Name: Wpływ kwasu hialuronowego 35 kDa na model in vitro przedwczesnego uszkodzenia jelita cienkiego i gojenie za pomocą monowarstw pochodzących z enteroidu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Poznaj metodę scratch wound assay na monowarstwach pochodzących z enteroidów jelita cienkiego do badania regeneracji jelit u wcześniaków. Technika umożliwia wizualizację gojenia ran w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta treść jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie reprezentuje oficjalne poglądy National Institutes of Health. HC jest wspierany przez P20GM134973 grantowe z National Institutes of Health. KB jest wspierany przez granty Fundacji Szpitala Dziecięcego (CHF) i Fundacji Zdrowia Prezbiteriańskiego (PHF). Usługi obrazowania żywych komórek świadczone przez Cancer Functional Genomics były częściowo wspierane przez National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 oraz National Cancer Institute Grant P30CA225520 of the National Institutes of Health, przyznany University of Oklahoma Health Sciences Center Stephenson Cancer Center.

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt w niniejszym badaniu zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Oklahoma Health Sciences Center. Po uzyskaniu zgody instytucjonalnej, próbki jelita cienkiego płodu pobrane w sposób wygodny od przedwcześnie urodzonego naczelnego (NHP, 90% okresu gestacji, pawian oliwkowy, Papio anubis) zostały pozyskane po eutanazji przeprowadzonej na potrzeby oddzielnego badania (Protokół nr 101523-16-039-I)20.
1. Ustanowienie trójwymiarowych enteroidów jelitowych przedwcześnie urodzonych naczelnych
<ol>
	<li>Przygotowanie pożywek 
	UWAGA: Pożywki można przygotować do 1 tygodnia przed izolacją krypt, stosując standardową technikę aseptyczną. W przypadku komórek pierwotnych, jeśli jest to pożądane, zamiast antybiotyków o szerokim spektrum działania można zastosować penicylinę/streptomycynę (stężenie końcowe 1%).
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę do wzrostu ludzkich organoidów + Y-27632 (HOGMY), mieszając 50 mL podstawowej pożywki do wzrostu ludzkich organoidów z 50 mL suplementu do organoidów (Tabela materiałów). Dodać 200 µL antybiotyków o szerokim spektrum działania (stężenie końcowe 100 µg/mL) (Tabela materiałów) oraz Y-27632 (do stężenia końcowego 10 µM). Pozostawić na blacie w temperaturze pokojowej do ogrzania.</li>
		<li>Przygotować pożywkę do wzrostu ludzkich organoidów (HOGM), mieszając 50 mL podstawowej pożywki do wzrostu ludzkich organoidów z 50 mL suplementu do organoidów. Dodać 200 µL antybiotyków o szerokim spektrum działania (100 µg/mL). Pozostawić na blacie w temperaturze pokojowej do ogrzania. 
		UWAGA: Pożywka HOGM będzie stosowana podczas wymiany pożywek po pierwszych 2-3 dniach od pasażowania.</li>
		<li>Schłodzić 100 mL 1x fosforanu buforu soli (PBS) bez wapnia i magnezu do temperatury lodowej.</li>
		<li>Przygotować 50 mL buforu do płukania, łącząc 1x PBS bez wapnia i magnezu z 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Schłodzić do temperatury lodowej.</li>
		<li>Przygotować bufor do płukania DMEM-F12, dodając 1 mL antybiotyków o szerokim spektrum działania (100 µg/mL) do 500 mL DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F12 + bufor HEPES 15 mM). Przechowywać w temperaturze lodowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja i wysiew krypt 
	UWAGA: Hydrożel oparty na macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) musi pozostawać w lodzie przez cały czas trwania procedury. Procedura ta zakłada dostępność wystarczającej ilości tkanki do wypełnienia sześciu kopułek z hydrożelu ECM. Jeśli pobrano inną gęstość krypt, liczbę kopułek należy odpowiednio zmienić.
	<ol>
		<li>Rozmrozić 150 µL ekstraktu z błony podstawnej (BME) o zredukowanej zawartości czynników wzrostu (GFR) (wolnego od czerwieni fenolowej) przez noc w lodzie w temperaturze 2-8 °C.</li>
		<li>Inkubować płytkę polistyrenową 24-dołkową o płaskim dnie, traktowaną do hodowli tkankowych, w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez minimum 30 min przed użyciem.</li>
		<li>Po eutanazji NHP i pobraniu tkanek, wypłukać fragment jelita krętego z zanieczyszczeń za pomocą końcówki pipety 1000 µL, używając lodowatego 1x PBS w jednorazowej płytce Petriego. 
		UWAGA: Świeża tkanka musi zostać pobrana szybko i przechowywana w temperaturze lodowej, aby uzyskać zdrowe enteroidy.</li>
		<li>Przeciąć jelito kręte wzdłużnie na całej długości jelita i przemyć 3x lodowatym PBS. Posiekać tkankę na małe fragmenty (o długości około 2 mm) za pomocą sterylnych nożyczek nad 50 mL probówką stożkową zawierającą 15 mL lodowatego PBS, zaczynając od części segmentu jelita krętego najbliższej probówce.</li>
		<li>Użyć pipety serologicznej 10 mL, aby rozbić krypty poprzez pipetowanie w górę i w dół 5-10x. Pozostawić fragmenty tkanki do osadzenia się na dnie probówki, następnie usunąć nadosad i zastąpić go świeżym, lodowatym PBS. Powtarzać ten proces minimum 7-10x, aż nadosad będzie przejrzysty i wolny od zanieczyszczeń.</li>
		<li>Po uzyskaniu przejrzystości usunąć nadosad i resuspender krypty w 25 mL odczynnika do dysocjacji komórek. Umieścić probówkę na platformie kołyszącej przy 20 obr./min przez 15 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wyjąć probówkę z kołysarki, pozwolić komórkom osadzić się przez około 30 s do 1 min i usunąć nadosad. Dodać 10 mL lodowatego buforu do płukania. Pipetować w górę i w dół pipetą p1000, aby dalej dysocjować do pojedynczych krypt.</li>
		<li>Przefiltrować tkankę przez sitko komórkowe 70 µm do nowej probówki stożkowej 50 mL. Przepłukać oryginalną probówkę stożkową 50 mL za pomocą 10 mL lodowatego buforu do płukania i przefiltrować przez sitko 70 µm, aby upewnić się, że wszystkie krypty zostały usunięte z oryginalnej probówki. Powtarzać to płukanie tkanki łącznie 4x.</li>
		<li>Odwirować filtrat przy 300 x g przez 5 min w 4 °C i usunąć nadosad. Dodać 600 µL HOGMY i rozbić osad poprzez pipetowanie w górę i w dół pipetą 200 µL. Umieścić probówkę w lodzie, aż roztwór osiągnie temperaturę lodową. 
		UWAGA: Jeśli roztwór nie będzie lodowaty, kopułka nie utrzyma właściwej struktury po wysiewie. Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza podczas pipetowania kopułek z hydrożelu ECM, ponieważ pęcherzyki uniemożliwią prawidłowe przyleganie do dna płytki.</li>
		<li>Dodać 600 µL lodowatego hydrożelu ECM, aby zawiesić osad komórkowy i dobrze wymieszać pipetą 200 µL.</li>
		<li>Wyjąć płytkę 24-dołkową z inkubatora i umieścić ją na podgrzewaczu do płytek o temperaturze 37 °C. Pipetować 50 µL lodowatej mieszaniny HOGMY/hydrożelu ECM do środka 24 dołków płytki hodowlanej 24-dołkowej (50 µL na kopułkę).</li>
		<li>Po wysiewie pozostawić kopułki na podgrzewaczu do płytek 37 °C przez 1 min, aby umożliwić przyleganie do dna płytki. Ostrożnie odwrócić płytkę, upewnić się, że na dnie nie skropliła się woda, i umieścić odwróconą płytkę w inkubatorze w 37 °C i 5% CO2.</li>
		<li>Po 15 min odwrócić płytkę z powrotem i pipetować 750 µL HOGMY w temperaturze pokojowej do każdego dołka. 
		UWAGA: Pożywkę pipetować powoli po ściance dołków, uważając, aby nie zniszczyć nowo powstałej trójwymiarowej kopułki z hydrożelu ECM.</li>
		<li>Po wypełnieniu wszystkich dołków pożywką, umieścić płytkę w inkubatorze i wymieniać pożywkę co 3 dni na 750 µL HOGM. Pasażować enteroidy co 7-10 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pasażowanie enteroidów jelitowych 
	UWAGA: Poniższy protokół dotyczy jednej płytki hodowlanej 24-dołkowej zawierającej enteroidy NHP przy stopniu rozcieńczenia 1:2.
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę z enteroidami z każdego dołka, uważając, aby nie zniszczyć kopułki ECM zawierającej enteroidy, dodać 500 µL lodowatego odczynnika do dysocjacji komórek do każdego dołka za pomocą pipety 1000 µL i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 min.</li>
		<li>Mechanicznie rozbić ECM poprzez pipetowanie w górę i w dół 8-12x. Przenieść zawartość 12 dołków do jednej probówki stożkowej 15 mL.</li>
		<li>Po zebraniu całego roztworu z płytki hodowlanej 24-dołkowej, dodać 250 µL odczynnika do rozbijania komórek do każdego dołka, aby upewnić się, że wszystkie enteroidy NHP zostały usunięte z każdego dołka, dodając to ostatnie płukanie do istniejących probówek stożkowych 15 mL.</li>
		<li>Umieścić na platformie kołyszącej przy 40 obr./min przez 15 min w temperaturze pokojowej (20 °C). Alternatywnie, wstrząsać probówkami ręcznie przez 15 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Po 15 min odwirować przy 300 x g przez 5 min w 4 °C. Usunąć nadosad z probówek 15 mL, aż pozostanie tylko osad.</li>
