Name: Wysokoprzepustowe, multipleksowane badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i COVID-19 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę multipleksowego wykrywania przeciwciał w cukrzycy typu 1, celiakii i COVID-19. Ta technika umożliwia efektywne badania przesiewowe dużych populacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie było wspierane przez grant JDRF 2--2019-695-S-B, 2--2020-965-S-B, 1--2017-564-M_N, grant NIH DK32083 oraz grant Centrum Badań nad Cukrzycą (DRC) P30 DK116073.

Protokół badawczy został zatwierdzony przez Colorado Multiple Institutional Review Board.
1. Przygotowanie bufora
<ol>
	<li>Przygotować bufor do etykietowania (2x PBS, pH 7,9): Dodać 100 ml 10x PBS do 400 ml wody destylowanej i dostosować pH za pomocą NaOH do 7,9.</li>
	<li>Zrobić 3 mM biotyny i Ru Sulfo-NHS: Rozpuść 1 mg biotyny w 588 μl buforu znakującego i rozpuść 150 nmol Ru Sulfo-NHS w 50 μl buforu znakującego.</li>
	<li>Przygotować bufor antygenu (1% BSA): Rozpuścić 5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 500 ml 1x PBS.</li>
	<li>Przygotować bufor powlekający (3% Bloker A): Rozpuścić 15 g Blokera A w 500 ml 1x PBS.</li>
	<li>Przygotuj pierwszy bufor do płukania (0,05 % Tween 20, PBST): Wymieszaj 2,5 ml Tween 20 w 5 000 ml 1x PBS.</li>
	<li>Przygotować drugi bufor do przemywania (0,4 M NaCl): Wymieszać 50 ml 5 M NaCl w 575 ml wody destylowanej, aby uzyskać 0,4 M roztwór NaCl. 
	UWAGA: Aby zapewnić skuteczne etykietowanie, zawsze używaj świeżo przygotowanych roztworów biotyny i Ru Sulfo-NHS, a nie wcześniej wyprodukowanych.</li>
</ol>
2. Znakowanie białka antygenowego osobno biotyną i Ru Sulfo-NHS
UWAGA: Wyższe stężenie białka antygenowego ≥0,5 mg/ml jest zalecane dla wyższej efektywności znakowania.
<ol>
	<li>Przygotuj sześć ukierunkowanych roztworów białek antygenowych, w tym proinsulinę,-65, IA-2, ZnT8, TG i domenę wiążącą receptor (RBD) białka kolca SARS-CoV-2. Obliczyć mole każdego białka antygenowego zgodnie z jego masą cząsteczkową i uzyskać odpowiednie proporcje molowe biotyny lub Ru Sulfo-NHS. Stosunek antygenu do sumy biotyny lub Ru Sulfo-NHS będzie wynosił 1:5 dla antygenów drobnocząsteczkowych (masa cząsteczkowa ≤10 kd), takich jak białko proinsuliny. W przypadku antygenów średniocząsteczkowych (masa cząsteczkowa 10-50 kd), takich jak ZnT8, stosunek dostosuje się do 1:10. W przypadku antygenów o dużej masie cząsteczkowej (masa cząsteczkowa >50 kd), takich jak, stosunek molowy będzie wynosił 1:20.</li>
	<li>Podzielić białko antygenu na dwie równe części i oddzielnie wymieszać je z biotyną i Ru Sulfo-NHS, stosując obliczony stosunek molowy w kroku 2.1. Mieszaninę inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 1,5 godziny, unikając światła. 
	UWAGA: Wszystkie redukujące substancje chemiczne, takie jak Tris lub glicyna w buforze białka antygenowego, muszą zostać usunięte przez kolumnę wirową zaklejającą zagruntowaną buforem 2x PBS (pH 7,9).</li>
	<li>Zalać kolumny wirowe 2x PBS (wielkość kolumny wirowej, 2 ml lub 5 ml, zależy od objętości znakującego białka antygenowego): Dodaj 1 ml buforu 2x PBS do kolumny wirowej, odwiruj ją przy 1,000 x g przez 2 minuty i powtórz krok jeszcze 2x.</li>
	<li>Pozwól, aby mieszanina białka antygenowego i biotyny lub -Ru Sulfo-NHS przeszła przez zagruntowaną kolumnę wirową 1x (odwirować kolumnę przy 1,000 x g przez 2 minuty) w celu oczyszczenia i zatrzymania reakcji znakowania.</li>
	<li>Zmierzyć końcową objętość znakowanego białka antygenowego eluowanego z kolumn wirowych, obliczając stężenia białka antygenowego znakowanego biotyną lub Ru Sulfo-NHS. Wykonać mniejsze porcje znakowanego białka antygenowego (50 μl/probówkę) i przechowywać je w temperaturze -80 °C do długotrwałego stosowania. 
	UWAGA: Pokrycie białka po każdej kolumnie wirowania będzie wynosić około 90%-95% wskaźnika retencji.</li>
</ol>
3. Zdefiniuj najlepsze stężenie i proporcje dla antygenów znakowanych biotyną i Ru Sulfo-NHS dla testu ECL 6-Plex (test szachownicy)
UWAGA: Test szachownicy dla każdego antygenu jest konieczny przed integracją z testem multipleksowanym.
<ol>
	<li>Zastosuj test szachownicy dla każdego antygenu osobno. 
	UWAGA: Kroki 3.2.-3.7. użyje TGA jako krótkiego przykładu. Proces testu szachownicy TGA polega na symulacji procesu testu, ale tylko z jednym rodzajem antygenu.</li>
	<li>Dokonać seryjnego rozcieńczenia biotynylowanego tTG i tTG znakowanego Ru Sulfo-NHS. Zalecane stężenia robocze pierwszego roztworu mieszaniny zaczynają się od 240 ng/ml zarówno dla tTG biotynylowanego, jak i znakowanego Ru Sulfo-NHS. Załóżmy, że stężenia zarówno oryginalnego tTG biotynylowanego, jak i znakowanego Ru Sulfo-NHS wynoszą 1,0 μg/μL. Wykonaj 10-krotne rozcieńczenie oryginalnego tTG znakowanego Ru Sulfo-NHS i 5-krotne rozcieńczenie oryginalnego biotynylowanego tTG z 5% BSA.</li>
	<li>Zmieszać 4 μl biotynylowanego białka tTG ze 156 μl 5% BSA (buforu antygenowego) i 240 μl łącznika sprzężonego ze streptawidyną w jednej probówce i inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 30 min. Następnie dodać 160 μl roztworu zatrzymującego i inkubować w temperaturze pokojowej przez kolejne 30 minut. Pobrać 400 μl mieszaniny i wymieszać z 2 ml roztworu zatrzymującego. Stężenie biotynylowanego tTG w mieszaninie wynosi 240 ng/ml.</li>
	<li>Aby wykonać seryjne rozcieńczenie antygenu ZnT8 znakowanego biotyną, należy przygotować kolejne pięć nowych probówek, pobrać 1 ml podwielokrotności z mieszaniny w kroku 3.3 i wymieszać z 1 ml roztworu zatrzymującego w nowej probówce i otrzymać mieszaninę o stężeniu 120 ng/ml. Powtórz ten krok, wykonaj seryjne rozcieńczenia 1:1 i uzyskaj tTG znakowany biotyną o stężeniach 60 ng/ml, 30 ng/ml, 15 ng/ml i 7,5 ng/ml.</li>
