Name: Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T13:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj metodę badania wpływu wskazówek matrycy na fenotyp komórek glejaka w kulturach 3D przy użyciu hydrożeli. Technika umożliwia przesiewowe testowanie warunków matrycy i identyfikację nowych terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby szczególnie podziękować Carolyn Kim, Amelii Lao, Ryanowi Stoutamore'owi i Itayowi Solomonowi za ich wkład we wcześniejsze wersje schematu fotożelowania. Linie komórkowe GS122 i GS304 zostały hojnie dostarczone przez Davida Nathansona. Wszystkie figury zostały stworzone z BioRender.com. Kluczowe znaczenie w pracach miały główne obiekty UCLA, Molecular Screening Shared Resources oraz Laboratorium Charakterystyki Nano i Pico. Chen Chia-Chun był wspierany przez UCLA Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program. Grigor Varuzhanyan był wspierany przez Tumor Cell Biology Training Program NIH Grant (T32 CA 009056).

<ol><li>Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosing+the+decline+in+pharmaceutical+R%26D+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).</li>
<li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li>
<li>Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+do+oncology+drugs+fail+to+gain+US+regulatory+approval%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).</li>
<li>Booth, B., Ma, P., Glassman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncology%27s+trials.+Market+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Oncology's trials. Market indicators.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 609-610 (2003).</li>
<li>Da Ros, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+chemoresistance%3A+The+double+play+by+microenvironment+and+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879(2018).</li>
<li>Broekman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+communication+in+the+microenvirons+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multidimensional communication in the microenvirons of glioblastoma.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (8), 482-495 (2018).</li>
<li>Grundy, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+response+of+patient-derived+primary+glioblastoma+cells+to+environmental+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).</li>
<li>Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3D+human+glioblastoma+cell+culture+system+for+modeling+drug+and+radiation+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses.</a> Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).</li>
<li>Simoni, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+complexes+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement membrane complexes with biological activity.</a> Biochemistry. 25 (2), 312-318 (2002).</li>
<li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-mimetic+3D+culture+platforms+allow+investigation+of+cooperative+effects+of+extracellular+matrix+features+on+therapeutic+resistance+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma.</a> Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).</li>
<li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+alternatives+to+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li>
<li>Spinelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+subtypes+and+differentiation+programmes+of+glioma+stem+cells+as+determinants+of+extracellular+vesicle+profiles+and+endothelial+cell-stimulating+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144(2018).</li>
<li>Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CBTRUS+statistical+report%3A+Primary+brain+and+other+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2014-2018%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018.</a> Neuro-Oncology. 23, Supplement_3 (2021).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
<li>Brennan, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+somatic+genomic+landscape+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The somatic genomic landscape of glioblastoma.</a> Cell. 155 (2), 462-477 (2013).</li>
<li>Tomczak, K., Czerwińska, P., Wiznerowicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cancer+Genome+Atlas+%28TCGA%29%3A+An+immeasurable+source+of+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Contemporary+oncology%22%5BJournal%5D)">The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge.</a> Contemporary oncology. 19, Poznan, Poland. 68-77 (2015).</li>
<li>Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temozolomide+resistance+in+glioblastoma+multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme.</a> Genes and Diseases. 3 (3), 198-210 (2016).</li>
<li>Joo, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+orthotopic+glioblastoma+xenograft+models+recapitulate+the+histopathology+and+biology+of+human+glioblastomas+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ.</a> Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).</li>
<li>Levy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+animal+as+models%3A+Ethical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Stroke%22%5BJournal%5D)">The use of animal as models: Ethical considerations.</a> International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).</li>
<li>Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitioning+preclinical+glioblastoma+models+to+clinical+settings+with+biomarkers+identified+in+3D+cell-based+models%3A+A+systematic+scoping+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 145, 112396(2022).</li>
<li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+scaffolds+for+3D+culture+demonstrate+extracellular+matrix-mediated+mechanisms+of+chemotherapy+resistance+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma.</a> Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).</li>
