Obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze spolaryzowanego transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek błony podstawnej podczas oogenezy Drosophila

Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie wewnątrzkomórkowego transportu i wydzielania białek błony podstawnej przy użyciu macierzy Drosophila jako systemu modelowego. Główną zaletą naszej techniki jest to, że umożliwia ona obrazowanie w wysokiej rozdzielczości wewnątrzkomórkowego transportu białek błony podstawnej przy użyciu endogennie znakowanych białek i mikroskopii superrozdzielczej Airyscan. Chociaż protokół ten został opracowany w celu obrazowania wewnątrzkomórkowego transportu białek błony podstawnej, można go rozszerzyć o badanie transportu innych białek będących przedmiotem zainteresowania i innych systemów biologicznych, w tym hodowli komórkowych i organoidów.

Na początek, po wypreparowaniu jajników Drosophila w PBS pod zakresem preparacji, dodaj jeden mililitr roztworu utrwalającego i utrwalaj jajniki na platformie nutacyjnej przez 15 minut. Usuń roztwór utrwalający i wykonaj dwa szybkie płukania, każde z jednym mililitrem PBST. Delikatnie odwracając probówki mikrowirówki pięć do sześciu razy, a następnie wykonaj cztery długie płukania po 10 minut każde jednym mililitrem PBST na kołysce platformy nutacyjnej.

Po wykonaniu utrwalenia i umycia usuń PBST, a następnie dodaj jeden mililitr roztworu blokującego i zablokuj jajniki na kołysce platformy nutacyjnej na co najmniej godzinę. Następnie usuń roztwór blokujący i dodaj 300 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego, zawierającego przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w odpowiednich stężeniach w roztworze blokującym. Inkubować przez noc na kołysce platformy nutującej w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Po usunięciu roztworu przeciwciała pierwszorzędowego wykonaj dwa szybkie płukania i cztery długie płukania, jak pokazano wcześniej, a następnie usuń PBST i dodaj 500 mikrolitrów roztworu przeciwciała drugorzędowego zawierającego fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe, które wykryją użyte przeciwciała pierwszorzędowe. Inkubować jajniki w roztworze przeciwciała wtórnego na kołysce platformy nutacyjnej przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie wykonać dwa szybkie płukania i cztery długie płukania w PBST, jak wykazano wcześniej na kołysce platformy nutacyjnej. Po ostatnim płukaniu użyj pipety P-1000, aby delikatnie odpipetować jajniki w górę iw dół w rurce, aby oddzielić komory na jaja.

Pozwól, aby komory na jajka opadły na dno, trzymając rurkę w pozycji pionowej przez pięć do 10 minut. Następnie usuń PBST za pomocą pipety Pasteura, pozostawiając około 50 mikrolitrów. Następnie usuń jak najwięcej pozostałego PBST za pomocą pipety P-200 i dodaj dwie krople podłoża montażowego, wystarczające do równomiernego rozprowadzenia na szkiełku nakrywkowym.

Aby umożliwić łatwe przenoszenie lepkiego medium montażowego na szkiełko z probówki do mikrowirówki, należy odciąć koniec końcówki pipety P-200. Następnie powoli przenieś wszystkie komory na jajka w podłożu montażowym do szkiełka podstawowego, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków. Pod mikroskopem preparacyjnym delikatnie rozprowadź podłoże montażowe i oddziel komory na jajka za pomocą nowej końcówki do pipet P-200 lub kleszczyków, aby pokryć obszar o wielkości mniej więcej szkiełka nakrywkowego.

Za pomocą kleszczy ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na komorach na jajka pod kątem, aby uniknąć pęcherzyków i przechowuj szkiełko w temperaturze pokojowej na płaskiej powierzchni w ciemności przez dwa dni w celu polimeryzacji. Po utwardzeniu nośnika montażowego szkiełko można przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza w ciemności przez kilka tygodni w celu wykonania obrazowania. Aby zobrazować wewnątrzkomórkową lokalizację białek błony podstawnej, ustaw obiektyw na 63x i delikatnie umieść kroplę olejku immersyjnego na jego soczewce, a następnie umieść szkiełko na obiektywie tak, aby szkiełko nakrywkowe było skierowane w stronę obiektywu, aby zlokalizować próbkę.

Zlokalizuj obszar zainteresowania za pomocą okularu mikroskopu epifluorescencyjnego, a następnie wybierz konfigurację z odpowiednimi ustawieniami, aby fluorofory obrazowały zgodnie z opisem w manuskrypcie. Po ustawieniu konfiguracji zobrazuj próbkę, wybierając opcję Live (Na żywo) w obszarze Acquisition Mode (Tryb akwizycji) i dostosuj powiększenie w zakresie od 2 do 4x, aby zoptymalizować obszar skanowania próbki. Dla każdego kanału wybierz utwór w obszarze Kanał i kliknij Na żywo.

Dostosuj wzmocnienie główne i moc lasera podczas korzystania z narzędzia wskaźnika zasięgu i postępuj zgodnie ze wszystkimi wskazówkami, aby uniknąć nasyconych pikseli, jak opisano w manuskrypcie, powtarzając to samo dla każdego kanału. W oknie przełączania Tryb akwizycji, w obszarze Rozmiar obrazu, kliknij SR, aby zmaksymalizować możliwości detektora i automatycznie dostosować rozmiar ramki. Zachowaj uśrednianie na Brak w trybie Airyscan, ponieważ zwykle nie jest to konieczne i skróci czas skanowania.

