Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Protokół przedstawia różnorodne techniki mikroskopowe stosowane w celu zrozumienia kolonizacji grzybów w roślinach mykoheterotroficznych, od pobierania po szczegółowe przygotowanie próbek i obejmuje niezbędne kroki. Takie techniki można zastosować do różnych roślin mykoheterotroficznych, a nawet do materiałów roślinnych innych niż mykoheterotroficzne. Metoda ta jest głównie związana z botaniką strukturalną i może również dostarczyć informacji na temat interakcji mikoryzowych, fizjologii, biologii rozrodu, ewolucji i ekologii roślin mykoheterotroficznych.

Na początek zbierz rośliny mykoheterotroficzne, badając glebę wokół podstawy rośliny, uważając, aby nie uszkodzić podziemnych organów. Unikaj również wyciągania roślin z ziemi, aby zapobiec odłączeniu organów powietrznych od podziemnych. Ostrożnie kop wokół konstrukcji powietrznych za pomocą kielni ogrodniczej, badając podziemne organy, takie jak korzenie, łodygi, kłącza i organy spichrzowe, nie uszkadzając tych struktur.

Usuń cząstki gleby, aby zachować delikatne struktury i delikatnie umyj te narządy wodą z kranu, aby spłukać pozostałe cząstki gleby przed utrwaleniem próbek. Rośliny mykoheterotroficzne związane ze ściółką z liści wymagają szczególnej uwagi. Dlatego ostrożnie zbieraj delikatne narządy połączone z rozkładającym się materiałem przez ich strzępki, nie wyciągając ich z połączonych struktur.

Zachowaj struktury z takimi połączeniami i zbierz śmieci do analizy. W przypadku analizy transmisyjnej mikroskopii elektronowej należy podzielić próbki o grubości od 3 do 4 milimetrów w kropli buforu kakodylanu aldehydu glutarowego na mniejsze odcinki o grubości od 1 do 2 milimetrów. Wyrzuć przycięte krawędzie poza spadek.

Zapewnić przeprowadzenie procesu utrwalania w miejscu zbioru bezpośrednio po zebraniu roślin. Natychmiast przenieść skrawki do probówki zbiorczej o objętości utrwalacza ponad 10 razy większej niż objętość próbek, ponieważ jest to utrwalacz z dodatkiem. Do analizy powierzchniowej powierzchownych strzępek w narządach, zwłaszcza w podziemnych i mających kontakt ze ściółką z liści.

Obserwuj świeży lub utrwalony materiał pod mikroskopem preparacyjnym w powiększeniu 7.5x lub większym. Szukaj obszarów zainteresowania, kierując się powierzchownymi strzępkami i ryzomorfami. Wybierz próbki zawierające obszary powierzchownych ryzomorfów, ponieważ można je podzielić na sekcje, aby uwidocznić pelotony i cewki strzępek w komórkach korowych w korzeniach i łodygach.

Przygotować 0,2 miligrama na mililitr sprzężonego fluorochromu aglutyniny z kiełków pszenicy i 1% białych roztworów kalkofluoru w 0,1-molowym buforze fosforanowym zgodnie z opisem w manuskrypcie. Teraz inkubuj skrawki na szkiełkach szkiełkowych, odpowiednio przykrywając je roztworem sprzężonym fluorochromu aglutyniny z kiełków pszenicy przez 30 minut. Po inkubacji przemyć skrawki 0,1 molowym buforem fosforanowym i inkubować je w roztworze kalkofluoru jako pożywkę montażową.

Następnie umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach i obserwuj je pod mikroskopem konfokalnym lub fluorescencyjnym przy użyciu wskazanych filtrów. Po utrwaleniu próbek, wykonaniu odwodnienia i przechowywaniu ich w 70% etanolu, należy odsłonić dowolną powierzchnię do analizy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej za pomocą ostrej i nowej żyletki do wykonywania cięć ruchem jednokierunkowym. W razie potrzeby użyj mikroskopu stereoskopowego, aby wybrać próbki i weź pod uwagę obszar metalowych króćców podczas określania wielkości próbek.

Następnie odwodnić próbki w serii etanolowej. Małe i delikatne próbki należy przechowywać przez 30 minut w każdym stężeniu, a większe i gęstsze próbki przez 1 godzinę. Następnie złóż małe koperty za pomocą bibuły, aby uporządkować próbki do kolejnych kroków.

Większe próbki można obsługiwać bez koperty. Oznacz koperty ołówkiem i prowadź dziennik próbek. Ostrożnie umieść próbki w kopertach za pomocą pędzla.

Teraz przechowuj te próbki w absolutnym etanolu. Natychmiast przystąp do suszenia w punkcie krytycznym, uruchamiając osuszacz punktu krytycznego zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi. W tym celu należy umieścić próbki w etanolu absolutnym w uchwycie na próbkę i umieścić je w komorze ciśnieniowej suszarki punktu krytycznego.

Płyn pośredni rozpuszcza się w płynie przejściowym w krytycznym punkcie dwutlenku węgla, wysuszając w ten sposób próbki. Ponieważ reabsorpcja wilgoci atmosferycznej może zniszczyć próbki, należy je przechowywać w pojemniku do wysuszania natychmiast po wysuszeniu w punkcie krytycznym. Przed zamontowaniem próbek na metalowych króćcach załóż rękawice, aby manipulować króćcami.