	<li>Dodać 4 μl tTG znakowanego Ru Sulfo-NHS z 1,6 ml roztworu zatrzymującego i otrzymać mieszaninę tTG znakowanego Ru Sulfo-NHS o stężeniu 240 ng / ml. Wykonując te same kroki 3.4., wykonaj seryjne rozcieńczenia 1:1 i uzyskaj antygen ZnT8 znakowany Ru Sulfo-NHS przy 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml, 7,5 ng / ml i 3,75 ng / ml. Ostatnie stężenie wynosi 0 ng / ml, tylko roztwór zatrzymujący i bez antygenu znakowanego Ru Sulfo-NHS.</li>
	<li>Przygotować próbki surowicy kontroli dodatniej i kontroli ujemnej tTG (wstępnie zakwalifikowane i standaryzowane za pomocą pojedynczego testu ECL tTG) oraz 96-dołkową płytkę PCR. Porcjować próbki dodatniej i ujemnej surowicy kontrolnej odpowiednio do lewej i prawej połowy płytki, po 7 μl w każdym dołku. Dodaj 1x PBS do płytki, po 33 μl na dołek.</li>
	<li>Na lewą połowę płytki PCR dodać 24 μl seryjnie rozcieńczonego roztworu łącznika tTG znakowanego biotyną do każdej studzienki, jednej kolumny z jednym stężeniem w kolejności od najwyższego do najniższego. W ten sam sposób dodać 16 μl seryjnie rozcieńczonego antygenu tTG znakowanego Ru Sulfo-NHS do każdej studzienki, jeden rząd o jednym stężeniu, a następnie dokładnie wymieszać. Powtórz krok na prawej połowie płytki PCR.</li>
	<li>Kontynuować pozostałe etapy oznaczania opisane w krokach 5.3-9.1, aż do uzyskania surowych danych dotyczących liczenia.</li>
	<li>Obliczyć stosunek sygnałów kontroli dodatniej do odpowiadających im sygnałów kontroli ujemnej. Określić najlepsze stężenie antygenu znakowanego biotyną i antygenu znakowanego Ru Sulfo-NHS o wyższych wartościach współczynnika i niższym tle dla ujemnej próbki kontrolnej. Optymalne stężenia robocze biotyny i białka antygenowego znakowanego Ru Sulfo-NHS przedstawiono poniżej: 16,0 ng/ml i 8,0 ng/ml dla GAD65, 18,8 ng/ml i 9,4 ng/ml dla SARS-CoV-2 RBD, 42,0 ng/ml i 42,0 ng/ml dla IA-2, 60,0 ng/ml i 60,0 ng/ml dla tTG, 4,2 ng/ml i 4,2 ng/ml dla ZnT8, oraz 31,3 ng/ml i 31,3 ng/ml dla proinsuliny.</li>
</ol>
4. Utwórz rozwiązanie antygenowe sprzężone z łącznikiem
<ol>
	<li>Rozcieńczyć antygeny znakowane biotyną i Ru Sulfo-NHS 5% BSA do optymalnych stężeń roboczych zgodnie z krokiem 3.9.</li>
	<li>Zwiąż wstępnie wybrane łączniki z każdym biotynylowanym białkiem antygenowym. W przypadku jednego testu na 96-dołkowej płytce dodać 4 μl biotynylowanych GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 i białka antygenu proinsuliny do oddzielnej probówki zawierającej 156 μl 1% BSA i wymieszać z 240 μl odpowiednich łączników sprzężonych ze streptawidyną 1, 2, 3, 8, 9 i 10 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Podamy 160 μl roztworu zatrzymującego do każdej probówki i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Z każdej probówki wyjąć 400 μl roztworu mieszaniny i połączyć je ze sobą.</li>
	<li>Dodaj 4 μl Ru Sulfo-NHS znakowanego GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 i antygenu proinsuliny do powyższej mieszaniny, a następnie dodaj 1,6 ml roztworu zatrzymującego i 3,2 ml 1x PBS i wymieszaj. Teraz roztwór antygenu jest gotowy do użycia w teście.</li>
</ol>
5. Inkubuj próbki surowicy z oznaczonym antygenem
<ol>
	<li>Podwielokrotność 7 μl surowicy na dołek na 96-dołkową płytkę PCR i przykryć folią uszczelniającą. Podgrzej surowicę w temperaturze 56 °C przez 30 minut na maszynie do PCR. Krótko odwirować płytkę o masie 100 x g przez 1 min.</li>
	<li>Dodać 63 μl roztworu antygenu (przygotowanego w kroku 4.4) do dołka i wymieszać z surowicami. Przykryj płytkę PCR folią uszczelniającą, aby uniknąć światła.</li>
	<li>Wytrząsać płytkę na wytrząsarce z prędkością 450 obr./min w czasie suchej temperatury przez 2 godziny, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez 18-24 godziny.</li>
</ol>
6. Przygotuj płytę 6-Plex
<ol>
	<li>Wyjmij płytkę 6-Plex z lodówki o temperaturze 4 °C, pozwalając, aby płyta znalazła się w RT. Dodaj 150 μl 3% Blockera A do każdego dołka płytki 6-Plex.</li>
	<li>Włóż płytkę z powrotem do lodówki o temperaturze 4 °C, przykryj płytkę folią, unikając światła, i inkubuj przez noc. 
	UWAGA: Etapy oznaczania w dniu 1 obejmują sekcje 4.-6.</li>
</ol>
7. Surowica/antygen przenosi się do płytki 6-Plex
<ol>
	<li>Następnego dnia wyjmij inkubującą płytkę 6-Plex z lodówki i wylej cały bufor z płytki. Poklep talerz o ręczniki papierowe do wyschnięcia.</li>
	<li>Za każdym razem umyj płytkę 6-Plex 150 μl buforu myjącego na studzienkę. Wysuszyć płytkę na ręcznikach papierowych, a podwielokrotna surowica/antygen inkubuje się z każdej studzienki płytki do inkubacji PCR przez noc do dwóch dołków płytki 6-Plex (30 μl na studzienkę w przypadku duplikatów).</li>
	<li>Przykryj płytkę folią, następnie umieść płytkę na wytrząsarce do płytek i potrząsaj z prędkością 450 obr./min przy RT przez 1 godzinę.</li>
</ol>
8. Umyj płytkę 6-Plex i dodaj bufor do odczytu.
<ol>
	<li>Wlać roztwór do płytki 6-Plex i za każdym razem przemyć płytkę 3 razy 150 μl 0,4 M buforu płuczącego NaCl na studzienkę.</li>
	<li>Po zakończeniu trzeciego prania osusz płytkę o ręcznik papierowy i dodaj 150 μl buforu do odczytu do każdej studzienki. 
	UWAGA: Pęcherzyki powietrza w studni wpływają na dokładność czytnika płytek i należy ich za wszelką cenę unikać.</li>
</ol>
9. Przeczytaj tabliczkę i przeanalizuj dane
<ol>
	<li>Policz płytkę w analizatorze elektrochemiluminescencji. Wyniki odczytu zostaną przedstawione wraz z wartościami w zliczeniach na sekundę (CPS). Obliczyć względny wskaźnik przeciwciał w każdej próbce, używając surowego CPS uzyskanego z maszyny odczytującej w stosunku do CPS wewnętrznej wzorca dodatnich i ujemnych kontroli każdego specyficznego przeciwciała (wartość indeksu = [CPS (próbka) - CPS (norma ujemna)] / [CPS (norma dodatnia) - CPS (norma ujemna)]).</li>
	<li>Określ ujemne lub dodatnie wyniki przeciwciał, korzystając z wartości odcięcia, które zostały ustalone na 99,5do 99,8 percentyla 555 ujemnych próbek kontrolnych z badania ASK (wszystkie ujemne próbki przeciwciał bez historii lub historii rodzinnej cukrzycy lub innego rodzaju choroby autoimmunologicznej). 
	UWAGA: Etapy testu w dniu 2 obejmują sekcje 7-9.</li>
</ol>

