Name: Utrzymanie różnorodności komórkowej ludzkiego glejaka wielopostaciowego ex vivo przy użyciu trójwymiarowej hodowli organoidów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Poznaj metodę hodowli trójwymiarowych organoidów glejaka wielopostaciowego z próbek pacjentów. Technika ta zachowuje różnorodność komórkową i mikrośrodowisko nowotworu, umożliwiając badanie skuteczności leków oraz mechanizmów oporności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Justinowi Lathii za jego nieocenione rady i nieustające wsparcie. Dziękujemy również Katrinie Fife, Lisie Wallace i Mayi Camhi za ich doskonałe wsparcie techniczne.

<ol><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
<li>Heffernan, J. M., Sirianni, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+microenvironmental+regulation+of+glioblastoma+stem+cells%3A+a+biomaterials+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Materials%22%5BJournal%5D)">Modeling microenvironmental regulation of glioblastoma stem cells: a biomaterials perspective.</a> Frontiers in Materials. 5, 7(2018).</li>
<li>Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy+for+glioblastoma%3A+is+it+working%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Therapy for glioblastoma: is it working.</a> Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).</li>
<li>Hubert, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Three-dimensional+organoid+culture+system+derived+from+human+glioblastomas+recapitulates+the+hypoxic+gradients+and+cancer+stem+cell+heterogeneity+of+tumors+found+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A Three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo.</a> Cancer Research. 76 (8), 2465-2477 (2016).</li>
<li>Lathia, J. D., Heddleston, J. M., Venere, M., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deadly+teamwork%3A+neural+cancer+stem+cells+and+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Deadly teamwork: neural cancer stem cells and the tumor microenvironment.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 482-485 (2011).</li>
<li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell-derived+clonal+analysis+of+human+glioblastoma+links+functional+and+genomic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 851-856 (2015).</li>
<li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-like+glioma+cells+promote+tumor+angiogenesis+through+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor.</a> Cancer Research. 66 (16), 7843-7848 (2006).</li>
<li>Yu, S. C., Bian, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+cancer+stem+cells+based+on+heterogeneity+of+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Enrichment of cancer stem cells based on heterogeneity of invasiveness.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (1), 66-71 (2009).</li>
<li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li>
<li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumour+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Brain tumour stem cells.</a> Nature Reviews. Cancer. 6 (6), 425-436 (2006).</li>
<li>Zhu, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+create+a+stem+cell+niche+in+glioblastoma+by+providing+NOTCH+ligands+that+nurture+self-renewal+of+cancer+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells create a stem cell niche in glioblastoma by providing NOTCH ligands that nurture self-renewal of cancer stem-like cells.</a> Cancer Research. 71 (18), 6061-6072 (2011).</li>
<li>Calabrese, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+niche+for+brain+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular niche for brain tumor stem cells.</a> Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).</li>
<li>Charles, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+nitric+oxide+activates+notch+signaling+and+promotes+stem-like+character+in+PDGF-induced+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Perivascular nitric oxide activates notch signaling and promotes stem-like character in PDGF-induced glioma cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (2), 141-152 (2010).</li>
<li>Seidel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypoxic+niche+regulates+glioblastoma+stem+cells+through+hypoxia+inducible+factor+2+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A hypoxic niche regulates glioblastoma stem cells through hypoxia inducible factor 2 alpha.</a> Brain. 133, 983-995 (2010).</li>
<li>Yan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+cancer+stem+cells+secrete+Gremlin1+to+promote+their+maintenance+within+the+tumor+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Glioma cancer stem cells secrete Gremlin1 to promote their maintenance within the tumor hierarchy.</a> Genes & Development. 28 (10), 1085-1100 (2014).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+stem+cells+generate+vascular+pericytes+to+support+vessel+function+and+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma stem cells generate vascular pericytes to support vessel function and tumor growth.</a> Cell. 153 (1), 139-152 (2013).</li>
<li>Flavahan, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+initiating+cells+adapt+to+restricted+nutrition+through+preferential+glucose+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brain tumor initiating cells adapt to restricted nutrition through preferential glucose uptake.</a> Nature Neuroscience. 16 (10), 1373-1382 (2013).</li>
<li>Hjelmeland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidic+stress+promotes+a+glioma+stem+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Acidic stress promotes a glioma stem cell phenotype.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 829-840 (2011).</li>
<li>Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+increases+the+expression+of+stem-cell+markers+and+promotes+clonogenicity+in+glioblastoma+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres.</a> The American Journal of Pathology. 177 (3), 1491-1502 (2010).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factors+regulate+tumorigenic+capacity+of+glioma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells.</a> Cancer Cell. 15 (6), 501-513 (2009).</li>
<li>Azzarelli, R., Ori, M., Philpott, A., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+model+of+glioblastoma+by+co-culturing+tumor+stem+cells+with+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional model of glioblastoma by co-culturing tumor stem cells with human brain organoids.</a> Biology Open. 10 (2), 056416(2021).</li>
<li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26 (12), 3203-3211 (2019).</li>
<li>da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+glioblastoma+spheroid+infiltration+of+early-stage+cerebral+organoids+models+brain+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%3A+Advancing+Life+Sciences+R+%26+D%22%5BJournal%5D)">Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 23 (8), 862-868 (2018).</li>
<li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Patient-derived+glioblastoma+organoid+model+and+biobank+recapitulates+inter-+and+intra-tumoral+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity.</a> Cell. 180 (1), 188-204 (2020).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+from+endometrial+disease+capture+clinical+heterogeneity+and+are+amenable+to+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-and+patient-derived+tumor+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li>
