Name: Mikroskopia rozszerzająca retencję etykiety (LR-ExM) umożliwia obrazowanie w superrozdzielczości i etykietowanie o wysokiej wydajności (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Poznaj mikroskopię rozszerzającą retencję etykiety (LR-ExM) do obrazowania w superrozdzielczości komórek i tkanek. Ta metoda zapewnia sześciokrotnie wyższy sygnał fluorescencji niż tradycyjne podejścia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez U.S. National Institutes of Health (R00 GM126136 do X.S.), U.S. National Science Foundation (DMS1763272 do S.P.) oraz Simons Foundation (594598 do S.P.).

1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Użyj komórek U2OS hodowanych w pożywce McCoy's 5A uzupełnionej 10% FBS w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
	<li>Hodować komórki na 16-dołkowym wyjmowanym komorowym szkle nakrywkowym (powierzchnia hodowli 0,4cm2) dla łatwości obsługi.</li>
</ol>
2. Utrwalenie i przepuszczalność
UWAGA: Warunki fiksacji i przenikania zależą od zoptymalizowanych protokołów barwienia immunologicznego. Poniżej znajduje się protokół utrwalania i przepuszczalności mikrotubul do barwienia immunologicznego i dołów pokrytych klatryną (CCP).
<ol>
	<li>Gdy liczba komórek osiągnie ~ 0,04 x 106, utrwal komórki za pomocą 100 μl 3,2% paraformaldehydu (PFA) w buforze PEM (100 mM PIPES, 1 mM EGTA i 1 mM MgCl2, pH 6,9) przez 10 minut w temperaturze pokojowej (Tabela 1). 
	UWAGA: Mocowanie za pomocą PFA odbywa się w certyfikowanym kapturze ochronnym.</li>
	<li>Przemyć komórki trzy razy przez 5 minut każdy, 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Przepuszczalność komórek za pomocą 100 μl buforu permeabilizacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut (Tabela 1). 
	UWAGA: Kontynuuj znakowanie tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć degradacji docelowego białka, RNA lub DNA i uzyskać optymalny wynik. Jeśli jednak zajdzie taka potrzeba, utrwalone próbki mogą być przechowywane przez wydłużony czas (do miesiąca) w buforze PBS w temperaturze 4 °C. Odparowany PBS należy wymienić i chronić próbkę przed fotobieleniem.</li>
</ol>
3. Endogenne blokowanie streptawidyny i biotyny
<ol>
	<li>Inkubować komórki z roztworem streptawidyny rozcieńczonym w buforze blokującym komórki (100 μl) przez 15 minut w temperaturze pokojowej (Tabela 1).</li>
	<li>Przepłukać krótko 200 μl buforu blokującego komórki.</li>
	<li>Inkubować komórki ze 100 μl roztworu biotyny rozcieńczonego w buforze blokującym komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: W przypadku korzystania z metody samodzielnego etykietowania, takiej jak używanie znaczników SNAP lub CLIP-, pomiń krok 4 i przejdź do kroku 5.1: podejście do samodzielnego etykietowania.</li>
</ol>
4. Barwienie przeciwciał pierwotnych
<ol>
	<li>Inkubować komórki z szczurzym przeciwciałem anty-α-tubulinowym (rozcieńczenie 1:500) i króliczym przeciwciałem przeciwko klatrynie łańcucha ciężkiego (rozcieńczenie 1:100) w 100 μl buforu blokującego komórki przez 16 godzin w temperaturze 4 °C lub 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dwukrotnie wydłużyć czas inkubacji próbek tkanek.</li>
	<li>Próbki należy przemywać czterokrotnie 200 μl PBS przez 5 minut każda.</li>
</ol>
5. Barwienie przeciwciał wtórnych specyficznych dla LR-ExM
<ol>
	<li>Sprzężone przeciwciała IgG z trójfunkcyjnymi łącznikami, takimi jak N-hydroksysukcynimid (NHS) - metakryloamid (MA) - biotyna lub NHS-MA-digoksygenina (Dig) (<silna klasa = "xfig">Figura 1B). Synteza trójfunkcyjnych kotwic i koniugacja przeciwciał drugorzędowych zostały wcześniej wprowadzone w Shi et al.1. Podejście do samoznakowania: Sprzężone przeciwciała IgG z trójfunkcyjnymi łącznikami, takimi jak MA- benzylguanina (BG)-Biotyna lub MA- benzylocytozyna (BC)-Dig (<silna klasa = "xfig">Figura 1B). Synteza trójfunkcyjnych kotwic i koniugacja drugorzędowych przeciwciał zostały wcześniej wprowadzone w Shi et al.1.</li>
	<li>Inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi anty-królika-Dig-MA (rozcieńczenie 1:100) i osła anty-szczur-biotyna-MA (rozcieńczenie 1:100) w 100 μl buforu blokującego komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Należy podwoić ten czas inkubacji dla próbek tkanek.</li>
	<li>Próbki należy przemywać czterokrotnie w 200 μl PBS przez 5 minut każda.</li>
</ol>
6. Dodatkowe zakotwiczenie
<ol>