<ol><li>Group, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Environmental+Determinants+of+Diabetes+in+the+Young+%28TEDDY%29+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY) Study.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1150, 1-13 (2008).</li>
<li>Vehik, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+incidence+of+type+1+diabetes+in+0-+to+17-year-old+Colorado+youth%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth.</a> Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).</li>
<li>Insel, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+presymptomatic+type+1+diabetes%3A+a+scientific+statement+of+JDRF%2C+the+Endocrine+Society%2C+and+the+American+Diabetes+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association.</a> Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).</li>
<li>Stahl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+screening+for+celiac+disease%3A+The+autoimmunity+screening+for+kids+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mass screening for celiac disease: The autoimmunity screening for kids study.</a> The American Journal of Gastroenterology. 116 (1), 180-187 (2021).</li>
<li>Al-Hussaini, A., Sulaiman, N., Al-Zahrani, M., Alenizi, A., El Haj, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+celiac+disease+among+Saudi+children+with+type+1+diabetes%3A+A+prospective+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High prevalence of celiac disease among Saudi children with type 1 diabetes: A prospective cross-sectional study.</a> BMC Gastroenterology. 12, 180(2012).</li>
<li>Agardh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+features+of+celiac+disease%3A+A+prospective+birth+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Clinical features of celiac disease: A prospective birth cohort.</a> Pediatrics. 135 (4), 627-634 (2015).</li>
<li>Jaime, G., Deville, E. S., Ouellette, C. P. COVID-19: Clinical manifestations and diagnosis in children. UpToDate. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-manifestations-and-diagnosis-in-children/print">https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-manifestations-and-diagnosis-in-children/print</a> (2021).</li>
<li>Barron, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+type+1+and+type+2+diabetes+with+COVID-19-related+mortality+in+England%3A+a+whole-population+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Diabetes+%26+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Associations of type 1 and type 2 diabetes with COVID-19-related mortality in England: a whole-population study.</a> The Lancet Diabetes & Endocrinology. 8 (10), 813-822 (2020).</li>
<li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemiluminescence+assays+for+insulin+and+glutamic+acid+decarboxylase+autoantibodies+improve+prediction+of+type+1+diabetes+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Technology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Electrochemiluminescence assays for insulin and glutamic acid decarboxylase autoantibodies improve prediction of type 1 diabetes risk.</a> Diabetes Technology & Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).</li>
<li>Jia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+SARS-CoV-2+antibodies+in+children+and+adults+with+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Technology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Prevalence of SARS-CoV-2 antibodies in children and adults with Type 1 diabetes.</a> Diabetes Technology & Therapeutics. 23 (7), 517-521 (2021).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+multiplex+electrochemiluminescence+assay+applicable+to+general+population+screening+for+type+1+diabetes+and+celiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Technology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">High-throughput multiplex electrochemiluminescence assay applicable to general population screening for type 1 diabetes and celiac disease.</a> Diabetes Technology & Therapeutics. , (2022).</li>
<li>McQueen, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+and+cost-effectiveness+of+large-scale+screening+for+type+1+diabetes+in+Colorado%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Cost and cost-effectiveness of large-scale screening for type 1 diabetes in Colorado.</a> Diabetes Care. 43 (7), 1496-1503 (2020).</li>
<li>Insel, R. A., Dunne, J. L., Ziegler, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+population+screening+for+type+1+diabetes%3A+has+its+time+come%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Endocrinology+%26+Diabetes+and+Obesity%22%5BJournal%5D)">General population screening for type 1 diabetes: has its time come.</a> Current Opinion in Endocrinology & Diabetes and Obesity. 22 (4), 270-276 (2015).</li>
<li>Ziegler, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3+Screen+ELISA+for+high-throughput+detection+of+beta+cell+autoantibodies+in+capillary+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Technology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">3 Screen ELISA for high-throughput detection of beta cell autoantibodies in capillary blood.</a> Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).</li>
<li>Cortez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+multiple+islet+autoantibodies+in+type+1+diabetes+using+small+sample+volumes+by+agglutination-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of multiple islet autoantibodies in type 1 diabetes using small sample volumes by agglutination-PCR.</a> PLoS One. 15 (11), 0242049(2020).</li>
<li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECL-IAA+and+ECL-GADA+can+identify+high-risk+single+autoantibody-positive+relatives+in+the+TrialNet+pathway+to+prevention+study%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Technology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">ECL-IAA and ECL-GADA can identify high-risk single autoantibody-positive relatives in the TrialNet pathway to prevention study.</a> Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinsulin%2FInsulin+autoantibodies+measured+with+electrochemiluminescent+assay+are+the+earliest+indicator+of+prediabetic+islet+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity.</a> Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).</li>
<li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAD65+autoantibodies+detected+by+electrochemiluminescence+assay+identify+high+risk+for+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+persistent+insulin+autoantibodies+with+differential+risk%3A+Nonradioactive+bivalent+proinsulin%2Finsulin+autoantibody+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: Nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay.</a> Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+sensitivity+and+earlier+identification+of+celiac+disease+autoimmunity+by+a+nonradioactive+assay+for+transglutaminase+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Higher sensitivity and earlier identification of celiac disease autoimmunity by a nonradioactive assay for transglutaminase autoantibodies.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 2904563(2016).</li>
<li>Jia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+ZnT8+autoantibodies+by+electrochemiluminescence+assay+improve+risk+prediction+for+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">High-affinity ZnT8 autoantibodies by electrochemiluminescence assay improve risk prediction for type 1 diabetes.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (12), 3455-3463 (2021).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete-panel+islet+autoantibody+multiplex+ECL+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">A complete-panel islet autoantibody multiplex ECL assay.</a> Diabetes. 70, Supplement 1 158(2021).</li>
<li>Achenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+high-affinity+immune+responses+to+%28pro%29insulin+anticipate+the+autoimmune+cascade+that+leads+to+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation. 114 (4), 589-597 (2004).</li>
<li>Schlosser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+insulin-autoantibody-positive+children+from+the+general+population%2C+antibody+affinity+identifies+those+at+high+and+low+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">In insulin-autoantibody-positive children from the general population, antibody affinity identifies those at high and low risk.</a> Diabetologia. 48 (9), 1830-1832 (2005).</li>
<li>Mayr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAD+autoantibody+affinity+and+epitope+specificity+identify+distinct+immunization+profiles+in+children+at+risk+for+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">GAD autoantibody affinity and epitope specificity identify distinct immunization profiles in children at risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 56 (6), 1527-1533 (2007).</li>
<li>Siljander, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+insulin+autoantibody+affinity+as+a+predictive+marker+for+type+1+diabetes+in+young+children+with+HLA-conferred+disease+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2FMetabolism+Research+and+Reviews%22%5BJournal%5D)">Role of insulin autoantibody affinity as a predictive marker for type 1 diabetes in young children with HLA-conferred disease susceptibility.</a> Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 25 (7), 615-622 (2009).</li>
<li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+multiplexed+autoantibody+detection+to+screen+type+1+diabetes+and+multiple+autoimmune+diseases+simultaneously%5BTitle%5D)+AND+%22Ebiomedicine%22%5BJournal%5D)">High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously.</a> Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).</li>
<li>Jia, X., He, L., Gu, Y., High, H., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+electrochemiluminescence+7-plex+assay+simultaneously+screening+for+type+1+diabetes+and+multiple+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A high-throughput electrochemiluminescence 7-plex assay simultaneously screening for type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases.</a> Journal of Visualized Experiments. (159), e61160(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Interwencja w leczeniu cukrzycy typu 1 weszła w erę poprzedzającą cukrzycę typu 1, w której trwają krajowe i międzynarodowe programy badań przesiewowych na dużą skalę w kierunku cukrzycy typu 1 oraz dynamicznie rozwijające się badania kliniczne stosowane w stadium 1 cukrzycy typu 1 w celu zniesienia lub spowolnienia progresji do klinicznej cukrzycy typu 112,13. Pomiary czterech IAb przy użyciu obecnego standardu RBA z pojedynczym formatem testu IAb są pracochłonne i nieefektywne w przypadku programu masowych badań przesiewowych. Wraz z pilnym zapotrzebowaniem na wysokoprzepustowy multipleksowany test IAbs, multipleksowany test ECL, 3-ekranowy test ICA ELISA oraz wykrywanie przeciwciał metodą aglutynacji-PCR (ADAP) stały się obecnie konkurencyjnymi technologiami. W badaniu Fr1da dotyczącym badań przesiewowych w kierunku cukrzycy typu 1 w populacji małych dzieci w Niemczech, jako główny test zastosowano 3-przesiewowy test ICA ELISA łączący 3 IAb (, IA-2A i ZnT8A)14. Głównym ograniczeniem 3-ekranowego testu ICA ELISA jest brak IAA, który jest w większości pierwszym IAb, który pojawia się z dużą częstością występowania u małych dzieci z cukrzycą typu 1. Ponadto test nie jest w stanie odróżnić, który z trzech IAb jest dodatni od pozytywnego sygnału, a każda dodatnia próbka musi zostać powtórzona z trzema pojedynczymi testami w celu potwierdzenia. ADAP15 łączy, IA-2A i IAA i zilustrował wysoką czułość i swoistość testu podczas warsztatów IASP, ale brakuje danych dotyczących jego predykcyjności w populacyjnych badaniach przesiewowych w kierunku cukrzycy typu 1, których warsztaty IASP nie są w stanie określić. Multipleksowy test ECL w niniejszym badaniu jest zbudowany na platformie pojedynczego testu ECL, który został zwalidowany pod kątem obecnego standardu RBA w wielu badaniach klinicznych, takich jak TrailNet 9,16, DAISY 17,18,19 i ASK 4,20,21 studiować. Niniejszy test został zwalidowany zarówno w stosunku do RBA, jak i pojedynczego testu ECL przy użyciu 880 próbek surowicy od uczestników badania ASK. Jak pokazano na rycinie 2 i rycinie 3, poziomy przeciwciał między 6-Plex a pojedynczym ECL lub między 6-Plex a RBA były w większości zgodne ze sobą pod względem dodatniej skuteczności przeciwciał. Współczynniki koincydencji IAb testowanych przez RBA i 6-Plex wynosiły 91,7%-97,8%, a współczynniki koincydencji IAb testowanych przez pojedyncze ECL i 6-Plex wynosiły 95,3%-99,2%. Rozbieżność między testem ECL a RBA dotyczyła głównie osób z pojedynczym IAb. Poziomy IAb testowane przez 6-Plex i pojedynczy ECL (r = 0,6431-0,9434, wszystkie p < 0,0001) oraz 6-Plex i RBA (r = 0,5775-0,8576, wszystkie p < 0,0001) były również dobrze skorelowane. TGA testowane testem 6-Plex były silnie skorelowane z wynikami zarówno testu RBA (99,4%), jak i pojedynczego testu ECL (99,4%). Dodatkowo, COVID-19A testowany przez 6-Plex osiągnął 99,8% zgodność z wynikami pojedynczego testu ECL.
W rezultacie, test ECL 6-Plex został formalnie zaakceptowany jako podstawowa metoda przesiewowa dla trwającego badania ASK i zastąpił standardową RBA22. Test ten wykazał doskonałą czułość i swoistość przy wyższej przepustowości, niższych kosztach i mniejszej objętości surowicy w porównaniu ze standardowym RBA.
Udokumentowano, że w badaniu przesiewowym T1D pojedynczy IAb wykryty przez RBA, który stanowił dużą część dodatnich wyników IAb, miał niskie powinowactwo, niskie ryzyko choroby i skutkował ogólnie niską wartością predykcyjną 19,21,23,24,25,26 . Tak niskie przewidywanie ryzyka spowodowało ogromne dodatkowe koszty wizyt kontrolnych i spowodowało trudności w badaniach profilaktycznych nad cukrzycą typu 1. W wielu badaniach klinicznych wykazano, że uznana platforma testowa ECL pozwala na odróżnienie IAb o wysokim powinowactwie od IAb o niskim powinowactwie generowanych przez RBA i znaczne zwiększenie wartości predykcyjnych dla wszystkich czterech IAb, zwłaszcza w przypadku pojedynczego dodatniego IAb 16,17,18,21. Technologia multipleksowego testu ECL została zbudowana na platformie pojedynczego testu ECL, z tą wyraźną zaletą, jaką jest wykrywanie Abs o wysokim powinowactwie. W niniejszym badaniu test ECL 6-Plex zilustrował jego podobieństwo do odpowiadających mu testów z pojedynczym ECL pod względem czułości i swoistości.
Niektóre ograniczenia i problemy techniczne związane z testem ECL multiplex przy użyciu wielu płytek Plex zostały już omówione w poprzednich publikacjach27,28. Przy sześciu znakowanych antygenach w jednym dołku mogą występować pewne wpływy między różnymi antygenami, a tło testu może wzrosnąć po dodaniu każdego testu przeciwciał do multipleksowania w tym samym dołku. Potrzebna jest duża ilość prac optymalizacyjnych w celu dostosowania warunków testu, w szczególności w celu dostosowania końcowych stężeń każdego znakowanego białka antygenowego w oparciu o test szachownicy dla każdego antygenu, w celu utrzymania czułości i swoistości dla każdego testu przeciwciał. Jak wspomniano w poprzednich badaniach27,28, niewielka liczba próbek (<1%) skutkuje fałszywie dodatnim wynikiem na płytce wielokrotnej Plex bez wyraźnej przyczyny. Wszystkie dodatnie wyniki należy powtórzyć i potwierdzić pojedynczym testem ECL w ramach rutynowego laboratoryjnego zapewnienia jakości; Zazwyczaj fałszywe alarmy są usuwane. W niniejszym badaniu nie zaobserwowano wyników fałszywie ujemnych spowodowanych "efektem prozonu" zaobserwowanym w poprzednim teście ECL 7-Plex27,28. W opisanym tutaj teście usunęliśmy etap obróbki kwasem próbek surowicy z poprzedniego protokołu; zamiast tego podgrzaliśmy próbki surowicy w temperaturze 56 °C przez 30 minut (krok 5.1.). W drugim dniu mycia talerzy użyliśmy bufora myjącego zawierającego 0,4 M NaCl (krok 8.1.) zamiast zwykłego buforu myjącego, aby bardziej rygorystycznie umyć płytkę. Modyfikacje te sprawiły, że multipleksowy test ECL stał się prostszy i obniżył tło bez utraty czułości testu.
Podsumowując, test ten ma wyjątkową wydajność w wykrywaniu jednocześnie czterech IAb, TGA i COVID-19A. Funkcja multipleksowania, a także wysoka przepustowość, niski koszt i małe zapotrzebowanie na objętość surowicy sprawiają, że badania przesiewowe na dużą skalę w kierunku cukrzycy typu 1 i chorób współistniejących są znacznie bardziej wykonalne w populacji ogólnej. Pacjenci z cukrzycą typu 1 lub jakąkolwiek chorobą autoimmunologiczną mają znacznie większe ryzyko wystąpienia innych chorób autoimmunologicznych. Multipleksowy test ECL stanowi doskonałą platformę do jednoczesnych badań przesiewowych w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu chorób autoimmunologicznych.

