Name: Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Poznaj techniki mikroskopowe do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych. Protokół obejmuje przygotowanie próbek, mikroskopię elektronową i symbiotyczne kiełkowanie nasion.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za dofinansowanie od FAEPEX i FAPESP (2015/26479-6). MPP dziękuje Capesowi za stypendium magisterskie (proces 88887.600591/2021-00) i CNPq. JLSM dziękuje CNPq za granty na produktywność (303664/2020-7). Autorzy dziękują również za dostęp do sprzętu i pomocy zapewnionej przez LME (Laboratorium Mikroskopii Elektronowej - IB/Unicamp), INFABiC (Narodowy Instytut Nauki i Technologii Fotoniki Stosowanej w Biologii Komórki - Unicamp) oraz LaBiVasc (Laboratorium Biologii Naczyniowej - DBEF/IB/Unicamp); LAMEB (UFSC) i Eliana de Medeiros Oliveira (UFSC) za wkład w protokół krioprotekcji; LME za wkład w protokół TEM.

<ol><li>Evert, R. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvert%2C+RF+%22Esau%E2%80%99s+Plant+Anatomy%3A+Meristems%2C+Cells%2C+and+Tissues+of+the+Plant+Body%3A+Their+Structure%2C+Function%2C+and+Development%22">Esau’s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development</a>. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. (2006).</li>
<li>Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYeung%2C+ECT+%22Plant+Microtechniques+and+Protocols%22">Plant Microtechniques and Protocols</a>. , Springer International Publishing. Cham, Switzerland. (2015).</li>
<li>Sokoloff, D. D., Jura-Morawiec, J., Zoric, L., Fay, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+anatomy%3A+at+the+heart+of+modern+botany%5BTitle%5D)+AND+%22Botanical+Journal+of+the+Linnean+Society%22%5BJournal%5D)">Plant anatomy: at the heart of modern botany.</a> Botanical Journal of the Linnean Society. 195 (3), 249-253 (2021).</li>
<li>Leake, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+myco-heterotrophic+%28%E2%80%98saprophytic%E2%80%99%29+plants%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The biology of myco-heterotrophic (‘saprophytic’) plants.</a> New Phytologist. 127 (2), 171-216 (1994).</li>
<li>Bidartondo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+ecology+of+myco-heterotrophy%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The evolutionary ecology of myco-heterotrophy.</a> New Phytologist. 167 (2), 335-352 (2005).</li>
<li>Imhof, S., Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. Subterranean morphology and mycorrhizal structures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aImhof%2C+S+%22Mycoheterotrophy%22">Mycoheterotrophy</a>. , Springer. New York, NY. 157-214 (2013).</li>
<li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchid+mycorrhiza%3A+implications+of+a+mycophagous+life+style%5BTitle%5D)+AND+%22Oikos%22%5BJournal%5D)">Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style.</a> Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).</li>
<li>Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jersáková, J., Těšitelová, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+and+seedling+establishment+in+orchids%3A+a+complex+of+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements.</a> Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).</li>
<li>Zettler, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terrestrial+orchid+conservation+by+symbiotic+seed+germination%3A+techniques+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Selbyana%22%5BJournal%5D)">Terrestrial orchid conservation by symbiotic seed germination: techniques and perspectives.</a> Selbyana. 18 (2), 188-194 (1997).</li>
<li>Stewart, S. L., Kane, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiotic+seed+germination+and+evidence+for+in+vitro+mycobiont+specificity+in+Spiranthes+brevilabris+%28Orchidaceae%29+and+its+implications+for+species-level+conservation%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Plant%22%5BJournal%5D)">Symbiotic seed germination and evidence for in vitro mycobiont specificity in Spiranthes brevilabris (Orchidaceae) and its implications for species-level conservation.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 43 (3), 178-186 (2007).</li>
<li>Zhao, D. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchid+reintroduction+based+on+seed+germination-promoting+mycorrhizal+fungi+derived+from+protocorms+or+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Orchid reintroduction based on seed germination-promoting mycorrhizal fungi derived from protocorms or seedlings.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 701152(2021).</li>
<li>Selosse, M. A., Roy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+plants+that+feed+on+fungi%3A+facts+and+questions+about+mixotrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Green plants that feed on fungi: facts and questions about mixotrophy.</a> Trends in Plant Science. 14 (2), 64-70 (2009).</li>
<li>Merckx, V. S. F. T., Mennes, C. B., Peay, K. G., Geml, J. Evolution and diversification. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMerckx%2C+VSFT+%22Mycoheterotrophy%3A+The+Biology+of+Plants+Living+on+Fungi%22">Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi</a>. , Springer. New York, NY. 215-244 (2013).</li>
<li>Boon, M. E., Drijver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+Cytological+Staining+Techniques%3A+Theoretical+Background+and+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22Macmillan+International+Higher+Education%22%5BJournal%5D)">Routine Cytological Staining Techniques: Theoretical Background and Practice.</a> Macmillan International Higher Education. , Hampshire, UK. (1986).</li>
<li>Karnovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 27 (2), 137-138 (1964).</li>
<li>Hayat, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayat%2C+M+%22Fixation+for+Electron+Microscopy%22">Fixation for Electron Microscopy</a>. , Academic Press. New York, USA. (1981).</li>
<li>Roland, J. C., Vian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+preparation+and+staining+of+thin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Electron+Microscopy+of+Plant+Cells%22%5BJournal%5D)">General preparation and staining of thin sections.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. 1, 675(1991).</li>
<li>Gerrits, P. O., Horobin, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycol+methacrylate+embedding+for+light+microscopy%3A+basic+principles+and+trouble-shooting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Glycol methacrylate embedding for light microscopy: basic principles and trouble-shooting.</a> Journal of Histotechnology. 19 (4), 297-311 (1996).</li>
<li>Zhang, Z., Niu, L., Chen, X., Xu, X., Ru, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+plant+cryosection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Improvement of plant cryosection.</a> Frontiers in Biology. 7 (4), 374-377 (2012).</li>
