Wpływ kwasu hialuronowego 35 kDa na model in vitro przedwczesnego uszkodzenia jelita cienkiego i gojenie za pomocą monowarstw pochodzących z enteroidu

Protokół ten rozszerza bardzo powszechny test ran drapanych stosowany w badaniach regeneracji z monowarstwami pochodzącymi z enteroidów reprezentującymi wszystkie główne typy komórek jelita cienkiego. Technika ta umożliwia wizualizację zamknięcia rany w czasie rzeczywistym w jednowarstwowym modelu regeneracji jelit 2D z enteroidu. Nasza technika może być zastosowana do badania jelit wcześniaków ssaków, które są zazwyczaj słabo modelowane przy użyciu przekształconych linii komórkowych raka jelita grubego.

Zacznij od rozmrożenia 96 mikrolitrów macierzy zewnątrzkomórkowej lub hydrożelu BME na bazie ECM przez noc na lodzie w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza. Rozcieńczyć hydrożel na bazie ECM i lodowaty PBS bez wapnia i magnezu w stosunku jeden do 50. Pokryć każdą studzienkę 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej 200 mikrolitrami lodowato rozcieńczonego hydrożelu na bazie ECM i inkubować powlekaną płytkę przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Następnie odessać pożywkę z 24-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej enteroidy 3D przeznaczone do monowarstw i zastąpić ją 500 mikrolitrami odczynnika do dysocjacji komórek na studzienkę. Ręcznie zakłócij kopułki hydrożelowe oparte na ECM, pipetując w górę i w dół od ośmiu do 12 razy i przenosząc zawartość 12 studzienek do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Umyj 12 pustych studzienek 250 mikrolitrami odczynnika do dysocjacji komórek, aby upewnić się, że wszystkie enteroidy zostały usunięte i przenieś zawartość do 15-mililitrowych stożkowych probówek.

Odwirować stożkowe probówki o masie 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant. Dodaj 10 mililitrów lodowatego buforu do płukania DMEM/F-12 do stożkowych probówek i zawiesić granulki enteroidalne, odwracając probówki. Wirować przy 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant.

Ponownie zawiesić granulki komórek w 12 mililitrach trypsyny-EDTA o temperaturze 37 stopni Celsjusza i umieścić probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut lub do momentu, gdy komórki będą rozpuszczalne. Dodaj trzy mililitry buforu do płukania DMEM/F-12 do każdej probówki, aby rozcieńczyć Trypsynę-EDTA. Wymieszaj, odwracając rurki i umieść na lodzie.

Przefiltruj zdysocjowane enteroidy przez sitko do komórek o siatce 37 mikrometrów. Zbierz zawartość do czystych 15-mililitrowych stożkowych probówek i odwiruj probówki o wadze 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant ze stożkowych probówek i ponownie zawiesić granulki komórek sześcioma mililitrami HOMGY.

Następnie wyjąć z inkubatora płytkę pokrytą hydrożelem na bazie ECM i odessać nadmiar roztworu hydrożelu na bazie ECM, nie rysując powlekanej powierzchni ani całkowicie wysuszając płytkę. Dodaj 500 mikrolitrów połączonej 12-mililitrowej zawiesiny komórek HOMGY do każdej studzienki 24-dołkowej płytki pokrytej hydrożelem na bazie ECM. Zakręć płytką z założoną pokrywką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek w studzienkach.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, wymieniając pożywkę HOMGY co dwa dni, aż monowarstwy osiągną zbieżność większą niż 90%. Gdy monowarstwy osiągną konfluflurację większą niż 90%, odessaj pożywkę, aby usunąć wszelkie komórki, które nie mogą się przyczepić. Potraktuj komórki 500 mikrolitrami HA35 lub PBS rozpuszczonymi w HOMGY przez 24 godziny.

Następnie usuń nośnik bez naruszania powierzchni monowarstwy. Używając końcówki do pipet o pojemności 200 mikrolitrów, wykonaj liniowe zadrapanie na całej średnicy powierzchni monowarstwy w każdym dołku, uważając, aby monowarstwy nie wyschły. Umyj porysowane monowarstwy raz 500 mikrolitrami 1X PBS i dodaj 500 mikrolitrów HA35 lub PBS rozpuszczonych w HOMGY.

Przenieś płytkę do przyrządu do analizy żywych komórek w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pod ikoną Harmonogram w oprogramowaniu do analizy komórek na żywo kliknij ikonę Uruchom kreatora dodawania nowego statku. Wybierz opcję Skanuj zgodnie z harmonogramem, a następnie kliknij przycisk Dalej.