Duże badania epidemiologiczne na całym świecie pokazują, że częstość występowania cukrzycy typu 1 (T1D) gwałtownie wzrasta o 3%-5% rocznie, a częstość występowania cukrzycy typu 1 podwoiła się w ciągu ostatnich 20 lat, szczególnie u małych dzieci1,2. Autoprzeciwciała przeciwko wyspom trzustkowym (IAb) zwykle pojawiają się wiele lat przed objawami klinicznymi i są obecnie najbardziej wiarygodnymi biomarkerami predykcyjnymi i diagnostycznymi dla T1D3. Badania przesiewowe w kierunku autoprzeciwciał przeciwko cukrzycy typu 1 mogą zidentyfikować osoby zagrożone progresją do klinicznej cukrzycy typu 1, edukować społeczeństwo, znacznie zmniejszyć zagrażające życiu powikłania kwasicy ketonowej i przynieść korzyści w badaniach klinicznych dotyczących terapii profilaktycznych. Na całym świecie prowadzone są działania prewencyjne w kierunku cukrzycy typu 1 i przeprowadza się wiele badań interwencyjnych wśród osób z dodatnim wynikiem IAbs w celu opóźnienia progresji do klinicznej cukrzycy typu 1, a Barbara Davis Center for Diabetes rozpoczęło pierwsze amerykańskie badanie kliniczne badań przesiewowych w populacji ogólnej w 2016 r. w kierunku cukrzycy typu 1 i celiakii, Autoimmunity Screening for the Kids (ASK)4. Celiakia (CD) jest przewlekłą chorobą zapalną jelit związaną z czynnikami immunologicznymi i genetycznymi. Częstość występowania CD u dzieci z cukrzycą typu 1 może sięgać nawet 24,5%5. Ponad połowa osób z CD może nie mieć typowych objawów w momencie prezentacji6, więc serologiczne badania przesiewowe w kierunku celiakii są jak najbardziej konieczne.
Od początku pandemii choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19) na całym świecie zgłoszono ponad 200 milionów przypadków, a dzieci stanowią do 16% potwierdzonych laboratoryjnie przypadków7. Wiele badań wykazało wpływ istniejącej cukrzycy typu 1 na ciężkość i śmiertelność zakażenia COVID-19 8, podczas gdy wpływ zakażenia COVID-19 na rozwój cukrzycy typu 1 nie jest jasny. Badanie całkowitego wskaźnika zakażeń COVID-19 w populacji ogólnej poprzez oznaczenie przeciwciał przeciwko koronawirusowi zespołu ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-COV-2) oraz badanie związku między zakażeniem COVID-19 a wywołaniem autoimmunizacji T1D lub przyspieszeniem progresji T1D jest pilnie potrzebne i bardzo ważne, a trwające badanie ASK stanowi do tego doskonałą platformę. Ze względu na pojedynczy format testu i generowanie dużej ilości dodatnich przeciwciał o niskim powinowactwie, standardowy test wiązania promieniotwórczego (RBA) napotkał wąskie gardło w postaci niskiej skuteczności i niskiej swoistości choroby9. W niniejszej pracy przedstawiamy nowatorski test elektrochemiluminescencji 6-pleksowej (ECL) zbudowany na naszej poprzedniej platformie testowej multipleksowej ECL przy użyciu płytki Multiple-Plex, łączącej sześć testów autoprzeciwciał w jednym dołku, w tym wszystkie cztery główne IAb na insulinę (IAA), dekarboksylazę kwasu glutaminowego-65 (), antygen insulinoma-2 (IA-2A) i transport-8 (ZnT8A), autoprzeciwciała przeciwko transglutaminazie (TGA) w celiakii, oraz przeciwciała przeciwko domenie wiążącej receptor SARS-CoV-2 (RBD) (COVID-19A). Jest to pierwszy test multipleksowy, w którym zrekrutowano pełny panel czterech głównych IAb, a następnie połączono go z TGA i COVID-19A. Został on zatwierdzony i formalnie zaakceptowany jako podstawowe narzędzie przesiewowe zastępujące standardowe RBA w badaniu ASK.