<li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior%3A+what+is+the+impact+for+novel+discoveries%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: what is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li>
<li>Lenin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drug+screening+pipeline+using+2D+and+3D+patient-derived+in+vitro+models+for+preclinical+analysis+of+therapy+response+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A drug screening pipeline using 2D and 3D patient-derived in vitro models for preclinical analysis of therapy response in glioblastoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4322(2021).</li>
<li>Rybin, M. J., Ivan, M. E., Ayad, N. G., Zeier, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+glioblastoma+and+their+role+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organoid models of glioblastoma and their role in drug discovery.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15 (4), 605255(2021).</li>
<li>Shakya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+lipid+metabolism+marks+glioblastoma+stem+and+non-stem+cells+in+separate+tumor+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Altered lipid metabolism marks glioblastoma stem and non-stem cells in separate tumor niches.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 101(2021).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li>
<li>Bian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+cerebral+organoids+model+brain+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation.</a> Nature Methods. 15 (8), 631-639 (2018).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li>
<li>Sundar, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organoid+culture+unveils+resistance+to+clinical+therapies+in+adult+and+pediatric+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organoid culture unveils resistance to clinical therapies in adult and pediatric glioblastoma.</a> Translational Oncology. 15 (1), 101251(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Organoidy GBM są metodą hodowli komplementarną do tradycyjnych sfer, która obejmuje większą heterogeniczność komórkową i mikrośrodowiskową 4,22,30. Chociaż hodowla organoidów jest bardziej czasochłonna i zasobożerna, może dostarczyć cennych informacji na temat zachowania wewnątrz guza i mechanizmów oporności na leki.
GBM jest napędzany przez populację CSC 5,31, a metody te zostały opracowane, aby umożliwić ciągły wzrost i samoodnowę tej populacji CSC. Wiadomo, że naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) i czynnik wzrostu fibroblastów (FGF) poprawiają utrzymanie i wzrost komórek macierzystych oraz zapewniają sygnalizację aktywnej receptorowej kinazy tyrozynowej (RTK). Tworzenie heterogenicznych populacji komórkowych i odrębnych mikrośrodowisk nowotworowych w obrębie guzów GBM opiera się na wspieraniu zachowań CSC. Wybór lrECM naśladuje bogate w lamininę środowisko mózgu i wspiera komórki w hodowli organoidów w samoorganizacji i migracji przez inwazję. Chociaż niektóre grupy ustaliły hodowlę organoidów bez użycia pożywki wzbogaconej o lrECM lub EGF/FGF24,28, które mogą oferować bardziej efektywny czasowo sposób tej metody hodowli i silniejszą selekcję sygnalizacji onkogennej w celu stymulowania wzrostu, metody te zostały wybrane w celu optymalizacji środowiska komórek macierzystych, aby jak najlepiej ustalić heterogeniczność komórkową organoidów. Zarówno organoidy mózgowe, jak i organoidy GBM zostały wykonane z lrECM w literaturze wcześniej 21,32,33. Chociaż ustaliliśmy dane dotyczące populacji guzów znalezionych w organoidach i zmienności przestrzennej, mniej wiadomo o populacjach nienowotworowych w organoidach i o tym, jak długo przeżywają one od oryginalnych próbek pacjentów. Niektóre barwniki IHC (takie jak CD45) mogą dostarczyć tych danych i mogą być interesującym punktem badań w przyszłości nad organoidami.
Znajomość przeznaczenia hodowli organoidów jest ważna dla wyboru odpowiednich metod. Tworzenie organoidów z próbek pierwotnych w porównaniu z hodowlą jednolitych organoidów do określonych eksperymentów ma nieco inne procedury. Zrozumienie tego, w jaki sposób organoidy dojrzewają i wizualnie wypełniają rusztowanie lrECM, jest ważne, aby móc przeznaczyć odpowiedni czas i zasoby na hodowlę organoidów. Rzadkie regiony komórek w organoidach będą się powoli rozszerzać i rosnąć, aby wypełnić lrECM, co może zająć od 2 do 8 tygodni, w zależności od zachowania próbki. To tempo wzrostu jest w pewnym stopniu nieodłączne od każdego okazu; Jest zachowany w różnych partiach organoidów i dość zgodny ze względnym tempem wzrostu kuli. Organoidy mogą być utrzymywane przez ponad 1 rok i zachowują zdolność do tworzenia guza na ksenoprzeszczepie u myszy; Zaleca się jednak ich uprawę w określonym celu, aby nie marnować zasobów laboratoryjnych (zarówno materiałów, jak i czasu)4. Wzrost organoidów został przetestowany w wielu rozmiarach i formatach dołków i pokazuje, że płytka o średnicy 10 cm jest idealnym miejscem do utrzymania optymalnej żywotności komórek, a następnie płytka 6-dołkowa z trzema organoidami na studzienkę34. Organoidy zużywają więcej pożywek w porównaniu z ich dwuwymiarowymi odpowiednikami z kultur, a użycie mniejszego formatu studzienki nie prowadzi do właściwej konserwacji. Na przykład jedna studzienka z 96-dołkową płytką nie ma wystarczającej ilości miejsca lub objętości podłoża w stosunku do wielkości organoidu, aby podtrzymać wzrost organoidów.
Jak pokazują organoidy, bycie spostrzegawczym jest ważne dla zwiększenia sukcesu. Początkowo organoidy będą zużywać pożywkę powoli, ale gdy staną się gęstsze i bardziej dojrzałe, będą zużywać pożywkę szybciej. Dodanie czerwieni fenolowej do pożywki może służyć jako wskaźnik zużycia mediów. Kiedy pożywka jest bardziej żółta, może to skłonić nas do dostosowania wzorca karmienia, niezależnie od tego, czy chodzi o wymianę większej objętości pożywki, zwiększenie całkowitej ilości pożywki na płytce, podzielenie organoidów na wiele płytek do hodowli komórkowych, aby nadążyć za ich wzrostem, czy nawet dostosowanie harmonogramu eksperymentów. 
Pod wieloma względami organoidy są nieefektywnym sposobem prowadzenia badań nad rakiem. Wiążą się one z długimi skalami czasowymi, są kosztowne i wymagają dużych zasobów w porównaniu z kulturą sfery GBM. Jednak w porównaniu z ksenoprzeszczepami pochodzącymi od pacjentów, alternatywną metodą odtwarzania różnorodności komórkowej i mikrośrodowiskowej, są one prostsze, tańsze i łatwiejsze do kontrolowania. Wybór najlepszych metod stosowania organoidów jest ważny dla badaczy nowotworów. Nie mają one na celu zastąpienia tradycyjnej sfery lub kultury przylegającej, ani nie mają na celu zastąpienia modeli ksenoprzeszczepów. Organoidy mogą, jeśli zostaną zastosowane do właściwego pytania naukowego, połączyć korzyści z obu tych systemów i mogą pozwolić nam obserwować biologię komórek nowotworowych, która w przeciwnym razie pozostałaby ukryta. Społeczność naukowa dopiero zaczyna rozumieć, jakie możliwości uczenia się oferują organoidy, ale jasne jest, że w przyszłości będą one nieocenionym narzędziem do zrozumienia złożonej biologii GBM.