		<li>Dodać 8 mL lodowatego DMEM + antybiotyków o szerokim spektrum działania do jednej probówki stożkowej 15 mL, upewniając się, że osad został wystarczająco rozbity. Odwirować przy 300 x g przez 5 min w 4 °C i odrzucić nadosad.</li>
		<li>Dodać 600 µL HOGMY i rozbić osad poprzez pipetowanie w górę i w dół pipetą 1000 µL. Umieścić probówkę w lodzie, aż roztwór osiągnie temperaturę lodową. Gdy roztwór będzie lodowaty, dodać 600 µL lodowatego ECM, aby zawiesić osad komórkowy i dobrze wymieszać pipetą 1000 µL. Powtórzyć kroki 1.3.2.-1.3.7. dla pozostałych 12 dołków.
		<ol>
			<li>W pozostałych krokach należy odnieść się do kroków 1.2.11.-1.2.16.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Tworzenie monowarstwy enteroidów i testy gojenia rany (scratch assay)
<ol>
	<li>Przygotowanie mediów i substancji do traktowania
	<ol>
		<li>Schłodzić 5 mL PBS bez wapnia i magnezu do temperatury lodowej.</li>
		<li>Przygotować bufor płuczący DMEM-F12, dodając 1 mL antybiotyków o szerokim spektrum działania (100 µg/mL) do 500 mL DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F12 + bufor HEPES 15 mM). Przechowywać w temperaturze lodowej.</li>
		<li>Przygotować 100 mL HOGMY zgodnie z opisem w kroku 1.1.1. i ogrzać na blacie do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Ogrzać 25 mL 0,25% trypsyny z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przygotować stężenia HA35 wynoszące 50 µg/mL, 100 µg/mL i 200 µg/mL do traktowania komórek, używając sterylnego PBS bez wapnia i magnezu jako rozpuszczalnika. Do końcowego rozcieńczenia HA35 należy użyć HOMGY jako rozpuszczalnika. 
		UWAGA: Przygotowanie HA35 może wymagać kilku rozcieńczeń, ponieważ HA35 często wytrąca się z roztworu przy stężeniu wyższym niż 5 mg/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie monowarstwy enteroidów 
	UWAGA: Poniższa procedura podaje objętości wystarczające do wytworzenia monowarstw enteroidów na jednej płytce 24-dołkowej. Należy dostosować objętości do pożądanej liczby monowarstw.
	<ol>
		<li>Rozmrozić 96 µL hydrożelu BME na bazie ECM (bez czerwieni fenolowej) przez noc na lodzie w temperaturze 2-8 °C. Rozcieńczyć hydrożel na bazie ECM w lodowatym PBS bez wapnia i magnezu w stosunku 1:50. Pokryć każdy dołek płytki hodowlanej 24-dołkowej 200 µL lodowatego rozcieńczonego hydrożelu na bazie ECM.</li>
		<li>Inkubować płytkę pokrytą hydrożelem na bazie ECM przez minimum 1 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Odessać medium z płytki hodowlanej 24-dołkowej zawierającej 3D enteroidy przeznaczone do monowarstw i zastąpić je 500 µL odczynnika do dysocjacji komórek na dołek.</li>
		<li>Ręcznie rozbić kopułki hydrożelu na bazie ECM poprzez 8-12 krotne pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieść zawartość 12 dołków do probówki stożkowej 15 mL.</li>
		<li>Przepłukać 12 pustych dołków 250 µL odczynnika do dysocjacji komórek, aby upewnić się, że wszystkie enteroidy zostały usunięte, i przenieść zawartość do probówki stożkowej 15 mL. Powtórzyć kroki 2.2.5. i 2.2.6. dla pozostałych 12 dołków, używając drugiej probówki stożkowej 15 mL.</li>
		<li>Wirować probówki stożkowe przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C i odrzucić nadsącz. Dodać 10 mL lodowatego buforu płuczącego DMEM-F12 do probówek stożkowych 15 mL i zawiesić osady enteroidów poprzez odwracanie probówek. Wirować przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usunąć nadsącz i resuspendować osady komórkowe w 12 mL trypsyny-EDTA o temperaturze 37 °C. Umieścić probówki w łaźni wodnej 37 °C na 10 min lub do momentu, aż komórki wydadzą się rozpuszczalne. Dodać 3 mL buforu płuczącego DMEM-F12 do każdej probówki, aby rozcieńczyć trypsynę-EDTA, wymieszać poprzez odwracanie probówek i umieścić na lodzie.</li>
		<li>Przefiltrować zdysocjowane enteroidy przez sito komórkowe o oczkach 37 µM, zbierając zawartość do czystych probówek stożkowych 15 mL. Wirować probówki przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Podczas wirowania komórek wyjąć z inkubatora płytkę pokrytą hydrożelem na bazie ECM i odessać nadmiar roztworu hydrożelu na bazie ECM, uważając, aby nie porysować pokrytej powierzchni i nie dopuścić do całkowitego wyschnięcia płytki.</li>
		<li>Usunąć nadsącz z probówek stożkowych i resuspendować osady komórkowe w 6 mL HOMGY. Dodać 500 µL połączonej zawiesiny komórkowej w 12 mL HOMGY do każdego dołka płytki 24-dołkowej pokrytej hydrożelem na bazie ECM przy gęstości siewu wynoszącej około 3 x 105 komórek/dołek. Zakręcić płytkę z zamkniętą pokrywą, aby zapewnić równomierne rozłożenie komórek w dołkach.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2, wymieniając medium HOMGY co 2 dni, aż monowarstwy osiągną &gt;90% konfluencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Traktowanie monowarstwy i test rany zarysowanej
	<ol>
		<li>Gdy monowarstwy osiągną &gt;90% konfluencji, odessać medium, aby usunąć komórki, które nie przyrosły. Traktować komórki 500 µL HA35 (50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL) lub PBS rozpuszczonego w HOMGY przez 24 h.</li>
		<li>Po 24 h usunąć medium, uważając, aby nie naruszyć powierzchni monowarstwy. Używając końcówki do pipety 200 µL, wykonać liniowe zarysowanie przez całą średnicę powierzchni monowarstwy w każdym dołku, uważając, aby monowarstwy nie wyschły.</li>
		<li>Przepłukać zarysowane monowarstwy 1x 500 µL 1x PBS. Dodać 500 µL HA35 (50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL) lub PBS rozpuszczonego w HOMGY i przenieść płytkę do instrumentu do analizy żywych komórek (Tabela materiałów) w inkubatorze 37 °C i 5% CO2.</li>
		<li>Pod ikoną Schedule w oprogramowaniu do analizy żywych komórek (Tabela materiałów) kliknąć ikonę Launch Add New Vessel Wizard i ustawić częstotliwość skanowania na skanowanie harmonogramowane. Utworzyć nowe naczynie typu Whole Well w sekcji Scan Type, określić ustawienia skanowania (np. Phase dla Image Channels oraz 4x dla Objective) i kliknąć Next.</li>
		<li>Wybrać producenta płytki i numer katalogowy z dostarczonej listy. Pod ikoną Schedule wybrać symbol plus w miejscu, gdzie płytka zostanie umieszczona w instrumencie do analizy żywych komórek. Wybrać pożądany Scan Pattern, a następnie utworzyć mapę płytki, wybierając „+” na stronie Plate Layout. Wybrać Defer Analysis Until Later, a następnie ustawić Scanning Schedule co 4 h przez 24 h i zweryfikować ustawienia akwizycji na stronie Vessel Wizard Summary. Na koniec wybrać Add to Schedule.</li>
		<li>Po zakończeniu 24-godzinnego testu, pod ikoną View icon kliknąć dwukrotnie Vessel Name i wyeksportować obrazy oraz filmy. Wybrać dołki i serię obrazów do wyświetlenia i eksportu jako JPEG. Przeanalizować obrazy pod kątem procentowego gojenia rany, korzystając z wtyczki Wound Healing Size Plugin dla ImageJ21, zgodnie z krokiem 2.4. poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza rany zarysowanej
	<ol>
		<li>Otworzyć oprogramowanie ImageJ. Przesłać obrazy z testu rany zarysowanej (.TIFF lub .JPG).</li>
		<li>Wybrać Image &gt; Type &gt; 8-bit, aby zmienić obraz z 24-bitowego RGB na 8-bitowy. Zainstalować wtyczkę Wound Healing Size Plugin, wybierając Plugins &gt; Macros &gt; Install &gt; Wound Healing Size Plugin.</li>
		<li>Obrócić obraz tak, aby zarysowanie było pionowe, i zainicjować wtyczkę Wound Healing Size Tool.</li>
		<li>Wybrać parametry wtyczki w oknie dialogowym, aby jak najlepiej dopasować je do rany zarysowanej. Ustawić wartości parametrów dla opcji wielkości gojenia rany następująco: Variance Window Radius na 20, wartość Threshold na 100, Percentage of Saturated Pixels na 0.001 oraz wybrać Yes dla Set Scale Global. Zatwierdzić wybór, klikając przycisk OK . Sprawdzić, czy wybrany obszar jest obszarem rany. Powyższe parametry mogą wymagać standaryzacji w zależności od laboratorium.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 2.4.2.-2.4.4. dla pozostałych punktów czasowych dla każdego zarysowania.</li>
		<li>Obliczyć procent gojenia powierzchni zarysowania przez migrujące lub proliferujące komórki w ciągu 24 h w następujący sposób: 
		% Gojenia rany = <img alt="Wzór obliczania zmiany temperatury, \(\frac{(T_0-T_C)}{T_0} \times 100\), równanie matematyczne." src="/files/ftp_upload/63758/63758eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