<table><tbody><tr><td>5 mM</td><td>NaCl ThermoFisher</td><td>1070832</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa wytrząsarka</td><td>płytkowa VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa okrągła płyta dolna</td><td>Fisher</td><td>8408220</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>PI21329</td><td></td></tr><tr><td>Blocker A</td><td>MSD</td><td>R93AA</td><td></td></tr><tr><td>Butelka 500 ml Filtr</td><td>Fisher</td><td>0974064A</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>Sigma</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Białko GAD65</td><td>Diamyd Medical</td><td>10-65702-01</td><td></td></tr><tr><td>Białko IA-2 (AA 605-979)</td><td>Creative BioMart</td><td>283309</td><td></td></tr><tr><td>MESO QuickPlex SQ120</td><td>MSD</td><td>R31QQ-3</td><td>Analizator elektrochemiluminescencji</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>ThermoFisher</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Białko proinsulinowe</td><td>AmideBio</td><td>20160118B3</td><td></td></tr><tr><td>Bufor odczytu B</td><td>MSD</td><td>Y0800019</td><td></td></tr><tr><td>białko RBD SARS-CoV-2</td><td>Creative Biomart</td><td>Spike-190V</td><td></td></tr><tr><td>Stop Solution</td><td>MSD</td><td>Y0090019</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-TAG</td><td></td><td></td> MSD R91AO-1 <td></td></tr><tr><td>tTG</td><td>Diarect AG</td><td>15201</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P-1379</td><td></td></tr><tr><td>U-Plex 6-testowa płytka SECTOR</td><td>MSD</td><td>Z00U0142E</td><td>6-plex</td></tr><tr><td>Linker U-PLEX 1</td><td>MSD</td><td>L0010022</td><td></td></tr><tr><td>U-PLEX Linker 10</td><td>MSD</td><td>L0100020</td><td></td></tr><tr><td>U-PLEX Linker 2</td><td>MSD</td><td>L0020015</td><td></td></tr><tr><td>U-PLEX Linker 3</td><td>MSD</td><td></td><td></td>L0030018</tr><tr><td>U-PLEX Linker 8</td><td>MSD</td><td>L0080018</td><td></td></tr><tr><td>U-PLEX Linker 9</td><td>MSD</td><td>L0090014</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna ZeBa</td><td>ThermoFisher</td><td>89892</td><td>Kolumny wirujące</td></tr><tr><td>Laboratorium Badawcze</td><td>Białka ZnT8</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe, multipleksowane badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i covid-19