<li>BeneŠ, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+media+improving+freeze-sectioning+of+plant+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">On the media improving freeze-sectioning of plant material.</a> Biologia Plantarum. 15 (1), 50-56 (1973).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), (2008).</li>
<li>Sakai, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+method+for+differential+staining+of+paraffin+embedded+plant+material+using+toluidine+blue+O%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">Simple method for differential staining of paraffin embedded plant material using toluidine blue O.</a> Stain Technology. 48 (5), 247-249 (1973).</li>
<li>O’Brien, T., Feder, N., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polychromatic+staining+of+plant+cell+walls+by+toluidine+blue+O%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O.</a> Protoplasma. 59 (2), 368-373 (1964).</li>
<li>Ventrella, M. C., Almeida, A. L., Nery, L. A., Coelho, V. P. deM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%A9todos+Histoqu%C3%ADmicos+Aplicados+%C3%A0s+Sementes%5BTitle%5D)+AND+%22Universidade+Federal+de+Vi%C3%A7osa%22%5BJournal%5D)">Métodos Histoquímicos Aplicados às Sementes.</a> Universidade Federal de Viçosa. , Viçosa, Brazil. (2013).</li>
<li>Pearse, A. G. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPearse%2C+AGE+%22Histochemistry%2C+Theoretical+and+Applied%22">Histochemistry, Theoretical and Applied</a>. , J & A Churchill. London, UK. (1960).</li>
<li>Andrade-Linares, D. R., Franken, P. Fungal endophytes in plant roots: taxonomy, colonization patterns, and functions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndrade-Linares%2C+DR+%22Symbiotic+Endophytes%22">Symbiotic Endophytes</a>. , Springer. Berlin. 311-334 (2013).</li>
<li>Wymer, C. L., Beven, A. F., Boudonck, K., Lloyd, C. W. Confocal microscopy of plant cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWymer%2C+CL+%22Confocal+Microscopy+Methods+and+Protocols%22">Confocal Microscopy Methods and Protocols</a>. , Humana Press. Totowa. 103-130 (1999).</li>
<li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+de+T%C3%A9cnicas+Aplicadas+%C3%A0+Histopatologia+Vegetal%5BTitle%5D)+AND+%22FEALQ%22%5BJournal%5D)">Manual de Técnicas Aplicadas à Histopatologia Vegetal.</a> FEALQ. , Piracicaba, Brazil. (2021).</li>
<li>Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+Phakopsora+euvitis+on+Vitis+vinifera%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera.</a> European Journal of Plant Pathology. 154 (4), 1185-1193 (2019).</li>
<li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugarcane+cell+wall-associated+defense+responses+to+infection+by+Sporisorium+scitamineum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 698(2018).</li>
<li>Jeffree, C. E., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient-and+low-temperature+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Electron+Microscopy+of+Plant+Cells%22%5BJournal%5D)">Ambient-and low-temperature scanning electron microscopy.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , 313-413 (1991).</li>
<li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBozzola%2C+JJ+%22Electron+Microscopy%3A+Principles+and+Techniques+for+Biologists%22">Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists</a>. , Jones & Bartlett Learning. Sudbury, MA, USA. (1999).</li>
<li>Murray, S. Basic transmission and scanning electron microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurray%2C+S+%22Introduction+to+electron+Microscopy+for+Biologists%22">Introduction to electron Microscopy for Biologists</a>. , Academic Press. 3-18 (2008).</li>
<li>Tanaka, M. Glossary of TEM terms. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/">https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/</a> (2021).</li>
<li>Seaton, P. T., et al. Orchid seed and pollen: a toolkit for long-term storage, viability assessment and conservation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSeaton%2C+PT+%22Orchid+Propagation%3A+From+Laboratories+to+Greenhouses%E2%80%94Methods+and+Protocols%22">Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses—Methods and Protocols</a>. , Humana Press. New York, NY. 71-98 (2018).</li>
<li>Otero, J. T., Ackerman, J. D., Bayman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+mycorrhizal+preferences+between+two+tropical+orchids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Differences in mycorrhizal preferences between two tropical orchids.</a> Molecular Ecology. 13 (8), 2393-2404 (2004).</li>
<li>Koch, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marasmioid+rhizomorphs+in+bird+nests%3A+Species+diversity%2C+functional+specificity%2C+and+new+species+from+the+tropics%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Marasmioid rhizomorphs in bird nests: Species diversity, functional specificity, and new species from the tropics.</a> Mycologia. 112 (6), 1086-1103 (2020).</li>
<li>Webster, J., Weber, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWebster%2C+J+%22Introduction+to+Fungi%22">Introduction to Fungi</a>. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).</li>
<li>Sisti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+non-mycorrhizal+fungi+in+germination+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1589(2019).</li>
<li>Martos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+recruitment+of+saprotrophic+fungi+as+mycorrhizal+partners+by+tropical+achlorophyllous+orchids%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids.</a> New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).</li>
<li>Alves, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+development+and+genetic+structure+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Reproductive development and genetic structure of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> BMC Plant Biology. 21 (1), 332(2021).</li>
<li>Merckx, V. S. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoheterotrophy%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoheterotrophy%3A+The+Biology+of+Plants+Living+on+Fungi%22%5BJournal%5D)">Mycoheterotrophy: an introduction.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 1-17 (2013).</li>
<li>Hall, J. L., Hawes, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHall%2C+JL+%22Electron+Microscopy+of+Plant+Cells%22">Electron Microscopy of Plant Cells</a>. , Academic Press. Cambridge, UK. (1991).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Analizy obrazowe w zakresie anatomii i morfologii roślin mają istotny potencjał, aby spełnić cele i pomóc w zrozumieniu relacji między roślinami mykoheterotroficznymi a ich niezbędnymi endofitami grzybów, jak wykazano w badaniach podziemnych organów 6,40, analizach strukturalnych symbiotycznego kiełkowania nasion39 oraz struktur powietrznych i rozrodczych41. Botanika strukturalna, mimo że w ostatniej dekadzie straci...

