopy+methods%3A+Tools+for+tackling+challenging+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).</li>
<li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM%3A+From+grid+preparation+to+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).</li>
<li>Rames, M., Yu, Y., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+negative+staining%3A+A+high-throughput+protocol+for+examining+small+and+asymmetric+protein+structure+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51087(2014).</li>
<li>Miller, B. K., Crozier, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System+for+in+situ+UV-visible+illumination+of+environmental+transmission+electron+microscopy+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).</li>
<li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336 (6077), 61-64 (2012).</li>
<li>Schneider, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron-Water+interactions+and+implications+for+liquid+cell+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+C%22%5BJournal%5D)">Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy.</a> Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Instalacja i uruchomienie iluminatora wymaga podstawowej wiedzy serwisowej i może spowodować uszkodzenie mikroskopu. Najprostszym sposobem wprowadzenia światła do mikroskopu jest podłączenie światłowodu od góry soczewki obiektywu, gdzie zwykle jest miejsce na cewki odchylające TEM i dodatkowe detektory. Więcej wolnej przestrzeni można również oczekiwać od starszych urządzeń z wejściem od góry, w których w tym samym miejscu znajduje się blokada próżniowa próbki i mechanizm instalacji próbki. Konfiguracja ta jest szeroko o...

Zjawiska wywołane światłem w wysokiej rozdzielczości są interesujące w wielu dziedzinach, takich jak nanoinżynieria1,2,3, kataliza4,5 i biofotonika6. Niektóre oryginalne projekty, które pozwalają na takie eksperymenty, można znaleźć w literaturze, w tym modyfikacje uchwytów na próbki1,4,7,8,9 oraz światłowód podłączony do mikroskopu10,11.
Połączenie oświetlenia światłem, płynnego środowiska i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) daje doskonałą okazję do szczegółowych, dynamicznych badań procesów wywołanych światłem. Jednak warunki wysokiej próżni wewnątrz mikroskopu są raczej niekorzystne dla wielu cieczy, zwłaszcza roztworów wodnych. Enkapsulacja cieczy, która chroni ją przed środowiskiem, może być osiągnięta za pomocą kilku technik opartych głównie na podłożach grafenowych12, krzemu nitride13, lub carbon14. Oprócz badań w dziedzinie materiałoznawstwa2, tak zwane komórki płynne oferują możliwości prowadzenia niekonwencjonalnych obserwacji mikroskopowych na próbkach biologicznych w pobliżu ich rodzimych warunków15. Takie obserwacje są niezwykle wymagające, zwłaszcza dla żywych mikroorganizmów, takich jak komórki bakteryjne. Wiązka elektronów jako promieniowanie jonizujące powoduje nieodwracalne uszkodzenia uwodnionych próbek, dlatego dawka elektronów musi być określona16. Jest to konieczne, aby zminimalizować niekorzystne efekty, kontrolować uszkodzenia i uniknąć mylących artefaktów. Optymalna maksymalna dawka elektronów, która pozwala na obserwacje żywych komórek, jest nadal wątpliwym tematem16, ale dawka 30 e−/nm2 wydaje się być wartością progową, przynajmniej dla bakterii17.
Niektóre z tematów interesujących dla takich badań mikroskopowych to procesy zachodzące podczas przeciwbakteryjnej terapii fotodynamicznej (APDT)18. Krótko mówiąc, terapia przebiega w następujący sposób. Komórki bakteryjne są otoczone światłoczułą cieczą zwaną fotouczulaczem. Gdy oświetlenie świetlne jest nadawane na określonej długości fali, cytotoksyczne reaktywne formy tlenu (ROS) są generowane w wyniku przeniesienia energii lub ładunku ze wzbudzonych cząsteczek fotouczulacza do tlenu naturalnie występującego w roztworze. Patogeny wystawione na działanie ROS są szybko inaktywowane z bardzo wysoką skutecznością, bez skutków ubocznych19. Odpowiedź na terapię jest różna dla różnych drobnoustrojów – na przykład wpływ tego samego fotouczulacza może być zupełnie inny dla bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych20. Ogólnie rzecz biorąc, ustalono, że głównym celem ROS są zewnętrzne struktury komórek, gdzie uszkodzenie skutkuje zaburzeniami funkcjonalnymi błony komórkowej, a w konsekwencji prowadzi do śmierci bakterii21,22. Jednak uszkodzenie kwasów nukleinowych i białek może być również uważane za przyczynę inaktywacji18, więc nadal nie wiadomo, które struktury komórkowe są głównymi celami podczas tego procesu19. Głębsze zrozumienie szkodliwych procesów może pomóc w ulepszeniu tej ostatecznej terapii. W porównaniu z metodami mikroskopii świetlnej stosowanymi w badaniach APDT23, techniki TEM dają więcej możliwości przyjrzenia się mechanizmowi APDT z wyższą rozdzielczością i powiększeniem24. TEM został już z powodzeniem wykorzystany do obserwacji komórek w trakcie trwającej terapii, co pozwoliło nam na zbadanie uszkodzeń bakterii Gram-dodatnich i szczegółowe opisanie zmian zachodzących w obrębie ściany komórkowej6,25.
Obecny protokół przedstawia odpowiednią konfigurację eksperymentalną do obrazowania w wysokiej rozdzielczości inaktywacji bakterii wywołanych światłem za pomocą TEM, co wymaga odpowiedniego systemu oświetlenia światłem, hermetyzacji komórek cieczą i ścisłej kontroli dawki elektronów. Bakterią użytą do obserwacji był Staphylococcus aureus, a jako fotouczulacz użyto roztworu błękitu metylenowego. Specjalny zestaw oświetlenia świetlnego składa się z przestrajalnego lasera półprzewodnikowego połączonego bezpośrednio z kolumną mikroskopu za pomocą światłowodu. Taka konstrukcja zapewnia równomierne napromieniowanie w całej próbce ze względu na prawie równoległe ułożenie światłowodu do osi mikroskopu. Monochromatyczne światło o dużym natężeniu generowane przez laser można następnie wykorzystać do badania różnych efektów fotochemicznych. Światło użyte w eksperymencie miało długość fali równą 660 nm, ponieważ w obszarze widzialnym błękit metylenowy ma piki absorpcyjne przy 613 nm i 664 nm26. Protokół enkapsulacji płynów oparty jest na substratach węglowych, co sprawia, że zabieg jest szybki i nieskomplikowany. Na koniec przedstawiono metodę niskodawkowej obserwacji in situ komórek w cieczy. Omówiono trudności związane z przygotowaniem próbki, wpływem dawki elektronów na wrażliwą próbkę oraz rozsądną interpretacją obrazu.

