Odkrywanie wzajemnych oddziaływań między komórkami NK a neuronami nocyceptorowymi

Biorąc pod uwagę, że neuron nocyceptorowy wydziela różne neuropeptydy i że komórka NK wyraża receptor dla tych neuropeptydów, zdecydowaliśmy się opracować metodę wspólnej hodowli w celu zbadania wzajemnych oddziaływań między komórką NK a neuronami nocyceptorowymi. Taka redukcjonistyczna metoda może być przydatna do zbadania, w jaki sposób neurony nocyceptorowe kontrolują funkcję przeciwnowotworową komórki NK, a także może być interesująca do zbadania, w jaki sposób komórka NK kontroluje eliminację uszkodzonych neuronów. Procedurę zademonstruje Ali Ahmadi, były student studiów magisterskich z mojego laboratorium.

Aby rozpocząć izolację i hodowlę komórek NK metodą NK lub NK należy zebrać śledzionę myszy w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej zawierającej 500 mikrolitrów sterylnego PBS, a następnie homogenizować śledzionę za pomocą tłuczka. Następnie rozcieńczyć komórki jednym mililitrem sterylnego PBS i przefiltrować mieszaninę przez sitko do komórek o średnicy 50 mikronów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Uzupełnij objętość przefiltrowanego homogenatu do 10 mililitrów za pomocą sterylnego PBS.

Policz komórki w 10 mikrolitrach rozcieńczonego homogenatu za pomocą hemocytometru. Odwirować pozostałe komórki przez pięć minut w temperaturze 500 G i usunąć supernatant. Następnie ponownie zawieś komórki w ilości od 10 do ośmiu komórek na mililitr w uzupełnionym pożywce RPMI 1640.

Oczyść magnetycznie komórki NK śledziony za pomocą mysiego zestawu do izolacji komórek NK i potwierdź czystość komórek NK za pomocą cytometrii przepływowej. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru, następnie odwirować po pięciu minutach w temperaturze 500 G, a następnie usunąć supernatant. W celu stymulacji granulowanych komórek NK należy ponownie zawiesić te komórki w pożywce hodowlanej RPMI 1640 uzupełnionej IL-2 i IL-15.

Hoduj dwa razy od 10 do szóstego komórek NK na mililitr w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U przez 48 godzin. 24 godziny przed stymulacją komórek NK pokryj 96-dołkową płytkę 100 mikrolitrami na studzienkę blaszki i inkubuj ją przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji usunąć roztwór i pozostawić studzienki do wyschnięcia na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Następnie zabezpiecz uśpioną mysz na planszy w pozycji leżącej. Podnieś skórę i nacinij skórę wzdłuż kolumny grzbietowej. Odetnij staw lędźwiowo-krzyżowy i oddziel kość krzyżową od odcinka lędźwiowego kręgosłupa nożyczkami.

Następnie oddziel kręgosłup, przecinając mięśnie i żebra po obu stronach w kierunku czaszki, aż do osiągnięcia podstawy czaszki. Użyj nożyczek, aby odciąć kręgosłup w stawie szczytowo-potylicznym. Następnie należy usunąć tkankę mięśniową i tłuszczową z kręgosłupa.

Przypnij i otwórz kręgosłup, aby usunąć rdzeń kręgowy przed uzyskaniem dostępu do zwoju korzenia grzbietowego lub DRG w otworze międzykręgowym połączonym z rdzeniem kręgowym przez korzeń grzbietowy. Następnie zbierz DRG do 15-mililitrowej stożkowej rurki wypełnionej 10 mililitrami lodowatego DMEM. Następnie odwirować preparat przez pięć minut w temperaturze 200 G w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.

Dodać 250 mikrolitrów PBS zawierających jeden miligram na mililitr kolagenazy IV i 2,4 jednostki na mililitr dypazy II. Inkubować ten DRG z roztworem kolagenazy i dypazy przez 80 minut z łagodnym mieszaniem. Aby dezaktywować enzymy, dodaj pięć mililitrów uzupełnionej pożywki DMEM i odwiruj roztwór o stężeniu 200 G. Po pięciu minutach delikatnie usuń supernatant za pomocą pipety i pozostaw około 100 mikrolitrów supernatantu, aby uniknąć niepożądanej utraty komórek. Następnie dodaj jeden mililitr uzupełnionej pożywki DMEM do komórek i użyj pistoletu do pipet i trzech szklanych pipet Pasteura o malejących rozmiarach, aby delikatnie rozprowadzić DRG na preparat z pojedynczą komórką.