	<li>Inkubować komórki z 0,25% aldehydem glutarowym (GA) w PBS (100 μl) przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu zakotwiczenia białek na hydrożelu. Alternatywnie do zakotwiczenia należy użyć 25 mM estru N-hydroksysukcynimidu kwasu metakrylowego (MA-NHS). Zaleca się jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Próbki należy myć trzykrotnie w PBS przez 5 minut każda.</li>
</ol>
7. Żelowanie
UWAGA: Szybkość rozprężania jest określana przez czas dyfuzji soli i wody na zewnątrz lub do żelu; tak więc odlewanie cienkich żeli przyspiesza czas rozprężania.
<ol>
	<li>Usuń górną strukturę 16-dołkowej płytki żelowej. Dodać 40 μl roztworu monomeru do każdej studzienki, aby kondycjonować komórki na lodzie. Inkubować na lodzie przez 5 minut.
	<ol>
		<li>Aby przygotować roztwór monomeru, patrz Tabela 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór żelujący na lodzie. Dodać podwójnie destylowaną wodę i 10% akcelerator N,N,N′,N′ tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do roztworu monomeru (10% TEMED: roztwór monomeru = 1:47); nie dodawaj jeszcze inicjatora (Tabela 3).</li>
	<li>W komorze do hodowli komórkowej o powierzchni 0,4cm2 należy użyć roztworu żelującego o objętości około 40 μl. Przygotować 45 μl roztworu żelującego na każdą studzienkę.</li>
	<li>Dodać 10% nadsiarczanu amonu (APS) do roztworu żelującego, inkubować na lodzie i natychmiast odpipetować 40 μl roztworu żelującego do każdej silikonowej uszczelki dobrze na lodzie. Inkubować na lodzie przez 3 minuty (10% APS: 10% TEMED: roztwór monomeru = 1:1:47).</li>
	<li>Chronić próbkę przed światłem i przenieść szkło nakrywkowe z szalki Petriego o średnicy 10 cm do inkubatora o temperaturze 37 °C na 1,5 godziny w celu żelowania. Aby utrzymać wilgotność żelu podczas inkubacji w temperaturze 37 °C, przykryć szalkę Petriego pokrywką i wlać kilka kropli wody do płytki Petriego.</li>
</ol>
8. Trawienie
<ol>
	<li>Po żelowaniu wyjmij szklankę, aby oddzielić żel i przenieś żel na płytkę 6-dołkową. Trawić osadzone komórki za pomocą 2 ml buforu wytrawiającego (tabela 1) przez noc w temperaturze pokojowej lub 4 godziny w temperaturze 37 °C. Użyć co najmniej 10-krotnego nadmiaru buforu do wytrawiania.</li>
	<li>Żele należy myć z co najmniej 10-krotnym nadmiarem wody niż końcowa objętość żelu. Powtórz etap prania cztery razy przez 20 do 30 minut za każdym razem. Żel rozszerza się około dwukrotnie w każdym wymiarze. 
	UWAGA: Próbki żelu można przechowywać do 1 miesiąca w buforze PBS w temperaturze 4 °C. Wymień odparowaną wodę, aby uniknąć wysuszenia i chroń próbkę przed światłem podczas przechowywania. Aby uniknąć degradacji kotew trójfunkcyjnych, próbki należy zabarwić jak najszybciej po roztrawieniu i umyciu.</li>
</ol>
9. Barwienie fluorescencyjne po trawieniu
<ol>
	<li>Inkubować żele w objętości 2 ml buforu barwiącego streptawidynę (STV)/digoksygeninę (DIG) z 2 do 5 μM barwnikiem STV i/lub barwnikiem anty-DIG przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Próbki należy przechowywać w ciemności.</li>
</ol>
10. Rozbudowa
<ol>
	<li>Umyj i rozpręż żel czterokrotnie nadmiarem wody (2-3 ml) przez 30 minut do 1 godziny za każdym razem.</li>
	<li>Dla łatwiejszej wizualizacji komórek pod mikroskopem fluorescencyjnym, wybarwić komórki DAPI podczas trzeciego z pięciu myć. Rozcieńczyć stężenie podstawowe DAPI (5 mg/ml, przechowywane w temperaturze 4 °C) w rozcieńczeniach 1:5 000 w wodzie do mycia. Żel inkubować z roztworem wodnym DAPI (2 ml) przez 30 minut do 1 godziny.</li>
	<li>Przemyć jeszcze dwa razy 3 ml wody.</li>
	<li>Rozpręż żele w dowolnym płaskim naczyniu, które jest wystarczająco duże, aby pomieścić próbki. Żele ekspandowane, które są przygotowywane na szkle nakrywkowym o powierzchni0,4 cm i 2 cm, dobrze mieszczą się w 6-dołkowej płytce ze szklanym dnem. 
	UWAGA: Próbki barwione po ekspandowaniu mogą być przechowywane do 4 miesięcy w buforze PBS w temperaturze 4°C. Dodaj tyle wody, aby uniknąć wysuszenia i chronić próbkę przed fotowybielaniem. Powtórz etap ekspansji i barwienia DAPI przed obrazowaniem. Aby uniknąć ryzyka degradacji fluoroforu, próbki należy jak najszybciej zobrazować.</li>
</ol>
11. Obrazowanie
<ol>
	<li>Pokryj 6-dołkową komorę obrazowania ze szklanym dnem 0,01% poli-L-lizyny (po 3 ml każda) w celu unieruchomienia próbek żelu.</li>
	<li>Przenieść próbki żelu do powlekanej komory obrazowania.</li>
	<li>Zobrazuj próbki za pomocą dowolnych lunet fluorescencyjnych.</li>
</ol>