		gdzie T0 = % powierzchni w czasie 0 h, a Tc = % powierzchni w 0 h, 4 h, 12 h lub 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lemons, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+low+birth+weight+outcomes+of+the+National+Institute+of+Child+Health+and+Human+Development+Neonatal+Research+Network%2C+January+1995+through+December+1996%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996.</a> Pediatrics. 107 (1), 1(2001).</li>
<li>Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+composition%2C+digestion%2C+and+absorption+differences+among+neonatal+feeding+strategies%3A+Potential+implications+for+intestinal+inflammation+in+preterm+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants.</a> Nutrients. 13 (2), 550(2021).</li>
<li>Duffy, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+mediating+bacterial+translocation+in+the+immature+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine.</a> The Journal of Nutrition. 130, 2S Suppl 432-436 (2000).</li>
<li>Nanthakumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+excessive+intestinal+inflammation+in+necrotizing+enterocolitis%3A+An+immature+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response.</a> PLoS One. 6 (3), 17776(2011).</li>
<li>Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+the+developing+human+intestine%3A+A+possible+pathophysiologic+contribution+to+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).</li>
<li>He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+components+modulate+toll-like+receptor-mediated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation.</a> Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).</li>
<li>Walker, W. A., Iyengar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+milk%2C+microbiota%2C+and+intestinal+immune+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis.</a> Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).</li>
<li>Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+enteral+supplementation+of+a+prebiotic+mixture+of+non-human+milk+galacto-%2C+fructo-+and+acidic+oligosaccharides+on+intestinal+permeability+in+preterm+infants%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants.</a> British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).</li>
<li>vanden Berg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+glutamine-enriched+enteral+nutrition+on+intestinal+permeability+in+very-low-birth-weight+infants%3A+A+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parenteral+and+Enteral+Nutrition%22%5BJournal%5D)">The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial.</a> Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).</li>
<li>Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+immunoglobulin+for+preventing+necrotizing+enterocolitis+in+preterm+and+low+birth+weight+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).</li>
<li>Maffei, D., Schanler, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+is+the+feeding+strategy+to+prevent+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Perinatology%22%5BJournal%5D)">Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).</li>
<li>Patel, A. L., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+and+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human milk and necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).</li>
<li>Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+immunomodulating+components+of+maternal+breast+milk+and+protection+against+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis.</a> Nutrients. 12 (1), 14(2019).</li>
<li>Hill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+hyaluronan+enhances+innate+defense+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).</li>
<li>Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glycosaminoglycans+in+protection+from+neonatal+necrotizing+enterocolitis%3A+A+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review.</a> Nutrients. 12 (2), 546(2020).</li>
<li>Chaaban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+small+intestine+development+and+remodeling+of+the+microbiome+following+hyaluronan+35+kDa+treatment+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice.</a> Nutrients. 13 (6), 2030(2021).</li>
<li>Gunasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+35+kDa+enhances+epithelial+barrier+function+and+protects+against+the+development+of+murine+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis.</a> Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).</li>
<li>Montenegro-Miranda, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+organoid+model+of+damage+and+repair+identifies+HNF4%CE%B1+as+a+critical+regulator+of+intestinal+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4α as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).</li>
<li>Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+regeneration+ability+of+Crohn%27s+disease+assessed+using+patient-derived+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013(2021).</li>
<li>Gurung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Zika+virus+%28ZIKV%29+infection+following+vaginal+inoculation+with+ZIKV-infected+semen+in+timed-pregnant+olive+baboons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons.</a> Journal of Virology. 94 (11), 00058(2020).</li>
<li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).</li>
<li>Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cell+migration+monitoring+to+analyze+drug+synergism+in+the+scratch+assay+using+the+IncuCyte+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system.</a> Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).</li>
<li>de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+milk+nutrients+driving+intestinal+epithelial+layer+maturation+via+Wnt+and+Notch+signaling%3A+Implications+for+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229(2021).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+protects+epithelial+cells+from+excessive+autophagy+and+apoptosis+in+experimental+neonatal+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis.</a> PLoS One. 8 (7), 69620(2013).</li>
<li>Kessler, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+role+of+35+kilodalton+hyaluronan+in+promoting+defense+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).</li>
<li>Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan%3A+Its+nature%2C+distribution%2C+functions+and+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover.</a> Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+35kDa+treatment+protects+mice+from+Citrobacter+rodentium+infection+and+induces+epithelial+tight+junction+protein+ZO-1+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo.</a> Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).</li>
<li>Prehm, P., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+hyaluronan+export+from+human+fibroblasts+by+inhibitors+of+multidrug+resistance+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters.</a> Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).</li>
<li>Stenson, W. F., Ciorba, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmicrobial+activation+of+TLRs+controls+intestinal+growth%2C+wound+repair%2C+and+radioprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection.</a> Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510(2021).</li>
<li>Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+regulates+normal+intestinal+and+colonic+growth+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).</li>
<li>Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+and+TLR4+mediate+hyaluronic+acid+regulation+of+Lgr5%2B+stem+cell+proliferation%2C+crypt+fission%2C+and+intestinal+growth+in+postnatal+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).</li>
<li>Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific-sized+hyaluronan+fragments+promote+expression+of+human+beta-defensin+2+in+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).</li>
<li>Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+intestinal+epithelial+wound+healing+through+protease-activated+receptor-2+activation+in+Caco2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).</li>
<li>Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+accurate+quantification+of+cell+migration+using+human+small+intestine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering+Communications%22%5BJournal%5D)">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li>
<li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272(2020).</li>
<li>Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+organoids%3A+a+next-generation+tool+for+modeling+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+a+model+of+upper+small+intestinal+ion+transport+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia ani nie mają konfliktu interesów.

