Wysokoprzepustowe, multipleksowane badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i COVID-19

Zgodnie z pilną potrzebą badań przesiewowych w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i choroby koronawirusowej 2019, opracowaliśmy wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 6-Plex do jednoczesnego wykrywania wszystkich czterech autoprzeciwciał wysp trzustkowych, autoprzeciwciał transglutaminazy tkankowej oraz przeciwciał przeciwko domenie wiążącej receptor koronawirusa 2 zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej.

Nowatorski test 6-Plex ECL jest pierwszym testem multipleksowym zwalidowanym i obecnie stosowanym w badaniu klinicznym w badaniach przesiewowych populacji ogólnej. Jednocześnie łączy sześć testów autoprzeciwciał odpowiednich do badań przesiewowych cukrzycy typu 1, celiakii i COVID-19 w dużej populacji. W porównaniu z obecnym standardowym testem autoprzeciwciał, technika ta może skuteczniej badać wiele autoprzeciwciał w kierunku wielu chorób autoimmunologicznych jednocześnie.

Implikacje tej techniki sprawią, że badania przesiewowe na dużą skalę staną się bardziej wykonalne i specyficzne dla choroby, prowadząc do wczesnego przewidywania choroby w celu zapobiegania i bardziej precyzyjnej diagnozy na potrzeby terapii. Na początek dodaj cztery mikrolitry biotynylowanego GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 i białka antygenu proinsuliny do probówki zawierającej 156 mikrolitrów 1% BSA i wymieszaj z 240 mikrolitrami odpowiednich łączników sprzężonych ze streptawidyną, 1, 2, 3, 8, 9 i 10. Następnie inkubuj mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Porcję 160 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej probówki i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Teraz weź 400 mikrolitrów roztworu mieszaniny z każdej probówki i połącz je ze sobą. Do mieszaniny dodać cztery mikrolitry znakowanego rutenem GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 i antygenu proinsuliny.

Następnie dodaj 1,6 mililitra roztworu zatrzymującego i 3,2 mililitra PBS. Dokładnie wymieszaj wszystkie składniki. A teraz roztwór antygenu jest gotowy do użycia w teście.

W przypadku 96-dołkowej płytki PCR należy podać siedem mikrolitrów surowicy na dołek i przykryć płytkę folią uszczelniającą. Następnie podgrzej surowicę w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 30 minut na maszynie do PCR i krótko odwiruj płytkę w temperaturze 100 razy G przez jedną minutę. Dodać 63 mikrolitry przygotowanego roztworu antygenu do dołka, wymieszać z surowicami i przykryć płytkę PCR folią uszczelniającą, aby uniknąć światła.

Potrząsaj płytką na wytrząsarce z prędkością 450 obr./min przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. A następnie inkubuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin. Weź talerz 6-Plex z lodówki o temperaturze czterech stopni Celsjusza, pozwalając talerzowi osiągnąć temperaturę pokojową.

Następnie dodaj 150 mikrolitrów 3% Blockera A do każdego dołka płytki 6-Plex. Przykryj talerz folią, aby uniknąć światła. Włóż talerz z powrotem do lodówki o temperaturze czterech stopni Celsjusza i inkubuj przez noc.

Pod koniec inkubacji, po wyjęciu płytki z lodówki, należy usunąć cały bufor z płytki. Poklep talerz o ręczniki papierowe do wyschnięcia i umyj go trzykrotnie 150 mikrolitrami bufora do mycia na dołek za każdym razem. Osuszyć płytkę na ręczniku papierowym i podsycić 30 mikrolitrów antygenu surowicy z każdej studzienki płytki do inkubacji PCR przez noc do dwóch dołków płytki 6-Plex.

Przykryj płytkę folią, a następnie umieść płytkę na wytrząsarce do płytek i potrząsaj z prędkością 450 obr./min w temperaturze pokojowej przez godzinę. Wlej roztwór obecny na płytkę 6-Plex i umyj płytkę trzykrotnie 150 mikrolitrami 0,4 M buforu do przemywania chlorku sodu na studzienkę. Po zakończeniu trzeciego prania osusz płytkę o ręcznik papierowy i dodaj 150 mikrolitrów buforu do odczytu do każdej studzienki.

Poziomy sześciu autoprzeciwciał dla, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA i COVID-19A z testu 6-Plex ECL były dobrze skorelowane z odpowiadającymi im sześcioma pojedynczymi testami ECL i obecnym standardowym testem wiązania promieniotwórczego. Wartości indeksów dla każdej próbki dla wszystkich sześciu przeciwciał obliczono w odniesieniu do odpowiednich kontroli dodatnich i ujemnych. Zaobserwowano wartość indeksu większą niż wartość odcięcia, co wskazywało na wynik pozytywny.

Autoprzeciwciała w surowicy naruszyły antygen znakowany rutenem do antygenu biotynylowanego, tworząc kompleks ze specyficznym łącznikiem w celu zbudowania platformy multipleksowej. Taktyka ta sprawia, że badania przesiewowe na dużą skalę są bardziej wykonalne i skuteczniejsze w populacji ogólnej w kierunku cukrzycy typu pierwszej i chorób współistniejących, prowadząc do wczesnego przewidywania i zapobiegania chorobom.