Wysokoprzepustowe, multipleksowane badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i COVID-19
5 lipca 2022
Zgodnie z pilną potrzebą badań przesiewowych w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i choroby koronawirusowej 2019, opracowaliśmy wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 6-Plex do jednoczesnego wykrywania wszystkich czterech autoprzeciwciał wysp trzustkowych, autoprzeciwciał transglutaminazy tkankowej oraz przeciwciał przeciwko domenie wiążącej receptor koronawirusa 2 zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej.
Nowatorski test 6-Plex ECL jest pierwszym testem multipleksowym zwalidowanym i obecnie stosowanym w badaniu klinicznym w badaniach przesiewowych populacji ogólnej. Jednocześnie łączy sześć testów autoprzeciwciał odpowiednich do badań przesiewowych cukrzycy typu 1, celiakii i COVID-19 w dużej populacji. W porównaniu z obecnym standardowym testem autoprzeciwciał, technika ta może skuteczniej badać wiele autoprzeciwciał w kierunku wielu chorób autoimmunologicznych jednocześnie.
Implikacje tej techniki sprawią, że badania przesiewowe na dużą skalę staną się bardziej wykonalne i specyficzne dla choroby, prowadząc do wczesnego przewidywania choroby w celu zapobiegania i bardziej precyzyjnej diagnozy na potrzeby terapii. Na początek dodaj cztery mikrolitry biotynylowanego GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 i białka antygenu proinsuliny do probówki zawierającej 156 mikrolitrów 1% BSA i wymieszaj z 240 mikrolitrami odpowiednich łączników sprzężonych ze streptawidyną, 1, 2, 3, 8, 9 i 10. Następnie inkubuj mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Porcję 160 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej probówki i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Teraz weź 400 mikrolitrów roztworu mieszaniny z każdej probówki i połącz je ze sobą. Do mieszaniny dodać cztery mikrolitry znakowanego rutenem GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 i antygenu proinsuliny.
Następnie dodaj 1,6 mililitra roztworu zatrzymującego i 3,2 mililitra PBS. Dokładnie wymieszaj wszystkie składniki. A teraz roztwór antygenu jest gotowy do użycia w teście.
W przypadku 96-dołkowej płytki PCR należy podać siedem mikrolitrów surowicy na dołek i przykryć płytkę folią uszczelniającą. Następnie podgrzej surowicę w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 30 minut na maszynie do PCR i krótko odwiruj płytkę w temperaturze 100 razy G przez jedną minutę. Dodać 63 mikrolitry przygotowanego roztworu antygenu do dołka, wymieszać z surowicami i przykryć płytkę PCR folią uszczelniającą, aby uniknąć światła.
Potrząsaj płytką na wytrząsarce z prędkością 450 obr./min przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. A następnie inkubuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin. Weź talerz 6-Plex z lodówki o temperaturze czterech stopni Celsjusza, pozwalając talerzowi osiągnąć temperaturę pokojową.
Następnie dodaj 150 mikrolitrów 3% Blockera A do każdego dołka płytki 6-Plex. Przykryj talerz folią, aby uniknąć światła. Włóż talerz z powrotem do lodówki o temperaturze czterech stopni Celsjusza i inkubuj przez noc.
Pod koniec inkubacji, po wyjęciu płytki z lodówki, należy usunąć cały bufor z płytki. Poklep talerz o ręczniki papierowe do wyschnięcia i umyj go trzykrotnie 150 mikrolitrami bufora do mycia na dołek za każdym razem. Osuszyć płytkę na ręczniku papierowym i podsycić 30 mikrolitrów antygenu surowicy z każdej studzienki płytki do inkubacji PCR przez noc do dwóch dołków płytki 6-Plex.
Przykryj płytkę folią, a następnie umieść płytkę na wytrząsarce do płytek i potrząsaj z prędkością 450 obr./min w temperaturze pokojowej przez godzinę. Wlej roztwór obecny na płytkę 6-Plex i umyj płytkę trzykrotnie 150 mikrolitrami 0,4 M buforu do przemywania chlorku sodu na studzienkę. Po zakończeniu trzeciego prania osusz płytkę o ręcznik papierowy i dodaj 150 mikrolitrów buforu do odczytu do każdej studzienki.
