Ekstrakcja aminokwasów niebiałkowych z cyjanobakterii do analizy chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas

Protokół ten pomoże użytkownikom i nauczy uczniów prawidłowych kroków w ekstrakcji BMA, AEG i 2, 4-DAB. W ten sposób minimalizuje się ryzyko błędu i uzyskuje się spójne wyniki. Metoda ta jest powszechnie stosowaną i zwalidowaną metodą ekstrakcji BMA i jego izomerów, AEG i 2,4-DAB w matrycy bakteryjnej sauny.

Metoda ta może być wykorzystana do dalszych badań nad toksycznością BMA i zapewnić lepsze zrozumienie BMA i związanych z nim skutków zdrowotnych. Rozpocząć od odśrodkowania próbki sinic w temperaturze 3 500 G przez 10 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. I wyrzucanie supernatantu do odpadów biologicznych.

Przykryj probówkę wirówkową zawierającą osad folią uszczelniającą i przebij kilka otworów w folii za pomocą ostrej pęsety z długim nosem. Następnie przechowuj probówkę w pozycji pionowej w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po 30 minutach umieść probówkę pionowo w szklanym pojemniku do liofilizacji i umieść pojemnik w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na pięć minut w celu schłodzenia.

Wyjmij szklany pojemnik z zamrażarki i załóż gumową pokrywkę. Upewnij się, że uchwyt na gumowym wylocie zaworu liofilizatora jest skierowany do góry i jest odprowadzany do atmosfery. Mocno przymocuj szklany pojemnik.

Powoli przekręć uchwyt gumowego wylotu zaworu, aby skierować go w dół, aby wystawić słoik na działanie próżni. I pozwól na liofilizację do 24 godzin, aby sublimować cały płyn. Po zakończeniu zważ od 15 do 50 miligramów zamrożonych granulek próbki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Korzystanie z wagi analitycznej. Do próbki dodać od 300 do 600 mikrolitrów 10% wodnego roztworu kwasu trichlorooctowego lub TCA. Umieścić probówki z próbkami w pojemniku wypełnionym kruszonym lodem.

Przetrzyj sondę sonikatora niestrzępiącą się papierową chusteczką spryskaną 70% etanolem przed całkowitym zanurzeniem końca sondy w próbce i naciśnięciem przycisku start. Po zakończeniu umieścić próbkę zawierającą probówkę wirówkową na lodzie na jedną minutę. I powtórz proces sonikacji, aby zapewnić lizę komórek.

Po schłodzeniu próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny. Wirować przy 3,500 G przez 15 minut w temperaturze ośmiu stopni Celsjusza. Następnie za pomocą mikropipety przenieś supernatant do dwumililitrowej probówki oznaczonej jako wolna frakcja.

Dodać 400 mikrolitrów 10% wodnego TCA do osadu próbki i rozdrobnić osad przez mieszanie wirowe lub za pomocą końcówki mikropipety. Odwirować i przenieść supernatant do tej samej probówki z wolną frakcją o pojemności dwóch mililitrów. Powtórz ten krok po raz trzeci, używając 10% acetonu TCA.

Umieść probówkę z wolną frakcją z otwartą pokrywką w parowniku odśrodkowym, aż cała lotna ciecz zostanie usunięta. Gdy próbka jest wolna od lotnych cieczy, przykryj rurkę folią sufitową i przebij folię kilkoma otworami za pomocą ostrej pęsety z długim nosem. Po wcześniejszym liofilizacji rozpuść próbkę w 200 mikrolitrach 20-milimolowego kwasu solnego i umieść ją w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Dodaj 400 mikrolitrów 100% acetonu do osadu próbki za pomocą mikropipety i rozdrobnij osad za pomocą mieszania wirowego lub końcówki mikropipety. Ilościowo przenieść przemyty i ponownie zawieszony osad do odpowiedniej fiolki ze szklaną skorupą. Za pomocą mikropipety o pojemności jednego mililitra.

Dodaj kolejne 400 mikrolitrów acetonu do probówki z próbką, aby pomóc przenieść pozostały granulek. Odwirować i zdekantować ciecz sklarowaną nad osadem do odpadów biologicznych przed wysuszeniem granulatu w parowniku odśrodkowym, aż ciecz zostanie usunięta, a osad wyschnie. Aby przygotować plik do hydrolizy próżniowej, dodaj jeden mililitr sześciomolowego kwasu solnego na dno pliku do hydrolizy.