<li>Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Could+3D+models+of+cancer+enhance+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Could 3D models of cancer enhance drug screening.</a> Biomaterials. 232, 119744(2020).</li>
<li>Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+tumor+models+for+cancer+research+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation.</a> Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).</li>
<li>Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic-acid+based+hydrogels+for+3-dimensional+culture+of+patient-derived+Glioblastoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176(2018).</li>
<li>Preston, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digestion+products+of+the+PH20+hyaluronidase+inhibit+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination.</a> Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).</li>
<li>Kim, Y., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44-mediated+adhesion+to+hyaluronic+acid+contributes+to+mechanosensing+and+invasive+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility.</a> Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).</li>
<li>Pibuel, M. A., Poodts, D., Díaz, M., Hajos, S. E., Lompardía, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scrambled+story+between+hyaluronan+and+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma.</a> The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549(2021).</li>
<li>Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+the+glioblastoma+microenvironment+into+engineered+experimental+models%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Science+OA%22%5BJournal%5D)">Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models.</a> Future Science OA. 3 (3), (2017).</li>
<li>Trombetta-Lima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+proteome+remodeling+in+human+glioblastoma+and+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma.</a> Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).</li>
<li>Schregel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+glioblastoma+in+an+orthotopic+mouse+model+with+magnetic+resonance+elastography%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biomedicine%22%5BJournal%5D)">Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography.</a> NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840(2018).</li>
<li>Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic-acid+based+hydrogels+for+3-dimensional+culture+of+patient-derived+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176(2018).</li>
<li>Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((If+cell+mechanics+can+be+described+by+elastic+modulus%3A+Study+of+different+models+and+probes+used+in+indentation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).</li>
<li>Sneddon, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relation+between+load+and+penetration+in+the+axisymmetric+boussinesq+problem+for+a+punch+of+arbitrary+profile%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Engineering+Science%22%5BJournal%5D)">The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile.</a> International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).</li>
<li>Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elastic+modulus+of+MatrigelTM+as+determined+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).</li>
<li>Mayerhöfer, T. G., Popp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beer%27s+law+-+Why+absorbance+depends+%28almost%29+linearly+on+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%3A+A+European+Journal+of+Chemical+Physics+and+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Beer's law - Why absorbance depends (almost) linearly on concentration.</a> Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).</li>
<li>Puth, M. T., Neuhäuser, M., Ruxton, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+variety+of+methods+for+calculating+confidence+intervals+by+bootstrapping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Ecology%22%5BJournal%5D)">On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping.</a> Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).</li>
<li>Lavrentieva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Biochemical+Engineering%2FBiotechnology%22%5BJournal%5D)">Gradient hydrogels.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 178, 227-251 (2020).</li>
<li>Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient+hydrogels+for+screening+stiffness+effects+on+patient-derived+glioblastoma+xenograft+cellfates+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).</li>
<li>da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+glioma+models%3A+From+patients+to+dish+to+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals.</a> Cells. 8 (10), 1177(2019).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+transplantation+of+enteric+neural+crest+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).</li>
<li>Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+inhibitor+cilengitide+for+the+treatment+of+glioblastoma%3A+A+brief+overview+of+current+clinical+results%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results.</a> Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obecna praca przedstawia metody generowania 3D, zminiaturyzowanych kultur w oparciu o HA, przy jednoczesnej zmianie sztywności matrycy i peptydów dostępnych do angażowania integryn. Technika ta umożliwia systematyczne badanie, w jaki sposób parametry macierzy wpływają na fenotypy komórkowe (np. żywotność komórek nowotworowych narażonych na chemioterapię) ze zwiększoną przepustowością. Poprzednie podejścia, w tym przedstawione w niniejszym dokumencie, dostosowały sztywność hydrożelu poprzez zmianę procentowej zawartości c...

