Name: Obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze spolaryzowanego transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek błony podstawnej podczas oogenezy Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Odkryj obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze transportu białek błony podstawnej w komórkach nabłonkowych Drosophila. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę lokalizacji i wydzielania białek w czasie oogenezy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Julie Merkle za jej pomocne komentarze na temat rękopisu. Praca ta była wspierana przez grant NIH R15GM137236 dla O.D. Obrazy konfokalne i superrozdzielcze uzyskano za pomocą aparatu Zeiss LSM 900 z Airyscan 2, zakupionego w ramach grantu NSF MRI 2018748.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

BM ma kluczowe znaczenie dla morfogenezy embrionalnej i narządowej oraz funkcji fizjologicznych dorosłych. Ponadto BM działa jako platforma sygnalizacyjna do ustanawiania i utrzymywania polaryzacji nabłonka oraz zapewnia wsparcie tkankom2. Jednak mechanizmy, które regulują prawidłowe rozmieszczenie białek BM, są słabo poznane. Lepsze zrozumienie szlaków biologicznych dedykowanych do transportu wewnątrzkomórkowego i spolaryzowanego wydzielania białek BM wymaga dokładnej analizy składników tych szla...

Błona podstawna (BM) to cienki arkusz warstwowej przylegającej do komórek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) krytycznej dla struktury i morfogenezy nabłonka1. Składa się z ~50 białek i występuje powszechnie pod komórkami nabłonka i śródbłonka oraz obejmuje komórki mięśnia szkieletowego, gładkiego i mięśnia sercowego oraz adipocyty1,2,3. Trzy główne składniki BM po stronie podstawy komórek nabłonka to kolagen IV, perlekan i lamininy. BM leży u podstaw komórek nabłonkowych i jest odpowiedzialny za wiele funkcji, w tym separację i barierę tkankową, wzrost i wsparcie oraz polaryzację komórek2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Jego rola jako platformy sygnalizacyjnej reguluje morfologię i różnicowanie komórek i tkanek nabłonka podczas rozwoju3,13,14. Co więcej, nieprawidłowa regulacja BM i/lub naruszenie jego integralności są głównymi przyczynami wielu stanów patologicznych, w tym przerzutów nowotworowych2,15,16. Pomimo podstawowych funkcji pełnionych przez BM podczas morfogenezy tkanek i narządów, składniki szlaku biologicznego dedykowanego spolaryzowanemu transportowi wewnątrzkomórkowemu i wydzielaniu białek BM są niejasno znane.
Aby badać wewnątrzkomórkowy transport pęcherzyków zawierających BM i wydzielanie białek BM przez komórki nabłonkowe, nabłonek pęcherzykowy (FE) jajnika Drosophila jest potężnym systemem modelowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Jajnik Drosophila składa się z 16-20 długich, rurkowatych struktur, zwanych jajnikami (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A,B)17,18,19. Każdy jajnik można traktować jako linię montażową jaja, z postępem wieku komór jajowych (z których każda daje początek jaju), która zaczyna się na przednim końcu i przesuwa się do tyłu, aż dojrzałe jajo wyjdzie przez jajowód. Każda komora jajowa jest otoczona FE, monowarstwą komórek pęcherzyków somatycznych (FC), która otacza centralne komórki linii rozrodczej (GC). FE jest silnie spolaryzowany z wyraźną polaryzacją wierzchołkowo-podstawną, w której domena wierzchołkowa jest skierowana w stronę linii zarodkowej, a białka BM są wydzielane zasadniczo18,19. FC aktywnie wydzielają wszystkie główne składniki BM, w tym kolagen IV, perlekan i Lamininy20,21. W komórkach nabłonkowych, takich jak FC, wytwarzane są składniki BM, które wymagają wyspecjalizowanego spolaryzowanego szlaku wydzielania do ich odkładania poza komórką. Na przykład w przypadku najobficiej występującego składnika BM, kolagenu IV (Coll IV), szczegóły dotyczące jego spolaryzowanego transportu i wydzielania wewnątrzkomórkowego są niejasne, mimo że jego produkcja i odkładanie są przedmiotem wielu badań. Coll IV ulega translacji w retikulum endoplazmatycznym (ER), gdzie każde fibryle - złożone z trzech polipeptydów (dwa łańcuchy α1 i jeden łańcuch α2) - jest składane