Podczas pracy w komorze bezpieczeństwa biologicznego rozcieńczyć albuminę surowicy bydlęcej lub BSA w sterylnym PBS do końcowego stężenia 15% i przechowywać jedną mililitrową porcję w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby utworzyć gradient BSA w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów, dodaj dwa mililitry sterylnego PBS, a następnie powoli dozuj jeden mililitr 15% roztworu BSA na dno probówki. Unikaj zakłócania gradientu, delikatnie wyjmując pipetę.

Za pomocą pipety P200 dodaj zawiesinę zwojów nerwowych zawierających neurony z boku rurki do gradientu. Następnie ustaw przyspieszenie i opóźnienie na minimum, aby odwirować neuron zawierający gradient BSA przez 12 minut w temperaturze 200 G. Po odwirowaniu usuń cały supernatant za pomocą pipety i ponownie zawieś komórki w 500 mikrolitrach Neurobasal. Płytka 10 000 neuronów na studzienkę w 96-dołkowej płytce pokrytej blamininą z płaskim dnem.

Aby umożliwić przyczepienie się neuronów, inkubuj 96-dołkową płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć kokulturację, powoli usuń Neurobasetal z hodowli neuronów. Po 48 godzinach stymulacji IL-2 i IL-15 ponownie zawiesić komórki NK i dodać 10 do piątej komórki NK na studzienkę do hodowli neuronów.

Wspólna hodowla komórek w uzupełnionym Neurobasal MX w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 48 godzinach zebrać i przemyć komórki trzykrotnie PBS i odwirować je przez pięć minut w temperaturze 500 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant przed zabarwieniem komórek jednym do 1 000 rozcieńczonych barwników żywotności eFluor 780 przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Umyć i odwirować komórki, jak pokazano, a następnie poddać działaniu CD 1632 przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu zablokowania niespecyficznych miejsc na komórkach, a następnie trzykrotnie zebrać i przemyć komórki PBS. Po następnym cyklu mycia i wirowania wybarwić komórki BV421, anty-NK-1.1, izotiocyjanianem fluoresceiny anty-NKp46 i fikoerytryną anty-GM-CSF przez 15 minut. Ponownie zebrać i przemyć komórki trzykrotnie PBS, odwirować je i wyrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach buforu FACS i immunofenotypować komórki NK za pomocą cytometrii przepływowej.

Podczas hodowli w monoterapii komórki NK wykazywały ekspresję podstawowych poziomów czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów lub GM-CSF i NKp46. Podczas wspólnej hodowli z neuronami DRG pobranymi od myszy z nienaruszonymi nocyceptorami, stymulacja kapsaicyny zmniejszyła ekspresję GM-CSF w komórkach NK. Kapsaicyna nie miała wpływu na aktywację komórek NK, gdy była hodowana wspólnie z neuronami DRG pobranymi od myszy z ablacją nocyceptorów.

Poziom NKp46 pozostał niezmieniony. Kluczowymi krokami w tym protokole jest dysocjacja i izolacja DRG. Chodzi o to, aby utrzymać maksymalną żywotność neuronów poprzez unikanie tworzenia pęcherzyków i używanie pipety o odpowiednim rozmiarze.

Po protokole badacz może użyć sekwencjonowania RNA lub qPCR do pomiaru zmiany transkryptu w oczyszczonych komórkach FACS lub może użyć ELISA do pomiaru wydzielania cytokin lub neuropeptydów. Takie wzajemne oddziaływanie ujawnia, że funkcja komórek NK jest prawdopodobnie dostrojona przez neuron nocyceptorowy. A ten przesłuch może być ważny w procesach biologicznych, począwszy od uszkodzenia nerwów, infekcji bakteryjnych i wirusowych, aż po nowotwory złośliwe.