Oczekiwany koszt opracowania nowego leku stale rósł w ciągu ostatniej dekady, z ponad 1 miliardem dolarów według obecnych szacunków1. Częścią tego wydatku jest wysoki wskaźnik niepowodzeń leków wchodzących do badań klinicznych. Około 12% kandydatów na leki ostatecznie uzyskuje zgodę amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) w 2019 roku. Wiele leków nie przechodzi fazy I z powodu nieoczekiwanej toksyczności2, podczas gdy inne, które przejdą testy bezpieczeństwa, mogą nie przejść z powodu braku skuteczności3. To wyczerpanie z powodu braku skuteczności można częściowo wytłumaczyć faktem, że modele nowotworów używane podczas opracowywania leków notorycznie nie przewidują skuteczności klinicznej4.
Funkcjonalne rozbieżności między modelami in vitro i in vivo można przypisać usuwaniu komórek rakowych z ich rodzimego mikrośrodowiska, w tym komórek nienowotworowych i fizycznego ECM5,6. Zwykle grupy badawcze używają dostępnych na rynku matryc hodowlanych, takich jak Matrigel (białkowa macierz błony podstawnej pochodząca z mięsaków myszy), aby zapewnić hodowanym komórkom nowotworowym mikrośrodowisko macierzy 3D. W porównaniu z hodowlą 2D, hodowla 3D w matrycy błonowej poprawiła kliniczne znaczenie wyników in vitro7,8. Jednak biomateriały hodowlane z tkanek bezkomórkowych, w tym matrycy błonowej, zazwyczaj wykazują zmienność między partiami, która może zagrozić odtwarzalności9. Co więcej, matryce pochodzące z nowotworów o innym pochodzeniu tkankowym niż badane mogą nie dostarczać odpowiednich wskazówek fizjologicznych10. Wreszcie, nowotwory o wysokim stopniu niejednorodności wewnątrznowotworowej mają cechy mikrośrodowiskowe, które różnią się w skali submikronowej i których nie można dostroić do rekapitulacji matrycy błonowej11.
Glejak wielopostaciowy (GBM), jednolicie śmiertelny guz mózgu o medianie czasu przeżycia około 15 miesięcy, jest nowotworem, dla którego opracowanie leczenia było szczególnie trudne12,13. Obecny standard opieki nad GBM składa się z pierwotnej resekcji guza, następnie radioterapii, a następnie chemioterapii z użyciem temozolomidu (TMZ)14. Jednak ponad połowa klinicznych nowotworów GBM wykazuje oporność na leczenie poprzez różne mechanizmy15,16,17. Przewidywanie skuteczności schematu leczenia u konkretnego pacjenta jest niezwykle trudne. Standardowe modele przedkliniczne stosowane do przewidywania indywidualnych wyników składają się z komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta, ksenoprzeszczepowanych ortotopowo myszom z obniżoną odpornością. Podczas gdy ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów mogą podsumować wiele aspektów klinicznych nowotworów GBM i są cenne dla modeli przedklinicznych18, są one z natury drogie, mają niską przepustowość, są czasochłonne i wiążą się z problemami etycznymi19. Hodowle komórek pochodzących od pacjentów, na powierzchniach plastikowych 2D lub w postaci sferoid, w większości przypadków pozwalają uniknąć tych problemów. Podczas gdy komórki pochodzące od pacjentów zachowują aberracje genetyczne, ich hodowle w 2D lub jako zawieszone sferoidy były w dużej mierze słabymi reprezentacjami ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów u gryzoni i oryginalnych guzów pacjentów20. Wcześniej my i inni wykazaliśmy, że komórki GBM hodowane w 3D ECM, który naśladuje mechaniczne i biochemiczne właściwości tkanki mózgowej, mogą zachować fenotypy oporności na leki10,21,22,23.
Interakcje między kwasem hialuronowym (HA), polisacharydem występującym w dużych ilościach w mózgu ECM i nadmiernie eksprymowanym w nowotworach GBM, a jego receptorem CD44 modulują nabywanie oporności na leki in vitro21,24,25,26,27. Na przykład włączenie kwasu hialuronowego do miękkich kultur 3D zwiększyło zdolność komórek GBM pochodzących od pacjentów do nabywania oporności terapeutycznej. Ta mechano-responsywność była zależna od wiązania HA z receptorami CD44 na komórkach GBM21. Dodatkowo, wiązanie integryny z peptydami zawierającymi RGD, włączonymi do matryc kultur 3D, wzmacniały chemooporność za pośrednictwem CD44 w sposób zależny od sztywności21. Poza HA, ekspresja kilku białek ECM, z których wiele zawiera regiony RGD, różni się między normalnymi guzami mózgu a guzami GBM28. Na przykład jedno z badań wykazało, że 28 różnych białek ECM było regulowanych w górę w guzach GBM29. W tym złożonym mikrośrodowisku macierzy nowotworowej komórki rakowe integrują mechaniczne i biochemiczne wskazówki, aby uzyskać określony fenotyp oporności, który zależy od stosunkowo niewielkich różnic (np. mniej niż rząd wielkości) w module Younga lub gęstości peptydów wiążących integryny28,29,30.
Obecny protokół opisuje, w jaki sposób komórki nowotworowe interpretują unikalne kombinacje sygnałów matrycowych i identyfikują złożone, specyficzne dla pacjenta mikrośrodowiska matrycowe, które promują oporność na leczenie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Fotochemiczna metoda generowania zminiaturyzowanych, precyzyjnie dostrojonych matryc do hodowli 3D zapewnia dużą, ortogonalną zmienną przestrzeń. Specjalnie zbudowany układ diod LED, obsługiwany przez mikrokontroler, został włączony do fotosieciowania hydrożeli w formacie płytki 384-dołkowej w celu zwiększenia automatyzacji i odtwarzalności. Intensywność ekspozycji była zróżnicowana w całym dołku, aby zmienić właściwości mikromechaniczne otrzymanych hydrożeli, jak oceniono za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM). Chociaż ten manuskrypt nie skupia się na konstruowaniu samej matrycy oświetleniowej, schemat obwodu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B) i lista części (Tabela materiałów) są dostarczane jako pomoce w reprodukcji urządzenia.
Ten raport pokazuje szybkie generowanie szeregu komórek GBM hodowanych w unikalnych, 3D mikrośrodowiskach, w których moduł Younga (cztery poziomy w jednym rzędzie wielkości) i zawartość peptydu wiążącego integrynę (pochodzącego z czterech różnych białek ECM) były zmieniane ortogonalnie. Podejście to wykorzystano następnie do zbadania względnego wpływu mechaniki hydrożelu i zaangażowania integryny specyficznej dla ECM na żywotność i proliferację komórek GBM pochodzących od pacjenta, gdy nabywają one oporność na chemioterapię temozolomidem (TMZ).