Badania strukturalne w botanice, obejmujące morfologię i anatomię roślin, są podstawowe dla zrozumienia całego organizmu1,2 oraz dostarczają niezbędnych perspektyw pozwalających na integrację i poszerzanie wiedzy dotyczącej ekologii, fizjologii, rozwoju i ewolucji roślin3. Metody morfologii i anatomii roślin obejmują obecnie protokoły, sprzęt i wiedzę opracowaną niedawno, jak i taką, która powstała ponad wiek temu2. Ciągłe stosowanie i adaptacja metod klasycznych (np. mikroskopii świetlnej) wraz z nowszymi technikami (np. mikroskopią konfokalną, mikrotomografią rentgenowską) opierają się na tej samej zasadzie: wiedzy teoretycznej umożliwiającej opracowanie metodologii.
Głównym narzędziem w anatomii i morfologii roślin jest obraz. Pomimo błędnego przekonania, że tego typu analizy są prostymi obserwacjami pozostawiającymi miejsce na subiektywne interpretacje2, analiza i zrozumienie obrazów w tej dziedzinie wymagają wiedzy o zastosowanych metodach (sprzęcie, rodzaju analizy, procedurach metodologicznych), komponentach komórkowych, histochemii oraz budowie rośliny (organizacji i funkcji tkanek, ontogenezie, adaptacjach morfologicznych). Interpretacja obrazów uzyskanych via różnymi metodami może prowadzić do korelacji formy i funkcji, odczytania składu chemicznego struktury, potwierdzenia opisów taksonów, zrozumienia infekcji fitopatogenami oraz innych tego rodzaju ocen.
Podczas badania roślin mykoheterotroficznych (MH)&#160;(tj. roślin niezdolnych do fotosyntezy, które pobierają węgiel z grzybów mikoryzowych4,5),&#160;analiza niezwykłych aspektów ich adaptacji strukturalnych, wzorców kolonizacji tkanek przez grzyby oraz morfoanatomii organów podziemnych może rzucić światło na ich strategie rozwojowe i relacje z hifami, będącymi źródłem składników odżywczych. Organy podziemne roślin MH zazwyczaj wykazują istotne adaptacje związane z ich asocjacją z grzybami glebowymi, dlatego niezbędne jest przeprowadzenie tych badań anatomicznych i morfologicznych6. Nie należy pomijać organów nadziemnych gatunków MH, ponieważ w tych tkankach mogą występować również endofity, nawet jeśli nie są one grzybami mikoryzowymi (obserwacje własne, nieopublikowane).
Poza dobrze udokumentowanym znaczeniem związku grzybów mikoryzowych z gatunkami MH w trakcie całego ich cyklu życiowego7, każdy gatunek storczyka, nawet te autotroficzne, przechodzi w środowisku naturalnym początkowy obligatoryjny etap mikoheterotrofii. Wynika to z faktu, że zarodek storczyka jest niezróżnicowany i pozbawiony endospermy lub liści zakiełkowych, przez co nie jest w stanie rozwijać się i zakorzeniać w środowisku naturalnym bez wsparcia odżywczego ze strony partnerów grzybowych4,8. Biorąc to pod uwagę, protokoły kiełkowania symbiotycznego można stosować nie tylko w odniesieniu do gatunków MH, ale również do storczyków fotosyntetyzujących, w celu zbadania specyficzności relacji storczyk-grzyb podczas kiełkowania i rozwoju protokormu, co jest szeroko stosowaną metodologią w inicjatywach na rzecz ochrony gatunków zagrożonych9,10,11.
W niniejszym zestawieniu metod opisujemy kluczowe etapy gromadzenia, utrwalania i przechowywania próbek roślin MH do badań anatomicznych (sekcja 1), analizy powierzchni i selekcji próbek (sekcja 2), metod skrawania (ręcznego: sekcja 3, mikrotomii: sekcja 4, kriomikrotomii: sekcja 5), barwienia i montowania (sekcja 6), mikroskopii fluorescencyjnej i konfokalnej endofitów grzybowych (sekcja 7), skaningowej mikroskopii elektronowej (sekcja 8) oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej (sekcja 9). Dodatkowo opisujemy metodę symbiotycznego kiełkowania nasion storczyków (MH i autotroficzne, sekcja 10), ponieważ wspomniane wcześniej metody obrazowania można z powodzeniem zastosować do analizy kolonizacji grzybowej nasion, protokormów i siewek w procesie kiełkowania.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63777/63777fig01.jpg" /> 
Rycina 1: Schematyczne podsumowanie metod obrazowania. Schematy wskazują kroki protokołu, w których są one szczegółowo opisane. Skróty: GMA = glicykolimetakrylan, OCT = optymalny związek do temperatury cięcia, SEM = skaningowa mikroskopia elektronowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63777/63777fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Technikom mikroskopowym opisanym tutaj szczegółowo (Rysunek 1) poprzedzają następujące kluczowe etapy: pobieranie, utrwalanie, odwadnianie, zatapianie i krojenie próbek. Ponieważ kroki te są zmienne (Rysunek 1) w zależności od wybranej techniki (lub technik), ważne jest wcześniejsze zaplanowanie procesu, biorąc pod uwagę fiksaty do przygotowania i transportu w miejsce pobierania próbek, sposób przygotowania próbek przed utrwaleniem, procesy odwadniania, które zostaną zastosowane (rozdział 1), a także różne możliwości zatapiania i metody krojenia (rozdziały 4, 5 i 9). Rysunek 1 przedstawia w kolejności wszystkie etapy wymagane dla każdej z technik mikroskopowych szczegółowo opisanych poniżej.