<ol><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-retention+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Label-retention expansion microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067(2021).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
<li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li>
<li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+expansion+microscopy+with+structured+illumination+microscopy+for+analyzing+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes.</a> Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).</li>
<li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li>
<li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+scalable+super+resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size+adjustable+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li>
<li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+protein+tag+for+multiprotein+labeling+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells.</a> Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).</li>
<li>Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+fusion+proteins+with+synthetic+fluorophores+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).</li>
<li>Thevathasan, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pores+as+versatile+reference+standards+for+quantitative+super+resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy.</a> Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).</li>
<li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (19), 45836(2018).</li>
<li>Damstra, H. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cellular+and+tissue+ultrastructure+using+Ten-fold+Robust+Expansion+Microscopy+%28TREx%29%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx).</a> eLife. 11, 73775(2021).</li>
<li>M'Saad, O., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+of+proteins+in+their+ultrastructural+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Light microscopy of proteins in their ultrastructural context.</a> Nature Communications. 11 (1), 3850(2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Kluczową innowacją LR-ExM jest wykorzystanie trójfunkcyjnych kotwic do skutecznego znakowania docelowych białek i poprawy jakości obrazu. Metoda ta jest ograniczona przez kotwice trójfunkcyjne, które nie są tak łatwo dostępne dla badaczy. Jednak trójfunkcyjne kotwice mogą być udostępniane innym badaczom na żądanie, a podobne produkty, takie jak sondy ExM firmy Chrometa, są teraz również dostępne na rynku.
W tym protokole przeprowadzono 1-godzinną inkubację w temperaturze pokojowej dla etapów b...