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęściej występującym pierwotnym nowotworem mózgu, którego rokowanie wynosi około 15 miesięcy od diagnozy1. Terapie, które są skuteczne w badaniach przedklinicznych, często mogą być słabo skuteczne u pacjentów2,3. Słaba odpowiedź kliniczna jest przypisywana wielu czynnikom, w tym niejednorodności mikrośrodowiskowej GBM i złożonym interakcjom wewnątrznowotworowym. Mogą one być trudne do odtworzenia w warunkach laboratoryjnych przy użyciu tradycyjnych metod hodowli przylegającej lub sferycznej4. Obecność podzbioru samoodnawiających się nowotworowych komórek macierzystych (CSC) w GBM może również przyczyniać się do tej złożoności5,6. CSC mają kluczowe znaczenie dla propagacji guza i utrzymania wzrostu guza poprzez promowanie aktywnej angiogenezy, inwazji raka i oporności na terapie, w tym radioterapię7,8,9. CSC nie są równomiernie rozmieszczone w guzach, ale są wzbogacone w określonych mikrośrodowiskach, w tym w niszy okołonaczyniowej i regionach okołonaczyniowych, z których każdy zapewnia odrębną molekularną regulację swoich stanów komórkowych10,11,12,13,14. CSC nie są biernymi odbiorcami sygnałów mikrośrodowiskowych, ale posiadają zdolność do przebudowy własnych mikrośrodowisk7,15,16. Mikrośrodowisko CSC może sprzyjać utrzymaniu stanu komórek macierzystych w odpowiedzi na presje, takie jak niedobór składników odżywczych, pH i niedotlenie17,18,19,20, co sugeruje znaczenie tych warunków w systemie modelowym. Rekapitulacja zróżnicowanego mikrośrodowiska komórkowego w obrębie nowotworów ma zatem kluczowe znaczenie dla zrozumienia oporności terapeutycznej i zidentyfikowania nowych terapii.
Kultura trójwymiarowa zyskała na popularności w ostatnich latach21,22. Organoidy były stosowane w innych typach nowotworów, a głównym celem utrzymania komórek jako organoidów jest umożliwienie wzrostu heterogenicznych populacji komórek (z których wiele może być normalnie prześcigniętych w bardziej jednorodnej kulturze sferycznej) i różnorodności przestrzennej, postrzeganej jako regionalne mikrośrodowiska guza o swoistości genetycznej4,23,24,25,26. Istnieje wiele metod trójwymiarowej hodowli komórek nowotworowych, z których każda ma zalety i wady27,28,29. Hodowla organoidów nie ma na celu zastąpienia tradycyjnej kultury przylegającej lub sferycznej. Najlepiej stosować ją jako technikę uzupełniającą metody dwuwymiarowe, gdy istnieją konkretne pytania, w których interakcja między mikrośrodowiskiem komórki a odpowiedziami komórek nowotworowych jest krytyczna.
Ten artykuł opisuje niezawodne i powtarzalne metody generowania organoidów GBM zarówno z pierwotnych próbek pobranych od pacjentów, jak i z kultur pochodzących od pacjentów. Zajmujemy się dwoma różnymi celami trójwymiarowej hodowli organoidów: (1) tworzenie organoidów z pierwotnej tkanki pacjenta, z maksymalnym potencjałem wszczepienia niezależnie od jednorodności, lub (2) hodowanie jednolitych organoidów do bardziej ilościowego zastosowania eksperymentalnego. Przy ustalaniu próbki pierwotnej jako organoidów nie jest konieczne filtrowanie w poszukiwaniu pojedynczych komórek ani liczenie komórek, ponieważ priorytetem jest utrzymanie maksymalnej liczby i typów komórek w celu ustalenia początkowej hodowli. Jednak w przypadku hodowli organoidów do eksperymentów porównawczych konieczna jest filtracja jednokomórkowa i zliczanie komórek, aby zapewnić, że powtórzone organoidy są porównywalne pod względem spójności eksperymentalnej. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób ustanawiać hodowle organoidów i tworzyć jednolite organoidy, a także wyrafinowane metody osadzania i konserwowania organoidów oraz standardowe eksperymenty z hodowlami komórkowymi, w tym immunohistochemię, immunofluorescencję i ocenę całkowitej żywotności komórek w organoidach GBM.