<table><tbody><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td> <td>(do montażu klocków SEM)</td></tr> <tr><td>Agar-agar (AA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td> <td>(do testów kiełkowania nasion)</td></tr> <tr><td>Calcofluor White Stain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18909</td><td>barwnik fluorescencyjny (wykrywa celulozę)</td></tr> <tr><td>Roztwór buforowy cytrynianu, 0,09 M pH 4,8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2488</td> <td>(do barwienia błękitem toluidyny O)</td></tr><tr><td>Przewodząca dwustronna taśma węglowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-285-81</td> <td>(dla SEM)</td></tr> <tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td></td> <td>(dowolny model)</td></tr> <tr><td>Siatki miedziane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4776</td> <td>(dla TEM)</td></tr> <tr><td>Suszarka punktu krytycznego</td><td>Balzers</td><td></td> <td>(dowolny model)</td></tr> <tr><td>Kriostat</td><td>Leica Biosystems</td><td></td> <td>(dowolny model)</td></tr> <tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>(= mikroskop stereoskopowy, dowolny model)</td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107960</td><td>medium do szybkiego montażu do mikroskopii</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy, czysty (&ge; 99,5%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>(= etanol, do procesów odwadniania)</td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu, 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>(do przygotowania roztworu NBF)</td></tr><tr><td>Roztwór formaliny, obojętny buforowany, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>histologicznego utrwalacza tkanki</td></tr><tr><td>Kapsułki żelatynowe do TEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-248-71</td><td>(do polimeryzacji żywicy w TEM)</td></tr><tr><td>Roztwór żelatyny, 2% w H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td> <td>(rozcieńczony do przygotowania szkiełek - przyleganie OCT)</td></tr><tr><td>Roztwór aldehydu glutarowego, 25%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td> <td>(dla Karnovsky' s przygotowanie roztworu)</td></tr><tr><td>HistoResin</td><td>Leica Biosystems</td><td>14702231731</td><td>zestaw do zatapiania metakrylanu glikolu (GMA)</td></tr><tr><td>Jod</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>207772</td><td>(do przygotowania płynu Lugola)</td></tr><tr><td>Azotan ołowiu(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228621</td><td>Pb(NO3)2 (do barwienia kontrastowego TEM)</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Olympus</td><td></td><td>(dowolny model)</td></tr><tr><td>LR Biała żywica akrylowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9774</td><td>hydrofilowa żywica akrylowa do TEM</td></tr><tr><td>Lugol roztwór</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62650</td> <td>(do barwienia)</td></tr><tr><td>Metalowe króćce do mocowania próbek</td><td>Rave Scientific</td><td></td> <td>(dla SEM, różne modele)</td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>ręczny mikrotom obrotowy lub inny model</td></tr><tr><td>Agar z płatków owsianych (OMA)</td><td>Millipore</td><td>O3506</td> <td>(do testów kiełkowania nasion)</td></tr><tr><td>Związek OCT, Tissue-Tek</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td>pożywka do zatapiania tkanek mrożonych Tetratlenek</td></tr><tr><td>osmu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201030</td><td>OsO4 (do postfiksacji TEM)</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td>uszczelniająca folia</td></tr> <tr><td>termoplastycznaParaformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>(dla Karnovsky'ego' s przygotowanie roztworu)</td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny, 0,1% w H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td> <td>(do przygotowania szkiełek - przyleganie OCT)</td></tr><tr><td>Szkiełka Poly-Prep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0425</td><td>szkiełka powlekane poli-L-lizyną Tacki</td></tr> na <tr><td>kubki z polietylenu</td><td>Polysciences</td><td>17177A-3</td> <td>(6x8x5 mm, do zanurzania próbek w żywicy GMA)</td></tr> <tr><td>Formowanie polietylenu Tacki na kubki</td><td>Polysciences</td><td>17177C-3</td><td>(13x19x5 mm, do zanurzania próbek w żywicy GMA)</td></tr><tr><td>Jodek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221945</td><td>(do przygotowania roztworu Lugola)</td></tr><tr><td>Agar z dekstrozą ziemniaczaną (PDA)</td><td>Milipor</td><td>70139</td><td>(do testów kiełkowania nasion)</td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>Jeol</td><td></td> <td>(dowolny model)</td></tr><tr><td>Silan [(3-aminopropyl)trietoksysilan]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td> <td>(do przygotowania preparatów - przyleganie OCT)</td></tr><tr><td>Preparaty silanowe Szkiełka</td><td>szklane Sigma-Aldrich</td><td>S4651</td><td>pokryte silanem</td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy pomarańczowy, granulowany</td><td>Supelco</td><td>10087</td> <td>(do procesów osuszania)</td></tr><tr><td>Kakodylan sodu trójwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td> <td>(do buforu kakodylanu aldehydu glutarowego)</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>NaOH (dla Karnovsky'ego' s przygotowanie roztworu i barwienie kontrastowe TEM)</td></tr><tr><td>Roztwór podchlorynu sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>425044</td><td>NaClO (do dezynfekcji powierzchni nasion)</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy, bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71640</td><td>Na2HPO4 (do roztworu NBF i preparatu PB)</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy jednowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>NaH2PO4&middot; H2O (dla NBF i PB)</td></tr><tr><td>Powlekarka do napylania</td><td>Balzers</td><td></td><td>(dowolny model)</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>C12H22O11 (do krioprotekcji i testu kiełkowania)</td></tr><tr><td>Sudan III</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4131</td><td>(do barwienia)</td></tr><tr><td>Sudan IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198102</td><td>(do barwienia)</td></tr><tr><td>Sudan Black B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199664</td><td>(do barwienia)</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td></td><td></td><td>(3 mL, dowolna marka, do barwienia kontrastowego TEM)</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy, Millex-GV 0,22 i mikro; m</td><td>Millipore</td><td>SLGV033R</td><td>PVDF, 33 mm, sterylizowany promieniami gamma (do barwienia kontrastowego TEM)</td></tr><tr><td>Tek Bond Super Glue 793</td><td>Tek Bond Saint-Gobain</td><td>78072720018</td><td>płynny klej cyjanoakrylowy, średnia lepkość</td></tr><tr><td>Błękit toluidynowy O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td> <td>(do barwienia)</td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>Jeol</td><td></td> <td>(dowolny model)</td></tr> <tr><td>Trifenylotetrazol chlorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8877</td> <td>(do testu tetrazolowego w kiełkowaniu nasion)</td></tr> <tr><td>Cytrynian trisodowy dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td>Na3(C6H5O7)&middot; 2H2O (do barwienia kontrastowego TEM)</td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>(dowolny model)</td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-607-645</td><td>UO2(CH3COO)2 (do barwienia kontrastowego TEM)</td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td> <td>(dowolny model)</td>Aglutynina <td></td><td></td></tr><tr><td>z kiełków pszenicy, Alexa Fluor 488 Conjugate</td><td>TermoFisher Scientific</td><td>W11261</td><td>lektyna sprzężona z barwnikiem fluorescencyjnym (wykrywa pozostałości kwasu sjalowego i N-acetyloglukozaminylu)</td></tr></tbody></table>

techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Botanika strukturalna to niezbędna perspektywa, aby w pełni zrozumieć ekologię, fizjologię, rozwój i ewolucję roślin. Podczas badań nad roślinami mykoheterotroficznymi (tj. roślinami, które pozyskują węgiel z grzybów), niezwykłe aspekty ich adaptacji strukturalnych, wzorce kolonizacji tkanek przez grzyby i morfoanatomia podziemnych narządów mogą oświecić ich strategie rozwojowe i relacje ze strzępkami, źródłem składników odżywczych. Inna ważna rola grzybów symbiotycznych jest związana z kiełkowaniem nasion orchidei; wszystkie gatunki Orchidaceae są mykoheterotroficzne w fazie kiełkowania i siewki (początkowa mykoheterotrofia), nawet te, które fotosyntetyzują w stadiach dorosłych. Ze względu na brak rezerw odżywczych w nasionach orchidei, symbionty grzybów są niezbędne do zapewnienia substratów i umożliwienia kiełkowania. Analiza etapów kiełkowania z perspektywy strukturalnej może również odpowiedzieć na ważne pytania dotyczące interakcji grzybów z nasionami. Różne techniki obrazowania można zastosować do odsłonięcia endofitów grzybów w tkankach roślinnych, jak zaproponowano w tym artykule. Odręczne i cienkie fragmenty organów roślinnych można barwić, a następnie obserwować za pomocą mikroskopii świetlnej. Fluorochrom sprzężony z aglutyniną z kiełków pszenicy można nakładać na grzyby i inkubować razem z Calcofluor White w celu podkreślenia ścian komórkowych roślin w mikroskopii konfokalnej. Ponadto szczegółowo opisano metodologie skaningowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej dla mykoheterotroficznych storczyków oraz zbadano możliwości zastosowania takich protokołów w pokrewnych roślinach. Symbiotyczne kiełkowanie nasion storczyków (tj. w obecności grzybów mikoryzowych) zostało szczegółowo opisane w protokole wraz z możliwościami przygotowania struktur otrzymanych z różnych etapów kiełkowania do analiz za pomocą mikroskopii świetlnej, konfokalnej i elektronowej.