w potrójną helisę22. Prawidłowe fałdowanie i funkcja Coll IV wymagają białek opiekuńczych i enzymów ER, w tym hydroksylaz lizylowych i prolilowych, takich jak Plod i PH4αEFB20,22,23,24,25,26. Te enzymy potranslacyjne regulują sortowanie ER Coll IV, ponieważ utrata każdego z nich powoduje, że Coll IV jest uwięziony w podstawowej klasie ER<sup="xref">20,23,24,25,26. Następnie nowo zsyntetyzowany Coll IV opuszcza ER dla Golgiego w pęcherzykach pokrytych COPII. Receptor ładunku Tango1 pomaga w pakowaniu kolagenów w spore pęcherzyki związane z Golgiego, które mogą pomieścić duże białka multimeryczne20,27. Gdy Coll IV zostanie upakowany w wewnątrzkomórkowych pęcherzykach egzocytarnych, jest specyficznie wydzielany zasadniczo z komórek nabłonkowych. Aby skierować odkładanie się BM na stronę podstawną, komórki nabłonkowe wymagają innego zestawu czynników specjalnie dedykowanych do spolaryzowanego wydzielania BM. Korzystając z FE jajnika Drosophila, scharakteryzowano kilka składników tego nowego procesu komórkowego, w tym czynniki wymiany nukleotydów (GEF) Crag i Stratum, GTPazy Rab8 i Rab10, a także poziomy fosfoinozytolu PI(4,5)P2 oraz białek motorycznych kinezyny 1 i 320,28,29,30,31. Składniki te mają kluczowe znaczenie w zapewnieniu spolaryzowanej dystrybucji białek BM.
Do monitorowania wewnątrzkomórkowej lokalizacji białek BM w FE można użyć endogennie oznaczonych białek błony podstawnej (pułapek białkowych), takich jak Viking-GFP (Vkg-GFP lub α2 Coll IV-GFP) i Perlecan-GFP (Pcan-GFP)32,33. Wykazano, że te linie pułapek białkowych dokładnie odzwierciedlają endogenną dystrybucję białek BM i pozwalają na bardziej czułe wykrywanie transportu pęcherzykowego28,30. Składniki biorące udział w spolaryzowanym osadzaniu się BM w FE zostały po raz pierwszy scharakteryzowane przy użyciu linii pułapek białkowych dla Vkg-GFP i Pcan-GFP20,28,29,30. Pułapki białkowe mogą być używane w różnych tłach genetycznych, w tym mutantów i linii Gal434. Co więcej, pułapki białkowe mogą być stosowane w połączeniu z barwnikami fluorescencyjnymi i/lub immunobarwieniem fluorescencyjnym, co pozwala na precyzyjne scharakteryzowanie lokalizacji białek BM podczas porównywania warunków typu dzikiego i zmutowanego35.
Aby dokładnie i efektywnie ocenić rozmieszczenie i lokalizację pęcherzyków zawierających białko BM, konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM) i techniki obrazowania super-rozdzielczościowego stanowią znaczącą przewagę nad innymi podejściami do obrazowania. Podejścia te łączą obrazowanie w wysokiej rozdzielczości ze względną łatwością użycia. CLSM to technika mikroskopowa, która pozwala na poprawę rozdzielczości optycznej poprzez skanowanie próbki laserem w sposób skanowania rastrowego przy użyciu galwanometrów. Otwór otworkowy jest podstawowym elementem mikroskopu konfokalnego. Blokując nieostre sygnały dochodzące z góry lub poniżej płaszczyzny ogniskowej, przysłona otworkowa zapewnia znacznie lepszą rozdzielczość w osi z36. Umożliwia to również uzyskanie serii obrazów w płaszczyźnie z, zwanej stosem z, odpowiadającej serii przekrojów optycznych. Stosy z tworzą następnie obraz 3D próbki poprzez rekonstrukcję 3D za pomocą oprogramowania do obrazowania. Konwencjonalne mikroskopy epifluorescencyjne (szerokokątne), w przeciwieństwie do mikroskopów konfokalnych, pozwalają na to, aby nieostre światło przyczyniało się do poprawy jakości obrazu, zmniejszając rozdzielczość obrazu i kontrast36,37. To sprawia, że mikroskopia epifluorescencyjna jest mniej atrakcyjnym kandydatem do badania lokalizacji lub kolokalizacji białek.