<table><tbody><tr><td>Tabletki 3,3-diaminobenzydyny (DAB)</td><td>MP Biomedicals</td><td>08980681</td><td>Tabletki 3,3-diaminobenzydyny (DAB)</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki PCR</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>96-dołkowe płytki PCR</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SCR005</td><td>Roztwór do odrywania komórek</td></tr><tr><td>Antybiotykowo-przeciwgrzybiczy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Antybiotykowo-przeciwgrzybiczy</td></tr><tr><td>suplement B-27 minus witamina A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12587001</td><td>Suplement B-27 minus witamina A (50x)</td></tr><tr><td>Odczynnik GelCode Blue Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>24590</td><td>Odczynnik do niebieszczenia</td></tr><tr><td>Sitko do komórek (70 &mikro; m)</td> <td>CellTreat Scientific</td><td>229483</td><td>Sitko do komórek (70 &mikro; m)</td></tr> <tr><td>CellTiter-Glo 3D</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>Test żywotności komórek luminescencyjnych</td></tr><tr><td>Clarifier 2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>7301</td><td>Odczynnik do klarowania hematoksyliny jądrowej</td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Substytut ksylenu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>6901</td></tr><tr><td>Epredia Gill 2 Hematoxylin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>72504</td><td>Glutamina hematoksyliny</td></tr><tr><td> w 0,85% NaCl</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Glutamina w 0,85% NaCl (200 mM)</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>354234</td><td>Macierz zewnątrzkomórkowa wzbogacona w lamininę</td></tr><tr><td>Mini długopis PAP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>008877</td><td>Hydrofobowy długopis barierowy</td></tr><tr><td>Podłoże montażowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-050-102</td><td>Podłoże montażowe</td></tr><tr><td>Neurobasal podłoże bez czerwieni fenolowej</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12349015</td><td>Pożywka neurobazalna minus czerwień fenolowa (500 ml)</td></tr><tr><td>Normalna surowica osła (NDS)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Normalna surowica osła (NDS)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 4% w PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td>Paraformaldehyd 4% w PBS</td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Czerwień fenolowa (0,5%)</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant z DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10144</td><td>Płynny utwardzany uchwyt</td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko EGF</td><td>R& Systemy D</td><td>236-EG-01M</td><td>Rekombinowane ludzkie białko EGF (250 &mikro; g / mL)</td></tr> <tr><td>Rekombinowany ludzki FGF zasadowy</td><td>R& Systemy D</td><td>4144-TC-01</td><td>Rekombinowany ludzki FGF zasadowy (250 &mikro; g / mL)</td></tr><tr><td>SignalStain Rozcieńczalnik</td><td>przeciwciał Sygnalizacja komórkowa</td><td>8112</td><td>Rozcieńczalnik przeciwciał</td></tr><tr><td>SignalStain Boost Odczynnik do wykrywania IHC</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>8114</td><td>Odczynnik do wykrywania immunohistochemii</td></tr><tr><td>Roztwór demaskujący cytrynian SignalStain</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>14746</td><td>Roztwór demaskujący cytrynian</td></tr><tr><td>Żyletka jednokrawędziowa</td><td>Uline</td><td>H-595B</td><td>Pojedyncza krawędź żyletka</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td><td>Pirogronian sodu (100 mM)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomolds</td><td>VWR</td><td>25608-916</td><td>Jednorazowe krioformy</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Mieszanka o optymalnej temperaturze cięcia</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T10282</td><td>Barwnik nieprzepuszczalny komórkowy (0,4%)</td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td>Ksylen</td></tr></tbody></table>

utrzymanie różnorodności komórkowej ludzkiego glejaka wielopostaciowego ex vivo przy użyciu trójwymiarowej hodowli organoidów