Przeprowadzenie kluczowych etapów utrwalania tkanek roślinnych pozwala uzyskać struktury komórkowe jak najbliższe stanowi żywym, z uwzględnieniem morfologii, objętości oraz organizacji przestrzennej komponentów komórkowych i tkanek.16Obserwować&#160;takie cechy w próbkach po utrwaleniu chemicznym (Rycina 4). Rycina 4C-F przedstawia prawidłowo utrwalone próbki w mikroskopii świetlnej. Przeprowadzenie opisa...

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

Protokół przedstawia różnorodne techniki mikroskopowe stosowane w celu zrozumienia kolonizacji grzybów w roślinach mykoheterotroficznych, od pobierania po szczegółowe przygotowanie próbek i obejmuje niezbędne kroki. Takie techniki można zastosować do różnych roślin mykoheterotroficznych, a nawet do materiałów roślinnych innych niż mykoheterotroficzne. Metoda ta jest głównie związana z botaniką strukturalną i może również dostarczyć informacji na temat interakcji mikoryzowych, fizjologii, biologii rozrodu, ewolucji i ekologii roślin mykoheterotroficznych.Na początek zbierz rośliny mykoheterotroficzne, badając glebę wokół podstawy rośliny, uważając, aby nie uszkodzić podziemnych organów. Unikaj również wyciągania roślin z ziemi, aby zapobiec odłączeniu organów powietrznych od podziemnych. Ostrożnie kop wokół konstrukcji powietrznych za pomocą kielni ogrodniczej, badając podziemne organy, takie jak korzenie, łodygi, kłącza i organy spichrzowe, nie uszkadzając tych struktur.Usuń cząstki gleby, aby zachować delikatne struktury i delikatnie umyj te narządy wodą z kranu, aby spłukać pozostałe cząstki gleby przed utrwaleniem próbek. Rośliny mykoheterotroficzne związane ze ściółką z liści wymagają szczególnej uwagi. Dlatego ostrożnie zbieraj delikatne narządy połączone z rozkładającym się materiałem przez ich strzępki, nie wyciągając ich z połączonych struktur.Zachowaj struktury z takimi połączeniami i zbierz śmieci do analizy. W przypadku analizy transmisyjnej mikroskopii elektronowej należy podzielić próbki o grubości od 3 do 4 milimetrów w kropli buforu kakodylanu aldehydu glutarowego na mniejsze odcinki o grubości od 1 do 2 milimetrów. Wyrzuć przycięte krawędzie poza spadek.Zapewnić przeprowadzenie procesu utrwalania w miejscu zbioru bezpośrednio po zebraniu roślin. Natychmiast przenieść skrawki do probówki zbiorczej o objętości utrwalacza ponad 10 razy większej niż objętość próbek, ponieważ jest to utrwalacz z dodatkiem. Do analizy powierzchniowej powierzchownych strzępek w narządach, zwłaszcza w podziemnych i mających kontakt ze ściółką z liści.Obserwuj świeży lub utrwalony materiał pod mikroskopem preparacyjnym w powiększeniu 7.5x lub większym. Szukaj obszarów zainteresowania, kierując się powierzchownymi strzępkami i ryzomorfami. Wybierz próbki zawierające obszary powierzchownych ryzomorfów, ponieważ można je podzielić na sekcje, aby uwidocznić pelotony i cewki strzępek w komórkach korowych w korzeniach i łodygach.Przygotować 0,2 miligrama na mililitr sprzężonego fluorochromu aglutyniny z kiełków pszenicy i 1% białych roztworów kalkofluoru w 0,1-molowym buforze fosforanowym zgodnie z opisem w manuskrypcie. Teraz inkubuj skrawki na szkiełkach szkiełkowych, odpowiednio przykrywając je roztworem sprzężonym fluorochromu aglutyniny z kiełków pszenicy przez 30 minut. Po inkubacji przemyć skrawki 0,1 molowym buforem fosforanowym i inkubować je w roztworze kalkofluoru jako pożywkę montażową.Następnie umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach i obserwuj je pod mikroskopem konfokalnym lub fluorescencyjnym przy użyciu wskazanych filtrów. Po utrwaleniu próbek, wykonaniu odwodnienia i przechowywaniu ich w 70% etanolu, należy odsłonić dowolną powierzchnię do analizy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej za pomocą ostrej i nowej żyletki do wykonywania cięć ruchem jednokierunkowym. W razie potrzeby użyj mikroskopu stereoskopowego, aby wybrać próbki i weź pod uwagę obszar metalowych króćców podczas określania wielkości próbek.Następnie odwodnić próbki w serii etanolowej. Małe i delikatne próbki należy przechowywać przez 30 minut w każdym stężeniu, a większe i gęstsze próbki przez 1 godzinę. Następnie złóż małe koperty za pomocą bibuły, aby uporządkować próbki do kolejnych kroków.Większe próbki można obsługiwać bez koperty. Oznacz koperty ołówkiem i prowadź dziennik próbek. Ostrożnie umieść próbki w kopertach za pomocą pędzla.Teraz przechowuj te próbki w absolutnym etanolu. Natychmiast przystąp do suszenia w punkcie krytycznym, uruchamiając osuszacz punktu krytycznego zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi. W tym celu należy umieścić próbki w etanolu absolutnym w uchwycie na próbkę i umieścić je w komorze ciśnieniowej suszarki punktu krytycznego.Płyn pośredni rozpuszcza się w płynie przejściowym w krytycznym punkcie dwutlenku węgla, wysuszając w ten sposób próbki. Ponieważ reabsorpcja wilgoci atmosferycznej