Przewód pokarmowy wcześniaka znajduje się pod ciągłą presją regeneracyjną spowodowaną powtarzającym się narażeniem na czynniki środowiskowe związane z dysbiozą, zapalnymi metabolitami bakteryjnymi i toksynami oraz przerywanym niedotlenieniem23,24. Niestety, nabłonek jelitowy wcześniaka nie jest w stanie szybko ustanowić integralności funkcjonalnej23, co skutkuje dysfunkcją bariery, zwiększoną przepuszczalnością jelit, a w ciężkich przypadk...

Martwicze zapalenie jelit (NEC) jest jednym z najczęstszych przypadków żołądkowo-jelitowych u wcześniaków1. Choroba charakteryzuje się ciężkim stanem zapalnym jelit, który może szybko ulec pogorszeniu do martwicy jelit, posocznicy i potencjalnie śmierci. Chociaż etiologia jest niejasna, dowody sugerują, że NEC jest wieloczynnikowy i jest wynikiem złożonej interakcji żerowania, nieprawidłowej kolonizacji bakteryjnej i niedojrzałego nabłonka jelitowego2,3. Wcześniaki mają zwiększoną przepuszczalność jelit, nieprawidłową kolonizację bakteryjną i niską zdolność regeneracyjną enterocytów4,5, co zwiększa ryzyko dysfunkcji bariery jelitowej, translokacji bakteryjnej i rozwoju NEC. Dlatego określenie strategii lub interwencji w celu przyspieszenia dojrzewania nabłonka jelitowego i promowania regeneracji lub gojenia nabłonka jelitowego ma kluczowe znaczenie w zapobieganiu tej śmiertelnej chorobie.
Badania wykazały, że mleko kobiece (HM) chroni przed NEC u wcześniaków6,7,8,9,10,11. Zarówno badania na ludziach, jak i na zwierzętach wykazały, że formuła na bazie bydła zwiększa przepuszczalność jelit i jest bezpośrednio toksyczna dla komórek nabłonka jelitowego2,12. Chociaż nie zostało to w pełni wyjaśnione, dowody sugerują, że ochronne działanie HM jest pośredniczone przez składniki bioaktywne, takie jak laktoferyna, immunoglobulina A (IgA) i oligosacharydy HM 13. HM jest również bogaty w hialuronian (HA), unikalnie niesiarczanowany glikozaminoglikan z powtarzającym się kwasem D-glukuronowym i disacharydami N-acetylo-D-glukozaminy14,15. Co ważne, wykazaliśmy, że doustny 35 kDa HA (HA35), naśladujący HM HA, łagodzi nasilenie uszkodzenia jelit, zapobiega translokacji bakteryjnej i zmniejsza śmiertelność w mysim modelu uszkodzenia jelit podobnego do NEC16,17.
Tutaj dalej badane są efekty HA35 na gojenie i regenerację jelit in vitro. Obecnie najpowszechniej stosowanym testem in vitro do leczenia i naprawy jelit jest test ran drapanych wykonywany w monowarstwach komórek raka jelita grubego (CRC). Fizjologiczne znaczenie takiego modelu dla jelita wcześniaków jest ograniczone, ponieważ gojenie ran w komórkach CRC opiera się w dużej mierze na wysoce proliferacyjnej naturze komórek rakowych, a nie na procesach naprawczych napędzanych komórkami macierzystymi18. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opisano tutaj ustanowienie modelu 2D rany brzusznej enteroidalnej, w tym procedurę izolacji i utrzymania pierwotnych enteroidów jelita cienkiego pochodzących z komórek macierzystych od wcześniaków naczelnych (NHP). Biorąc pod uwagę, że wcześniak NEC jest najczęściej zgłaszany w dystalnym jelicie cienkim, zastosowanie pierwotnych organoidów komórek nabłonkowych w modelu uszkodzenia i naprawy jelit zapewnia bardziej fizjologicznie przekładalny model in vitro w porównaniu z istniejącymi modelami wykorzystującymi tradycyjne monowarstwy jelita grubego18,19.