Wybierz Nowy w obszarze Utwórz naczynie i kliknij Dalej, a następnie wybierz Cała studnia w obszarze Typ skanowania i kliknij Dalej. Wybierz Fazę dla kanałów obrazu i 4x dla obiektywu. Wybierz producenta tabliczki i numer katalogowy z podanej listy, a następnie kliknij przycisk Dalej.

Wybierz lokalizację pustego naczynia, a następnie żądany wzór skanowania. Wprowadź nazwę blachy w polu Nazwa, a następnie wybierz plus, aby utworzyć układ blachy. Wybierz mały plus, aby utworzyć nazwę zabiegu.

Wprowadź krótką nazwę, a następnie OK. Zaznacz dołki płytkowe odpowiadające temu zabiegowi i naciśnij duży plus, aby oznaczyć dołki z tym zabiegiem. Wprowadź stężenie związku i kliknij przycisk OK. Po zakończeniu tworzenia płytki wybierz przycisk OK, Dalej. Wybierz pozycję Odłóż analizę na później, a następnie pozycję Utwórz nowy harmonogram ze skanowaniem w odstępach czterech godzin.

Przerwij skanowanie po jednym dniu, zero godzin. Upewnij się, że podsumowanie jest poprawne, a następnie dodaj do harmonogramu. W oprogramowaniu do analizy komórek na żywo wybierz opcję Widok u góry ekranu.

Z menu Vessel Name (Nazwa statku) przejdź do zakończonego 24-godzinnego skanowania i kliknij dwukrotnie nazwę statku. Wybierz ikonę Eksportuj obrazy i filmy po lewej stronie, a następnie opcję Jak wyświetlono. Wyróżnij interesujące Cię źródła, a następnie wybierz punkty zainteresowania w czasie i Serie obrazów w takiej postaci, w jakiej są wyświetlane.

Upewnij się, że typ sekwencji i skany są poprawne. Wybierz żądaną lokalizację folderu docelowego. Wybierz JPEG z menu rozwijanego, a następnie Eksportuj.

Otwórz oprogramowanie ImageJ i prześlij obraz testu rany na zadrapaniach. Wybierz opcję Obraz, a następnie wpisz 8-bitowy, aby zmienić obraz z 24-bitowego RGB. Wybierz Wtyczki, Makra, Zainstaluj Wound_healing_size wtyczkę, aby zainstalować wtyczkę Wound Healing Size.

Następnie ustaw promień okna wariancji na 20, wartość progową na 100, procent nasyconych pikseli na 0,001. Tak dla opcji Ustaw skalę globalną, a następnie kliknij przycisk OK. Sprawdź, czy zarysowany obszar jest obszarem rany i powtórz dla dodatkowych zadrapań. Na koniec oblicz procent gojenia się ran w obszarze zadrapania migrujących lub proliferujących komórek w ciągu 24 godzin, korzystając z równania pokazanego na ekranie.

Tutaj T0 to obszar w czasie zero godzin, a TC to obszar w godzinie zero, czterech godzinach, 12 godzinach lub 24 godzinach. Na tych obrazach pokazano wytwarzanie enteroidów i procedurę jednowarstwowego oznaczania ran pochodzących z enteroidów. Hodowla trójwymiarowych, niebędących ludzkimi enteroidami jelitowymi naczelnych służy do dysocjacji na dwuwymiarowe monowarstwy.

Monowarstwy wyhodowano do ponad 90% konfluencji w 24-dołkowej płytce, a następnie potraktowano HA35 lub PBS przez 24 godziny. Monowarstwy zostały następnie zarysowane za pomocą końcówki do pipety P200. Pokazano tutaj reprezentatywne obrazy HA35 w leczeniu kontrolnym monowarstw enteroidów naczelnych innych niż ludzie.

Obrazy uzyskano po godzinie zero, czterech godzinach, 12 godzinach i 24 godzinach po wykonaniu zadrapania końcówką do pipety P200. Wpływ HA35 na gojenie się ran i monowarstwy oidowe pokazano tutaj. Zmiana gojenia się ran w czasie w monowarstwach enteroidalnych zależy od stężenia HA35 w leczeniu.

HA35 znacznie przyspieszył gojenie się ran po czterech godzinach i 12 godzinach przy dawce 100 mikrogramów na mililitr i 200 mikrogramów na mililitr w porównaniu z kontrolą, ale tempo gojenia zbiegło się między zabiegami o 24 godziny. Jedną z najważniejszych rzeczy, o których należy pamiętać przy tej procedurze, jest to, że monowarstwy jelit enteroidalnych są krótkotrwałe. Tak więc, gdy są one w 90% spójne, badacze powinni starać się je szybko wykorzystać.

Technika ta stała się naszym ulubionym modelem regeneracji przedwczesnych jelit in vitro, zwłaszcza jeśli interesują nas urazy bardziej mechaniczne, a nie zapalne.