Mikroskopia ekspansywacyjna (ExM) jest używana przez badaczy od kiedy została po raz pierwszy wprowadzona jako wygodne podejście do uzyskania obrazowania w super rozdzielczości za pomocą konwencjonalnych mikroskopów, takich jak mikroskopy epifluorescencyjne i konfokalne1,2,3,4,5,6,7. Korzystając z ExM, możliwe jest osiągnięcie rozdzielczości bocznej ~70 nm nawet przy użyciu zwykłych mikroskopów konfokalnych. Gdy ExM jest połączony z obrazowaniem w superrozdzielczości, rozdzielczość jest jeszcze lepsza. Na przykład można osiągnąć rozdzielczość około 30 nm za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SIM) i rozdzielczość około 4 nm za pomocą stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (STORM)1,5.
Jednak niska skuteczność etykietowania jest krytycznym problemem w przypadku standardowych metod ExM. Utrata fluorescencji może się różnić w zależności od rodzaju grup fluorescencyjnych i czasu trawienia. Średnio jednak doniesiono, że ponad 50% fluoroforów jest traconych po etapach polimeryzacji i trawienia białek ExM, co jest szkodliwe dla jakości obrazowania3,4.
W ten sposób opracowano mikroskopię rozszerzającą zapamiętywanie etykiet (LR-ExM), która może skutecznie zatrzymywać etykiety i zmniejszać straty sygnału1. Kluczową innowacją LR-ExM jest zastosowanie zestawu trójfunkcyjnych kotwic, a nie tylko barwników fluorescencyjnych - jak w standardowej procedurze ExM - do barwienia interesujących białek. Te trójfunkcyjne łączniki składają się z trzech części: (1) łącznika (np. N-hydroksysukcynimidu (NHS)) do połączenia z przeciwciałem, (2) kotwicy (np. metakryloamidu (MA)) do zakotwiczenia białek w polimerze oraz (3) łącznika reporterowego (np. biotyny lub digoksygeniny (DIG)) do koniugacji z barwnikiem organicznym. Trójfunkcyjne kotwice przetrwają etapy polimeryzacji i trawienia białek, a tym samym zapobiegają utracie fluoroforu.
Ponadto, ta metoda ma ogromny potencjał, ponieważ jest kompatybilna z samoetykietującymi znacznikami enzymatycznymi, takimi jak SNAP czy CLIP. Metody znaczników enzymatycznych mają pewne zalety w porównaniu z podejściem immunologicznym pod względem wysokiej swoistości i skuteczności znakowania8,9,10.
W tym manuskrypcie szczegółowo opisano procedurę LR-ExM. LR-ExM to wysoce skuteczna i elastyczna metoda pozwalająca osiągnąć wysoką rozdzielczość przestrzenną przy zwiększonej wydajności etykietowania.