<table><tbody><tr><td>Pipeta serologiczna 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-49</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie 100x21mm, Nunclon Delta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Rurka stożkowa</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa, z powłoką TC, płaska płyta</td><td>denna Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>37 &micro; M Odwracalne sitko komórkowe</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Rurka stożkowa</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Sterylne sitka komórkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Albumina bydlęca (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Test żywotności komórek CellTiter-Glo 3D</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana mieszanka szynki Eagle's Modified Eagle's Medium / Nutrient F-12 (DMEM-F12) z 15 mM buforem HEPES</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>Delikatna komórka Odczynnik dysocjacyjny</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0485</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Incucyte S3 Przyrząd do analizy żywych komórek</td><td>Sartorius</td><td>4647</td><td></td></tr><tr><td>Moduł oprogramowania do analizy ran zadrapań Incucyte</td><td>Sartorius</td><td>9600-0012</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>06010</td><td>To jest HOGMY, ale bez Y-27632 i antybiotyków. Stosowany również jako baza dla HOGM, ale wtedy brakuje tylko antybiotyków.</td></tr><tr><td>Lipopolisacharydy z Escherichia coli O111:B4, oczyszczone metodą chromatografii z filtracją żelową</td><td>Millipore Sigma</td><td>L3012-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matryca membrany podstawnej, Phenol Red-Free</td><td></td><td>Corning 356231</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-treated, płaskodenna mikropłytka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), 1X [-] Wapń, magnez, pH 7,4</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>Jest to antybiotyk o szerokim spektrum działania</td></tr><tr><td>Hialuronian sodu, klasa badawcza, HA20K</td><td>Lifecore Biomedical</td><td>HA20K-1</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automatyczny licznik komórek Firma</td><td>: Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 1X, 0,25% trypsyny</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Technologie STEMCELL</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

wpływ kwasu hialuronowego 35 kda na model in vitro przedwczesnego uszkodzenia jelita cienkiego i gojenie za pomocą monowarstw pochodzących z enteroidu