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęściej występującym pierwotnym złośliwym nowotworem mózgu o bardzo złym rokowaniu. Wewnątrznowotworowa różnorodność komórkowa i molekularna, a także złożone interakcje między mikrośrodowiskami nowotworu, mogą sprawić, że znalezienie skutecznych metod leczenia może być wyzwaniem. Tradycyjne metody hodowli adherentowej lub sferycznej mogą maskować taką złożoność, podczas gdy trójwymiarowa hodowla organoidów może podsumowywać regionalne gradienty mikrośrodowiskowe. Organoidy to metoda trójwymiarowej hodowli GBM, która lepiej naśladuje architekturę guza pacjenta, zawiera fenotypowo zróżnicowane populacje komórek i może być stosowana w eksperymentach o średniej przepustowości. Chociaż trójwymiarowa hodowla organoidów jest bardziej pracochłonna i czasochłonna w porównaniu z kulturą tradycyjną, oferuje wyjątkowe korzyści i może służyć do wypełnienia luki między obecnymi systemami in vitro i in vivo. Organoidy stały się nieocenionymi narzędziami w arsenale biologów nowotworowych, aby lepiej zrozumieć zachowanie guza i mechanizmy oporności, a ich zastosowania wciąż rosną. Tutaj znajdują się szczegółowe informacje na temat metod generowania i utrzymywania organoidów GBM. Opisano również instrukcje dotyczące zatapiania i cięcia próbek organoidów przy użyciu technik zatapiania zarówno zamrożonych, jak i parafinowych, a także zalecenia dotyczące protokołów immunohistochemicznych i immunofluorescencyjnych na skrawkach organoidów oraz pomiaru całkowitej żywotności komórek organoidowych.

Rysunek 1 przedstawia wczesny wzrost organoidów obserwowany za pomocą mikroskopii świetlnej przy powiększeniu 10x. Rysunek 1A pokazuje migrację i inwazję pojedynczych komórek przez lrECM w widoku centralnym. Komórki będą nadal namnażać się i „kolonizować” lrECM, stając się gęstszymi i w końcu nieprzezroczystymi w ocenie wizualnej. Rysunek 1B przedstawia kilka dojrzałych organoidów (w 7. tygodniu) bez powiększenia, w odniesieniu do rozmiaru monety o nominale 10 centów.
Rysunek 2 przedstawia barwienie immunohistochemiczne organoidów GBM na fosfo-histon H3, będący markerem aktywnej proliferacji. Większość komórek o wysokiej zdolności do proliferacji widoczna jest na obwodzie organoidu w porównaniu z jego rdzeniem. Barwienie pozytywne będzie miało brązowy/miedziany kolor.
Rycina 3 opisuje proces homogenizacji i pomiaru całkowitej liczby komórek w organoidach GBM przy użyciu luminescencyjnego testu żywotności komórek dedykowanego strukturą 3D. Ze względu na wysoką liczbę komórek obecnych w organoidach GBM, większa struktura organoidu jest początkowo homogenizowana poprzez triturację w odczynniku do testu luminescencyjnego. Następnie frakcje całkowitego lizatu organoidu są przenoszone do poszczególnych studzienek i rozcieńczane dodatkowym odczynnikiem do testu luminescencyjnego przed inkubacją i odczytem na odpowiednim czytniku płytek wielodołkowych.
Rysunek 4 przedstawia dane kontrolne dla organoidów z użyciem DMSO (powszechny nośnik). Wykreślone dane wykazują spójność wewnątrzorganoidową oraz międzyorganoidową. Przy generowaniu danych eksperymentalnych dane dotyczące żywotności luminescencyjnej będą zazwyczaj normalizowane względem kontroli dla każdego preparatu.
<img alt="Mikroskopowy wzrost grzybni; porównanie rozmiaru z monetą, schemat; badanie morfologii i wielkości grzybni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Obraz z mikroskopu świetlnego (10x). (A) Wczesny wzrost organoidów wykazujący migrację/inwazję komórek GBM w bogatej w lamininę macierzy zewnątrzkomórkowej. (B) Dojrzałe organoidy w odniesieniu do rozmiaru monety. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Przekrój histologiczny, barwiona tkanka, analiza mikroskopowa, struktura komórkowa, powiększony widok wstawkowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Immunohistochemia organoidów GBM. (A, B) Organoidy GBM wykazujące komórki barwione na fosfo-histon H3 w celu oceny aktywnej proliferacji. Paski skali wynoszą odpowiednio 600 µm dla A i 300 µm dla B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat testu żywotności organoidów: hodowla, tryturacja, rozcieńczanie odczynników, pomiar luminescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Protokół luminescencyjnego pomiaru żywotności komórek dla organoidów. (A) Przenieść poszczególne organoidy do małych probówek wirówkowych i usunąć nadmiar pożywki. (B) Do każdej probówki dodać 500 µL mieszaniny PBS i odczynnika do luminescencyjnego testu żywotności komórek w stosunku 1:1, a następnie intensywnie pipetować w celu rozbicia organoidu. (C) Do każdego dołka płytki 96-dołkowej dodać 25 µL tak przygotowanej mieszaniny organoidów oraz 75 µL tej samej mieszaniny PBS i odczynnika do luminescencyjnego testu żywotności komórek w stosunku 1:1. (D) Umieścić na wytrząsarce na 2 min, następnie inkubować przez 20 min w RT, a potem zmierzyć luminescencję za pomocą czytnika płytek. Rycina wykonana przy użyciu BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres żywotności komórek organoidów w 0,1% DMSO; analiza danych dotycząca relatywnych jednostek światła." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Żywotność komórek. Dane dotyczące żywotności komórek organoidów w 0,1% dimetylosulfotlenku (DMSO) dla sześciu powtórzeń technicznych czterech organoidów z próbek pochodzących od czterech pacjentów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig04large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>Ilość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pożywka Neurobasal bez czerwieni fenolowej</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suplement B-27 bez witaminy A (50x)</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antybiotyk-antymykotyk (100x)</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pirowinian sodu (100 mM)</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamina w 0,85% NaCl (200 mM)</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rekombinowany ludzki FGF podstawowy (250 µg/mL)</td>
			<td>20 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rekombinowane ludzkie białko EFG (250 µg/mL)</td>
			<td>20 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czerwony fenol</td>
			<td>500 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład kompletnego medium Neurobasal (NBMc)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Czas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% etanol</td>
			<td>3 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% etanol</td>
			<td>3 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% etanol</td>
			<td>3 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% etanol</td>
			<td>4 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% etanol</td>
			<td>2 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% etanol</td>
			<td>3 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etanol 100%</td>
			<td>4 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zamiennik ksylenu</td>
			<td>2 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zamiennik ksylenu</td>
			<td>3 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zamiennik ksylenu</td>
			<td>4 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafina</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wosk parafinowy</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Harmonogram przetwarzania małych organoidów (o średnicy poniżej 3 mm)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Czas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% etanol</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% etanol</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% etanol</td>
			<td>5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% etanol</td>
			<td>8 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% etanol</td>
			<td>5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% etanol</td>
			<td>5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% etanol</td>
			<td>8 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zamiennik ksylenu</td>
			<td>5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zamiennik ksylenu</td>
			<td>5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zamiennik ksylenu</td>
			<td>8 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wosk parafinowy</td>
			<td>30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wosk parafinowy</td>
			<td>30 min</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Harmonogram przetwarzania dużych organoidów (o średnicy powyżej 3 mm)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Odczynnik</td>
			<td >Czas</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Hematoksylina</td>
			<td >2 min</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Bieżąca diH2O</td>
			<td >2 min</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Odczynnik do klarowania hematoksyliny jądrowej</td>
			<td >1 min</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Bieżąca diH2O</td>
			<td >1 min</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Odczynnik do błękitnienia</td>
			<td >1 min</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Bieżąca diH2O</td>
			<td >2 min</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >70% etanol</td>
			<td >1 min</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >100% etanol</td>
			<td >1 min</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >100% etanol</td>
			<td >1 min</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Zamiennik ksylenu</td>
			<td >2 min</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Zamiennik ksylenu</td>
			<td >2 min</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 4: Kontrastowanie hematoksyliną