<table><tbody><tr><td>Akrylamid&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9099&nbsp;</td><td>Żel ExM</td></tr><tr><td>AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>H+L, 711&ndash; 005-152</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>H+L, 712&ndash; 005-153</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-Streptavidin</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-540-084</td><td>Sondy fluorescencyjne&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Streptavidin</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-580-084</td><td>Sondy fluorescencyjne&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Streptavidin</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-600-084</td><td>Sondy fluorescencyjne&nbsp;</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A3678&nbsp;</td><td>Żel ExM</td></tr><tr><td>anty-H3K4me3</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>anty-H3K9me3</td><td>Abcam</td><td>ab176916</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>DAPI dioctan</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D3571</td><td>Sondy fluorescencyjne&nbsp;</td></tr><tr><td>DyLight 488 Anty-digoxigenina/digoksyna (DIG)</td><td>Vector Laboratories</td><td>DI-7488</td><td>Sondy fluorescencyjne&nbsp;</td></tr><tr><td>DyLight 594 Znakowane anty-digoxigenin/digoksyna (DIG)</td><td>Vector Laboratories</td><td>DI-7594</td><td>Sondy fluorescencyjne&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>324626-25GM</td><td>Bufor utrwalający</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Bufor trawienny</td> <td>EDTA</td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy 10% EM Grade</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>50-262-13</td><td>Zakotwiczenie</td></tr><tr><td>Grace Bio-Labs CultureDobrze wyjmowana komorowa szklana osłona</td><td>Grace Bio-Labs&nbsp;</td><td>GBL112358-8EA</td><td>Komora do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Grace Bio-Labs Narzędzie do usuwania CultureWell</td><td>Grace Bio-Labs&nbsp;</td><td>GBL103259</td><td>Narzędzie do usuwania</td></tr><tr><td>guanidyny HCl&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G3272&nbsp;</td><td>Bufor mineralizacyjny</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma</td><td>M8266-1KG</td><td>Bufor utrwalający</td></tr><tr><td>McCoy's 5a</td><td>ATCC</td><td>30&ndash; 2007</td><td>Pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>Ester N-hydroksysukcynimidu kwasu metakrylowego, 98%&nbsp; (MA-NHS)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>730300-1G</td><td>Zakotwiczenie</td></tr><tr><td>monoklonalne mysie przeciwciało anty-Nup153</td><td>Abcam</td><td>ab24700</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>N,N&prime; Metylenobisakrylamid&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M7279&nbsp;</td><td>Żel ExM</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime; Tetrametyloetylenodiamina&nbsp; (TEMED)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T7024&nbsp;</td><td>Żel ExM</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehydowe roztwory wodne</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>50-980-487</td><td>Bufor utrwalający</td></tr><tr><td>RURY</td><td>Sigma</td><td>P6757-25G</td><td>Bufor utrwalający</td></tr><tr><td>Poli-L-Lizyna</td><td>Sigma</td><td>P8920-100ML</td><td>Powłoka komory</td></tr><tr><td>Proteinaza K&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4850-5ML</td><td>Bufor trawienny</td></tr><tr><td>Królik przeciwciało przeciw klatrynie o łańcuchach ciężkich</td><td>Abcam</td><td>ab21679</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>anty&ndash; &alfa;-tubulina, tyrozynowa, klon YL1/2</td><td>Millipore Sigma</td><td>MAB1864-I</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>Akrylan Sodu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>408220</td><td>ExM Gel zestaw</td></tr><tr><td>blokujący streptawidynę / biotynę</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-2002</td><td>Bufor blokujący</td></tr><tr><td>Tris-HCl&nbsp;</td><td>Technologie życiowe&nbsp;</td><td>AM9855&nbsp;</td><td>Bufor mineralizacyjny</td></tr><tr><td>U2OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>6-dołkowe szklane płytki dolne</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td>Płytka obrazowa</td></tr></tbody></table>

mikroskopia rozszerzająca retencję etykiety (lr-exm) umożliwia obrazowanie w superrozdzielczości i etykietowanie o wysokiej wydajności

Label-Retention Expansion Microscopy (LR-ExM) Enables Super-Resolution Imaging and High-Efficiency Labeling

Mikroskopia ekspansywacyjna (ExM) to technika przygotowania próbki, którą można połączyć z większością metod mikroskopii świetlnej w celu zwiększenia rozdzielczości. Po zanurzeniu komórek lub tkanek w pęczniejącym hydrożelu, próbki mogą być fizycznie rozszerzane od trzech do szesnastu razy (wymiar liniowy) w porównaniu z pierwotnym rozmiarem. W związku z tym efektywna rozdzielczość każdego mikroskopu jest zwiększana przez współczynnik rozszerzalności. Głównym ograniczeniem wcześniej wprowadzonego ExM jest zmniejszona fluorescencja po polimeryzacji i procedurze trawienia. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowano mikroskopię rozszerzającą retencję etykiet (LR-ExM), która zapobiega utracie sygnału i znacznie zwiększa wydajność etykietowania przy użyciu zestawu nowatorskich kotwic trójfunkcyjnych. Technika ta pozwala na osiągnięcie wyższej rozdzielczości podczas badania struktur komórkowych lub subkomórkowych w skali nanometrycznej przy minimalnych stratach sygnału fluorescencyjnego. LR-ExM może być stosowany nie tylko do znakowania immunofluorescencyjnego, ale także do samoznakowania znaczników białkowych, takich jak znaczniki SNAP i CLIP, osiągając w ten sposób wyższą wydajność znakowania. W niniejszej pracy przedstawiono procedurę i rozwiązywanie problemów związanych z tym podejściem opartym na barwieniu immunologicznym, a także omówienie podejść do samoznakowania LR-ExM jako alternatywy.

Do immunobarwienia wgłębień powlekanych klatryną (CCPs) wykorzystano kotwice trójfunkcyjne (Rysunek 1B), a następnie przeprowadzono LR-ExM zgodnie z opisem na Rysunku 1A. LR-ExM (Rysunek 2C,E) wykazuje znacznie wyższą intensywność fluorescencji w porównaniu do mikroskopii ekspansyjnej z retencją białek (proExM, Rysunek 2A) lub biotin-ExM (Rysunek 2B); sygna...

