Izolacja, hodowla i charakterystyka pierwotnych komórek Schwanna, keratynocytów i fibroblastów z ludzkiego napletka

Skóra zawiera wiele typów komórek, w tym keratynocyty, fibroblasty i nerwowe komórki Schwanna. Protokół ten umożliwia izolację każdego z tych typów komórek do eksperymentów in vitro. Izolacja i założenie indywidualnych pierwotnych kultur komórkowych od jednego dawcy pozwala na solidne porównania i eksperymenty z kohodowlą, przy jednoczesnym złagodzeniu skutków zmienności genetycznej.

Dzięki temu protokołowi analiza poszczególnych komórek i ich interakcji pozwala na analizę roli komórek Schwanna w homeostazie i patofizjologii skóry. Te odrębne populacje komórek mogą być wykorzystywane do badania komórek Schwanna, fibroblastów lub keratynocytów pojedynczo lub w połączeniu w normalnej fizjologii skóry, gojeniu się ran lub w stanach chorobowych skóry. Jagadeeshaprasad M.G., doktor habilitowany w moim laboratorium, będzie mi pomagał w demonstrowaniu procedury.

Po uzyskaniu napletka noworodka zgodnie ze standardowymi procedurami pielęgnacyjnymi, wycięty napletek należy umieścić w probówce z mikrowirówką zawierającą od ośmiu do 10 mililitrów lodowatej pożywki podstawowej DMEM i natychmiast przetransportować napletek do laboratorium hodowli komórkowych w celu izolacji komórek. Dwukrotnie spłucz napletek 20 do 25 mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco lub DPBS, zawierającej antybiotyki i leki przeciwgrzybicze. Następnie namocz umytą skórę w 25 do 30 mililitrach lodowatego podłoża podstawowego DMEM w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowych.

Po 15 minutach rozetnij napletek za pomocą skalpela, aby odsłonić skórę właściwą i podskórną tkankę tłuszczową. Użyj kleszczy, ostrza skalpela i nożyczek, aby usunąć i wyrzucić podskórną tkankę tłuszczową. Następnie pokrój czysty napletek na trzy do pięciu mniejszych kawałków i inkubuj kawałki skóry w 16 do 20 mililitrach Dispace jedno podłoże DMEM w sterylnej stożkowej probówce.

Podczas pierwszych 30 minut inkubacji za pomocą Dispace należy z przerwami mieszać kawałki skóry w stożkowej probówce przez inwersję. Następnie umieść stożkową rurkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 16 do 18 godzin. Następnego dnia usuń kawałki skóry i umieść je na suchym, sterylnym naczyniu do hodowli i rozwiń każdy kawałek skóry tak, aby zewnętrzna warstwa naskórka dotykała naczynia hodowlanego.

Zaczynając od krawędzi tkanki, oderwij naskórek od skóry właściwej za pomocą dwóch zestawów kleszczy. Dodaj oddzielone fragmenty naskórka do pięciu mililitrów HBS w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym, aby inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie zebrać roztwór HBS w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów i dodać pięć mililitrów buforu neutralizującego trypsynę lub T i B do stożkowej probówki.

Odłóż rurkę na bok. Do fragmentów naskórka w naczyniu hodowlanym dodaj trzy mililitry roztworu trypsyny do inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po inkubacji delikatnie wymieszaj fragmenty naskórka kleszczami, aż roztwór keratynocytów trypsyny stanie się mętny.

Następnie dodaj roztwór keratynocytów trypsyny do probówki HBS T i B. Po rozpuszczeniu niestrawionych fragmentów naskórka roztworem trypsyny EDTA, dodaj dwa mililitry FBS do probówki HBS T i B zawierającej roztwór trypsyny EDTA i odwiruj te dwa roztwory około 870 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w trzech mililitrach kompletnej pożywki wzrostowej keratynocytu, a następnie przeprowadzić filtrację zawiesiny komórek za pomocą sterylnego filtra 100 mikrometrów do sterylnej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

Po ilościowym określeniu liczby komórek i żywotności komórek, wysiewaj komórki na płytkach hodowlanych, aby umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Po dwóch dniach odessaj nieprzylegające komórki i odświeżaj pożywkę do hodowli komórkowych co drugi dzień, aż keratynocyty osiągną 50 do 80% konfluencji w celu pasażowania lub dalszych eksperymentów. Wstępnie pokryj kolby T25 poli-l-lizyną lub PLL, używając pięciu mililitrów DPBS i umieść wstępnie powlekane kolby w temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy godziny.