może zniszczyć próbki, należy je przechowywać w pojemniku do wysuszania natychmiast po wysuszeniu w punkcie krytycznym. Przed zamontowaniem próbek na metalowych króćcach załóż rękawice, aby manipulować króćcami.Zanurz je w acetonie na 5 minut, aby usunąć tłuszcz i pozwól im wyschnąć. Pod mikroskopem stereoskopowym przymocuj próbki do króćca za pomocą przewodzącej dwustronnej taśmy klejącej z włókna węglowego i umieść je. Miejsce z góry jest jedyną możliwą perspektywą na obrazach ze skaningowej mikroskopii elektronowej.Aby manipulować próbkami, użyj pęsety z cienkim czubkiem. Część próbki, której dotyka pęseta, jest zwykle uszkodzona. Bądź więc ostrożny i staraj się dotykać części znajdujących się z dala od obszarów zainteresowania.Utrzymać kikuty z próbkami na szczelnie zamkniętej szalce Petriego z żelem krzemionkowym. Następnie należy przystąpić do napylania w celu osadzenia warstwy złota lub platyny na powierzchni próbek w atmosferze gazu obojętnego pod niskim ciśnieniem, postępując zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi. Grubość powłoki zależy od topografii próbki i zwykle wynosi od 15 do 40 nanometrów.Na koniec utrzymuj pokryte kikuty na szczelnie zamkniętej szalce Petriego z żelem krzemionkowym zatrzymującym wilgoć. Próbki mogą być przechowywane w ten sposób przez wiele tygodni. Użyj skaningowego mikroskopu elektronowego, aby przeanalizować te próbki.Wiązka elektronów uderza w próbkę in vacuo podczas skaningowej mikroskopii elektronowej, a emisja sygnału z takiej interakcji jest interpretowana jako obrazy. Upewnij się, że roztwory i materiały używane w symbiotycznym kiełkowaniu nasion są sterylne. aby uniknąć zanieczyszczenia.Zacznij od autoklawowania ich przez 20 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza. W okapie z laminarnym przepływem powietrza należy powierzchownie zdezynfekować owoce i nasiona, zanurzając je w roztworze podchlorynu sodu zawierającym 2% aktywnego chloru. Smukłe i kruche nasiona można zanurzyć w rozcieńczonym w 1:1 roztworze podchlorynu sodu.Po dezynfekcji zregeneruj nasiona, filtrując je za pomocą tkaniny kserograficznej. Umyj owoce i nasiona trzykrotnie w autoklalawowanej wodzie destylowanej, aby usunąć roztwór podchlorynu przed przystąpieniem do testów kiełkowania. W razie potrzeby przechowywać je w kopertach z bibuły filtracyjnej wewnątrz szklanych kolb z żelem krzemionkowym w temperaturze 4 stopni Celsjusza i hermetycznie zamknąć kolby i uszczelnić folią spożywczą, a następnie ocenić skuteczność procesu mycia, przenosząc kilka kropli wody z ostatniego prania na agar z dekstrozą ziemniaczaną.W celu symbiotycznego kiełkowania nasion orchidei należy inkubować nasiona na 1 do 2-centymetrowych autoklawowanych krążkach z bibuły filtracyjnej umieszczonych na szalkach Petriego zawierających pożywkę do hodowli agaru z płatków owsianych. Teraz zaszczepij środek szalki Petriego fragmentem pożywki hodowlanej zawierającej grzybnię z wybranego izolowanego grzyba. Uszczelnij szalki Petriego folią spożywczą i inkubuj je w ciemności w temperaturze około 25 stopni Celsjusza lub temperaturze pokojowej, w zależności od wzrostu grzybów.Przygotuj kilka potraw z nasionami i bez inokulacji grzybów jako kontrolę negatywną dla testu kiełkowania. Analizuj wyniki kiełkowania co tydzień, zbierając dane ilościowe i jakościowe oraz fotografując protobulmy i sadzonki. Ryzomorfy można łatwo rozpoznać zwykle jako ciemne, przypominające sznurowadła struktury.Odręczne lub inne metody uzyskiwania odcinków grubszych niż 10 mikrometrów mogą lepiej uwidocznić peletony i dostarczyć bardziej reprezentatywnych obrazów wzorców kolonizacji grzybów. Sekcje odręczne mogą być również odpowiednie do analizy strzępek w wyższym wzmocnieniu. Chociaż szczegóły lepiej uzyskuje się w cieńszych sekcjach.Wtórne ściany komórkowe w pierwiastkach ksylemu można łatwo zidentyfikować po jasnym kolorze, jaki uzyskuje toluidyna. Tymczasem elementy łyka składające się tylko z pierwotnych ścian komórkowych są identyfikowane na podstawie ich cieńszych i ciemniejszych ścian komórkowych. Artefakty autofluorescencji można zobaczyć w przekrojach żywicy glikolowo-metakrylanowej.Artefakty te są zwykle związane ze stężeniem fluorochromu i można ich uniknąć, przemłukując próbki większą liczbę razy buforem. Odręczna część korzenia pokazuje strzępki wewnętrzne i zewnętrzne. Ten sam narząd można zobaczyć za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej z dużą ilością ryzomorfów i pojedynczych strzępek na jego powierzchni.Większość gatunków storczyków kiełkuje w ciągu kilku tygodni po zakażeniu zaszczepionym grzybem lub do prawie ponad miesiąca. Światło w skaningowej mikroskopii elektronowej można zastosować do kwiatów, owoców i nasion w celu zbadania biologii reprodukcyjnej lub roślin mykoheterotroficznych. Symbiotyczne kiełkowanie nasion można również przetestować w storczykach autotroficznych.