<table><tbody><tr><td>Rezystory 1,1 kOhm, 6 W</td><td>Digikey</td><td>35601k1ft</td><td></td></tr><tr><td>1,7 mL rurka mikrowirówkowa</td><td>Genesse Scientific</td><td>21-108</td><td></td></tr><tr><td>15 mL rurka stożkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>365 nm LED</td><td>Digikey</td><td>LTPL-c034uvh365</td><td></td></tr><tr><td>384 well plate</td><td>Bio Greiner One</td><td>781090</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m filtr siatkowy</td><td>MTC bio</td><td>C4040</td><td></td></tr><tr><td>4-ramienny glikol polietylenowy zakończony tiolem (20 kDa)</td><td>Laysan Bio</td><td>4arm-PEG-SH-20K-1g</td><td></td></tr><tr><td>6 NPN BJTs</td><td>Rezystory Digikey</td><td>2n5550ta</td><td></td></tr><tr><td>80 Ohm, 0,125 W</td><td>Digikey</td><td>erjj-6ENF80R6V</td><td></td></tr><tr><td>8-Armed glikol polietylenowy zakończony norbornenem (20 kDa)</td><td>Jenkem Technology</td><td>A7025-1</td><td></td></tr><tr><td>Innowacyjne technologie komórkowe</td> <td>Accutase</td><td>AT104500</td><td>&nbsp; Dysocjacja komórek&nbsp; odczynnik</td></tr><tr><td>AFM Sondy</td><td>Novascan</td><td></td><td>0,01 N/m Nominalna stała sprężystości, 2,5 i mikro; m Cząstka SiO2</td></tr><tr><td>Arduino IDE</td><td>Arduino</td><td>1.8.19</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Nano</td><td>Makerfire</td><td>Mini Nano V3.0 ATmega328P Płytka</td><td></td>mikrokontrolera</tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>20 ng / mL</td></tr><tr><td>CCK8</td><td>Abcam</td><td>ab228554</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermoscientific</td><td>sorvall legend xtr</td><td></td></tr><tr><td>CP100ST</td><td>Gilson</td><td>F148415</td><td>Końcówki do pipet wyporowych</td></tr><tr><td>Cubis Semi-Micro Balance</td><td>Sartorius</td><td>MSA225S100DI</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - F12 (50-50)</td><td>Life Technologies</td><td>11330057</td><td>1x</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>DPBS Ca (-) Mg (-)</td><td>Genesse Scientific</td><td>25-508</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF100-15</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>Etanol, bezwodny</td><td>Fisher Scientific</td><td>A405P</td><td>Dodaj wodę DI, aby rozcieńczyć do 70%</td></tr><tr><td>Fiolki z gwintem Fisherbrand Class B ze szkła bursztynowego</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-339-23C</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Papier do ważenia</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr><tr><td>G21 Suplement</td><td>Gemini Bio</td><td>400-160</td><td>50x</td></tr><tr><td>Hanks Zrównoważony roztwór soli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HCl, ACS, 12M</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S25838A</td><td>Dodaj wodę DI, aby rozcieńczyć do 1 M</td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świń</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149-100Ku</td><td>25 &micro; g / mL</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H7006-100G</td><td></td></tr><tr><td>Pistolet na gorące powietrze</td><td>Wagner</td><td>HT1000</td><td></td></tr><tr><td>Peptyd sialoproteiny wiążącej integrynę (IBSP)</td><td>Genscript</td><td>Zamówienie niestandardowe</td><td>GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY</td>Trimetylobenzoilofosfinian</tr><tr><td>litu (LAP), >95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>900889-1G</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczna płyta mieszająca</td><td>Thermo Scientific</td><td>SP194715</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall legend micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta jednokanałowa Microman E</td><td>Gilson</td><td>FD10004</td><td>Pipeta wyporowa</td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet</td><td>Różni producenci</td><td>Różne rozmiary</td>mikropipet mLine Sartorious N-acetylocysteina <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7250-10G</td><td></td></tr><tr><td>Nanowizard 4</td><td>Mikroskop Bruker</td><td></td><td>AFM</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>ss255-1</td><td>Dodaj wodę DI, aby rozcieńczyć do 1 M</td></tr><tr><td>Normoicin</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-1</td><td>500x</td></tr><tr><td>Peptyd osteopontyny</td><td>Genscript</td><td>Zamówienie niestandardowe</td><td>GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG</td></tr><tr><td>Pipet Aid</td><td>Drummond</td><td>4000102</td><td></td></tr><tr><td>Zwykłe szkiełka mikroskopowe</td><td>Izolator silikonowy Globe Scientific</td><td>1301</td><td></td></tr><tr><td>Press-To-Seal, średnica 12-4,5 mm x głębokość 2 mm</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664201-A</td><td>Wytnij tak, aby z jednego arkusza wykonano 8 pojedynczych form</td></tr><tr><td>Przetwarzanie</td><td></td><td>Przetwarzanie 3.5.4</td><td></td></tr><tr><td>Repeater M4</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td></td></tr><tr><td>Repeater Końcówki</td> <td>do pipetSartorious</td><td>30089430</td><td>Rozmiary 1 mL</td></tr><tr><td>Peptyd RGD Genscript</td><td></td><td></td><td>GCGYGRGDSPG</td></tr><tr><td>Taśma Scoth Pipety</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>serologiczne</td><td>Genesse Scientific</td><td>12-102,12-104</td><td>5,10 mL</td></tr><tr><td>Pasta lutownicza</td><td>Digikey</td><td>315-NC191LT15T5-ND</td><td></td></tr><tr><td>Drut</td><td></td><td></td><td></td>lutowniczy</tr><tr><td>prosty kleszcze preparacyjne</td><td>VWR Scientific</td><td>82027-408</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Czytnik płytek</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-75 Kolba poddana hodowli komórkowej</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-209</td><td></td></tr><tr><td>Temozolomid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2577</td><td>Zwykle używany od 10 &mikro; M do 100 i mikro; M</td></tr><tr><td>Tenascin-C Peptide</td><td>Genscript</td><td></td><td>GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV</td></tr><tr><td>Tiolowany kwas hialuronowy (700 kDa), 6-8% modyfikowany</td><td>Lifecore Biomedical</td><td>HA700K5</td><td></td></tr><tr><td>VWR Spinbar, Flea Micro</td><td>VWR</td><td>58948-375</td><td></td></tr></tbody></table>

matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3d nowotworów

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Interakcje komórka-matryca pośredniczą w złożonych procesach fizjologicznych poprzez sygnały biochemiczne, mechaniczne i geometryczne, wpływając na zmiany patologiczne i reakcje terapeutyczne. Oczekuje się, że uwzględnienie efektów matrycy na wcześniejszym etapie opracowywania leków zwiększy prawdopodobieństwo sukcesu klinicznego nowych środków terapeutycznych. Istnieją strategie oparte na biomateriałach, które rekapitulują określone mikrośrodowiska tkankowe w hodowli komórkowej 3D, ale ich integracja z metodami hodowli 2D stosowanymi głównie do badań przesiewowych leków była wyzwaniem. W związku z tym przedstawiony tutaj protokół szczegółowo opisuje rozwój metod hodowli 3D w zminiaturyzowanych matrycach biomateriałów w formacie płytki wielodołkowej, aby ułatwić integrację z istniejącymi rurociągami badań przesiewowych leków i konwencjonalnymi testami żywotności komórek. Ponieważ oczekuje się, że cechy matrycy kluczowe dla zachowania klinicznie istotnych fenotypów w hodowanych komórkach będą wysoce specyficzne dla tkanek i chorób, konieczne będzie kombinatoryczne badanie przesiewowe parametrów matrycy w celu określenia odpowiednich warunków dla określonych zastosowań. Opisane tutaj metody wykorzystują zminiaturyzowany format hodowli do oceny odpowiedzi komórek nowotworowych na ortogonalną zmienność mechaniki macierzy i prezentację ligandów. W szczególności badanie to demonstruje wykorzystanie tej platformy do zbadania wpływu parametrów matrycy na odpowiedzi komórek glejaka wielopostaciowego (GBM) pochodzących od pacjenta na chemioterapię.

Pomiary AFM potwierdziły precyzyjną kontrolę właściwości mechanicznych hydrożelu w zależności od natężenia promieniowania UV (mW/cm2) podczas sieciowania światłem przy użyciu zbudowanej na zamówienie matrycy LED sterowanej przez Arduino (Rycina 2A). Skład hydrożelu użytego w niniejszym protokole znajduje się w Tabeli 2. Rozstaw diod LED na dostarczonym szablonie odpowiada rozstawowi co drugiej studni płytki 384-dołkowej, co umożliwia formowanie żeli bezpośrednio w...

Obecny protokół opisuje eksperymentalną platformę do oceny wpływu sygnałów mechanicznych i biochemicznych na reakcje chemoterapeutyczne komórek glejaka pochodzących od pacjenta w hodowlach 3D matrix-mimetic przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do oświetlania UV, umożliwiającego wysokoprzepustowe fotosieciowanie hydrożeli o regulowanych cechach mechanicznych.

Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...