Jednak w niektórych przypadkach uśrednienie 2x może poprawić stosunek sygnału do szumu, a następnie kliknij Snap, aby uzyskać obraz. Aby zdobyć stos Z, kliknij pole wyboru Z-Stack na karcie Akwizycja. Następnie wybierz żądany kanał, aby obserwować próbkę.

Na przykład kanał DAPI i kliknij na Na żywo, aby rozpocząć skanowanie na żywo, a następnie ustaw zakres dla stosu Z za pomocą pokrętła precyzyjnej regulacji na mikroskopie. Następnie ustaw punkty końcowe stosu Z, klikając Ustaw najpierw i Ustaw ostatnie. Aby uzyskać optymalną rekonstrukcję 3D, ustaw interwał dla stosu Z mniejszy niż 0,5 mikrometra, aby przypisać rozmiar kroku i kliknij Rozpocznij eksperyment, aby rozpocząć akwizycję stosu Z.

Po uzyskaniu obrazów lub stosu Z kliknij opcję Przetwarzanie, a następnie Metoda i wybierz Przetwarzanie Airyscan. Wykonaj automatyczne filtrowanie, aby rozpocząć, a w razie potrzeby wykonaj dalsze ręczne przetwarzanie, zmieniając wartość super rozdzielczości, aby uzyskać najlepsze wyniki dla próbki. Po określeniu optymalnej wartości SR kliknij Zastosuj, aby wygenerować przetworzony obraz.

W przypadku obrazów Z-stack przetwarzaj jako jeden Z-slice lub jako cały Z-stack, klikając pole Przetwarzanie 3D. Aby zobrazować transport białek w 3D po pozyskaniu stosu Z, wygeneruj obraz 3D, klikając ikonę 3D w oknie podglądu, która pojawi się w sekcji sterowania wyświetlaczem przetworzonego obrazu Airyscan. Z różnych opcji widoku 3D można użyć widoku Powierzchnia lub Widok mieszany podczas wyświetlania struktury pęcherzyków.

Aby uzyskać obraz o najwyższej jakości, wybierz ustawienie Precyzyjne, ponieważ ustawienie Najszybsze będzie mniej dokładne i doprowadzi do słabego renderowania 3D. Po wygenerowaniu obrazu manipuluj obrazem 3D, powiększając i obracając, aby ustawić ostrość w preferowanej lokalizacji. Po uzyskaniu widoku, w zakładce 3D wybierz Wyświetlana rozdzielczość, a następnie kliknij Utwórz obraz, co spowoduje utworzenie migawki obrazu w tej samej orientacji, w jakiej był wyświetlany i można go zapisać i wyeksportować w różnych formatach plików.

Mikroskopia konfokalna może być wykorzystana do wizualizacji wewnątrzkomórkowej lokalizacji i odkładania białek błony podstawnej, takich jak Viking-GFP, gdy parametry akwizycji są zoptymalizowane. Gdy akwizycja i przetwarzanie obrazu są wykonywane prawidłowo, mikroskopia superrozdzielcza zwiększa rozdzielczość obrazu w porównaniu z mikroskopią konfokalną. Jak ilustrują lepiej zdefiniowane obrazy w wewnątrzkomórkowym transporcie białek błony podstawnej, takich jak Viking.

Projekcja ortogonalna umożliwia wizualizację ogólnego rozmieszczenia pęcherzyków i przedziałów zawierających białka błony podstawnej na jednym obrazie przy użyciu obrazowania konfokalnego lub superrozdzielczego. Rekonstrukcja 3D polegająca na złożeniu stosu optycznych przekrojów Z pobranych za pomocą obrazowania konfokalnego lub superrozdzielczego została wykorzystana do oceny lokalizacji i dystrybucji wewnątrzkomórkowych białek błony podstawnej. Obrazowanie w superrozdzielczości może być wykorzystane do określenia precyzyjnej lokalizacji białek błony podstawnej w warunkach zmutowanych.

Na przykład w komórkach nabłonkowych Crag knockdown białka błony podstawnej gromadzą się zarówno wierzchołkowo, jak i podstawowo, co wskazuje, że kontrolują spolaryzowane wydzielanie białek błony podstawnej. Mikroskopia konfokalna i superrozdzielcza mogą być również stosowane w eksperymentach kolokalizacyjnych. Na przykład, rysunek ten pokazuje częściową kolokalizację Viking-GFP i markera Golgiego, GM-130, potwierdzając, że Viking jest sortowany do Golgiego przed wydzieleniem.

Aby skutecznie zobrazować transport białek błony podstawnej za pomocą mikroskopii superrozdzielczej, zalecamy staranny montaż jajników i zwrócenie szczególnej uwagi podczas ustawiania parametrów akwizycji i splotu. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem wizualizacji transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek błony podstawnej. Można go jednak łatwo zmodyfikować, aby skutecznie zobrazować transport innych interesujących białek.