Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów
June 16th, 2022
Obecny protokół opisuje eksperymentalną platformę do oceny wpływu sygnałów mechanicznych i biochemicznych na reakcje chemoterapeutyczne komórek glejaka pochodzących od pacjenta w hodowlach 3D matrix-mimetic przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do oświetlania UV, umożliwiającego wysokoprzepustowe fotosieciowanie hydrożeli o regulowanych cechach mechanicznych.
Metoda ta umożliwia naukowcom systematyczne badanie, w jaki sposób sygnały macierzy wpływają na fenotyp komórek w hodowli 3D. Demonstrujemy procedurę z wykorzystaniem kultur komórek GBM. Główną zaletą tej techniki jest implementacja o wysokiej przepustowości, która pozwala nam na przesiewanie wielu warunków macierzowych.
Technika ta może być wykorzystana do opracowania matryc tkankowo-mimetycznych, które zachowują określone funkcje w modelach hodowli komórkowych, takich jak lekooporność komórek nowotworowych, i potencjalnie identyfikują nowe terapie. Procedurę zademonstrują Mary Epperson i Kelly Tamura, badaczki z Seidlits Lab. Zacznij od przygotowania roztworu buforowanego przez HEPES, rozpuszczając proszek HEPES w 20-milimolowym roztworze soli Hanksa.
Dostosuj pH do siedmiu po pełnej sorbacji. W roztworze buforowanym HEPES rozpuścić tiolowany kwas hialuronowy tak, aby 6 do 8% reszty kwasu karboksylowego na każdym kwasie glukuronowym było modyfikowane tiolem o stężeniu 10 miligramów na mililitr w roztworze buforowym. Mieszaj z prędkością mniejszą niż 1 000 obrotów na minutę za pomocą magnetycznej płytki mieszającej w temperaturze pokojowej, aż do całkowitego rozpuszczenia, zwykle około 45 minut.
Podczas rozpuszczania HA przygotuj oddzielne roztwory 100 miligramów na mililitr norbornenu 8arm PEG, 100 miligramów na mililitr tiolu 4arm PEG, czteromilimolowych cysteiny lub peptydu zawierającego cysteinę i czterech miligramów na mililitr LAP w probówkach do mikrowirówek. Przygotuj w tym momencie czteromilimolowe roztwory wszystkich peptydów, które mają być uwiązane w jednym hydrożelu. Wymieszaj poszczególne roztwory HA, norbornenu PEG, tiolu PEG i peptydów zawierających cysteinę-tiol, aby uzyskać końcowe stężenia dla końcowych matryc hydrożelowych.
Mieszaj z prędkością mniejszą niż 1 000 obrotów na minutę na magnetycznej płycie schodowej przez co najmniej 30 minut, aby w pełni wymieszać. Wyrównaj próbki z urządzeniem oświetleniowym z każdą inną diodą LED w jednej kolumnie form silikonowych lub płytki 384-dołkowej. Otwórz okno Parametry UV LED i wprowadź wartości intensywności i oświetlenia.
Następnie kliknij Zakończ, aby rozpocząć oświetlenie. Po oświetleniu, po umieszczeniu w jednym rogu, przesuń płytkę studzienki do następnego rogu i powtórz. Aby oświetlić dołki na drugiej połowie płyty, wyjmij płytkę z uchwytu i obróć o 180 stopni.
Aby wytworzyć hydrożele o różnej mechanice, zacznij od wyczyszczenia szkiełek i silikonowych form za pomocą taśmy do usuwania zanieczyszczeń. Przyklej silikonowe formy do szkiełka szklanego, dociśnij, aby zapewnić dobre uszczelnienie i wypiernij wszelkie pęcherzyki powietrza. Następnie odpipetuj 80 mikrolitrów roztworu prekursora hydrożelu do każdej formy silikonowej na szkiełku podstawowym.
Umieść szklaną szkiełko na urządzeniu oświetleniowym wyrównanym z każdą inną diodą LED w jednej kolumnie. Wystaw prekursory hydrożelu na działanie światła UV przez 15 sekund, aby usieciować zdjęcie. Po ustaniu oświetlenia wyjmij szkiełka i poluzuj żele z form, śledząc wewnętrzny obwód formy cienką końcówką.
Usuń silikonowe foremki pęsetą lub kleszczami. Napełnij 12-dołkową płytkę dwoma mililitrami DPBS. Przenieś usieciowane hydrożele do indywidualnej płytki dołka, zwilżając szpatułką i delikatnie spychając je ze szkiełka.
Przygotuj żądane komórki jako roztwór jednokomórkowy. Zbierz sferoidy glejaka o średnicy około 150 mikrometrów z kultury zawiesinowej kolby T-75 do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Przepłukać kolbę hodowlaną pięcioma mililitrami DPBS w celu usunięcia wszelkich pozostałości komórek i pożywki i dodać tę objętość do stożkowej probówki.
