Indukowana światłem transmisyjna mikroskopia elektronowa in situ do obserwacji oddziaływania ciecz-miękka materia
26 lipca 2022
Obecny protokół opisuje modyfikacje transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) z systemem oświetlenia świetlnego, wytwarzanie komórek płynnych oraz obserwacje in situ TEM indukowanych światłem interakcji między komórkami bakteryjnymi a fotosensybilizatorem. Omówiono również metody przygotowania próbek, uszkodzenia wiązki elektronów i obrazowanie.
W protokole przedstawiono, w jaki sposób połączenie ciekłego TEM komórkowego i oświetlenia świetlnego można wykorzystać do obserwacji zmian strukturalnych w bakteriach otoczonych fotouczulaczem po oświetleniu światłem. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota. Protokół nie wymaga trudnego przygotowania próbki i zapewnia wystarczającą enkapsulację bakterii roztworem fotouczulającym.
Aby rozpocząć, zmodyfikuj transmisyjny mikroskop elektronowy, podłączając światłowód do kolumny mikroskopu w górnej części soczewki obiektywu. Pozostaw kilka centymetrów wolnej przestrzeni między soczewką obiektywu a soczewką kondensatora oraz wolną szczelinę na akcesoria. Umieść dwie nieobrobione siatki TEM pokryte amorficznym węglem między dwiema skrzyżowanymi pęsetami, skierowanymi do góry stroną pokrytą węglem.
Trzymaj siatki jak najbliżej krawędzi. Umieść cztery mikrolitry roztworu bakterii na jednej z kratek. Gęstość optyczna próbki musi mieścić się w zakresie od pięciu do 10.
Odczekaj 60 sekund i ostrożnie osusz płyn za pomocą bibuły filtracyjnej. Podczas tego procesu staraj się rozprowadzać płyn na całej powierzchni siatki. Umieść cztery mikrolitry fotosensybilizatora na tej samej siatce.
Po pięciu sekundach wytrzyj płyn. Pozostawić bardzo cienką warstwę płynu na podłożu. Szybko umieść suchą siatkę na tej pokrytej płynem.
Delikatnie przesuń górną siatkę do krawędzi drugiej i ściśnij podłoża na krawędziach za pomocą pęsety. Ostrożnie powtórz ściskanie. Pozostaw płynną komórkę między pęsetą na jedną minutę.
Próbkę należy włożyć do uchwytu TEM zaraz po zakończeniu przygotowania. Po włożeniu próbki do mikroskopu rozpocznij obserwacje w trybie małego powiększenia, aby znaleźć odpowiedni obszar obserwacji. Podczas obserwacji utrzymuj dawkę elektronów na jak najniższym poziomie.
Wydłuż czas ekspozycji. Znajdź komórki otoczone cieczą w odpowiednim powiększeniu z wydłużonym czasem naświetlania i natychmiast uchwyć pierwszy obraz. Utrzymuj stałą dawkę elektronów i zbieraj obrazy co 30 sekund, aby obserwować zmiany.
Dokładnie zbadaj obrazy i oblicz całkowitą dawkę elektronów, która odpowiada pierwszym widocznym zmianom w komórkach. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy ustawić natężenie światła lasera, dostosowując aktualną wartość. Włóż próbkę do mikroskopu i znajdź obszar obserwacji.
Uchwyć pierwszy obraz komórki przed rozpoczęciem oświetlenia próbki i użyj wygaszacza wiązki, aby wyłączyć wiązkę elektronów, aby uniknąć skutków promieniowania elektronów. Włącz laser. Zacznij od krótkiego czasu oświetlenia, ponieważ światło lasera ma stosunkowo dużą intensywność.
Po tym czasie wyłącz źródło światła. Wyłącz wygaszacz wiązki i natychmiast uchwyć obraz. Jeśli to możliwe, użyj automatycznego algorytmu, aby naświetlić próbkę tylko na czas potrzebny do wykonania obrazu.
Dokładnie zmierz czas napromieniania elektronów, aby obliczyć dawkę elektronów używaną do obrazowania. Obserwuje się zauważalną degradację zewnętrznej warstwy ogniwa spowodowaną przez reaktywne formy tlenu generowane przez lżejsze promieniowanie fotosensybilizatora po jednej minucie. Dalsza iluminacja światłem sprawiła, że zmiany stały się bardziej widoczne.
Właściwe punkty obserwacyjne z wystarczającą ilością płynu można łatwo znaleźć przy małym powiększeniu, ponieważ obszary te wydają się ciemniejsze i rozmyte. Bakterie pokryte cieczą są mniej widoczne niż suche, ale nadal można je odróżnić. Przydatne jest przyjrzenie się granicy cieczy podczas obrazowania, a jej ruch można łatwo wykryć, co oznacza, że wybrany obszar może być nieodpowiedni i niestabilny.
Kolejną kwestią podczas obserwacji jest parowanie wody i wytrącanie się roztworu, które może wystąpić w losowych obszarach próbki, w tym w obszarach otaczających bakterie. Enkapsulacja bakterii może być również wykonywana przy użyciu membran z grafenu i azotanu krzemu. Przygotowanie próbki jest trudniejsze, ale stabilność płynnej komórki będzie lepsza.
Przedstawiona metoda może być wykorzystana do obserwacji reakcji na ciecz wywołanych światłem. Na przykład wpływ światła na materiały metalowe, katalizatory indukowane światłem i reakcje fotochemiczne.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje zastosowanie transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w połączeniu z naświetlaniem światłem do badania oddziaływań bakterii z fotosensybilizatorem. Podkreślono w nim prostotę metody oraz skuteczną enkapsulację bakterii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Mikrobiologia
Wstęp
- Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) jest potężną techniką obrazowania.
