Mikroskopia rozszerzająca retencję etykiety (LR-ExM) umożliwia obrazowanie w superrozdzielczości i etykietowanie o wysokiej wydajności

Jednym z głównych ograniczeń mikroskopii ekspansyjnej jest spowolnienie fluorescencji po polimeryzacji i trawieniu. Mikroskopia ekspansji retencji etykiet, nazywana przez nas LR-ExM, wykorzystuje trójfunkcyjne kotwice, które służą do polimeryzacji i trawienia. Po użyciu kotwicy trójfunkcyjnej wprowadzamy fluorescencję po kroku ekspansji.

Dzięki temu zachowujemy dobry stosunek sygnału do szumu, mając jednocześnie wysoką rozdzielczość. Mikroskopia ekspandyjna retencji etykiet może być łączona z dowolnymi innymi wprowadzonymi wcześniej mikroskopami ekspandacyjnymi, a także mikroskopami fluorescencyjnymi. Jest bardzo wytrzymały w wszechstronnej metodzie.

A w przypadku obrazowania o wysokiej regulacji bardzo ważne jest, aby mieć wzmocniony sygnał. Na początek hoduj komórki na 16-dołkowym wyjmowanym szkle nakrywkowym z kompletnym podłożem o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy liczba komórek osiągnie około 40 000, utrwal komórki za pomocą 100 mikrolitrów 3,2% PFA w buforze PEM przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie przepuszczaj komórki za pomocą 100 mikrolitrów buforu permeablacyjnego w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Inkubować komórki z roztworem streptawidyny rozcieńczonym w buforze blokującym komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie krótko przepłukać 200 mikrolitrami buforu blokującego komórki. Następnie inkubuj komórki ze 100 mikrolitrami roztworu biotyny rozcieńczonego w buforze blokującym komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie inkubować komórki ze 100 mikrolitrami roztworu przeciwciała pierwszorzędowego zawierającego szczurze przeciwciało anty alfa tubuliny i królicze przeciwciało przeciwko klatrynie o łańcuchu ciężkim przez 16 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj komórki ze 100 mikrolitrami roztworu przeciwciał drugorzędowych zawierających kotwice trójfunkcyjne, MA przeciwko ośłowi królikowi i biotynie MA przeciwko szczurom przez godzinę w temperaturze pokojowej. Inkubuj komórki ze 100 mikrolitrami 0,25% aldehydu glutarowego przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu zakotwiczenia białek na hydrożelu.

Usuń górną strukturę płytki 16-dołkowej za pomocą żyletki lub dowolnego wybranego narzędzia do usuwania i zachowaj dolną szklaną pokrywę. Umieść szklankę nakrywkową na szalce Petriego i umieść je na lodzie. Dodaj 45 mikrolitrów roztworu monomeru do każdej studzienki, aby kondycjonować komórki.

Inkubować na lodzie przez pięć minut. Aby przygotować roztwór żelujący, przygotuj 1,5 mililitra mikroprobówkę wirówkową. Wymieszaj monomer, podwójnie destylowaną wodę i 10% T med.

Nie dodawaj jeszcze amonu na siarczan. W międzyczasie trzymaj probówkę z roztworem żelującym na lodzie. Dodać 10% nadsiarczanu amonu do roztworu żelującego.

Natychmiast odpipetować 40 mikrolitrów roztworu żelującego do każdej studzienki, przechowując probówkę z roztworem żelującym na lodzie. Umieść płytkę studzienki na lodzie na kolejne trzy minuty. Aby utrzymać wilgotność żelu podczas inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza, przykryj szalkę Petriego pokrywką i wlej kilka kropel wody do szalki Petriego.

Chroniąc próbkę przed światłem, przenieś szkło nakrywkowe i 10-centymetrową szalkę Petriego do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 1,5 godziny w celu żelowania. Po żelowaniu przetnij szkło nakrywkowe, aby oddzielić każdy żel. Przenieś żele do sześciu płytek dołkowych.

Dodaj dwa mililitry buforu wytrawiającego do każdej studzienki. Pozostaw próbki na noc w temperaturze pokojowej lub na cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umyj żele z co najmniej 10-krotnym nadmiarem wody w stosunku do końcowej objętości żelu, powtarzając etap prania cztery razy przez 20 do 30 minut za każdym razem, a żel rozszerzy się około czterokrotnie w każdym wymiarze.

Inkubować żele w dwóch mililitrach objętości buforu barwiącego digoksygeninę streptawidyny z dwoma do pięciu mikromolowych barwnikami streptawidyny i/lub barwnikiem antydigoksygeninowym przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, trzymając próbki w ciemności. Następnie umyj i rozpręż żel dwa do czterech razy nadmiarem wody. Każde pranie trwa około 30 minut do godziny.

Dla łatwiejszej wizualizacji komórek pod mikroskopem fluorescencyjnym, wybarwić komórki DAPI podczas trzeciego mycia. Rozcieńczyć zapas DAPI w jednym do 5 000 złudzeń w wodzie do mycia. Inkubować żel z roztworem DAPI przez 30 minut do jednej godziny.

Następnie umyj jeszcze dwa razy trzema mililitrami wody. Pokryj sześciodołkową komorę obrazowania ze szklanym dnem trzema mililitrami 0,01% polilizyny, aby unieruchomić próbki żelu. Następnie przenieś próbki żelu do zakodowanej komory obrazowania i zobrazuj próbki za pomocą dowolnych fluorescencyjnych skopów.

Mikroskopia ekspansji retencji etykiet wykazuje lepsze znakowanie fluorescencyjne w porównaniu z mikroskopią ekspansji retencji białek lub próbkami mikroskopii ekspansji biotyny. Mikroskopia ekspansji retencji etykiet wykazuje około sześciokrotnie wyższy sygnał fluorescencji w porównaniu z mikroskopią ekspansji retencji białek. LR-ExM może skutecznie wychwytywać małe struktury, takie jak wżery pokryte klatryną z rozdzielczością graniczną subdefrakcji.

Mikrotubule i wgłębienia pokryte klatryną były barwieniami koimmunologicznymi przy użyciu funkcjonalnych kotwic, NHS MA dig i NHS MA biotyny. Podobnie, wgłębienia i mitochondria pokryte klatryną znakowano przy użyciu enzymatycznego znacznika białkowego z kotwicami trójfunkcyjnymi, takimi jak biotyna BG MA i BC MA dig. Ponadto połączono podejście oparte na barwieniu immunologicznym i podejście do znacznika białka enzymatycznego, aby pokazać strukturę laminy A/C i kompleksu nukleoporowego.

Mikroskopię ekspansji retencji znaczników przeprowadzono na tkance mózgowej myszy poprzez koimmunologiczne barwienie markera presynaptycznego, fagotu, i markera postsynaptycznego, Homera 1. Obie etykiety były wyraźne i dobrze oddzielone, co wspiera wysoką rozdzielczość i wydajność etykietowania. Mikroskopia ekspandywna retencji pracy jest wszechstronną i solidną metodą, którą można łączyć z dowolnymi innymi wcześniej wprowadzonymi mikroskopami ekspandacyjnymi.

W przypadku obrazowania o wysokiej rozdzielczości ważne jest osiągnięcie dobrej wydajności etykietowania, aby lepiej uchwycić strukturę skali molekularnej. Mikroskopia ekspansji retencji pracy jest skuteczną i solidną metodą wzmacniania sygnału.