Chociaż CLSM jest odpowiednim podejściem do różnych zastosowań, w tym obrazowania i charakterystyki wewnątrzkomórkowego transportu białek BM, nadal stanowi problem podczas obrazowania próbek poniżej granicy dyfrakcji światła Abbego (200-250 nm). Podczas obrazowania takich próbek mikroskopia konfokalna, zwłaszcza w przypadku korzystania z obiektywu olejowego, może skutkować wysoką rozdzielczością. Jednak techniki superrozdzielczości przewyższają granice mikroskopii konfokalnej. Istnieją różne podejścia do uzyskania mikroskopii superrozdzielczej, z których każde ma określone limity rozdzielczości i każde jest odpowiednie dla różnych analiz. Podejścia te obejmują fotoaktywowaną mikroskopię lokalizacyjną (PALM) lub stochastyczną mikroskopię rekonstrukcji optycznej (STORM), mikroskopię zubożenia emisji wymuszonej (STED), mikroskopię oświetlenia strukturalnego (SIM) i mikroskop<ię Airyscan (superrozdzielczość) class="xref">38,39,40,41,42,43,44,45,46. Chociaż Airyscan ma grubszą rozdzielczość niż PALM/STORM, STED i SIM, nadal może osiągnąć rozdzielczość do ~120 nm (około dwukrotnie większą rozdzielczość niż CLSM). Co więcej, wykazano, że to podejście do mikroskopii superrozdzielczej ma przewagę nad SIM i innymi technikami superrozdzielczości podczas obrazowania grubych próbek i próbek o niskim stosunku sygnału do szumu47,48.
Airyscan to stosunkowo nowa technologia mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości46. W przeciwieństwie do tradycyjnych CLSM, które wykorzystują detektory otworkowe i jednopunktowe do odrzucania nieostrego światła, to podejście o wysokiej rozdzielczości wykorzystuje 32-kanałowy detektor obszaru fotopowielacza z fosforku arsenku galu (GaAsP), który zbiera całe światło w każdej pozycji skanowania45. Każdy z 32 detektorów działa jak mały otwór otworkowy, zmniejszając rozmiar otworka z tradycyjnej jednostki 1,0 Airy (A.U.) do ulepszonego 0,2 A.U., umożliwiając jeszcze wyższą rozdzielczość i stosunek sygnału do szumu, przy jednoczesnym zachowaniu wydajności 1,25 A.U. diameter45. Co więcej, liniowa dekonwolucja stosowana przez Airyscan powoduje nawet 2-krotny wzrost rozdzielczości45. Biorąc to pod uwagę, CLSM, a w szczególności mikroskopia superrozdzielcza, dobrze nadają się do badania białek BM i białek, które regulują podstawowe odkładanie białek BM, ponieważ mogą generować obrazy o bardzo wysokiej rozdzielczości do badań lokalizacji i kolokalizacji, dostarczając w ten sposób nowych informacji na temat zdarzeń przestrzennych, czasowych i molekularnych, które kontrolują te procesy.
Alternatywnym podejściem do mikroskopii konfokalnej, które może być użyte do przeprowadzenia eksperymentów lokalizacyjnych, jest dekonwolucja obrazu. Ponieważ mikroskopia szerokokątna umożliwia dotarcie nieostrego światła do detektorów, matematyczne i obliczeniowe algorytmy dekonwolucji mogą być stosowane do usuwania lub ponownego przypisywania nieostrego światła z obrazów uzyskanych za pomocą mikroskopii szerokokątnej, poprawiając w ten sposób rozdzielczość i kontrast obrazu49. Algorytmy dekonwolucji mogą być również stosowane do obrazów konfokalnych, aby jeszcze bardziej zwiększyć rozdzielczość i kontrast, uzyskując końcowe obrazy prawie porównywalne z mikroskopią superrozdzielczą50. Airyscan wykorzystuje dekonwolucję opartą na filtrze Weinera wraz z reprzypisacją pikseli Shepparda, co skutkuje znacznie lepszą rozdzielczością przestrzenną i stosunkiem sygnału do szumu. W porównaniu z mikroskopią konfokalną, przy użyciu tej ><><techniki mikroskopii superrozdzielczej obserwuje się 2-krotny wzrost rozdzielczości we wszystkich trzech wymiarach przestrzennych (120 nm w x i y oraz 350 nm w z).
Ten manuskrypt dostarcza szczegółowych i zoptymalizowanych protokołów barwienia, pozyskiwania i wizualizacji wewnątrzkomórkowego transportu i depozycji białek BM przy użyciu FE jajnika Drosophila jako systemu modelowego połączonego z mikroskopią konfokalną i superrozdzielczą. Linie Drosophila wyrażające endogennie znakowane białka błony podstawnej, np. Vkg-GFP i Pcan-GFP, są wydajnymi i dokładnymi narzędziami do wizualizacji transportu i wydzielania białek BM. Ponadto mogą być łatwo używane w różnych tłach genetycznych, w tym w liniach mutantów i Gal4/UAS34. Chociaż endogennie znakowane białka błony podstawnej są zalecane, stosowanie przeciwciał przeciwko specyficznym białkom BM jest również zgodne z opisanymi protokołami. Protokoły te są szczególnie przydatne dla naukowców, którzy są zainteresowani badaniem transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek BM w nienaruszonej tkance nabłonkowej za pomocą obrazowania konfokalnego i superrozdzielczego. Co więcej, możliwość połączenia analizy tkanki nabłonkowej z ekspansywnymi narzędziami genetyki Drosophila sprawia, że podejście to jest szczególnie skuteczne. Wreszcie, protokoły te można łatwo zaadaptować do badania transportu pęcherzykowego i sortowania innych interesujących białek.