A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19

Trwające badanie kliniczne, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), jest pierwszym badaniem przesiewowym w populacji ogólnej w kierunku cukrzycy typu 1 (T1D) i celiakii w Stanach Zjednoczonych. W związku z pandemią choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19) pilnie potrzebna jest epidemiologia COVID-19 w populacji ogólnej oraz wiedza na temat związku między zakażeniem COVID-19 a rozwojem cukrzycy typu 1. Obecnie standardowa metoda przesiewowa testu wiązania promieniotwórczego (RBA) sprostała dwóm wielkim wyzwaniom: niskiej skuteczności przy pojedynczym formacie testu i niskiej swoistości choroby przy dużym odsetku przeciwciał o niskim powinowactwie generowanych podczas badań przesiewowych. Dzięki opracowanej wcześniej platformie multipleksowego testu elektrochemiluminescencji (ECL), opracowano nowatorski test ECL 6-Plex, który łączy w jednym dołku wszystkie cztery autoprzeciwciała wysp trzustkowych (IAb) przeciwko insulinie, dekarboksylazie kwasu glutaminowego (GAD65), antygenowi insulinoma 2 (IA-2) i transporterowi 8 (ZnT8) dla T1D, autoprzeciwciałom przeciwko transglutaminazie (TGA) w przypadku celiakii i przeciwciałom przeciwko koronawirusowi zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) wiążącemu receptor (RBD) dla COVID-19. Test został zwalidowany w ślepej próbie przy użyciu 880 próbek z badania ASK, w tym 325 próbek dodatnich i 555 próbek wszystkich ujemnych pod względem przeciwciał, i porównany ze standardowymi RBA i pojedynczym testem ECL. Dzięki zaletom wysokiej skuteczności, niskiego kosztu i małej objętości surowicy, test ten został zaakceptowany jako podstawowe narzędzie przesiewowe w badaniu ASK.