Poziomy sześciu autoprzeciwciał dla, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA i COVID-19A z testu 6-Plex ECL były dobrze skorelowane z odpowiadającymi im sześcioma pojedynczymi testami ECL i obecnym standardowym testem wiązania promieniotwórczego. Wartości indeksów dla każdej próbki dla wszystkich sześciu przeciwciał obliczono w odniesieniu do odpowiednich kontroli dodatnich i ujemnych. Zaobserwowano wartość indeksu większą niż wartość odcięcia, co wskazywało na wynik pozytywny.
Autoprzeciwciała w surowicy naruszyły antygen znakowany rutenem do antygenu biotynylowanego, tworząc kompleks ze specyficznym łącznikiem w celu zbudowania platformy multipleksowej. Taktyka ta sprawia, że badania przesiewowe na dużą skalę są bardziej wykonalne i skuteczniejsze w populacji ogólnej w kierunku cukrzycy typu pierwszej i chorób współistniejących, prowadząc do wczesnego przewidywania i zapobiegania chorobom.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowatorski 6-pleksowy test elektrochemiluminescencyjny, zaprojektowany do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał związanych z cukrzycą typu 1, chorobą celiakią oraz COVID-19. Celem testu jest zwiększenie wydajności masowych badań przesiewowych w kierunku tych chorób autoimmunologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Autoiimmunizacja
- Diagnostyka kliniczna
- Testy elektrochemiluminescencyjne
Wstęp
- Cukrzyca typu 1 oraz celiakia to choroby autoimmunologiczne, które wymagają wczesnego wykrycia.
- COVID-19 przyniósł nowe wyzwania w zakresie przesiewowego wykrywania chorób autoimmunologicznych.
- Obecne metody przesiewowe są często nieefektywne i czasochłonne.
- Analizy multipleksowe mogą poprawić możliwości diagnostyki przesiewowej poprzez jednoczesne badanie wielu przeciwciał.
Cel badania
- Opracowanie wysokoprzepustowego testu do jednoczesnego wykrywania wielu autoprzeciwciał.
- Walidacja testu pod kątem zastosowania w badaniach klinicznych.
- Ułatwienie wczesnego przewidywania i zapobiegania chorobie.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworów antygenów z wykorzystaniem białek biotynylowanych i znakowanych rutenem.
- Inkubacja próbek surowicy z przygotowanymi roztworami antygenów.
- Wykorzystanie 96-dołkowej płytki PCR do przetwarzania próbek.
- Korelacja wyników z testami standardowymi w celu walidacji podejścia multipleksowego.
Główne wyniki
- Test 6-Plex ECL wykazał silną korelację z tradycyjnymi testami pojedynczymi.
- Wartości indeksu wskazały na obecność autoprzeciwciał w próbkach surowicy.
- Analiza ta umożliwia wydajny screening wielu chorób autoimmunizacyjnych.
- Wyniki potwierdzają możliwość przeprowadzenia przesiewowych badań populacyjnych na dużą skalę.
Wnioski
- Analiza 6-Plex ECL jest obiecującym narzędziem do wczesnego wykrywania chorób autoimmunologicznych.
- Metoda ta zwiększa efektywność procesów przesiewowych.
- Posiada ona potencjał do poprawy wyników leczenia pacjentów dzięki wczesnej interwencji.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zwalidowany test ECL 6-Plex umożliwia wysokoprzepustową, multipleksową detekcję autoprzeciwciał w cukrzycy typu 1, celiakii oraz COVID-19, odpowiadając na potrzebę efektywnego, specyficznego dla danych chorób przesiewu populacyjnego. Platforma ta zwiększa wiarygodność prognostyczną w najwcześniejszym punkcie zwrotnym na kontinuum od odkrycia do diagnozy, wspierając decyzje dotyczące portfela badań nad chorobami autoimmunologicznymi i zakaźnymi, skorygowane o poziom ryzyka. Jej zastosowanie jako podstawowego narzędzia przesiewowego wykazuje wpływ na poziomie przedsiębiorstwa na translacyjne i przedkliniczne przepływy pracy.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia jednoczesne badanie wielu celów autoimmunologicznych i wirusowych w pojedynczym formacie testu.