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 546 falloidyna</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>Barwnik F-aktynowy (1/500 z 66&mikro; M)</td></tr> <tr><td>Alexa Fluor 647 falloidyna</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>Barwnik F-aktynowy (1/100 z 66 i mikro; M) ) Przeciwciało</td></tr> <tr><td>anty-GM130</td><td>abcam</td><td>ab30637</td><td>Dla barwienia Golgiego (kolokalizacja); stosować jako stężenie 7&mikro; g / uL</td></tr><tr><td>Aqua-Polymount</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>1860620</td><td>Podłoże</td></tr><tr><td>montażowe Drożdże piekarskie (aktywne suche drożdże)</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td>Aby utuczyć nadmiary do sekcji</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (30% roztwór)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7284</td><td>Do roztworu blokującego</td></tr><tr><td>Studnie depresyjne</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>7156101</td><td>Do rozwarstwienia (zamiast tego można użyć szkiełka wklęsłego)</td></tr> <tr><td>Igła preparcyjna</td><td>Fisher scientifc</td><td>13-820-024</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Drosophila</td><td>Genesee Scientific/Invictus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)</td><td></td><td></td><td>Morin et al., 2001</td></tr><tr><td>Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>33594</td><td>RNAi przeciwko Crag</td></tr><tr><td>Stado muchowe: linia Viking-GFP Drosophila (CC00791)</td><td></td><td></td><td>Buszczak et al., 2007</td></tr><tr><td>Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4</td><td></td><td></td><td>Devergne et al., 2017. Steruj ekspresją Crag RNAi w</td></tr><tr><td>kleszczach FE (Dumont 5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Do rozwarstwiania</td></tr><tr><td>Szklany szkiełko wklęsłe Mikroskopia</td><td>elektronowa Nauki</td><td>7187804</td><td>Do sekcji (zamiast tego można użyć studzienek depresyjnych)</td></tr> <tr><td>Kozia anty-królik IgG, Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11036</td><td>Przeciwciało drugorzędowe (przeciwciało GM130) (5 &mikro; g/mL)</td></tr><tr><td>Hoechst (Hoechst 33342)</td><td>Barwnik DNA Invitrogen</td><td>H3570</td><td>(1 ug/mL)</td></tr><tr><td>Chusteczki</td><td>Kimtech</td><td>Fisher Scientific: 06-666</td><td>Delikatne wycieraczki do zadań</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy Leica&nbsp; M165 FC</td><td>Leica</td><td></td><td>Do obrazowania jajników</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Corning</td><td>294875X25</td><td>Szkiełka mikroskopowe</td></tr><tr><td>Platforma nutacyjna Rocker</td><td>Corning Life Sciences</td><td>6720</td><td>Do utrwalania i barwienia jajników</td></tr><tr><td>Nutri-Fly BF</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-121</td><td>Pokarm dla much</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 20%</td><td>roztwór Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>Fisher Naukowy: 15713</td><td>Do 4%</td></tr> <tr><td>tabletek soli fizjologicznej buforowanych fosforanem</td> PFA <td>Fisher scientific</td><td>BP2944100</td><td>Do roztworu PBS</td></tr><tr><td>ProLong Glass Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P36980</td><td>Montaż Średnia</td></tr><tr><td>kwadratowa szklana osłona</td><td>Corning</td><td>285022</td><td>Szkło nakrywkowe do szkiełek mikroskopowych</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-19-5</td><td>Do PBST</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 900 z Airyscan 2</td> Mikroskop <td>konfokalny i superrozdzielczy</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Zeiss Stemi 305</td><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Zen w wersji 3.3 (Blue Edition)</td><td>Akwizycja i przetwarzanie obrazów</td> <td>Zeiss</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze spolaryzowanego transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek błony podstawnej podczas oogenezy drosophila