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

Testy ran in vitro są powszechnie używane do badania mechanizmów i cech gojenia się nabłonka w różnych typach tkanek. W tym miejscu opisujemy protokół generowania dwuwymiarowej (2D) monowarstwy z trójwymiarowych (3D) enteroidów naczelnych innych niż człowiek pochodzących z krypt jelitowych końcowego odcinka jelita krętego. Te monowarstwy pochodzące z enteroidów zostały następnie wykorzystane w teście in vitro na ranach drapanych w celu przetestowania zdolności hialuronianu 35 kDa (HA35), naśladującego kwas hialuronowy w mleku ludzkim, do promowania migracji i proliferacji komórek wzdłuż krawędzi rany nabłonkowej. Po tym, jak monowarstwy zostały wyhodowane do zlewania się, zostały ręcznie zarysowane i poddane działaniu HA35 (50 μg/ml, 100 μg/mL, 200 μg/ml) lub kontrolnej (PBS). Migrację i proliferację komórek do szczeliny zobrazowano za pomocą mikroskopu światła przechodzącego wyposażonego w obrazowanie żywych komórek. Zamknięcie rany określono ilościowo jako procent gojenia się ran za pomocą wtyczki Wound Healing Size w ImageJ. Obszar zadrapania i szybkość migracji komórek oraz procent zamknięcia rany mierzono w ciągu 24 godzin. HA35 in vitro przyspiesza gojenie się ran w monowarstwach jelita cienkiego, prawdopodobnie poprzez połączenie proliferacji komórek na krawędzi rany i migracji do obszaru rany. Metody te mogą być potencjalnie wykorzystane jako model do badania regeneracji jelit w jelicie cienkim wcześniaków.

Wpływ HA na naprawę tkanek i gojenie ran w różnych tkankach i narządach jest dobrze udokumentowany; jednak specyficzne działanie HA o masie cząsteczkowej 35 kDa na gojenie i regenerację jelita cienkiego płodu lub noworodka jest obecnie nieznane. Aby przetestować zdolność HA35 do promowania gojenia ran w modelu jelita cienkiego płodu lub noworodka, wygenerowano trójwymiarowe enteroidy jelitowe z tkanki jelita krętego NHP, a następnie dysocjowano tę tkankę do pojedynczych komórek w celu stworzenia dwuwymiarowych monowarstw...

Ten protokół opisuje metodę zakładania i przeprowadzania testu ran drapanych na dwuwymiarowych (2D) monowarstwach pochodzących z trójwymiarowych (3D) enteroidów wyizolowanych z jelita krętego naczelnych innych niż ludzkie.

Wpływ kwasu hialuronowego 35 kDa na model in vitro przedwczesnego uszkodzenia jelita cienkiego i gojenie za pomocą monowarstw pochodzących z enteroidu