Metoda ta umożliwia naukowcom systematyczne badanie, w jaki sposób sygnały macierzy wpływają na fenotyp komórek w hodowli 3D. Demonstrujemy procedurę z wykorzystaniem kultur komórek GBM. Główną zaletą tej techniki jest implementacja o wysokiej przepustowości, która pozwala nam na przesiewanie wielu warunków macierzowych.Technika ta może być wykorzystana do opracowania matryc tkankowo-mimetycznych, które zachowują określone funkcje w modelach hodowli komórkowych, takich jak lekooporność komórek nowotworowych, i potencjalnie identyfikują nowe terapie. Procedurę zademonstrują Mary Epperson i Kelly Tamura, badaczki z Seidlits Lab. Zacznij od przygotowania roztworu buforowanego przez HEPES, rozpuszczając proszek HEPES w 20-milimolowym roztworze soli Hanksa.Dostosuj pH do siedmiu po pełnej sorbacji. W roztworze buforowanym HEPES rozpuścić tiolowany kwas hialuronowy tak, aby 6 do 8% reszty kwasu karboksylowego na każdym kwasie glukuronowym było modyfikowane tiolem o stężeniu 10 miligramów na mililitr w roztworze buforowym. Mieszaj z prędkością mniejszą niż 1 000 obrotów na minutę za pomocą magnetycznej płytki mieszającej w temperaturze pokojowej, aż do całkowitego rozpuszczenia, zwykle około 45 minut.Podczas rozpuszczania HA przygotuj oddzielne roztwory 100 miligramów na mililitr norbornenu 8arm PEG, 100 miligramów na mililitr tiolu 4arm PEG, czteromilimolowych cysteiny lub peptydu zawierającego cysteinę i czterech miligramów na mililitr LAP w probówkach do mikrowirówek. Przygotuj w tym momencie czteromilimolowe roztwory wszystkich peptydów, które mają być uwiązane w jednym hydrożelu. Wymieszaj poszczególne roztwory HA, norbornenu PEG, tiolu PEG i peptydów zawierających cysteinę-tiol, aby uzyskać końcowe stężenia dla końcowych matryc hydrożelowych.Mieszaj z prędkością mniejszą niż 1 000 obrotów na minutę na magnetycznej płycie schodowej przez co najmniej 30 minut, aby w pełni wymieszać. Wyrównaj próbki z urządzeniem oświetleniowym z każdą inną diodą LED w jednej kolumnie form silikonowych lub płytki 384-dołkowej. Otwórz okno Parametry UV LED i wprowadź wartości intensywności i oświetlenia.Następnie kliknij Zakończ, aby rozpocząć oświetlenie. Po oświetleniu, po umieszczeniu w jednym rogu, przesuń płytkę studzienki do następnego rogu i powtórz. Aby oświetlić dołki na drugiej połowie płyty, wyjmij płytkę z uchwytu i obróć o 180 stopni.Aby wytworzyć hydrożele o różnej mechanice, zacznij od wyczyszczenia szkiełek i silikonowych form za pomocą taśmy do usuwania zanieczyszczeń. Przyklej silikonowe formy do szkiełka szklanego, dociśnij, aby zapewnić dobre uszczelnienie i wypiernij wszelkie pęcherzyki powietrza. Następnie odpipetuj 80 mikrolitrów roztworu prekursora hydrożelu do każdej formy silikonowej na szkiełku podstawowym.Umieść szklaną szkiełko na urządzeniu oświetleniowym wyrównanym z każdą inną diodą LED w jednej kolumnie. Wystaw prekursory hydrożelu na działanie światła UV przez 15 sekund, aby usieciować zdjęcie. Po ustaniu oświetlenia wyjmij szkiełka i poluzuj żele z form, śledząc wewnętrzny obwód formy cienką końcówką.Usuń silikonowe foremki pęsetą lub kleszczami. Napełnij 12-dołkową płytkę dwoma mililitrami DPBS. Przenieś usieciowane hydrożele do indywidualnej płytki dołka, zwilżając szpatułką i delikatnie spychając je ze szkiełka.Przygotuj żądane komórki jako roztwór jednokomórkowy. Zbierz sferoidy glejaka o średnicy około 150 mikrometrów z kultury zawiesinowej kolby T-75 do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Przepłukać kolbę hodowlaną pięcioma mililitrami DPBS w celu usunięcia wszelkich pozostałości komórek i pożywki i dodać tę objętość do stożkowej probówki.Odwirować stożkową probówkę zawierającą komórki o stężeniu 200 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu usunąć supernatant za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego i ponownie zawiesić w pięciu mililitrach DPBS. Wirować 200 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu umycia komórek.Odessać supernatant pięciomililitrową pipetą serologiczną, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego, a