Ostrożnie włóż oznakowane fiolki z wysuszonymi próbkami do pilnika do hydrolizy za pomocą pęsety, zapewniając stabilną pozycję w pionie. Przymocuj pokrywkę do pilnika do hydrolizy i naciśnij czerwone pokrętło na pokrywie, aby zamknąć zawór. Po włączeniu pompy próżniowej przymocuj rurkę próżniową do głowicy pokrywy pilnika do hydrolizy i naciśnij zielone pokrętło na pokrywie, aby otworzyć zawór.

Następnie pozwól pompie próżniowej usunąć powietrze z fiolki na jedną minutę. Następnie zamknąć fiolkę, naciskając czerwone pokrętło na wieczku fiolki do hydrolizy. Wyłącz pompę próżniową i wyjmij rurkę próżniową.

Przymocuj gumową rurkę do kurka z azotem na stole laboratoryjnym. I lekko odkręć kran. Umieść kciuk na końcu rurki, uszczelnij ją i licz, aż gaz zacznie uciekać wraz ze wzrostem ciśnienia.

Następnie przymocuj drugi koniec gumowej rurki do główki wieczka fiolki do hydrolizy. I natychmiast naciśnij zielone pokrętło pokrywy. Policz czas potrzebny do ucieczki gazu.

Szybko naciśnij czerwone pokrętło na pokrywie i wyjmij gumową rurkę. Powtórz cały proces obróbki próżniowej dwukrotnie. Upewnij się, że szklana fiolka do hydrolizy jest wolna od powietrza i wypełniona gazowym azotem.

Umieść fiolkę do hydrolizy w nagrzanym piekarniku nastawionym na 110 stopni Celsjusza na 16 do 18 godzin. Używając rękawic kuchennych, wyjmij szklaną fiolkę do hydrolizy z piekarnika. Pozostawić fiolkę do ostygnięcia w dygestorii przez 10 minut, a następnie nacisnąć zielone pokrętło, kierując je w stronę przeciwną, w celu uwolnienia ciśnienia i gazu.

Rozpuść zhydrolizowane granulki próbki w 200 mikrolitrach 20-molowego kwasu solnego w fiolce z otoczką i ponownie zawiesić osad. Odwirować fiolki z otoczką zawierającą odtworzone granulki próbki przez dwie minuty w temperaturze 5, 300 G i 25 stopni Celsjusza. Przenieś odtworzone próbki wolnej frakcji i frakcji białkowej do dwóch mililitrowych probówek filtracyjnych zawierających filtry membranowe porów o średnicy 0,2 mikrona i oznaczonych jako wolna frakcja i frakcja białkowa.

Umieść probówki do wirowania na 30 minut w temperaturze 5 000 G i 25 stopni Celsjusza. Chromatogram monitorujący wielokrotne reakcje wzorca zawierającego beta-metyloamino-L-alaninę lub BMAA i jego izomery oznaczone kolorowymi liniami jest pokazany tutaj. Pozytywną detekcję dla wszystkich trzech izomerów, BMAA, DAB i AEG, zaobserwowano w wolnej frakcji gatunków Merismopedia zebranych z jeziora Liddel.

Natomiast frakcja związana gatunków Microcystis flos-aquae zebranych z wodociągów Waka wykazała wynik ujemny dla BMAA i jego izomerów. Zawieszony osad musi zostać ilościowo przeniesiony do odpowiedniej fiolki z otoczką, aby umożliwić dokładny punkt normalizacji na podstawie masy sinic. Podczas wykonywania tego kroku zaleca się pacjentów i zachowanie należytej staranności.

Postępując zgodnie z tą procedurą. Wyekstrahowane frakcje będą musiały przejść etap dewitalizacji, aby umożliwić fazę odwrotną. Chromatografia cieczowa, analiza tandemowej spektrometrii mas.

Zastosowanie tej techniki rozszerza różne dziedziny nauki. W tym nauki o środowisku poprzez analizę cynotoksyn w próbkach środowiskowych. Oraz dziedziny takie jak toksykologia i biochemia poprzez badanie teorii błędnej inkorporacji BMA.