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Błona podstawna (BM) - wyspecjalizowany arkusz macierzy zewnątrzkomórkowej obecny po stronie podstawy komórek nabłonkowych - jest kluczowa dla ustanowienia i utrzymania morfologii tkanki nabłonkowej oraz morfogenezy narządów. Co więcej, BM jest niezbędny do modelowania tkanek, służy jako platforma sygnalizacyjna i dostarcza sił zewnętrznych do kształtowania tkanek i narządów. Pomimo wielu ważnych ról, jakie BM odgrywa podczas normalnego rozwoju i stanów patologicznych, szlaki biologiczne kontrolujące wewnątrzkomórkowy transport pęcherzyków zawierających BM oraz sposób, w jaki wydzielanie podstawowe prowadzi do spolaryzowanego odkładania się białek BM, są słabo poznane. Nabłonek pęcherzykowy jajnika Drosophila jest doskonałym systemem modelowym do badania podstawowego odkładania się białek błonowych BM, ponieważ wytwarza i wydziela wszystkie główne składniki BM. Obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze w połączeniu z przetwarzaniem obrazu w utrwalonych tkankach pozwala na identyfikację i charakterystykę czynników komórkowych specyficznie zaangażowanych w transport wewnątrzkomórkowy i odkładanie białek BM. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół barwienia i obrazowania pęcherzyków zawierających BM i zdeponowanego BM za pomocą endogennie znakowanych białek w nabłonku pęcherzykowym jajnika Drosophila. Protokół ten może być stosowany zarówno do rozwiązywania problemów jakościowych, jak i ilościowych i został opracowany w celu dostosowania do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, co pozwala na szybką i skuteczną identyfikację czynników zaangażowanych w spolaryzowany transport wewnątrzkomórkowy i wydzielanie pęcherzyków podczas rozwoju tkanki nabłonkowej.