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

Protokół ten rozszerza bardzo powszechny test ran drapanych stosowany w badaniach regeneracji z monowarstwami pochodzącymi z enteroidów reprezentującymi wszystkie główne typy komórek jelita cienkiego. Technika ta umożliwia wizualizację zamknięcia rany w czasie rzeczywistym w jednowarstwowym modelu regeneracji jelit 2D z enteroidu. Nasza technika może być zastosowana do badania jelit wcześniaków ssaków, które są zazwyczaj słabo modelowane przy użyciu przekształconych linii komórkowych raka jelita grubego.Zacznij od rozmrożenia 96 mikrolitrów macierzy zewnątrzkomórkowej lub hydrożelu BME na bazie ECM przez noc na lodzie w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza. Rozcieńczyć hydrożel na bazie ECM i lodowaty PBS bez wapnia i magnezu w stosunku jeden do 50. Pokryć każdą studzienkę 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej 200 mikrolitrami lodowato rozcieńczonego hydrożelu na bazie ECM i inkubować powlekaną płytkę przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Następnie odessać pożywkę z 24-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej enteroidy 3D przeznaczone do monowarstw i zastąpić ją 500 mikrolitrami odczynnika do dysocjacji komórek na studzienkę. Ręcznie zakłócij kopułki hydrożelowe oparte na ECM, pipetując w górę i w dół od ośmiu do 12 razy i przenosząc zawartość 12 studzienek do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Umyj 12 pustych studzienek 250 mikrolitrami odczynnika do dysocjacji komórek, aby upewnić się, że wszystkie enteroidy zostały usunięte i przenieś zawartość do 15-mililitrowych stożkowych probówek.Odwirować stożkowe probówki o masie 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant. Dodaj 10 mililitrów lodowatego buforu do płukania DMEM/F-12 do stożkowych probówek i zawiesić granulki enteroidalne, odwracając probówki. Wirować przy 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant.Ponownie zawiesić granulki komórek w 12 mililitrach trypsyny-EDTA o temperaturze 37 stopni Celsjusza i umieścić probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut lub do momentu, gdy komórki będą rozpuszczalne. Dodaj trzy mililitry buforu do płukania DMEM/F-12 do każdej probówki, aby rozcieńczyć Trypsynę-EDTA. Wymieszaj, odwracając rurki i umieść na lodzie.Przefiltruj zdysocjowane enteroidy przez sitko do komórek o siatce 37 mikrometrów. Zbierz zawartość do czystych 15-mililitrowych stożkowych probówek i odwiruj probówki o wadze 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant ze stożkowych probówek i ponownie zawiesić granulki komórek sześcioma mililitrami HOMGY.Następnie wyjąć z inkubatora płytkę pokrytą hydrożelem na bazie ECM i odessać nadmiar roztworu hydrożelu na bazie ECM, nie rysując powlekanej powierzchni ani całkowicie wysuszając płytkę. Dodaj 500 mikrolitrów połączonej 12-mililitrowej zawiesiny komórek HOMGY do każdej studzienki 24-dołkowej płytki pokrytej hydrożelem na bazie ECM. Zakręć płytką z założoną pokrywką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek w studzienkach.Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, wymieniając pożywkę HOMGY co dwa dni, aż monowarstwy osiągną zbieżność większą niż 90%. Gdy monowarstwy osiągną konfluflurację większą niż 90%, odessaj pożywkę, aby usunąć wszelkie komórki, które nie mogą się przyczepić. Potraktuj komórki 500 mikrolitrami HA35 lub PBS rozpuszczonymi w HOMGY przez 24 godziny.Następnie usuń nośnik bez naruszania powierzchni monowarstwy. Używając końcówki do pipet o pojemności 200 mikrolitrów, wykonaj liniowe zadrapanie na całej średnicy powierzchni monowarstwy w każdym dołku, uważając, aby monowarstwy nie wyschły. Umyj porysowane monowarstwy raz 500 mikrolitrami 1X PBS i dodaj 500 mikrolitrów HA35 lub PBS rozpuszczonych w HOMGY.Przenieś płytkę do przyrządu do analizy żywych komórek w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pod ikoną Harmonogram w oprogramowaniu do analizy komórek na żywo kliknij ikonę Uruchom kreatora dodawania nowego statku. Wybierz opcję Skanuj zgodnie z harmonogramem, a następnie kliknij przycisk Dalej.Wybierz Nowy w obszarze Utwórz naczynie i kliknij Dalej, a następnie wybierz Cała studnia w obszarze Typ skanowania i kliknij Dalej. Wybierz Fazę dla kanałów obrazu i 4x dla obiektywu. Wybierz producenta tabliczki i numer katalogowy z podanej listy, a następnie kliknij przycisk Dalej.Wybierz lokalizację pustego naczynia, a następnie żądany wzór skanowania. Wprowadź nazwę blachy w polu Nazwa, a następnie wybierz plus, aby utworzyć układ blachy. Wybierz mały plus, aby utworzyć nazwę zabiegu.Wprowadź krótką nazwę, a następnie OK. Zaznacz dołki płytkowe odpowiadające temu zabiegowi i naciśnij duży plus, aby oznaczyć dołki z tym zabiegiem. Wprowadź stężenie związku i kliknij przycisk OK. Po zakończeniu tworzenia płytki wybierz przycisk OK, Dalej. Wybierz pozycję Odłóż analizę na później, a następnie pozycję Utwórz nowy harmonogram ze skanowaniem w odstępach czterech godzin.Przerwij skanowanie po jednym dniu, zero godzin. Upewnij się, że podsumowanie jest poprawne, a następnie dodaj do harmonogramu. W oprogramowaniu do analizy komórek na żywo wybierz opcję Widok u góry ekranu.Z menu Vessel Name (Nazwa statku) przejdź do zakończonego 24-godzinnego skanowania i kliknij dwukrotnie nazwę statku. Wybierz ikonę Eksportuj obrazy i filmy po lewej stronie, a następnie opcję Jak wyświetlono. Wyróżnij interesujące Cię źródła, a następnie wybierz punkty zainteresowania w czasie i Serie obrazów w takiej postaci, w jakiej są wyświetlane.Upewnij się, że typ sekwencji i skany są poprawne. Wybierz żądaną lokalizację folderu docelowego. Wybierz JPEG z menu rozwijanego, a następnie Eksportuj.Otwórz oprogramowanie ImageJ i prześlij obraz testu rany na zadrapaniach. Wybierz opcję Obraz, a następnie wpisz 8-bitowy, aby zmienić obraz z 24-bitowego RGB. Wybierz Wtyczki, Makra, Zainstaluj Wound_healing_size wtyczkę, aby zainstalować wtyczkę Wound Healing Size.Następnie ustaw promień okna wariancji na 20, wartość progową na 100, procent nasyconych pikseli na 0,001. Tak dla opcji Ustaw skalę globalną, a następnie kliknij przycisk OK. Sprawdź, czy zarysowany obszar jest obszarem rany i powtórz dla dodatkowych zadrapań. Na koniec oblicz procent gojenia się ran w obszarze zadrapania migrujących lub proliferujących komórek w ciągu 24 godzin, korzystając z równania pokazanego na ekranie.Tutaj T0 to obszar w czasie zero godzin, a TC to obszar w godzinie zero, czterech godzinach, 12 godzinach lub 24 godzinach. Na tych obrazach pokazano wytwarzanie enteroidów i procedurę jednowarstwowego oznaczania ran pochodzących z enteroidów. Hodowla trójwymiarowych, niebędących ludzkimi enteroidami jelitowymi naczelnych służy do dysocjacji na dwuwymiarowe monowarstwy.Monowarstwy wyhodowano do ponad 90% konfluencji w 24-dołkowej płytce, a następnie potraktowano HA35 lub PBS przez 24 godziny. Monowarstwy zostały następnie zarysowane za pomocą końcówki do pipety P200. Pokazano tutaj reprezentatywne obrazy HA35 w leczeniu kontrolnym monowarstw enteroidów naczelnych innych niż ludzie.Obrazy uzyskano po godzinie zero, czterech godzinach, 12 godzinach i 24 godzinach po wykonaniu zadrapania końcówką do pipety P200. Wpływ HA35 na gojenie się ran i monowarstwy oidowe pokazano tutaj. Zmiana gojenia się ran w czasie w monowarstwach enteroidalnych zależy od stężenia HA35 w leczeniu.HA35 znacznie przyspieszył gojenie się ran po czterech godzinach i 12 godzinach przy dawce 100 mikrogramów na mililitr i 200 mikrogramów na mililitr w porównaniu z kontrolą, ale tempo gojenia zbiegło się między zabiegami o 24 godziny. Jedną z najważniejszych rzeczy, o których należy pamiętać przy tej procedurze, jest to, że monowarstwy jelit enteroidalnych są krótkotrwałe. Tak więc, gdy są one w 90% spójne, badacze powinni starać się je szybko wykorzystać.Technika ta stała się naszym ulubionym modelem regeneracji przedwczesnych jelit in vitro, zwłaszcza jeśli interesują nas urazy bardziej mechaniczne, a nie zapalne.

effect-hyaluronic-acid-35-kda-on-an-vitro-model-preterm-small

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film pokazuje rozwój choroby martwiczego zapalenia jelit w ludzkim modelu enteroidu noworodka, wywołanego leczeniem lipopolisacharydami. Model ten pomaga badać patofizjologię jelit.