- Oświetlenie światłem może usprawnić obserwację próbek biologicznych.
- Fotosensybilizatory to związki, które pod wpływem światła generują reaktywne formy tlenu.
- Zrozumienie oddziaływań bakterii z fotosensybilizatorami jest kluczowe dla wielu zastosowań.
Cel badania
- Zaprezentowanie metody obserwacji zmian strukturalnych w bakteriach.
- Uproszczenie procesu przygotowania próbek do TEM.
- Zbadanie interakcji między bakteriami a fotouczulaczami podczas ekspozycji na światło.
Zastosowane metody
- Modyfikacja TEM za pomocą systemu oświetlenia światłem widzialnym.
- Wytwarzanie ogniw cieczowych do enkapsulacji próbek.
- Obserwacje komórek bakteryjnych in situ.
- Wykorzystanie niepoddanych obróbce siatek TEM do umieszczania próbek.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia skuteczną obserwację oddziaływań indukowanych światłem.
- Wymagane jest minimalne przygotowanie próbek, co zwiększa dostępność metody.
- Enkapsulacja bakterii wraz z fotosensybilizatorem przebiega efektywnie.
- Zmiany strukturalne w bakteriach mogą być monitorowane w czasie rzeczywistym.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia bezpośrednie podejście do badania interakcji bakteryjnych.
- Otwiera ona nowe możliwości badawcze w dziedzinie mikrobiologii i biofizyki.
- Połączenie TEM i oświetlenia światłem jest cennym narzędziem dla badaczy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda in situ TEM indukowana światłem umożliwia bezpośrednią wizualizację oddziaływań między cieczą a materią miękką w kontrolowanym oświetleniu, co wspomaga ograniczanie ryzyka mechanistycznego w początkowej fazie odkryć. Zdolność ta jest kluczowa dla odróżnienia efektów wywołanych światłem od zmian indukowanych przez elektrony, co zwiększa pewność prognostyczną w badaniach fotodynamicznych i katalitycznych. Podejście to usprawnia ocenę dynamicznych odpowiedzi biologicznych i materiałowych, dostarczając informacji niezbędnych do podejmowania decyzji portfelowych na styku badań podstawowych i translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia obserwację zmian strukturalnych w próbkach biologicznych w czasie rzeczywistym pod wpływem aktywacji światłem.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez oddzielenie efektów indukowanych światłem od artefaktów wywołanych przepływem elektronów.
- Ułatwia walidację funkcjonalną oddziaływań między fotouczulaczem a bakteriami, istotnych w badaniach nad środkami przeciwbakteryjnymi.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia platformę do ilościowego obrazowania procesów aktywowanych światłem w środowiskach ciekłych.
- Umożliwia powtarzalną ocenę zmian mikrostrukturalnych przy kontrolowanej dawce elektronów i światła.
- Wspiera standaryzację testów poprzez umożliwienie precyzyjnej kalibracji oświetlenia i ekspozycji elektronowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia wgląd w mechanizmy fotodynamiczne istotne dla zastosowań przeciwdrobnoustrojowych i katalitycznych.
- Zapewnia ciągłość od obrazowania na etapie odkryć do rozwoju modeli przedklinicznych dla terapii aktywowanych światłem.
- Wspiera dostosowany do ryzyka postęp prac poprzez wyjaśnienie wkładu efektów świetlnych w porównaniu z efektami elektronowymi w obserwowanych zjawiskach.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając obrazowanie reakcji indukowanych światłem w układach ciekłych w oparciu o postawione hipotezy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów aktywowanych światłem w próbkach biologicznych i materiałowych.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania do rozwoju testów i oceny związków.
- Analityka: Zapewnia precyzyjny pomiar dawki elektronów i natężenia światła w celu odróżnienia czynników mechanistycznych.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne spostrzeżenia mechanistyczne z przedkliniczną walidacją interwencji fotodynamicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy modularną możliwość obrazowania, którą można dostosować do różnych badań w fazie ciekłej i napędzanych światłem.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez izolowanie i kwantyfikowanie zmian mikrostrukturalnych indukowanych światłem.
- Wartość operacyjna: Upraszcza przygotowanie próbek i standaryzuje warunki obrazowania w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań poprzez wyjaśnienie wkładu mechanistycznego w złożonych układach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów na terapeutyki i katalizatory aktywowane światłem z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w obsłudze TEM oraz kalibracji systemów dostarczania światła.
- Wymaga precyzyjnej kontroli dawki elektronów i natężenia światła w celu uzyskania wiarygodnych danych.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów obrazowania i rejestracji danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych podłoży (węgla, grafenu, azotku krzemu) o różnych profilach stabilności.
- Potencjalne ograniczenia obejmują odparowanie próbki i kompatybilność podłoży, co odnotowano w protokole.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące Biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:41
Encapsulation of Bacteria with the Photosensitizer
2:07
In Situ TEM Observations of Bacterial Cells in Liquid–Electron Dose Effect
2:50
In Situ TEM Observations of Light‐Induced Processes Between Bacterial Cells and Photosensitizer
3:51
Results: TEM Images of S. aureus Encapsulated with Methylene Blue Between Two Carbon Films and the Unfavorable Effects That May Occur During Imaging
4:47
Conclusion