- Poprawia proces ograniczania ryzyka biologicznego poprzez rozróżnianie profili autoprzeciwciał specyficznych dla danej choroby.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie strategii wczesnego wykrywania i zapobiegania chorobom.
- Ułatwia selekcję projektów w portfolio dzięki dostarczaniu multipleksowych, ilościowych odczytów do walidacji celów.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane układy multipleksowe do dalszych etapów przesiewowych i analiz biomarkerów.
- Standaryzuje warunki analizy w celu zapewnienia powtarzalności oraz porównywalności ilościowej między próbkami.
- Umożliwia skalowalne przesiewy wysokoprzepustowe przy minimalnym zapotrzebowaniu na objętość surowicy.
- Wspiera rzetelną ocenę wpływu związków lub interwencji na wiele istotnych dla choroby biomarkerów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze strategiami dotyczącymi biomarkerów istotnych dla danej choroby, zapewniając ciągłość translacyjną od etapu odkrycia do walidacji klinicznej.
- Dostarcza wyników ilościowych, które stanowią podstawę do podejmowania decyzji o kontynuacji badań w fazie przedklinicznej z uwzględnieniem analizy ryzyka.
- Usprawnia redukcję ryzyka poprzez korelację multipleksowych profili autoprzeciwciał z początkiem i progresją choroby.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Test 6-Plex ECL integruje etapy wczesnego odkrywania, identyfikacji wiodących związków oraz badań translacyjnych, umożliwiając płynne przejście od weryfikacji hipotez do walidacji przedklinicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera rygorystyczną weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez multipleksową detekcję autoprzeciwciał.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki odpowiednie dla środowisk wysokoprzepustowego przesiewania.
- Analityka: Zapewnia wartości indeksowe oraz punkty decyzyjne oparte na wartościach odcięcia, umożliwiając porównania między różnymi warunkami oraz analizę statystyczną.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkryć z walidacją kliniczną poprzez dopasowanie detekcji biomarkerów do punktów końcowych istotnych dla przebiegu choroby.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy wielokrotnego użytku, skalowalną platformę dla przyszłych inicjatyw w zakresie multipleksowego przesiewania.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad chorobami autoimmunologicznymi i zakaźnymi na wczesnym etapie.
- Wartość operacyjna: Usprawnia procesy badawcze poprzez standaryzację, powtarzalność i skalowalność wysokoprzepustową.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne zarządzanie portfelem projektów dzięki dostarczaniu zmuksylowanych, praktycznych danych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój kandydatów w oparciu o solidne, zmuksylowane dowody z biomarkerów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w opracowywaniu multipleksowych testów immunoologicznych oraz detekcji elektrochemiluminescencyjnej.
- Wymaga dostępu do specjalistycznej aparatury do odczytów ECL oraz wysokoprzepustowego systemu obsługi płytek.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja protokołów testowych i potoków analizy danych.
- Może wymagać adaptacji do różnych typów próbek lub modeli chorób w miarę rozwoju potrzeb portfolio.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność rygorystycznej walidacji w odniesieniu do uznanych testów jednoparametrowych i testów radiowiązania.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Create Linker‐Coupled Antigen Solution
2:36
Preparation of Antigen Labeled Serum and the 6‐Plex Plate
3:54
Serum/Antigen Incubates Transfer into the 6‐Plex Plate
4:42
Washing the 6‐Plex Plate and Reading Buffer Addition
5:11
Results: Comparison of Antibody Levels Study Between the Single and the 6‐Plex ECL Assay
5:59
Conclusion