Tutaj opisujemy metodę generowania organoidów glejaka (GBM) z pierwotnych próbek pacjentów lub hodowli komórkowych pochodzących od pacjentów i utrzymywania ich do dojrzałości. Te organoidy GBM zawierają fenotypowo zróżnicowane populacje komórek i odtwarzają mikrośrodowiska guza ex vivo.

Utrzymanie różnorodności komórkowej ludzkiego glejaka wielopostaciowego ex vivo przy użyciu trójwymiarowej hodowli organoidów

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

Znalezienie metod leczenia glejaka jest wyzwaniem ze względu na różnorodność komórkową występującą w nowotworach i interakcje między różnymi mikrośrodowiskami. Organoidy mogą pomóc w odtworzeniu części tej różnorodności przestrzennej, a my możemy to wykorzystać, aby lepiej zrozumieć biologię nowotworów. Podczas gdy tradycyjne metody hodowli komórkowej mają tendencję do wytwarzania jednorodnych populacji komórek nowotworowych, organoidy mogą lepiej naśladować różnorodność molekularną i komórkową glejaka oraz lepiej modelować interakcje wewnątrznowotworowe.Organoidy mogą być wykorzystywane do badania skuteczności leków i mechanizmów oporności. Oporność na terapie kliniczne może pojawić się tylko w organoidach, a nie w kulturze sfery tradycyjnej, odzwierciedlając rzeczywistość kliniczną tej choroby. Organoidy mogą pomóc w wykazaniu regionalnych efektów chemioterapii.Mogą być one wykorzystywane do odkrywania nowych terapii specyficznych dla nisz, a także mogą działać jako narzędzie predykcyjne dla medycyny spersonalizowanej w przyszłości. Niektóre materiały używane do tworzenia organoidów są wrażliwe na temperaturę, a zaniedbanie utrzymywania tych materiałów w odpowiedniej temperaturze może prowadzić do trudności w tworzeniu lub utrzymaniu organoidów. Rozpocznij przygotowanie form organoidowych pod kapturem hodowlanym, zdejmując papier woskowany z arkusza parafilmu i umieszczając go między dwiema sterylnymi 96-dołkowymi płytkami do reakcji łańcuchowej polimerazy lub PCR.Upewnij się, że wnętrze parafilmu jest czyste. Zastosuj równomierny nacisk na górną płytę, aby utworzyć małe wgłębienia o głębokości dwóch milimetrów w parafilmie bez tworzenia otworów. Oddziel talerze.Parafilm z wgłębieniami przyklei się do górnej płyty. Następnie umieść górną płytę na suchym lodzie na 30 sekund. Użyj sterylnych kleszczy, aby szybkim ruchem ściągnąć parafilm z górnej płyty.Zamrożony parafilm jest łatwiejszy do usunięcia. Umieść gotową formę parafilmową w przykrytym, sterylnym 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych. Aby przygotować zawiesinę jednokomórkową z glejaka wielopostaciowego lub hodowli przylegającej do GBM, należy usunąć zużyte podłoże z płytki.Następnie dodaj do płytki dwa mililitry roztworu do oddzielania komórek o temperaturze pokojowej i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni przez trzy minuty. Po potwierdzeniu oderwania komórek od płytki pod mikroskopem, dodaj osiem mililitrów pożywki Neurobasal Complete lub pożywki NBMc, aby zneutralizować roztwór do odwarstwiania komórek. Przecedzić zawiesinę przez pojedyncze sitko o średnicy 70 mikronów.Obracaj komórki w tempie 120 razy G przez pięć minut. Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze NBMc. Policzyć komórki z zawiesiny jednokomórkowej za pomocą nieprzewidzianego barwienia komórek.Aby wytworzyć organoidy z zawiesiny jednokomórkowej, dodaj odpowiednią ilość bogatej w lamininę macierzy zewnątrzkomórkowej lub lrECM do małej probówki wirówkowej w wiadrze z lodem lub zimnym bloku. Przygotuj mieszaninę komórek zawierającą 20 000 komórek na organoid. Mieszaninę zawiesiny komórkowej lrECM należy dokładnie wymieszać, aby uniknąć osiadania komórek, co mogłoby spowodować niejednorodne tworzenie organoidów.Następnie ostrożnie odpipetuj 20 mikrolitrów mieszaniny na formę parafilmową, aby utworzyć perłową kroplę. Upewnij się, że końcówka pipety jest chłodzona co dwa do trzech organoidów, aby zapobiec polimeryzacji lrECM. Po odpipetowaniu żądanej liczby organoidów na formę parafilmu na 10-centymetrowej płytce hodowlanej, należy inkubować organoidy w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin w inkubatorze do hodowli komórkowych.Po zestaleniu się organoidów delikatnie spłucz organoidy z formy parafilmowej pożywką NBMc za pomocą końcówki P1000 i zbierz je na nową 10-centymetrową płytkę hodowlaną zawierającą 20 mililitrów NBMc. Umieść płytkę hodowlaną w inkubatorze bez wstrząsania przez cztery dni. Po czterech dniach wymień nośnik w płycie.Aby to zrobić, umieść kawałek ciemnego papieru pod płytką do hodowli komórkowej. Przechyl talerz i odczekaj 20 sekund. Gdy organoidy całkowicie osiądą na dnie naczynia, powoli wyjmij pożywkę za pomocą szklanej pipety o dużym otworze.Po dodaniu nowych pożywek umieść płytkę w inkubatorze na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 80 obr./min, a następnie wymieniaj pożywkę co dwa do trzech dni. Wzrost organoidu obserwowano za pomocą mikroskopii świetlnej. W widoku centralnym wczesny wzrost organoidów wykazał migrację i inwazję pojedynczych komórek przez lrECM.Dojrzałe organoidy w wieku siedmiu tygodni były względne do wielkości dziesięciocentówki. Barwienie immunohistochemiczne organoidów GBM fosfohistonem H3 ujawniło wysoce proliferacyjne komórki o brązowym lub fioletowym wyglądzie na obwodzie organoidu w porównaniu z rdzeniem. Dane dotyczące żywotności komórek dla organoidów w 0,1% DMSO wykazały spójność wewnątrzorganoidową i międzyorganoidową.Zwróć uwagę na biomasę organoidową i zakwaszenie pożywki. Jeśli organoidy przechodzą przez pożywkę zbyt szybko, należy pamiętać o częstszej wymianie pożywki lub rozdzieleniu organoidów między dodatkowe płytki. Dojrzałe organoidy mogą być wykorzystywane do eksperymentów z terapiami lub osadzone i podzielone na sekcje do użytku z immunohistochemią lub immunofluorescencją.Zdysocjowane organoidy można wykorzystać do analizy FACS. Organoidy te zostały niedawno wykorzystane w trójwymiarowych funkcjonalnych badaniach przesiewowych w celu odkrycia celów niezbędnych w przestrzennie odrębnych niszach nowotworowych komórek macierzystych. Używamy również tych modeli, aby ustalić priorytety różnych leków i terapii przed testami in vivo.

maintaining-human-glioblastoma-cellular-diversity-ex-vivo-using-three

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Wideo pokazuje tworzenie i utrzymywanie organtypowych kultur warstwowych z tkanki glejaka. Wyizolowaną tkankę osadza się w matrycy agarozowej, a cienkie skrawki uzyskuje się za pomocą wibratomu. Sekcje te są następnie umieszczane na przepuszczalnych wkładkach membranowych w mikropłytce i hodowane w pożywce do hodowli warstwowej w celu długotrwałej konserwacji.

