Name: Odkrywanie wzajemnych oddziaływań między komórkami NK a neuronami nocyceptorowymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Odkryj metodę współkultury komórek NK i neuronów nocyceptorowych w badaniu interakcji neuroimmunologicznych. Technika ta pozwala analizować wpływ neuronów na funkcje przeciwnowotworowe komórek NK oraz ich rolę w eliminacji uszkodzonych neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez The New Frontiers in Research Fund (NFRFE201901326), Canadian Institutes of Health Research (162211, 461274, 461275), Canadian Foundation for Innovation (37439), Canada Research Chair program (950-231859), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (RGPIN-2019-06824), oraz Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380).

Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Montrealu (#22053, #22054) zatwierdziły wszystkie procedury dla zwierząt. Tabela 1 zawiera wykaz roztworów i ich skład, a Tabela materiałów zawiera wykaz materiałów, sprzętu i odczynników stosowanych w niniejszym protokole.
1. Izolacja, hodowla i stymulacja komórek NK
<ol>
	<li>Wygeneruj nienaruszony neuron nocyceptora (kontrola rodzeństwa z miotu; TRPV1wt::D TAfl/wt) i myszy poddane ablacji (TRPV1cre::D TAfl/wt) przez skrzyżowanie myszy z toksyną lox-stop-lox-błoniczą (DTAfl/fl) z myszamiTRPV1 cre/wt.</li>
	<li>Stosując inhalację CO2 należy poddać eutanazji naiwną mysz kontrolną z miotu (TRPV1wt::D TAfl/wt).</li>
	<li>Zebrać śledzionę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Homogenizuj śledzionę za pomocą tłuczka.</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki 1 ml sterylnego PBS.</li>
	<li>Przefiltrować mieszaninę przez sitko o pojemności 50 μm do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Uzupełnić objętość (10 ml) sterylnym PBS.</li>
	<li>Zbierz 10 μl i policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Odwirować komórki (500 × g, 5 min) i usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić komórki w stężeniu 108 komórek/ml w uzupełnionej pożywce RPMI 1640.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby magnetycznie oczyścić komórki NK śledziony za pomocą zestawu do izolacji mysich komórek NK. Potwierdź czystość komórek NK za pomocą cytometrii przepływowej11.</li>
	<li>Zbierz 10 μl i policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Odwirować komórki (500 × g, 5 min) i usunąć supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki NK w uzupełnionej pożywce hodowlanej RPMI 1640 (zawierającej IL-2 i IL-15).</li>
	<li>Hodowla 2 × 106 komórek NK/ml w 96-dołkowej płytce dolnej U przez 48 godzin.</li>
</ol>
2. Izolacja i hodowla neuronów DRG
<ol>
	<li>Na 24 godziny przed zakończeniem stymulacji komórek NK (krok 1.15) pokryć 96-dołkową płytkę 100 μl/basenik lamininy (1 ng/ml) i inkubować przez 45 minut (37 °C).</li>
	<li>Po inkubacji usunąć roztwór i pozostawić studzienki do wyschnięcia na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Stosując wdychanie CO2 należy poddać eutanazji neuron nocyceptora w stanie nienaruszonym (kontrola rodzeństwa; TRPV1wt::D TAfl/wt) lub myszy z ablacją (TRPV1cre::D TAfl/wt). 