Protokół mikroskopii rozszerzania retencji etykiet (LR-ExM) jest zademonstrowany. LR-ExM wykorzystuje nowatorski zestaw kotew trójfunkcyjnych, który zapewnia lepszą wydajność etykietowania w porównaniu z wcześniej wprowadzonymi mikroskopami ekspandacyjnymi.

Mikroskopia rozszerzająca retencję etykiety (LR-ExM) umożliwia obrazowanie w superrozdzielczości i etykietowanie o wysokiej wydajności

Expansion microscopy (ExM) is a sample preparation technique that can be combined with most light microscopy methods to increase the resolution. After ...

Jednym z głównych ograniczeń mikroskopii ekspansyjnej jest spowolnienie fluorescencji po polimeryzacji i trawieniu. Mikroskopia ekspansji retencji etykiet, nazywana przez nas LR-ExM, wykorzystuje trójfunkcyjne kotwice, które służą do polimeryzacji i trawienia. Po użyciu kotwicy trójfunkcyjnej wprowadzamy fluorescencję po kroku ekspansji.Dzięki temu zachowujemy dobry stosunek sygnału do szumu, mając jednocześnie wysoką rozdzielczość. Mikroskopia ekspandyjna retencji etykiet może być łączona z dowolnymi innymi wprowadzonymi wcześniej mikroskopami ekspandacyjnymi, a także mikroskopami fluorescencyjnymi. Jest bardzo wytrzymały w wszechstronnej metodzie.A w przypadku obrazowania o wysokiej regulacji bardzo ważne jest, aby mieć wzmocniony sygnał. Na początek hoduj komórki na 16-dołkowym wyjmowanym szkle nakrywkowym z kompletnym podłożem o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy liczba komórek osiągnie około 40 000, utrwal komórki za pomocą 100 mikrolitrów 3,2% PFA w buforze PEM przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie przepuszczaj komórki za pomocą 100 mikrolitrów buforu permeablacyjnego w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Inkubować komórki z roztworem streptawidyny rozcieńczonym w buforze blokującym komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie krótko przepłukać 200 mikrolitrami buforu blokującego komórki. Następnie inkubuj komórki ze 100 mikrolitrami roztworu biotyny rozcieńczonego w buforze blokującym komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Następnie inkubować komórki ze 100 mikrolitrami roztworu przeciwciała pierwszorzędowego zawierającego szczurze przeciwciało anty alfa tubuliny i królicze przeciwciało przeciwko klatrynie o łańcuchu ciężkim przez 16 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj komórki ze 100 mikrolitrami roztworu przeciwciał drugorzędowych zawierających kotwice trójfunkcyjne, MA przeciwko ośłowi królikowi i biotynie MA przeciwko szczurom przez godzinę w temperaturze pokojowej. Inkubuj komórki ze 100 mikrolitrami 0,25% aldehydu glutarowego przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu zakotwiczenia białek na hydrożelu.Usuń górną strukturę płytki 16-dołkowej za pomocą żyletki lub dowolnego wybranego narzędzia do usuwania i zachowaj dolną szklaną pokrywę. Umieść szklankę nakrywkową na szalce Petriego i umieść je na lodzie. Dodaj 45 mikrolitrów roztworu monomeru do każdej studzienki, aby kondycjonować komórki.Inkubować na lodzie przez pięć minut. Aby przygotować roztwór żelujący, przygotuj 1,5 mililitra mikroprobówkę wirówkową. Wymieszaj monomer, podwójnie destylowaną wodę i 10% T med.Nie dodawaj jeszcze amonu na siarczan. W międzyczasie trzymaj probówkę z roztworem żelującym na lodzie. Dodać 10% nadsiarczanu amonu do roztworu żelującego.Natychmiast odpipetować 40 mikrolitrów roztworu żelującego do każdej studzienki, przechowując probówkę z roztworem żelującym na lodzie. Umieść płytkę studzienki na lodzie na kolejne trzy minuty. Aby utrzymać wilgotność żelu podczas inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza, przykryj szalkę Petriego