następnie ponownie zawiesić komórki w dwóch mililitrach odczynnika do dysocjacji komórek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut. Dodaj trzy mililitry kompletnej pożywki i delikatnie pipetuj trzy do pięciu razy, aby rozbić sferoidy na zawiesinę jednokomórkową.Odwirować zawiesinę jednokomórkową o stężeniu 400 razy G przez pięć minut, aby granulować komórki w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant pięciomililitrową pipetą serologiczną, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze kompletnego podłoża.Usuń część komórek do liczenia za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć tę porcję dwukrotnie błękitem trypanowym, który przenika do komórek z upośledzoną żywotnością. Policz tylko żywe, bezbarwne komórki.Określ liczbę komórek niezbędnych do enkapsulacji. Przenieś objętość pożywki zawierającą całkowitą liczbę potrzebnych komórek do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 mililitra. Wirować z prędkością 400 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Odessać supernatant za pomocą mikropipety, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Zawiesić osad komórkowy w roztworze prekursora hydrożelu, dobrze mieszając, pipetując w górę iw dół za pomocą mikropipety o pojemności 1 000 mikrolitrów cztery do pięciu razy. Załaduj ogniwa do pipetera powtarzalnego ustawionego na dozowanie 10 mikrolitrów.Aby uniknąć pęcherzyków powietrza i nierównomiernego dozowania, należy zalać powtórny pipeter, dozując dodatkowo jeden lub dwa razy do pojemnika na odpady. Do każdej studzienki płytki 384-dołkowej należy dozować 10 mikrolitrów komórek zawieszonych w roztworze hydrożelu z powtórnego pipetera. Za pomocą matrycy LED oświetl każdą studzienkę zawierającą komórkę przez 15 sekund, aby osiągnąć pożądane właściwości mechaniczne.Dodaj 40 mikrolitrów kompletnej pożywki do każdej studzienki zawierającej komórki. Dodaj 50 mikrolitrów DPBS do nieeksperymentalnych suchych studzienek otaczających żele, aby zminimalizować straty spowodowane parowaniem. W przypadku komórek glejaka należy dodać 40 mikrolitrów leku zawierającego pożywkę, aby osiągnąć ostateczne pożądane stężenie, rozpoczynając trzy dni po kapsułkowaniu.Dodaj 10 mikrolitrów odczynnika CCK8 do każdej studzienki zawierającej komórki. Inkubować przez jedną do czterech godzin, zgodnie z instrukcjami producenta. Odczytać absorbancja przy 450 nanometrach dla wszystkich studzienek po inkubacji.Badanie AFM regionów w skali mikronowej na powierzchniach pojedynczych hydrożeli wykazało, że hydrożele z bardziej miękkimi średnimi modułami Younga miały również mniejsze zakresy modułów niż sztywniejsze hydrogels. 3D kultury komórek GS122 wysiewanych w gęstości 2 500 000 komórek na mililitr wykazywały znacznie wyższą żywotność, gdy oceniano je po siedmiu dniach w hodowli w porównaniu z tymi wysiewanymi przy gęstości 500. 000 komórek na mililitr. Komórki GS122 wykazały wzrost przeżywalności w stanie ośmiu kilopaskalów, gdy peptydy pochodzące z osteopontyny zostały włączone do matrycy, podczas gdy włączenie wiążącej integrynę sialoproteiny lub peptydów pochodzących z tenascyny C zapewniło minimalne korzyści w zakresie przeżycia, takie jak hodowla i matryce z peptydem RGD imbiru.W przeciwieństwie do tego, żadne peptydy nie zapewniały wzrostu przeżycia w warunkach hodowli 0,8 kilopaskala. Zarówno komórki GS122, jak i GS304 rozprzestrzeniają się podczas hodowli w miękkich lub sztywnych matrycach hydrożelowych, w tym peptydach zawierających RGD. Komórki GS122 wykazują podobny brak rozprzestrzeniania się zarówno w 0,8, jak i 8 kilopaskali z osteopontyną.Jednak GS122 wykazywał zwiększoną odporność na temozolomid tylko w stanie ośmiu kilopaskal. Wreszcie, ta zminiaturyzowana platforma hodowli 3D może być wykorzystana do hodowli komórek ludzkich z innych typów nowotworów, w tym żywotnych organoidów terminalnie zróżnicowanych komórek neuroendokrynnego raka prostaty. Po tej procedurze można zastosować dalsze techniki, takie jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki, w celu dalszej charakterystyki fenotypów komórek.