Tabela 1, Tabela 2 oraz Tabela 3 przedstawiają reprezentatywne wyniki. Surowe wartości CPS uzyskane z czytnika przedstawiono w Tabeli 1. W Tabeli 2 surowe wartości CPS zostały uporządkowane i pogrupowane według sześciu łączników i odpowiadających im przeciwciał. Tabela 3 przedstawia obliczone wartości wskaźnika z wykorzystaniem CPS, zgodnie z opisem w protokole badania. Wszystkie surowe wartości zliczania należy sprawdzić, aby uniknąć błędnych końcowych wyników wskaźnika spowodowanych wadliwymi powtórzeniami. W Tabeli 1 podano przykłady wadliwych powtórzeń, które doprowadziły do błędu w końcowym obliczeniu wskaźnika w Tabeli 3.
Test ten został zwalidowany w sposób zaślepiony z wykorzystaniem 880 wybranych próbek z badania ASK, w tym 325 próbek dodatnich pod kątem IAbs oraz 555 próbek ujemnych pod kątem wszystkich Abs. Poziomy autoprzeciwciał uzyskane w teście 6-Plex ECL dla 880 próbek porównano punkt po punkcie z poziomami z odpowiadających im pojedynczych testów ECL (Rysunek 2) oraz z odpowiednimi pojedynczymi standardowymi testami RBA (Rysunek 3). Wartość odcięcia, czułość i swoistość dla każdego przeciwciała przedstawiono w Tabeli 4. Czułość i swoistość tego testu ECL-COVID-19A określono odpowiednio na 100% i 99,9%10.
<img alt="Proces wykrywania autoprzeciwciał; schemat z opisanymi antygenami, płytka do analizy; metoda immunoanalizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ilustracja testu 6-Plex ECL. Autoprzeciwciała surowicze łączą antygen znakowany Ru Sulfo-NHS z antygenem biotynilowanym, który jest sprzężony ze specyficznym łącznikiem, tworząc kompleks antygen-przeciwciało-antygen-łącznik. Kompleksy są wychwytywane za pomocą każdego specyficznego łącznika w odpowiednich miejscach na płytce 6-Plex. Dla każdego antygenu przypisano numery specyficznych łączników: GAD-linker-1, Covid-19-linker-2, IA-2-linker-3, tTG-linker-8, ZnT8-linker-9 oraz Proinslulin-linker-10. Rycina została zmodyfikowana za zgodą He i wsp.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy rozrzutu porównujące poziomy Single vs. 6-Plex ECL w analizie przeciwciał, wykazujące korelacje." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Porównanie poziomów sześciu przeciwciał w 880 próbkach z badania ASK pomiędzy pojedynczym testem ECL a testem 6-Plex ECL. Panele przedstawiają porównania poziomów przeciwciał odpowiednio dla GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA oraz COVID-19A (indeks COVID-19A został przedstawiony jako (100 x obliczona wartość indeksu)). Linie przerywane reprezentują wartości odcięcia dla każdego testu przeciwciał. Rycina została zmodyfikowana za zgodą He i wsp.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wielokrotne wykresy rozrzutu korelacji, wykrywanie autoprzeciwciał, RBA vs 6-Plex ECL, analiza wyników." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Porównanie poziomów pięciu przeciwciał w 880 próbkach z badania ASK pomiędzy metodą RBA a testem 6-Plex ECL. Panele przedstawiają porównania poziomów przeciwciał odpowiednio dla GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A i TGA. Linie przerywane reprezentują wartości odcięcia (cutoff) dla każdego testu przeciwciał. Rycina została zmodyfikowana za zgodą He i wsp.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Surowe wartości zliczeń CPS (lewa połowa płytki). Surowe wartości zliczeń CPS uzyskane z lewej połowy płytki analitycznej. Każda próbka została wykonana w duplikacie. Każde zliczenie CPS w tej samej kolumnie (A1, A2, A3 itd.) reprezentuje dane odczytowe z 10 punktów w tej samej studience (oznaczono odpowiadające im numery linkerów). Przykłady błędnych duplikatów są wyróżnione na szaro, jak widać w wierszu D-linker 3 w kolumnie 5 i kolumnie 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Układ danych z Tabeli 1, uporządkowany według sześciu łączników. Wartości CPS z Tabeli 1 zostały przeorganizowane poprzez obliczenie średnich wartości dla powtórnych odczytów CPS oraz usunięcie niewykorzystanych wartości dla łączników 4-7. Wartości wewnętrznego standardu wysokiej kontroli dodatniej, niskiej kontroli dodatniej oraz kontroli ujemnej dla każdego testu autoprzeciwciał zaznaczono ciemną pogrubioną czcionką. PC, kontrola dodatnia. NC, kontrola ujemna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%202.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Wyniki wartości indeksu. Wartości indeksu dla każdej próbki dla wszystkich sześciu przeciwciał obliczono w odniesieniu do odpowiadających im kontroli pozytywnej i negatywnej. Wartość indeksu wyższa niż wartość odcięcia została zdefiniowana jako dodatnia i zaznaczona pogrubioną czcionką. Błędne wartości duplikatów CPS w Tabeli 1, wiersz D-linker 3 – kolumny 5 i 6, doprowadziły do dodatniej wartości indeksu IA-2A dla próbki 11 (wyróżnionej na szaro), co prawdopodobnie było wynikiem fałszywie dodatnim. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table_3.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 4: Odcięcie testu, czułość i swoistość dla GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA i TGA wśród 880 próbek ASK, w tym 325 próbek dodatnich pod kątem IAbs i 555 próbek ujemnych pod kątem wszystkich przeciwciał.Optymalna wartość indeksu odcięcia dla testów GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA i TGA została ustalona na poziomie co najmniej 99. percentyla z 555 próbek kontrolnych prawidłowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%204.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Zgodnie z pilną potrzebą badań przesiewowych w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i choroby koronawirusowej 2019, opracowaliśmy wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 6-Plex do jednoczesnego wykrywania wszystkich czterech autoprzeciwciał wysp trzustkowych, autoprzeciwciał transglutaminazy tkankowej oraz przeciwciał przeciwko domenie wiążącej receptor koronawirusa 2 zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej.

Wysokoprzepustowe, multipleksowane badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i COVID-19

An ongoing clinical trial, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), is the first screening study in the general population for type 1 diabetes (T1D) and ...

Nowatorski test 6-Plex ECL jest pierwszym testem multipleksowym zwalidowanym i obecnie stosowanym w badaniu klinicznym w badaniach przesiewowych populacji ogólnej. Jednocześnie łączy sześć testów autoprzeciwciał odpowiednich do badań przesiewowych cukrzycy typu 1, celiakii i COVID-19 w dużej populacji. W porównaniu z obecnym standardowym testem autoprzeciwciał, technika ta może skuteczniej badać wiele autoprzeciwciał w kierunku wielu chorób autoimmunologicznych jednocześnie.Implikacje tej techniki sprawią, że badania przesiewowe na dużą skalę staną się bardziej wykonalne i specyficzne dla choroby, prowadząc do wczesnego przewidywania choroby w celu zapobiegania i bardziej precyzyjnej diagnozy na potrzeby terapii. Na początek dodaj cztery mikrolitry biotynylowanego GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 i białka antygenu proinsuliny do probówki zawierającej 156 mikrolitrów 1% BSA i wymieszaj z 240 mikrolitrami odpowiednich łączników sprzężonych ze streptawidyną, 1, 2, 3, 8, 9 i 10. Następnie inkubuj mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Porcję 160 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej probówki i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Teraz weź 400 mikrolitrów roztworu mieszaniny z każdej probówki i połącz je ze sobą. Do mieszaniny dodać cztery mikrolitry znakowanego rutenem GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 i antygenu proinsuliny.Następnie dodaj 1,6 mililitra roztworu zatrzymującego i 3,2 mililitra PBS. Dokładnie wymieszaj wszystkie składniki. A teraz roztwór antygenu jest gotowy do użycia w teście.W przypadku 96-dołkowej płytki PCR należy podać siedem mikrolitrów surowicy na dołek i przykryć płytkę folią uszczelniającą. Następnie podgrzej surowicę w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 30 minut na maszynie do PCR i krótko odwiruj płytkę w temperaturze 100 razy G przez jedną minutę. Dodać 63 mikrolitry przygotowanego roztworu antygenu do dołka, wymieszać z surowicami i przykryć płytkę PCR folią uszczelniającą, aby uniknąć światła.Potrząsaj płytką na wytrząsarce z prędkością 450 obr./min przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. A następnie inkubuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin. Weź talerz 6-Plex z lodówki o temperaturze czterech stopni Celsjusza, pozwalając talerzowi osiągnąć temperaturę pokojową.Następnie dodaj 150 mikrolitrów 3% Blockera A do każdego dołka płytki 6-Plex. Przykryj talerz folią, aby uniknąć światła. Włóż talerz z powrotem do lodówki o temperaturze czterech stopni Celsjusza i inkubuj przez noc.Pod koniec inkubacji, po wyjęciu płytki z lodówki, należy usunąć cały bufor z płytki. Poklep talerz o ręczniki papierowe do wyschnięcia i umyj go trzykrotnie 150 mikrolitrami bufora do mycia na dołek za każdym razem. Osuszyć płytkę na ręczniku papierowym i podsycić 30 mikrolitrów antygenu surowicy z każdej studzienki płytki do inkubacji PCR przez noc do dwóch dołków płytki 6-Plex.Przykryj płytkę folią, a następnie umieść płytkę na wytrząsarce do płytek i potrząsaj z prędkością 450 obr./min w temperaturze pokojowej przez godzinę. Wlej roztwór obecny na płytkę 6-Plex i umyj płytkę trzykrotnie 150 mikrolitrami 0,4 M buforu do przemywania chlorku sodu na studzienkę. Po zakończeniu trzeciego prania osusz płytkę o ręcznik papierowy i dodaj 150 mikrolitrów buforu do odczytu do każdej studzienki.Poziomy sześciu autoprzeciwciał dla, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA i COVID-19A z testu 6-Plex ECL były dobrze skorelowane z odpowiadającymi im sześcioma pojedynczymi testami ECL i obecnym standardowym testem wiązania promieniotwórczego. Wartości indeksów dla każdej próbki dla wszystkich sześciu przeciwciał obliczono w odniesieniu do odpowiednich kontroli dodatnich i ujemnych. Zaobserwowano wartość indeksu większą niż wartość odcięcia, co wskazywało na wynik pozytywny.Autoprzeciwciała w surowicy naruszyły antygen znakowany rutenem do antygenu biotynylowanego, tworząc kompleks ze specyficznym łącznikiem w celu zbudowania platformy multipleksowej. Taktyka ta sprawia, że badania przesiewowe na dużą skalę są bardziej wykonalne i skuteczniejsze w populacji ogólnej w kierunku cukrzycy typu pierwszej i chorób współistniejących, prowadząc do wczesnego przewidywania i zapobiegania chorobom.