Indukcja martwiczego zapalenia jelit w ludzkim nabłonkowym modelu enteroidalnym

Ten protokół opisuje pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym po leczeniu farmakologicznym w organoidach jelitowych człowieka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii żywych komórek.

Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

Enteroidy wyłaniają się jako nowy model w badaniach nad chorobami ludzkimi. Protokół opisuje, w jaki sposób symulować enteroidalny model ludzkiego martwiczego zapalenia jelit za pomocą leczenia lipopolisacharydami (LPS) enteroidów generowanych z tkanki noworodka. Pobrane enteroidy wykazują zmiany zapalne podobne do tych obserwowanych w ludzkim martwiczym zapaleniu jelit.

Nowy ludzki nabłonkowy enteroidalny model martwiczego zapalenia jelit

Organoidy jelitowe pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) oferują ekscytujące możliwości modelowania chorób jelitowych in vitro. Wykazano różnicowanie hiPSC w organoidy jelitowe (iHO), stymulację tych iHO cytokinami oraz mikroiniekcję Salmonella Typhimurium do światła iHO, umożliwiając badanie inwazji nabłonka przez ten patogen.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych organoidów jelitowych pochodzących z komórek macierzystych do badania i modyfikowania ochrony komórek nabłonka przed salmonellą i innymi patogenami

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Ten protokół opisuje model wierzchołkowego martwiczego zapalenia jelit (NEC) w naczyniu, wykorzystujący enteroidy jelita cienkiego z odwróconą polaryzacją, umożliwiającą dostęp do powierzchni wierzchołkowej. Zapewniamy protokół barwienia immunofluorescencyjnego w celu wykrycia przerwania nabłonka związanego z NEC oraz metodę określania żywotności enteroidów wierzchołkowych poddanych protokołowi NEC-in-a-dish.

In vitro Wierzchołkowy model enteroidalny martwiczego zapalenia jelit

Ten protokół szczegółowo opisuje tworzenie enteroidów, trójwymiarowego modelu jelitowego, z tkanki jelitowej płodu. Do charakterystyki modelu wykorzystano obrazowanie immunofluorescencyjne biomarkerów nabłonkowych. Wierzchołkowa ekspozycja lipopolisacharydów, endotoksyny bakteryjnej, przy użyciu techniki mikroiniekcji indukowała przepuszczalność nabłonka w sposób zależny od dawki, mierzoną przez wyciek dekstranu fluorescencyjnego.

Badanie przepuszczalności nabłonka w enteroidach pochodzących z tkanek płodowych

Tutaj opisujemy konstrukcję podstawowego, trójwymiarowego (3D) modelu linii komórkowej jelitowej oraz protokołu osadzania parafiny do mikroskopowej oceny stałych jelitowych odpowiedników. Barwienie wybranych białek umożliwia analizę wielu parametrów wzrokowych z jednego eksperymentu do potencjalnego wykorzystania w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków.

Podstawowy trójwymiarowy (3D) model jelitowy z komponentem odpornościowym

Ten protokół opisuje model in vitro martwiczego zapalenia jelit (NEC), który może być wykorzystany do mechanistycznych badań nad patogenezą choroby. Posiada chip mikroprzepływowy wysiany enteroidami jelitowymi pochodzącymi z ludzkiego jelita noworodka, komórek śródbłonka i mikrobiomu jelitowego noworodka z ciężkim NEC.

Mikroprzepływowy model martwiczego zapalenia jelit zawierający enteroidy jelitowe ludzkiego noworodka i mikrobiom dysbiotyczny

Ten protokół ma na celu ocenę biofunkcjonalnych, samoorganizujących się peptydów pod kątem adhezji komórek, morfologii organoidów i ekspresji genów poprzez barwienie immunologiczne. Wykorzystamy linię komórkową raka jelita grubego, aby zapewnić opłacalny sposób pozyskiwania organoidów do intensywnych testów.

Wytwarzanie i charakterystyka organoidów raka jelita grubego z linii komórkowej SW1222 w ultrakrótkiej, samoorganizującej się matrycy peptydowej

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D jelit bydlęcych z organoidów, oferując lepszy dostęp do badania interakcji gospodarz-patogen. Obejmuje on metody oceny integralności i funkcjonalności błony, rozwijając modele in vitro, które naśladują fizjologię przewodu pokarmowego bydła. Podejście to obiecuje znaczące korzyści biomedyczne i rolnicze, w tym ulepszone strategie leczenia.

Postępy w technologii organoidów bydlęcych z wykorzystaniem jednowarstwowych interfejsów jelita cienkiego i grubego

Poznaj metodę scratch wound assay na monowarstwach pochodzących z enteroidów jelita cienkiego do badania regeneracji jelit u wcześniaków. Technika umożliwia wizualizację gojenia ran w czasie rzeczywistym.

Wpływ kwasu hialuronowego 35 kDa na model in vitro przedwczesnego uszkodzenia jelita cienkiego i gojenie za pomocą monowarstw pochodzących z enteroidu (Wideo) | JoVE Journal

Wpływ kwasu hialuronowego 35 kDa na model in vitro przedwczesnego uszkodzenia jelita cienkiego i gojenie za pomocą monowarstw pochodzących z enteroidu

Przeglądaj więcej filmów