<table><tbody><tr><td>Folia węglowa na siatce miedzianej o siatce 200</td><td>Agar Scientific</td><td>AGS160</td><td>Standardowe siatki TEM do obserwacji i przygotowania komórek cieczy</td></tr><tr><td>Pęseta krzyżowa</td><td>Dumont</td><td>N5</td><td>Pęseta jest niezbędna do przygotowania komórek płynnych</td></tr><tr><td>Czujnik mocy fotodiody</td><td>ThorLabs</td><td>S130C</td><td>Czujnik używany do pomiaru natężenia światła</td></tr><tr><td>Włókno wielomodowe powlekane poliimidem</td><td>Thorlabs</td><td>FG400UEP</td><td>Musi być wbudowany w mikroskop za pomocą adaptera wbudowanego na miejscu, zgodnie z 10.1016/j.ultramic.2021.113388</td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>Hitachi</td><td>H-800</td><td>Można go zastąpić dowolnym mikroskopem z bocznym wejściem, dostępnym do modyfikacji</td></tr><tr><td>Regulowany laser diodowy</td><td>CNI</td><td>MRL-III-660D</td><td>Długość fali światła należy dobrać na podstawie widma absorpcyjnego fotouczulacza</td></tr></tbody></table>

indukowana światłem transmisyjna mikroskopia elektronowa in situ do obserwacji oddziaływania ciecz-miękka materia

Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction

Obecny protokół opisuje modyfikacje ustawienia transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) do obserwacji in situ wywołanych światłem. Szklane światłowód umieszczony w kolumnie elektronowej nad nabiegunnikiem soczewki obiektywu oraz laser, regulowane źródło światła, zostały użyte do wytworzenia urządzenia. Po skalibrowaniu oświetlacza za pomocą zewnętrznego układu pomiarowego, pozwala on na dostosowanie natężenia oświetlenia do potrzeb obserwowanego procesu. Ten system oświetlenia został wykorzystany do zobrazowania zjawisk przeciwdrobnoustrojowej terapii fotodynamicznej, które są obecnie przedmiotem intensywnych badań. Próbkę przygotowano przez namiastkę zawiesiny bakterii na podłożu z węgla, grafenu lub azotku krzemu, osuszenie nadmiaru roztworu, wykrycie roztworu fotouczulacza, ponowne osuszenie nadmiaru cieczy, a następnie złożenie ciekłej komórki z drugim substratem lub folią grafenową. Sam proces eksperymentu obrazowego obejmuje wybór odpowiedniego miejsca do obserwacji z wykorzystaniem małego powiększenia i minimalnej dawki elektronów, a następnie cykliczne aktywowanie źródła światła w celu przechwytywania kolejnych obrazów w określonych odstępach czasu z minimalną ilością niezbędnych elektronów. Dawka elektronów każdej ekspozycji oraz czas i intensywność użytego oświetlenia muszą być dokładnie rejestrowane ze względu na złożoność obserwowanych zjawisk, ponieważ jednocześnie proces ten jest napędzany zarówno światłem, jak i elektronami. Po przeprowadzeniu właściwego eksperymentu należy przeprowadzić dodatkowe obserwacje kontrolne, w których stosuje się te same dawki elektronów, ale bez dodatkowego wpływu światła, a do wyższych dawek światła stosuje się mniejsze dawki elektronów. Umożliwia to odróżnienie efektów mikrostrukturalnych wywołanych światłem od tych powodowanych przez elektrony zarówno w dziedzinie nauk przyrodniczych, jak i materiałoznawstwa.

Układ eksperymentalny zaprojektowano w celu obserwacji procesów indukowanych światłem zachodzących w cieczy z wysoką rozdzielczością. Analiza porównawcza obrazów pozwoliła nam odróżnić uszkodzenia wywołane wiązką elektronów od zmian związanych z reakcją fotochemiczną. Wpływ wiązki elektronów na wrażliwą próbkę (w tym przypadku komórki zamknięte w cieczy) był widoczny w całym napromieniowanym obszarze, ponieważ elektrony przenikały przez niego jednorodnie. Oczywiście efekt ten zależy od dawki elektronów, zatem w przypadku...

Obecny protokół opisuje modyfikacje transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) z systemem oświetlenia świetlnego, wytwarzanie komórek płynnych oraz obserwacje in situ TEM indukowanych światłem interakcji między komórkami bakteryjnymi a fotosensybilizatorem. Omówiono również metody przygotowania próbek, uszkodzenia wiązki elektronów i obrazowanie.

Indukowana światłem transmisyjna mikroskopia elektronowa in situ do obserwacji oddziaływania ciecz-miękka materia

The current protocol describes the modifications of the transmission electron microscope (TEM) setup for in situ light-induced observations. A glass ...