pokrywką i wlej kilka kropel wody do szalki Petriego.Chroniąc próbkę przed światłem, przenieś szkło nakrywkowe i 10-centymetrową szalkę Petriego do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 1,5 godziny w celu żelowania. Po żelowaniu przetnij szkło nakrywkowe, aby oddzielić każdy żel. Przenieś żele do sześciu płytek dołkowych.Dodaj dwa mililitry buforu wytrawiającego do każdej studzienki. Pozostaw próbki na noc w temperaturze pokojowej lub na cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umyj żele z co najmniej 10-krotnym nadmiarem wody w stosunku do końcowej objętości żelu, powtarzając etap prania cztery razy przez 20 do 30 minut za każdym razem, a żel rozszerzy się około czterokrotnie w każdym wymiarze.Inkubować żele w dwóch mililitrach objętości buforu barwiącego digoksygeninę streptawidyny z dwoma do pięciu mikromolowych barwnikami streptawidyny i/lub barwnikiem antydigoksygeninowym przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, trzymając próbki w ciemności. Następnie umyj i rozpręż żel dwa do czterech razy nadmiarem wody. Każde pranie trwa około 30 minut do godziny.Dla łatwiejszej wizualizacji komórek pod mikroskopem fluorescencyjnym, wybarwić komórki DAPI podczas trzeciego mycia. Rozcieńczyć zapas DAPI w jednym do 5 000 złudzeń w wodzie do mycia. Inkubować żel z roztworem DAPI przez 30 minut do jednej godziny.Następnie umyj jeszcze dwa razy trzema mililitrami wody. Pokryj sześciodołkową komorę obrazowania ze szklanym dnem trzema mililitrami 0,01% polilizyny, aby unieruchomić próbki żelu. Następnie przenieś próbki żelu do zakodowanej komory obrazowania i zobrazuj próbki za pomocą dowolnych fluorescencyjnych skopów.Mikroskopia ekspansji retencji etykiet wykazuje lepsze znakowanie fluorescencyjne w porównaniu z mikroskopią ekspansji retencji białek lub próbkami mikroskopii ekspansji biotyny. Mikroskopia ekspansji retencji etykiet wykazuje około sześciokrotnie wyższy sygnał fluorescencji w porównaniu z mikroskopią ekspansji retencji białek. LR-ExM może skutecznie wychwytywać małe struktury, takie jak wżery pokryte klatryną z rozdzielczością graniczną subdefrakcji.Mikrotubule i wgłębienia pokryte klatryną były barwieniami koimmunologicznymi przy użyciu funkcjonalnych kotwic, NHS MA dig i NHS MA biotyny. Podobnie, wgłębienia i mitochondria pokryte klatryną znakowano przy użyciu enzymatycznego znacznika białkowego z kotwicami trójfunkcyjnymi, takimi jak biotyna BG MA i BC MA dig. Ponadto połączono podejście oparte na barwieniu immunologicznym i podejście do znacznika białka enzymatycznego, aby pokazać strukturę laminy A/C i kompleksu nukleoporowego.Mikroskopię ekspansji retencji znaczników przeprowadzono na tkance mózgowej myszy poprzez koimmunologiczne barwienie markera presynaptycznego, fagotu, i markera postsynaptycznego, Homera 1. Obie etykiety były wyraźne i dobrze oddzielone, co wspiera wysoką rozdzielczość i wydajność etykietowania. Mikroskopia ekspandywna retencji pracy jest wszechstronną i solidną metodą, którą można łączyć z dowolnymi innymi wcześniej wprowadzonymi mikroskopami ekspandacyjnymi.W przypadku obrazowania o wysokiej rozdzielczości ważne jest osiągnięcie dobrej wydajności etykietowania, aby lepiej uchwycić strukturę skali molekularnej. Mikroskopia ekspansji retencji pracy jest skuteczną i solidną metodą wzmacniania sygnału.

label-retention-expansion-microscopy-lr-exm-enables-super-resolution

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiono prostą i nowatorską technikę rejestrowania wyładowań doprowadzających z powodu mechanicznej stymulacji lancetowatych końcówek końcówek palisadowych, unerwiających mysie, skóry uszu, mieszków włosowych.