microscopy-techniques-for-interpreting-fungal-colonization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Problemy w przetwarzaniu próbek biologicznych do obserwacji skaningowej mikroskopii elektronowej obejmują zapadanie się komórek, traktowanie próbek z wilgotnych mikrośrodowisk i niszczenie komórek. Niedrogie i stosunkowo szybkie protokoły odpowiednie do przygotowania trudnych próbek, takich jak merystemy kwiatowe, cysty lęgniowców i grzyby (Agaricales) są kompilowane i szczegółowo opisywane tutaj.

Protokoły skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) dla problematycznych próbek roślin, lęgniowców i grzybów

Tutaj prezentujemy protokoły dla początkujących badaczy, które rozpoczynają fenotypowanie dla farmakologicznie ważnego rodzaju bakterii Streptomyces.

Wizualna i mikroskopowa ocena mutantów rozwojowych Streptomyces

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół przygotowania wspólnej hodowli komórek kryptokokowych i ameb, która jest badana przy użyciu nieruchomych, fluorescencyjnych obrazów i obrazów z transmisyjnego mikroskopu elektronowego o wysokiej rozdzielczości. Zilustrowano tutaj, w jaki sposób dane ilościowe mogą uzupełniać takie informacje jakościowe.

Komplementarne zastosowanie technik mikroskopowych i odczytu fluorescencji w badaniu interakcji kryptokokus z amebą

Niezbędne barwniki fluorescencyjne są niezbędnymi narzędziami do analiz obrazowania żywych komórek w nowoczesnej biologii komórek grzybów. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie znanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo-/egzocytozy i morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych.

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych

Micro-CT to nieniszczące narzędzie, które może analizować struktury roślin w trzech wymiarach. Niniejszy protokół opisuje przygotowanie próbki w celu wykorzystania mikro-CT do analizy struktury i funkcji roślin pasożytniczych. Aby podkreślić zalety tej metody w połączeniu z określonymi preparatami, stosuje się różne gatunki.

Wykorzystanie mikrotomografii komputerowej do analizy interakcji pasożytniczych między rośliną a żywicielem

Protokół tutaj opisuje metody oceny wzorców i strategii kolonizacji mikoryzowej w korzeniach dla dwóch gatunków: Zea mays i Festuca rubra. Zastosowanie metody MycoPatt pozwala na obliczanie parametrów, konwersję struktur mikoryzowych na dane cyfrowe oraz odwzorowanie ich rzeczywistego położenia w korzeniach.

Mapy mikoryzowe jako narzędzie do badania wzorców kolonizacji i strategii grzybów w korzeniach Festuca rubra i Zea mays

Ze względu na nieprzezroczystość gleby, interakcje między jej składowymi mikroorganizmami nie mogą być łatwo zobrazowane za pomocą rozdzielczości komórkowej. Zaprezentowano tu dwa narzędzia mikroprzepływowe, które dają nowe możliwości badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych. Urządzenia są wszechstronne i proste w użyciu, umożliwiając wysoką kontrolę czasoprzestrzenną i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości na poziomie komórkowym.

Narzędzia mikroprzepływowe do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie komórkowym

Obecny artykuł ma na celu dostarczenie szczegółowych i adekwatnych protokołów do izolacji grzybów endofitycznych związanych z roślinami, długoterminowego przechowywania izolatów, charakterystyki morfologicznej i całkowitej ekstrakcji DNA w celu późniejszej identyfikacji molekularnej i analiz metagenomicznych.

Izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja DNA w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje zoptymalizowany protokół inokulacji, który wykorzystuje oderwane osłonki liści kukurydzy do powtarzalnych badań cytologicznych, fizjologicznych i molekularnych interakcji kukurydzy z patogenami grzybów roślinnych. Pochwy liściowe ułatwiają obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórkowych między żywą rośliną a grzybem w nieutrwalonych tkankach.

Oderwane osłonki kukurydzy do obrazowania żywych komórek zakażenia patogenami grzybów kukurydzy dolistnej

Tutaj opisujemy prostą i tanią technikę inokulacji i obserwacji arbuskularnych grzybów mikoryzowych w superchłonnych systemach autotroficznych opartych na polimerach.

Inokulacja i obserwacja arbuskularnych kultur mikoryzowych w superchłonnych systemach autotroficznych na bazie polimerów

Poznaj techniki mikroskopowe do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych. Protokół obejmuje przygotowanie próbek, mikroskopię elektronową i symbiotyczne kiełkowanie nasion.

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion (Wideo) | JoVE Journal

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Przeglądaj więcej filmów