Odwirować stożkową probówkę zawierającą komórki o stężeniu 200 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu usunąć supernatant za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego i ponownie zawiesić w pięciu mililitrach DPBS. Wirować 200 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu umycia komórek.
Odessać supernatant pięciomililitrową pipetą serologiczną, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego, a następnie ponownie zawiesić komórki w dwóch mililitrach odczynnika do dysocjacji komórek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut. Dodaj trzy mililitry kompletnej pożywki i delikatnie pipetuj trzy do pięciu razy, aby rozbić sferoidy na zawiesinę jednokomórkową.
Odwirować zawiesinę jednokomórkową o stężeniu 400 razy G przez pięć minut, aby granulować komórki w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant pięciomililitrową pipetą serologiczną, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze kompletnego podłoża.
Usuń część komórek do liczenia za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć tę porcję dwukrotnie błękitem trypanowym, który przenika do komórek z upośledzoną żywotnością. Policz tylko żywe, bezbarwne komórki.
Określ liczbę komórek niezbędnych do enkapsulacji. Przenieś objętość pożywki zawierającą całkowitą liczbę potrzebnych komórek do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 mililitra. Wirować z prędkością 400 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Odessać supernatant za pomocą mikropipety, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Zawiesić osad komórkowy w roztworze prekursora hydrożelu, dobrze mieszając, pipetując w górę iw dół za pomocą mikropipety o pojemności 1 000 mikrolitrów cztery do pięciu razy. Załaduj ogniwa do pipetera powtarzalnego ustawionego na dozowanie 10 mikrolitrów.
Aby uniknąć pęcherzyków powietrza i nierównomiernego dozowania, należy zalać powtórny pipeter, dozując dodatkowo jeden lub dwa razy do pojemnika na odpady. Do każdej studzienki płytki 384-dołkowej należy dozować 10 mikrolitrów komórek zawieszonych w roztworze hydrożelu z powtórnego pipetera. Za pomocą matrycy LED oświetl każdą studzienkę zawierającą komórkę przez 15 sekund, aby osiągnąć pożądane właściwości mechaniczne.
Dodaj 40 mikrolitrów kompletnej pożywki do każdej studzienki zawierającej komórki. Dodaj 50 mikrolitrów DPBS do nieeksperymentalnych suchych studzienek otaczających żele, aby zminimalizować straty spowodowane parowaniem. W przypadku komórek glejaka należy dodać 40 mikrolitrów leku zawierającego pożywkę, aby osiągnąć ostateczne pożądane stężenie, rozpoczynając trzy dni po kapsułkowaniu.
Dodaj 10 mikrolitrów odczynnika CCK8 do każdej studzienki zawierającej komórki. Inkubować przez jedną do czterech godzin, zgodnie z instrukcjami producenta. Odczytać absorbancja przy 450 nanometrach dla wszystkich studzienek po inkubacji.
Badanie AFM regionów w skali mikronowej na powierzchniach pojedynczych hydrożeli wykazało, że hydrożele z bardziej miękkimi średnimi modułami Younga miały również mniejsze zakresy modułów niż sztywniejsze hydrogels. 3D kultury komórek GS122 wysiewanych w gęstości 2 500 000 komórek na mililitr wykazywały znacznie wyższą żywotność, gdy oceniano je po siedmiu dniach w hodowli w porównaniu z tymi wysiewanymi przy gęstości 500. 000 komórek na mililitr. Komórki GS122 wykazały wzrost przeżywalności w stanie ośmiu kilopaskalów, gdy peptydy pochodzące z osteopontyny zostały włączone do matrycy, podczas gdy włączenie wiążącej integrynę sialoproteiny lub peptydów pochodzących z tenascyny C zapewniło minimalne korzyści w zakresie przeżycia, takie jak hodowla i matryce z peptydem RGD imbiru.
W przeciwieństwie do tego, żadne peptydy nie zapewniały wzrostu przeżycia w warunkach hodowli 0,8 kilopaskala. Zarówno komórki GS122, jak i GS304 rozprzestrzeniają się podczas hodowli w miękkich lub sztywnych matrycach hydrożelowych, w tym peptydach zawierających RGD. Komórki GS122 wykazują podobny brak rozprzestrzeniania się zarówno w 0,8, jak i 8 kilopaskali z osteopontyną.