Połączony zapis mechanicznie stymulowanego wydzielania aferentnego i znakowania zakończeń nerwowych w lancetowatych zakończeniach mieszków włosowych myszy

Ten manuskrypt opisuje metodę znakowania pojedynczych transkryptów informacyjnego RNA (mRNA) za pomocą fluorescencyjnie znakowanych sond DNA, do wykorzystania w eksperymentach z hybrydyzacją fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ (smFISH) u E. coli. smFISH to metoda wizualizacji, która pozwala na jednoczesne wykrywanie, lokalizację i kwantyfikację pojedynczych cząsteczek mRNA w utrwalonych pojedynczych komórkach.

Metoda znakowania transkryptów w poszczególnych komórkach Escherichia coli do eksperymentów hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Mikroskopia superrozdzielcza może dostarczyć szczegółowych informacji na temat organizacji komponentów w kompleksie synaptonemalnym w mejozie. Tutaj demonstrujemy protokół rozwiązywania poszczególnych białek kompleksu synaptonemalnego Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia superrozdzielcza kompleksu synaptonemalnego w obrębie linii zarodkowej Caenorhabditis elegans

Tutaj przedstawiono protokół implementacji mikroskopii ekspansywnej we wczesnych zarodkach Drosophila w celu uzyskania obrazowania w superrozdzielczości przy użyciu konwencjonalnego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego.

Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości

Prezentowana jest tutaj nowa wersja mikroskopii ekspansyjnej (ExM), Magnify, która jest zmodyfikowana do 11-krotnej ekspansji, zachowując szeroki wachlarz klas biomolekuł i jest kompatybilna z szerokim zakresem typów tkanek. Umożliwia badanie konfiguracji biomolekuł w nanoskali przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów o ograniczonej dyfrakcji.

Uniwersalna retencja molekularna z 11-krotną mikroskopią ekspansywną

Tutaj proponujemy prosty protokół łączący metaboliczną inżynierię oligosacharydów, chemię kliknięć i mikroskopię ekspansji, który umożliwia bioobrazowanie wewnątrzkomórkowych sjalowanych N-glikoprotein z lepszą rozdzielczością przy użyciu rutynowego sprzętu mikroskopowego.

Wizualizacja sialilacji wewnątrzkomórkowej za pomocą chemii kliknięć i mikroskopii ekspansyjnej

Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół łączący metody kriofiksacji i mikroskopii ekspansyjnej (Cryo-ExM), umożliwiający obrazowanie w wysokiej rozdzielczości z zachowaniem strukturalnym dostosowanym do różnych próbek biologicznych. Próbki biologiczne są zamrażane, osadzane w polimerze puchniącym, denaturowane, rozszerzane i znakowane immunosystemowo, co umożliwia obrazowanie o nadrozdzielczości za pomocą standardowych mikroskopów świetlnych.

Mikroskopia ekspansyjna: Obrazowanie fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości za pomocą konwencjonalnego mikroskopu

Protokół ten określa procedurę wykonywania głębokiej, całkomórkowej mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej (SMLM) za pomocą obrotowego mikroskopu konfokalnego z optycznym przesunięciem fotonów, co umożliwia obrazowanie DNA-PAINT bez potrzeby stosowania niestandardowej optyki czy złożonego oświetlenia.

Obrazowanie całokomórkowe superrozdzielczości za pomocą DNA-PAINT na obracającym się dysku konfokalnym z optycznym przekształceniem fotonów

Opisujemy metodę obrazowania w super-rozdzielczości, aby zbadać strukturalną organizację bakteryjnego pierścienia FtsZ, niezbędnego aparatu do podziału komórek.  Metoda ta opiera się na analizach ilościowych obrazów z mikroskopii lokalizacji aktywowanej fotoaktywowaną (PALM) i może być stosowana do innych bakteryjnych białek cytoszkieletu.

Obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego

Poznaj mikroskopię rozszerzającą retencję etykiety (LR-ExM) do obrazowania w superrozdzielczości komórek i tkanek. Ta metoda zapewnia sześciokrotnie wyższy sygnał fluorescencji niż tradycyjne podejścia.

Mikroskopia rozszerzająca retencję etykiety (LR-ExM) umożliwia obrazowanie w superrozdzielczości i etykietowanie o wysokiej wydajności (Wideo) | JoVE Journal

Mikroskopia rozszerzająca retencję etykiety (LR-ExM) umożliwia obrazowanie w superrozdzielczości i etykietowanie o wysokiej wydajności

Przeglądaj więcej filmów