Zanurz je w acetonie na 5 minut, aby usunąć tłuszcz i pozwól im wyschnąć. Pod mikroskopem stereoskopowym przymocuj próbki do króćca za pomocą przewodzącej dwustronnej taśmy klejącej z włókna węglowego i umieść je. Miejsce z góry jest jedyną możliwą perspektywą na obrazach ze skaningowej mikroskopii elektronowej.

Aby manipulować próbkami, użyj pęsety z cienkim czubkiem. Część próbki, której dotyka pęseta, jest zwykle uszkodzona. Bądź więc ostrożny i staraj się dotykać części znajdujących się z dala od obszarów zainteresowania.

Utrzymać kikuty z próbkami na szczelnie zamkniętej szalce Petriego z żelem krzemionkowym. Następnie należy przystąpić do napylania w celu osadzenia warstwy złota lub platyny na powierzchni próbek w atmosferze gazu obojętnego pod niskim ciśnieniem, postępując zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi. Grubość powłoki zależy od topografii próbki i zwykle wynosi od 15 do 40 nanometrów.

Na koniec utrzymuj pokryte kikuty na szczelnie zamkniętej szalce Petriego z żelem krzemionkowym zatrzymującym wilgoć. Próbki mogą być przechowywane w ten sposób przez wiele tygodni. Użyj skaningowego mikroskopu elektronowego, aby przeanalizować te próbki.

Wiązka elektronów uderza w próbkę in vacuo podczas skaningowej mikroskopii elektronowej, a emisja sygnału z takiej interakcji jest interpretowana jako obrazy. Upewnij się, że roztwory i materiały używane w symbiotycznym kiełkowaniu nasion są sterylne. aby uniknąć zanieczyszczenia.

Zacznij od autoklawowania ich przez 20 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza. W okapie z laminarnym przepływem powietrza należy powierzchownie zdezynfekować owoce i nasiona, zanurzając je w roztworze podchlorynu sodu zawierającym 2% aktywnego chloru. Smukłe i kruche nasiona można zanurzyć w rozcieńczonym w 1:1 roztworze podchlorynu sodu.

Po dezynfekcji zregeneruj nasiona, filtrując je za pomocą tkaniny kserograficznej. Umyj owoce i nasiona trzykrotnie w autoklalawowanej wodzie destylowanej, aby usunąć roztwór podchlorynu przed przystąpieniem do testów kiełkowania. W razie potrzeby przechowywać je w kopertach z bibuły filtracyjnej wewnątrz szklanych kolb z żelem krzemionkowym w temperaturze 4 stopni Celsjusza i hermetycznie zamknąć kolby i uszczelnić folią spożywczą, a następnie ocenić skuteczność procesu mycia, przenosząc kilka kropli wody z ostatniego prania na agar z dekstrozą ziemniaczaną.

W celu symbiotycznego kiełkowania nasion orchidei należy inkubować nasiona na 1 do 2-centymetrowych autoklawowanych krążkach z bibuły filtracyjnej umieszczonych na szalkach Petriego zawierających pożywkę do hodowli agaru z płatków owsianych. Teraz zaszczepij środek szalki Petriego fragmentem pożywki hodowlanej zawierającej grzybnię z wybranego izolowanego grzyba. Uszczelnij szalki Petriego folią spożywczą i inkubuj je w ciemności w temperaturze około 25 stopni Celsjusza lub temperaturze pokojowej, w zależności od wzrostu grzybów.

Przygotuj kilka potraw z nasionami i bez inokulacji grzybów jako kontrolę negatywną dla testu kiełkowania. Analizuj wyniki kiełkowania co tydzień, zbierając dane ilościowe i jakościowe oraz fotografując protobulmy i sadzonki. Ryzomorfy można łatwo rozpoznać zwykle jako ciemne, przypominające sznurowadła struktury.

Odręczne lub inne metody uzyskiwania odcinków grubszych niż 10 mikrometrów mogą lepiej uwidocznić peletony i dostarczyć bardziej reprezentatywnych obrazów wzorców kolonizacji grzybów. Sekcje odręczne mogą być również odpowiednie do analizy strzępek w wyższym wzmocnieniu. Chociaż szczegóły lepiej uzyskuje się w cieńszych sekcjach.

Wtórne ściany komórkowe w pierwiastkach ksylemu można łatwo zidentyfikować po jasnym kolorze, jaki uzyskuje toluidyna. Tymczasem elementy łyka składające się tylko z pierwotnych ścian komórkowych są identyfikowane na podstawie ich cieńszych i ciemniejszych ścian komórkowych. Artefakty autofluorescencji można zobaczyć w przekrojach żywicy glikolowo-metakrylanowej.

Artefakty te są zwykle związane ze stężeniem fluorochromu i można ich uniknąć, przemłukując próbki większą liczbę razy buforem. Odręczna część korzenia pokazuje strzępki wewnętrzne i zewnętrzne. Ten sam narząd można zobaczyć za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej z dużą ilością ryzomorfów i pojedynczych strzępek na jego powierzchni.

Większość gatunków storczyków kiełkuje w ciągu kilku tygodni po zakażeniu zaszczepionym grzybem lub do prawie ponad miesiąca. Światło w skaningowej mikroskopii elektronowej można zastosować do kwiatów, owoców i nasion w celu zbadania biologii reprodukcyjnej lub roślin mykoheterotroficznych. Symbiotyczne kiełkowanie nasion można również przetestować w storczykach autotroficznych.