Jednak GS122 wykazywał zwiększoną odporność na temozolomid tylko w stanie ośmiu kilopaskal. Wreszcie, ta zminiaturyzowana platforma hodowli 3D może być wykorzystana do hodowli komórek ludzkich z innych typów nowotworów, w tym żywotnych organoidów terminalnie zróżnicowanych komórek neuroendokrynnego raka prostaty. Po tej procedurze można zastosować dalsze techniki, takie jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki, w celu dalszej charakterystyki fenotypów komórek.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę oceny wpływu sygnałów mechanicznych i biochemicznych na reakcje chemioterapeutyczne komórek glioblastoma w kulturach 3D. Technika wykorzystuje niestandardowe urządzenie do oświetlania UV do fotoprzesiewowego wiązania żeli.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Onkologia
- Biologia komórki
Tło
- Rozumienie, jak sygnały macierzy wpływają na zachowanie komórek, jest kluczowe dla badań nad rakiem.
- Systemy kultur 3D lepiej naśladują środowisko in vivo w porównaniu do tradycyjnych kultur 2D.
- Wysokowydajne przesiewanie może przyspieszyć identyfikację skutecznych strategii terapeutycznych.
- Komórki glioblastoma pochodzące od pacjenta zapewniają odpowiedni model do badania biologii guza.
Cel badania
- Systematyczne zbadanie wpływu warunków macierzy na reakcje komórek glioblastoma.
- Opracowanie macierzy mimetycznych tkanki, które zachowują określone funkcje komórkowe.
- Identyfikacja potencjalnych nowych leków w leczeniu glioblastoma.
Stosowane metody
- Przygotowanie roztworu buforowanego HEPES do kultury komórek.
- Wykorzystanie niestandardowego urządzenia do oświetlania UV do fotoprzesiewowego wiązania żeli.
- Wysokowydajne przesiewanie różnych warunków macierzy.
- Hodowla komórek glioblastoma pochodzących od pacjenta w środowiskach mimetycznych macierzy 3D.
Główne wyniki
- Metoda umożliwia ocenę odporności na leki w komórkach nowotworowych.
- Wysokowydajna implementacja umożliwia wydajne przesiewanie wielu warunków.
- Pokazana procedura przez studentów z laboratorium Seidlits.
- Potencjalna identyfikacja nowych strategii terapeutycznych dla glioblastoma.
Wnioski
- Ta technika poprawia rozumienie zachowania komórek glioblastoma w kulturach 3D.
- Dostarcza platformy do opracowywania nowych podejść terapeutycznych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie, aby zbadać dodatkowe warunki macierzy.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Integrating 3D hydrogel array platforms into early drug discovery enables systematic evaluation of matrix-driven effects on tumor cell phenotypes and therapeutic response. This approach increases predictive confidence by recapitulating tissue-specific microenvironments, supporting more informed go/no-go decisions for oncology portfolios. High-throughput compatibility with standard screening workflows positions this technology at a critical inflection point for translational pipeline advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-matrix interactions that drive drug resistance and tumor cell survival.
- Supports functional target validation by modeling clinically relevant phenotypes in 3D culture.
- Facilitates mechanistic de-risking through orthogonal variation of matrix mechanics and ligand presentation.
- Improves predictive confidence for candidate selection by mimicking in vivo-like conditions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 3D tumor models for integration with high-throughput drug screening pipelines.
- Standardizes assay conditions for reproducible, quantitative viability and drug response measurements.
- Enables scalable, miniaturized screening of combinatorial matrix parameters in multi-well formats.
- Supports reliable evaluation of compound efficacy in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with disease-relevant microenvironments for translational biomarker discovery.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by preserving patient-derived phenotypes.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on matrix-influenced therapeutic responses.
- Facilitates downstream single-cell analyses for deeper mechanistic insights.
Pipeline & Workflow Integration
This miniaturized 3D hydrogel array method bridges early discovery, screening, and translational research by enabling high-throughput, matrix-informed evaluation of tumor cell responses to therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on matrix-driven drug resistance and cell survival mechanisms.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible 3D models compatible with standard viability readouts.
- Analytics: Provides quantitative absorbance-based outputs for cross-condition comparison.
- Translational Research: Maintains disease-relevant phenotypes for preclinical model alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to various tumor types and matrix conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in oncology discovery.
- Operational Value: Enables standardized, scalable, and reproducible 3D culture workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by modeling clinically relevant responses.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture and hydrogel matrix preparation.
- Needs access to UV illumination devices and multi-well plate handling infrastructure.
- Demands cross-team standardization of matrix parameters and assay protocols.
- Adaptable to different tumor types and peptide ligands with protocol optimization.
- Throughput and readout scalability depend on plate format and analytical instrumentation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:50
Preparation of Hydrogel Solution
2:32
Illumination and Photocrosslinking of Hydrogels via an LED Array
4:20
Setting Up and Drug Treatment of 3D, Matrix-Embedded Cultures
8:22
Results: Effect of HA Based 3D Miniaturized Cultures on Matrix Stiffness and Integrin-Binding Peptides
10:24
Conclusion