Następnie dwukrotnie umyć matrycę powłoki PLL za pomocą DPBS. Po umyciu izolowanych fragmentów skóry właściwej pięcioma mililitrami podłoża podstawowego DMEM, zmielić skórę właściwą na małe kawałki nożyczkami. Strawić zmieloną skórę właściwą pięcioma mililitrami kolagenazy w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie i pół godziny, z delikatnym miareczkowaniem za pomocą końcówki pipety co 30 minut, aż skóra właściwa całkowicie się rozłączy.

Po strawieniu przefiltruj zawiesinę komórkową za pomocą sitka komórkowego o średnicy 70 mikrometrów, a następnie rozcieńcz przefiltrowaną zawiesinę komórkową pięcioma mililitrami kompletnej pożywki DMEM, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną kolagenazy. Następnie odwiruj zawiesinę komórkową w temperaturze 870 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawieś kartę do głosowania komórek w dwóch mililitrach kompletnego podłoża DMEM, aby podzielić komórki. Po powtórzeniu procesu centrowania zgodnie z opisem, odessać supernatant, aby użyć osadu komórkowego do wyizolowania komórek Schwanna lub fibroblastów.

Aby wyizolować komórki Schwana, ponownie zawieś osad komórkowy w pięciu mililitrach świeżej kompletnej pożywki DMEM i określ ilościowo liczbę komórek i żywotność przed wysiewem pięciu mililitrów zawieszonych komórek we wstępnie zakodowanych kolbach T25 o gęstości 4,0 razy 10 do trzech komórek na mililitr. Inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po 16 godzinach potwierdź adhezję komórek za pomocą mikroskopii przy 10-krotnym powiększeniu.

Następnie usuń nieprzylegające komórki i przemyj kolbę trzykrotnie pięcioma mililitrami DPBS. Następnie inkubuj komórki z pięcioma mililitrami 10-mikromolowego arabinozydu cytozyny w kompletnym pożywce DMEM. Po 24 godzinach odessać pożywkę zawierającą arabinozyd cytozyny przed przepłukaniem kolby, jak wykazano wcześniej.

Napełnij kolbę hodowlaną pięcioma mililitrami kompletnej pożywki hodowlanej z komórek Schwanna do inkubacji przez 48 godzin, jednocześnie odświeżając pożywkę co drugi dzień, aż komórki Schwanna osiągną 80% zbieżności. Aby wyizolować fibroblasty, ponownie zawieś zebrany osad w pięciu mililitrach kompletnego podłoża z fibroblastami. Hodowla komórek w niekodowanych kolbach hodowlanych T25 przez 24 godziny, jak wykazano dla komórek Schwanna.

Po odessaniu komórek nieprzylegających i umyciu kolby, inkubować komórki z pięcioma mililitrami świeżej pożywki z fibroblastami w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 48 godzin. Ponieważ izolowane komórki pierwotne były hodowane w odpowiednich pożywkach do hodowli komórkowych, pierwotne keratynocyty osiągnęły 85% konfluencji do siódmego dnia i wykazywały charakterystyczną morfologię komórek o brukowym kształcie. Komórki Schwanna osiągnęły 95% konfluencji w piątym dniu i wydawały się mieć kształt dwubiegunowy lub trójbiegunowy.

Kultury fibroblastów osiągnęły 95% konfluencji w czwartym dniu, a większość komórek wykazywała morfologię w kształcie wrzeciona. Barwienie immunofluorescencyjne potwierdziło ekspresję białek specyficznych dla typu komórki w kulturach komórkowych. Keratynocyty były dodatnie dla białka K10 i K14.

Połączone obrazy immunofluorescencji keratynowej i barwienia jądrowego DAPI wykazały czystość kultur komórkowych na poziomie 97,8%. Podobnie, komórki Schwanna były dodatnie dla S100 i P75 NTR i miały czystość 95,2% w hodowli. Fibroblasty wykazywały dodatnią ekspresję wimentyny, ale nie wykazywały ekspresji aktyny mięśni gładkich alfa, markera miofibroblastów.

Czystość kultury wynosiła około 97,2%Aby wzmocnić dowody Shanse'a, można użyć wstępnie powlekanego naczynia z poli-l-lizyny. Aby jeszcze bardziej złagodzić zanieczyszczenie włókniste, arabinozyd cytozyny i środek przeciwgrzybiczy dodano po dodaniu komórek przez krótki czas. Jest to prosta, niedroga procedura eksperymentalna polegająca na ustaleniu trzech pierwotnych komórek, takich jak komórki Shwanna, keratynocyty i fibroblasty, z jednej ludzkiej przedniej skóry.

Protokół ten jest idealny do eksperymentów in vitro obejmujących komunikację komórkową lub przesłuchy między typami komórek.