Generowanie i utrzymywanie kultur plastrów z ludzkiej tkanki glejaka wielopostaciowego

Ten film opisuje przygotowanie i hodowlę organoidów guza mózgu z zawiesiny pojedynczej komórki. Wykorzystując bogatą w lamininę macierz zewnątrzkomórkową jako rusztowanie i pożywkę hodowlaną dla składników odżywczych, komórki mają ułatwione namnażanie się i samoorganizację w organoidzie. W związku z tym generowane są organoidy ex vivo, naśladujące różnorodność komórkową i mikrośrodowisko guzów mózgu.

Generowanie kultury organoidów z zawiesiny komórek guza mózgu

Protokół rozmnażania zdysocjowanych próbek chirurgicznych glejaka wysokiego stopnia w pożywce neurosfery wolnej od surowicy do selekcji komórek o fenotypie rakowych komórek macierzystych. W przypadku próbek, które nie rosną jako neurosfery, sugerowany jest alternatywny protokół. Opisano technikę zatapiania parafiny w celu utrzymania architektury neurosfery 3D dla immunocytochemii.

Optymalizacja hodowli komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości z próbek chirurgicznych do zastosowania w klinicznie istotnych modelach zwierzęcych i immunochemii 3D

Obecne modele ex vivo glejaka (GBM) nie są zoptymalizowane pod kątem fizjologicznie istotnych badań nad inwazją nowotworów u ludzi. W tym miejscu przedstawiamy protokół generowania i utrzymywania organotypowych kultur warstwowych ze świeżej tkanki ludzkiej GBM. Przedstawiono opis technik mikroskopii poklatkowej i ilościowej analizy migracji komórek.

Organotypowy model hodowli warstwowej glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych

Ksenoprzeszczepy glejaka wielopostaciowego pochodzące od pacjentów mogą być miniaturyzowane do żywych mikroguzów za pomocą systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D. Ten test 3D guza in vivo nadaje się do testowania odpowiedzi na lek i profilowania molekularnego, w tym analizy kinomicznej.

Generowanie mikroguzów przy użyciu systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D i komórek glejaka pochodzących od pacjentów do profilowania kinomicznego i testowania odpowiedzi na leki

To badanie przedstawia i opisuje protokoły do uzyskania dwóch specyficznych ludzkich organoidów nerwowych jako odpowiedniego i dokładnego modelu do badania: 1) rozwoju glejaka u człowieka w obrębie ludzkich organoidów nerwowych wyłącznie u ludzi oraz 2) różnicowania dopaminergicznego neuronów generującego trójwymiarowy organoid.

Ludzkie organoidy nerwowe do badania raka mózgu i chorób neurodegeneracyjnych

Tutaj opisujemy łatwy w użyciu test na inwazję glejaka. Ten test jest odpowiedni dla komórek macierzystych podobnych do glejaka. Opisano również makro Fidżi do łatwego ilościowego określania inwazji, migracji i proliferacji.

Model sferoidalny 3D glejaka wielopostaciowego

To badanie wprowadza zautomatyzowaną metodę generowania trójwymiarowych organoidów glejaka pochodzących od pacjenta za pomocą rozdrabniacza tkanek. Metoda zapewnia odpowiednie i skuteczne podejście do pozyskiwania takich organoidów do badań terapeutycznych.

Hodowla organoidów glejaka pochodzącego od pacjenta ex vivo za pomocą rozdrabniacza tkanek

Zmutowane IDH1 rozlane glejaki o niskim stopniu złośliwości to rzadkie nowotwory, które są trudne do hodowli. Wprowadzamy prostą, nieenzymatyczną metodę eksplantacji, która zachowuje ekspresję białka z mutacją IDH1 i utrzymuje kultury przez wiele miesięcy. Co ważne, technika ta działa w przypadku kriokonserwowanych guzów, oferując cenne źródło informacji do badań nad glejakiem.

Protokół dla eksplantatów rozlanych glejaków o niskim stopniu złośliwości z mutacją IDH1

Tutaj przedstawiamy kompleksowy protokół generowania i wykorzystywania laboratoryjnie zaprojektowanych organoidów glejaka (LEGO) do badania zależności genotyp-fenotyp i badania potencjalnych leków do leczenia glejaka.

Laboratoryjnie zmodyfikowana hodowla organoidów glejaka wielopostaciowego i badania przesiewowe leków

Poznaj metodę hodowli trójwymiarowych organoidów glejaka wielopostaciowego z próbek pacjentów. Technika ta zachowuje różnorodność komórkową i mikrośrodowisko nowotworu, umożliwiając badanie skuteczności leków oraz mechanizmów oporności.

Utrzymanie różnorodności komórkowej ludzkiego glejaka wielopostaciowego ex vivo przy użyciu trójwymiarowej hodowli organoidów

Przeglądaj więcej filmów