W protokole przedstawiono, w jaki sposób połączenie ciekłego TEM komórkowego i oświetlenia świetlnego można wykorzystać do obserwacji zmian strukturalnych w bakteriach otoczonych fotouczulaczem po oświetleniu światłem. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota. Protokół nie wymaga trudnego przygotowania próbki i zapewnia wystarczającą enkapsulację bakterii roztworem fotouczulającym.Aby rozpocząć, zmodyfikuj transmisyjny mikroskop elektronowy, podłączając światłowód do kolumny mikroskopu w górnej części soczewki obiektywu. Pozostaw kilka centymetrów wolnej przestrzeni między soczewką obiektywu a soczewką kondensatora oraz wolną szczelinę na akcesoria. Umieść dwie nieobrobione siatki TEM pokryte amorficznym węglem między dwiema skrzyżowanymi pęsetami, skierowanymi do góry stroną pokrytą węglem.Trzymaj siatki jak najbliżej krawędzi. Umieść cztery mikrolitry roztworu bakterii na jednej z kratek. Gęstość optyczna próbki musi mieścić się w zakresie od pięciu do 10.Odczekaj 60 sekund i ostrożnie osusz płyn za pomocą bibuły filtracyjnej. Podczas tego procesu staraj się rozprowadzać płyn na całej powierzchni siatki. Umieść cztery mikrolitry fotosensybilizatora na tej samej siatce.Po pięciu sekundach wytrzyj płyn. Pozostawić bardzo cienką warstwę płynu na podłożu. Szybko umieść suchą siatkę na tej pokrytej płynem.Delikatnie przesuń górną siatkę do krawędzi drugiej i ściśnij podłoża na krawędziach za pomocą pęsety. Ostrożnie powtórz ściskanie. Pozostaw płynną komórkę między pęsetą na jedną minutę.Próbkę należy włożyć do uchwytu TEM zaraz po zakończeniu przygotowania. Po włożeniu próbki do mikroskopu rozpocznij obserwacje w trybie małego powiększenia, aby znaleźć odpowiedni obszar obserwacji. Podczas obserwacji utrzymuj dawkę elektronów na jak najniższym poziomie.Wydłuż czas ekspozycji. Znajdź komórki otoczone cieczą w odpowiednim powiększeniu z wydłużonym czasem naświetlania i natychmiast uchwyć pierwszy obraz. Utrzymuj stałą dawkę elektronów i zbieraj obrazy co 30 sekund, aby obserwować zmiany.Dokładnie zbadaj obrazy i oblicz całkowitą dawkę elektronów, która odpowiada pierwszym widocznym zmianom w komórkach. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy ustawić natężenie światła lasera, dostosowując aktualną wartość. Włóż próbkę do mikroskopu i znajdź obszar obserwacji.Uchwyć pierwszy obraz komórki przed rozpoczęciem oświetlenia próbki i użyj wygaszacza wiązki, aby wyłączyć wiązkę elektronów, aby uniknąć skutków promieniowania elektronów. Włącz laser. Zacznij od krótkiego czasu oświetlenia, ponieważ światło lasera ma stosunkowo dużą intensywność.Po tym czasie wyłącz źródło światła. Wyłącz wygaszacz wiązki i natychmiast uchwyć obraz. Jeśli to możliwe, użyj automatycznego algorytmu, aby naświetlić próbkę tylko na czas potrzebny do wykonania obrazu.Dokładnie zmierz czas napromieniania elektronów, aby obliczyć dawkę elektronów używaną do obrazowania. Obserwuje się zauważalną degradację zewnętrznej warstwy ogniwa spowodowaną przez reaktywne formy tlenu generowane przez lżejsze promieniowanie fotosensybilizatora po jednej minucie. Dalsza iluminacja światłem sprawiła, że zmiany stały się bardziej widoczne.Właściwe punkty obserwacyjne z wystarczającą ilością płynu można łatwo znaleźć przy małym powiększeniu, ponieważ obszary te wydają się ciemniejsze i rozmyte. Bakterie pokryte cieczą są mniej widoczne niż suche, ale nadal można je odróżnić. Przydatne jest przyjrzenie się granicy cieczy podczas obrazowania, a jej ruch można łatwo wykryć, co oznacza, że wybrany obszar może być nieodpowiedni i niestabilny.Kolejną kwestią podczas obserwacji jest parowanie wody i wytrącanie się roztworu, które może wystąpić w losowych obszarach próbki, w tym w obszarach otaczających bakterie. Enkapsulacja bakterii może być również wykonywana przy użyciu membran z grafenu i azotanu krzemu. Przygotowanie próbki jest trudniejsze, ale stabilność płynnej komórki będzie lepsza.Przedstawiona metoda może być wykorzystana do obserwacji reakcji na ciecz wywołanych światłem. Na przykład wpływ światła na materiały metalowe, katalizatory indukowane światłem i reakcje fotochemiczne.

light-induced-situ-transmission-electron-microscopy-for-observation

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Opracowaliśmy niezależną komórkę cieczową, która umożliwia obrazowanie przez ciecze za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Dynamiczne procesy zachodzące w nanocząstkach w cieczach mogą być ujawniane w czasie rzeczywistym z rozdzielczością subnanometrową.