a-high-throughput-multiplexed-screening-for-type-1-diabetes-celiac

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Tutaj przedstawiliśmy metody wykrywania autoprzeciwciał ludzkich wysp trzustkowych za pomocą testów elektrochemiluminescencyjnych (ECL). Protokół, stosowany do przewidywania cukrzycy typu 1, może być rozszerzony o wykrywanie autoprzeciwciał przeciwko innym chorobom autoimmunologicznym.

Testy elektrochemiluminescencyjne dla autoprzeciwciał ludzkich wysp trzustkowych

Identyfikacja wariantów genetycznych przyczyniających się do złożonych chorób ludzkich pozwala nam zidentyfikować nowe mechanizmy. W tym miejscu demonstrujemy podejście do genotypowania multipleksowego genów kandydujących lub analizy szlaków genowych, które maksymalizuje pokrycie przy niskich kosztach i jest podatne na badania kohortowe.

Testowanie genów kandydujących w klinicznych badaniach kohortowych z genotypowaniem multipleksowym i spektrometrią mas

Modelujemy prosty multipleksowany test ECL, który łączy ze sobą 7 testów autoprzeciwciał. Test jest w stanie przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu innych chorób autoimmunologicznych jednocześnie, w tym celiakii, autoimmunologicznej choroby tarczycy i autoimmunologicznego zespołu wielogruczołowego 1.

Wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 7-plex do jednoczesnego badania przesiewowego w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu chorób autoimmunologicznych

System analizy przepływu dla testów multipleksowych opartych na koralikach, który zapewnia odczyt z dwoma reporterami, został wykorzystany do opracowania multipleksowych testów serologicznych i neutralizacji przeciwciał, które mogą jednocześnie mierzyć neutralizujące przeciwciała IgG i IgM dla SARS-CoV-2.

Szybki, multipleksowy test neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach

Ten artykuł opisuje wygodną metodę monitorowania dynamicznych zmian w mianach przeciwciał dla dwóch izotypów immunoglobulin jednocześnie (IgA, IgM lub IgG) wynikających z odpowiedzi immunologicznej na zakażenie SARS-CoV-2 lub szczepienie. Ten "Multianalitowy panel odpowiedzi immunologicznej Covid-19" wykorzystuje trzy pośrednie testy immunologiczne zbudowane na kodowanych mikrosferach, które są odczytywane za pomocą przepływowego czytnika multipleksowego z funkcją "dwukanałową".

Dynamiczne monitorowanie serokonwersji za pomocą wieloanalitowego testu immunobeadowego w kierunku Covid-19

Trzykanałowy system analizy przepływu fluorescencji z podwójnym reporterem został wykorzystany do opracowania multipleksowego testu immunologicznego opartego na koralikach, który jednocześnie ocenia próbki surowicy pod kątem IgG i IgM wywołanych przez wiele antygenów różnych gatunków Borrelia, które powodują boreliozę z Lyme w Europie i Ameryce Północnej.

Jednoczesne wykrywanie różnych klas przeciwciał w multipleksowanym teście serologicznym

Prezentujemy dwa wewnętrzne, jednoetapowe zestawy RT-qPCR do powszechnych wirusów układu oddechowego. Pierwszy test dotyczy SARS-CoV-2 (N), grypy A (H1N1 i H3N2) oraz grypy B. Drugi dotyczy SARS-Cov-2 (N) i MERS (UpE i ORF1a). Testy te mogą być z powodzeniem wdrożone w każdym specjalistycznym laboratorium.

Opracowanie multipleksowych testów RT-qPCR w czasie rzeczywistym do wykrywania SARS-CoV-2, grypy A/B i MERS-CoV

Opisujemy niedawno opracowaną platformę testów immunologicznych opartą na zasadach bezkomórkowej biologii syntetycznej i technice dot-blot do konfigurowalnego wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych.

Bezkomórkowa plama punktowa jako praktyczna i elastyczna platforma testów immunologicznych do wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych

Zapewniamy powtarzalną metodę wywoływania cukrzycy typu 1 (T1D) u myszy w ciągu dwóch tygodni poprzez adopcyjny transfer pierwotnych limfocytów T CD4+ specyficznych dla antygenu wysp trzustkowych.

Przyspieszona indukcja cukrzycy typu 1 u myszy przez adoptywny transfer cukrzycowych limfocytów T CD4 +

Poznaj wysokoprzepustową metodę multipleksowego wykrywania przeciwciał w cukrzycy typu 1, celiakii i COVID-19. Ta technika umożliwia efektywne badania przesiewowe dużych populacji.

Wysokoprzepustowe, multipleksowane badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i COVID-19

Przeglądaj więcej filmów