Analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów do wykrywania wad funkcjonalnych plemników ludzkich

Technika ta przedstawia praktyczne podejście do szacowania wielu biomarkerów funkcjonalnych plemników ludzkich za pomocą cytometrii przepływowej bez znacznego uszczerbku dla jakości eksperymentu spowodowanego wydłużonym czasem oczekiwania. Technika ta może być praktycznym i niezawodnym zestawem narzędzi do diagnozowania niepłodności i oceny funkcji plemników zarówno na stole, jak i w łóżku, a także uzupełniać rutynowe badanie nasienia. Procedura ta jest przeprowadzana na platformie Accuri C6 i może być stosowana na innych platformach komercyjnych z niewielkimi modyfikacjami.

Na początek należy inkubować próbkę nasienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza i całkowicie upłynniać próbkę przez godzinę. Aby policzyć plemniki, dokładnie wymieszaj próbkę skroplonego nasienia, a następnie dodaj 10 mikrolitrów nasienia do komory do liczenia plemników i zeskanuj szkiełko w analizatorze klasy plemników. Policz co najmniej sześć obszarów i 400 plemników, aby oszacować stężenie plemników.

W celu wykrycia apoptozy plemników, za pomocą barwienia annexin-5 FITC PI, dodaj 10 do szóstej plemniki do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Umyj komórki 500 mikrolitrami zimnego PBS. Następnie odwirować zawiesinę plemników i wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem komórek w 200 mikrolitrach buforu wiążącego.

Następnie dodaj dwa mikrolitry aneksyny-5 FITC i dwa mikrolitry PI. Delikatnie zwiruj komórki i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności przed umieszczeniem ich w cytometrze przepływowym w celu analizy. W celu analizy potencjału błony mitochondrialnej lub MMP, za pomocą sondy JC-1, dodaj dwa razy 10 do szóstego plemnika do 1,5 mililitrowej probówki i odwiruj. Po odwirowaniu ponownie zawiesić zawiesinę plemników w jednomililitrowym roztworze roboczym JC-1.

Delikatnie zwiruj komórki i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Ponownie odwirować zawiesinę, wyrzucić supernatant i przemyć osad dwukrotnie jednym mililitrem PBS. Następnie ponownie zawiesić barwione plemniki w jednym mililitrze PBS w probówce cytometru przepływowego i natychmiast umieścić probówkę w cytometrze przepływowym w celu analizy.

Następnie użyj cyjanku karbonylu m-chlorofenylohydrazonu lub CCCP jako kontroli pozytywnej. Ponownie zawiesić plemniki w jednym mililitrze roztworu roboczego CCCP i delikatnie wirować przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po inkubacji odwirować zawiesinę, odrzucić supernatant i wykonać czynności analizy MMP za pomocą sondy JC-1, jak pokazano.

W przypadku testu struktury chromatyny plemników lub SCSA rozmrozić próbkę nasienia w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i rozcieńczyć buforem TNE do stężenia od jednego do dwóch razy od 10 do szóstych komórek na mililitr. Następnie dodaj 200 mikrolitrów rozcieńczonej próbki do probówki cytometru przepływowego i wymieszaj ją z 400 mikrolitrami roztworu kwasu. Zabarwić próbkę 1,2 mililitra roztworu pomarańczy akrydynowej.

Użyj próbki referencyjnej jako wzorca wewnętrznego do konfiguracji i kalibracji cytometru przepływowego. Rozcieńczyć próbkę buforem TNE o temperaturze czterech stopni Celsjusza do stężenia od jednego do dwóch razy od 10 do szóstych komórek na mililitr i wykonać czynności dla SCSA, jak pokazano. Otwórz oprogramowanie cytometru przepływowego i uruchom cytometr.

Aby zebrać dane próbki, załaduj próbkę kontrolną do cytometru przepływowego i kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć zbieranie danych. Tworzenie wykresów punktowych do przeglądania danych. Wybierz parametry osi XY i wyświetl liniowo, aby określić dane.

Następnie wybierz i zastosuj bramę wielokątną, aby wyznaczyć populację plemników do analizy. W przypadku apoptozy plemników ustaw FL1 jako oś X, a FL2 jako oś Y. Następnie, aby wyizolować żywe komórki apoptotyczne lub martwicze, dotknij i przeciągnij bramkę kwadrantową, aby podzbiór populacji plemników w dół do czterech określonych populacji.

W przypadku MMP ustaw FL1 jako oś X, a FL2 jako oś Y. Następnie utwórz bramę wielokątną, aby podzielić populacje plemników na dwie określone populacje. W przypadku SCSA ustaw FL4 jako oś X, a FL1 jako oś Y.

Narysuj bramę, ustaw kąt 45 stopni, aby wykluczyć sygnały zanieczyszczeń komórkowych. Oblicz 10 000 plemników dla każdej próbki do analizy apoptozy plemników, MMP i SCSA, ustaw limit przebiegu, aby wskazać, kiedy przestać zbierać dane, szybkość płynności, w zależności od liczby komórek i progu w celu wyeliminowania zanieczyszczeń i hałasu. Zastosuj te ustawienia do wszystkich próbek.

W razie potrzeby ustaw kompensację kolorów, aby skorygować rozlewanie się fluorescencji. Delikatnie odpipetować próbkę przed załadowaniem jej do cytometru przepływowego. Następnie wprowadź przykładową nazwę i kliknij przycisk Uruchom.

Po zakończeniu przebiegu zapisz przykładowe dane jako plik FCS, podając nazwę pliku do dalszej analizy. Pomiar apoptozy plemników za pomocą barwienia FITC PI ancyny-pięciu pokazano tutaj. Analiza ta obejmowała negatywną kontrolę niebarwionych plemników w celu ustawienia kompensacji i kwadrantów.

W próbce z apoptozą plemników wyniki wyrażono jako procent żywotnych lub żywych komórek wczesnej apoptozy lub apoptozy, późnej apoptozy i nekrotyki. Poniżej przedstawiono subpopulację plemników z wysokim i niskim MMP. Dobrej jakości próbka nasienia wykazała wysoką fluorescencję pomarańczową i niską zieloną.

I odwrotnie, próbka nasienia złej jakości wykazała niską fluorescencję pomarańczową i wysoką zieloną. Przedstawiono tutaj cytogramy SCSA od płodnego i niepłodnego mężczyzny. Populacja plemników została zidentyfikowana jako normalna z wysoką stabilnością DNA, indeksem fragmentacji DNA i szczątkami komórek.

Próbka nasienia musi być inkubowana w temperaturze 37 stopni Celsjusza i całkowicie upłynniona przez okres do jednej godziny.