Odkrywanie dynamicznych procesów materiałów w cieczach za pomocą mikroskopii elektronowej transmisji komórek ciekłych

Tutaj opisujemy procedurę obrazowania kompleksów wirusowych w cieczy w rozdzielczości nanometrowej za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

In situ TEM zespołów biologicznych w cieczy

Ten protokół opisuje działanie uchwytu na próbki przepływu cieczy do skanowania transmisyjnej mikroskopii elektronowej AuNPs w wodzie, używanej do obserwacji dynamicznych procesów w nanoskali.

Badanie procesów dynamicznych nano-rozmiarów obiektów w cieczy za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Przedstawiamy procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym i analizy składu pierwiastkowego cząstek bemitu w wodzie dejonizowanej za pomocą płynnej skaningowej mikroskopii elektronowej in situ.

In Situ Charakterystyka cząstek bemitu w wodzie przy użyciu ciekłego SEM

Tutaj wprowadzamy eksperymentalne protokoły obserwacji procesu samoorganizacji w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii elektronowej transmisyjnej komórki cieczowej.

Mikroskopia elektronowa transmisyjna z ciekłymi komórkami do śledzenia samoorganizacji nanocząstek

Metoda korelacyjnej mikroskopii elektronów świetlnych (CLEM) jest stosowana do obrazowania indukowanych wirusem struktur wewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) w komórkach, które zostały wcześniej wybrane przez mikroskopię świetlną (LM). LM i EM są łączone jako hybrydowe podejście do obrazowania w celu uzyskania zintegrowanego obrazu interakcji wirus-gospodarz.

Korelacyjna mikroskopia świetlno-elektronowa (CLEM) do śledzenia i obrazowania struktur związanych z białkami wirusowymi w komórkach unieruchomionych kriogenicznie

Przedstawiono protokół przygotowania mikrodobitkowych komórek płynnych z grafenem do mikroskopii elektronowej in situ nanokryształów złota z roztworu prekursorowego HAuCl4. Ponadto przedstawiono procedurę analizy w celu ilościowego określenia obserwowanego trawienia i dynamiki wzrostu.

Przygotowanie ciekłych komórek mikrostudzienkowych na bazie grafenu do transmisyjnej mikroskopii elektronowej in situ

Kontrola temperatury podczas eksperymentów z mikroskopią elektronową w fazie ciekłej otwiera nowe perspektywy badania dynamiki nanocząstek w środowiskach ciekłych, naśladując ich powstawanie lub stosowanie mediów. Korzystając z niedawno opracowanych ogniw cieczy grzewczej, bezpośrednio obserwowaliśmy wpływ temperatury na procesy zarodkowania i wzrostu nanocząstek złota w wodzie.

Badanie wpływu temperatury na zarodkowanie i wzrost nanocząstek za pomocą mikroskopii elektronowej transmisji ciekłych komórek

Tutaj opisane są protokoły przygotowania zestawów wirusów odpowiednich do analizy ciekłego EM i krio-EM w nanoskali przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Postęp w obrazowaniu w wysokiej rozdzielczości zespołów wirusów w cieczach i lodzie

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący oprogramowanie do widzenia maszynowego do stabilizacji dynamicznych procesów podczas obrazowania TEM, przy jednoczesnym indeksowaniu wielu strumieni metadanych do każdego obrazu na osi czasu, w której można nawigować. Pokazujemy, w jaki sposób platforma ta umożliwia automatyczną kalibrację i mapowanie dawki elektronów w trakcie eksperymentu.

Podejście oparte na widzeniu maszynowym do procesów pracy związanych z transmisyjną mikroskopią elektronową, analizą wyników i zarządzaniem danymi

Przedstawiamy szczegółowy protokół dla korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej Epon po osadzeniu przy użyciu białka fluorescencyjnego o nazwie mScarlet. Ta metoda może jednocześnie utrzymać fluorescencję i ultrastrukturę. Ta technika jest podatna na szeroką gamę zastosowań biologicznych.

Epon Post Osadzanie korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej

Poznaj metodę transmisyjnej mikroskopii elektronowej z oświetleniem świetlnym do obserwacji zmian strukturalnych w bakteriach z fotouczulaczem. Technika umożliwia badanie interakcji bakterii z fotouczulaczem w czasie rzeczywistym.

Indukowana światłem transmisyjna mikroskopia elektronowa in situ do obserwacji oddziaływania ciecz-miękka materia

Przeglądaj więcej filmów