hydrogel-arrays-enable-increased-throughput-for-screening-effects

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy wytwarzanie arkuszy hydrożelowych z mikrowzorzystymi elementami za pomocą prostego procesu, który może być składany i manipulowany w formie wolnostojącej. Korzystając z tych modułowych arkuszy hydrożelowych, można wygenerować prosty system hodowli komórkowych 3D w skali makro z kontrolowanym mikrośrodowiskiem komórkowym.

Budowa modułowych arkuszy hydrożelowych dla mikrowzorzystej architektury komórkowej 3D w skali makro

Ksenoprzeszczepy glejaka wielopostaciowego pochodzące od pacjentów mogą być miniaturyzowane do żywych mikroguzów za pomocą systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D. Ten test 3D guza in vivo nadaje się do testowania odpowiedzi na lek i profilowania molekularnego, w tym analizy kinomicznej.

Generowanie mikroguzów przy użyciu systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D i komórek glejaka pochodzących od pacjentów do profilowania kinomicznego i testowania odpowiedzi na leki

To jest metoda tworzenia trójwymiarowego rusztowania do hodowli komórkowych z zewnątrzkomórkowej macierzy płucnej. Nienaruszone płuca są przetwarzane na hydrożele, które mogą wspierać wzrost komórek w trzech wymiarach.

Przestrajalne hydrożele z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3D

Ten protokół opisuje wytwarzanie elastycznych makroporowatych mikrokriożeli 3D poprzez integrację mikrofabrykacji z technologią kriożelacji. Po załadowaniu komórkami generowane są mikrotkanki 3D, które można łatwo wstrzyknąć in vivo w celu ułatwienia terapii regeneracyjnej lub złożyć w matryce do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków in vitro.

Mikrotkanki 3D do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków

Opracowaliśmy heterogeniczny model raka piersi składający się z unieśmiertelnionych komórek guza i fibroblastów osadzonych w biodrukowalnym biotuszu alginian/żelatyna. Model podsumowuje mikrośrodowisko guza in vivo i ułatwia tworzenie wielokomórkowych sferoid guza, dostarczając informacji na temat mechanizmów napędzających nowotworzenie nowotworów.

Biodrukowalny hydrożel alginianowo-żelatynowy 3D Systemy modelowe in vitro indukują tworzenie sferoidów komórkowych

Płyta obrazowania oparta na HMCA jest prezentowana do wykonania testu inwazji. Płytka ta ułatwia tworzenie trójwymiarowych (3D) sferoid nowotworowych i pomiar inwazji komórek rakowych do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Kwantyfikacja testu inwazji odbywa się za pomocą analizy półautomatycznej.

Analiza inwazji komórek nowotworowych i przesiewowych badań przesiewowych leków przeciwprzerzutowych przy użyciu płytek opartych na hydrożelowej matrycy mikrokomorowej (HMCA)

Mikrośrodowisko guza jest istotną częścią wzrostu i inwazji raka. Aby naśladować postęp raka, potrzebna jest biologicznie istotna ludzka matryca. Protokół ten wprowadza ulepszenie trójwymiarowego testu inwazji sferoidalnej in vitro poprzez zastosowanie ludzkiej matrycy opartej na mięśniaku gładkokomórkowym. Protokół wprowadza również komputerową analizę inwazji komórek.

W pełni ludzka matryca oparta na guzie w trójwymiarowym teście inwazji sferoidów

Ten protokół demonstruje metody umożliwiające rozszerzoną hodowlę in vitro ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX). Jeden etap zwiększa ogólną żywotność wielokomórkowych kultur klastrowych w hydrożelach 3D, poprzez proste usuwanie niezdolnych do życia pojedynczych komórek. Drugi krok demonstruje najlepsze praktyki dotyczące hodowli PDX w perfuzjowanej platformie mikroprzepływowej.

Zwiększona żywotność kultur hydrożelowych ex vivo 3D ksenoprzeszczepów pobranych od pacjentów w perfuzjonej platformie mikroprzepływowej

Ten protokół przedstawia model biomimetyczny 3D z towarzyszącym zwłóknieniowym przedziałem zrębowym. Przygotowany z fizjologicznie odpowiednich hydrożeli w proporcjach naśladujących biofizyczne właściwości zrębu macierzy zewnątrzkomórkowej, aktywnego mediatora interakcji komórkowych, wzrostu guza i przerzutów.

Model biomimetyczny raka wątroby do badania interakcji guz-zręb w środowisku 3D o przestrajalnych właściwościach biofizycznych

Tutaj prezentujemy protokół, który umożliwia szybką, solidną i tanią produkcję sferoid nowotworowych, a następnie enkapsulację hydrożelową. Ma szerokie zastosowanie, ponieważ nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Byłoby to szczególnie przydatne do badania interakcji sferoida-matryca oraz budowania modeli fizjologii lub patologii tkanek in vitro.

Wytwarzanie i enkapsulacja sferoidów nowotworowych w hydrożelach glikolu polietylenowego do badania oddziaływań sferoida-matryca

Prezentujemy metodę replikacji mikrośrodowiska guza glejaka na froncie inwazyjnym, która obejmuje przepływ płynu śródmiąższowego. Ten model to hydrożel hialuronowo-kolagenowy I we wkładzie do hodowli tkankowej, w którym można zastosować głowicę ciśnieniową płynu. Inwazję można określić ilościowo, a komórki można wyizolować lub poddać lizie.

Fotopolimeryzowalny model inwazyjnego mikrośrodowiska glejaka z przepływem śródmiąższowym z kwasem hialuronowym i kolagenem

Poznaj metodę badania wpływu wskazówek matrycy na fenotyp komórek glejaka w kulturach 3D przy użyciu hydrożeli. Technika umożliwia przesiewowe testowanie warunków matrycy i identyfikację nowych terapii.

Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów (Wideo) | JoVE Journal

Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów

Przeglądaj więcej filmów