Opisane tutaj metody mogą być wykorzystane do wydajnego i dokładnego obrazowania oraz charakterystyki wewnątrzkomórkowego transportu i sekrecji białek błony podstawnej (BM) w spolaryzowanych komórkach nabłonkowych, takich jak nabłonek pęcherzykowy (FE) jajnika Drosophila. Następnie przedstawiamy spodziewane wyniki uzyskane przy użyciu opisanych metod, a także przydatne wskazówki i potencjalne problemy. W tym celu wykorzystano Vkg-GFP, endogennie oznakowane białko Vkg (Drosophila Col IV). Analogicznych w...

Błona podstawna jest niezbędna do morfogenezy tkanek i narządów podczas rozwoju. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy prowadzące do prawidłowego umiejscowienia tej struktury, w przedstawionym protokole opisano metody wizualizacji i charakterystyki wewnątrzkomórkowego transportu i wydzielania białek błony podstawnej w komórkach nabłonka za pomocą mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej.

Obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze spolaryzowanego transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek błony podstawnej podczas oogenezy Drosophila

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie wewnątrzkomórkowego transportu i wydzielania białek błony podstawnej przy użyciu macierzy Drosophila jako systemu modelowego. Główną zaletą naszej techniki jest to, że umożliwia ona obrazowanie w wysokiej rozdzielczości wewnątrzkomórkowego transportu białek błony podstawnej przy użyciu endogennie znakowanych białek i mikroskopii superrozdzielczej Airyscan. Chociaż protokół ten został opracowany w celu obrazowania wewnątrzkomórkowego transportu białek błony podstawnej, można go rozszerzyć o badanie transportu innych białek będących przedmiotem zainteresowania i innych systemów biologicznych, w tym hodowli komórkowych i organoidów.Na początek, po wypreparowaniu jajników Drosophila w PBS pod zakresem preparacji, dodaj jeden mililitr roztworu utrwalającego i utrwalaj jajniki na platformie nutacyjnej przez 15 minut. Usuń roztwór utrwalający i wykonaj dwa szybkie płukania, każde z jednym mililitrem PBST. Delikatnie odwracając probówki mikrowirówki pięć do sześciu razy, a następnie wykonaj cztery długie płukania po 10 minut każde jednym mililitrem PBST na kołysce platformy nutacyjnej.Po wykonaniu utrwalenia i umycia usuń PBST, a następnie dodaj j

confocal-super-resolution-imaging-polarized-intracellular-trafficking

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Źródło: Wagner, K.  i inni., Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP. J. Vis. Exp. (2022). Ten film przedstawia wizualizację transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorów Drosophila przy użyciu białek TRPL znakowanych eGFP. Szczegółowo opisano w nim przygotowanie transgenicznych muszek do obrazowania, przechwytywanie obrazów fluorescencyjnych komórek fotoreceptorowych oraz ilościowe określenie transportu TRPL...

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

Metoda obrazowania pionowego opisana w tym protokole pozwala na szczegółową wizualizację biegunów rozwijającego się jaja Drosophila melanogaster.  Ten widok od początku zapewnia nową perspektywę na rozmieszczenie i morfologię wielu typów komórek w nabłonku pęcherzykowym.

Obrazowanie pionowe komór jajowych Drosophila

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania żywych komórek w nienaruszonej tkance w superrozdzielczości. Ustandaryzowaliśmy warunki obrazowania bardzo wrażliwej populacji dorosłych komórek macierzystych w ich natywnym środowisku tkankowym. Technika ta polega na zrównoważeniu rozdzielczości czasowej i przestrzennej, aby umożliwić bezpośrednią obserwację zjawisk biologicznych w żywej tkance.

Obrazowanie żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

Tutaj przedstawiono protokół implementacji mikroskopii ekspansywnej we wczesnych zarodkach Drosophila w celu uzyskania obrazowania w superrozdzielczości przy użyciu konwencjonalnego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego.

Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do wykonywania na żywo obrazowania asymetrycznego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) w niszy jajnikowej Drosophila. Używamy linii transgenicznej, która wszechobecnie ulega ekspresji fuzji białka zielonej fluorescencji (GFP) białka spektrosomu Par-1.

Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster

Protokoły te określają, jak scharakteryzować organizację i funkcję zakrywającą złączeń przegrody plisowanej u nabłonka embrionalnego kontrolnego oraz mutacyjnego nabłonka embrionalnego Drosophila.

Eksperymenty immunobarwienia i penetracji barwnika w celu określenia białek styku przegrody w nabłonku embrionalnym Drosophila

Odkryj obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze transportu białek błony podstawnej w komórkach nabłonkowych Drosophila. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę lokalizacji i wydzielania białek w czasie oogenezy.

Obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze spolaryzowanego transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek błony podstawnej podczas oogenezy Drosophila (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze spolaryzowanego transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek błony podstawnej podczas oogenezy Drosophila

Przeglądaj więcej filmów