	UWAGA: Wdychanie CO2 jest preferowane w przypadku zwichnięcia szyjki macicy, ponieważ pozwala uniknąć zakłócenia nerwów rdzeniowych połączonych z DRG.</li>
	<li>Przymocuj mysz do tablicy w pozycji leżącej, unieś skórę i nacinaj skórę wzdłuż kolumny grzbietowej. Zapoznaj się z Perner et al., aby uzyskać szczegółowe video12.</li>
	<li>Odetnij staw lędźwiowo-krzyżowy i oddziel kość krzyżową od odcinka lędźwiowego kręgosłupa nożyczkami.</li>
	<li>Oddziel kręgosłup, przecinając mięśnie i żebra po obu stronach kręgosłupa w kierunku czaszki, aż do osiągnięcia podstawy czaszki.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek odetnij kręgosłup w stawie szczytowo-potylicznym.</li>
	<li>Usuń tkankę mięśniową i tłuszczową z kręgosłupa.</li>
	<li>Przypnij i otwórz kręgosłup, aby usunąć rdzeń kręgowy i uzyskać dostęp do DRG. Poszukaj DRG w otworze międzykręgowym połączonym z rdzeniem kręgowym przez korzeń grzbietowy, ale oddzielonym od opon mózgowych.</li>
	<li>Zbierz DRG do stożkowej probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 10 ml lodowato uzupełnionego DMEM.</li>
	<li>Odwirować preparat (200 × g, 5 min, temperatura pokojowa) i usunąć sklarowany nad osadem.</li>
	<li>Dodać 250 μl PBS zawierającego kolagenazę IV (1 mg/ml) i dypazę II (2,4 j./ml).</li>
	<li>Inkubować DRG z roztworem kolagenazy IV/Dispazy II (C/D) (80 min, 37 °C, łagodne mieszanie). Podczas łączenia zwojów od kilku myszy utrzymuj stosunek 125 μl roztworu C/D na ganglion</li>.
	<li>Aby dezaktywować enzymy, dodaj 5 ml uzupełnionej pożywki DMEM.</li>
	<li>Odwirować roztwór (200 × g, 5 min) i delikatnie usunąć supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Aby uniknąć niepożądanej utraty komórek, pozostaw ~100 μl supernatantu.</li>
	<li>Dodać 1 ml uzupełnionej pożywki DMEM.</li>
	<li>Za pomocą pistoletu do pipet i trzech szklanych pipet Pasteura o zmniejszających się rozmiarach, delikatnie rozetrzyj DRG (~10 góra/dół na rozmiar pipety Pasteura) na preparat jednokomórkowy.</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego rozcieńczyć albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w sterylnym PBS do końcowego stężenia 15%. Przechowywać 1 ml porcji w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Stwórz gradient BSA w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, dodając 2 ml sterylnego PBS i powoli dozując 1 ml 15% roztworu BSA na dno probówki. Unikaj zakłócania gradientu, delikatnie wyjmując pipetę.</li>
	<li>Za pomocą pipety P200 powoli pipetować zawiesinę zwojów nerwowych (która zawiera neurony) na bok rurki do gradientu.</li>
	<li>Odwirować gradient BSA zawierający neurony (200 × g, 12 min, temperatura pokojowa). Ustaw przyspieszenie i opóźnienie wirówki na prędkość minimalną. 
	UWAGA: Po odwirowaniu neurony znajdą się na dnie probówki, podczas gdy szczątki komórek zostaną uwięzione w gradiencie BSA.</li>
	<li>Delikatnie usunąć cały supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 500 μl Neurobasal.</li>
	<li>Płytka 104 neurony na dołek (200 μl neurobazal/studzienka) na pokrytej lamininą, płaskiej 96-dołkowej płytce. 
	UWAGA: Średnio badacz będzie w stanie napełnić ~8 studni na mysz.</li>
	<li>Hodowla neuronów (37 °C, przez noc), aby umożliwić przyczepienie się.</li>
</ol>
3. Kokultura i cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Powoli usuń neuronalę z hodowli neuronów.</li>
	<li>Po 48 godzinnej stymulacji IL-2 i IL-15 (patrz kroki 1.14-1.15), ponownie zawieś komórki NK i dodaj 105 komórek NK / studzienkę do hodowli neuronów (96-dołkowa płaska płytka denna). 
	UWAGA: Średnio badacz będzie w stanie napełnić ~6 studzienek na mysz.</li>
	<li>Współhodowla komórek w uzupełnionym neurobazalnym MX (37 °C, 48 h).</li>
	<li>Zebrać komórki, przemyć PBS (3x) i odwirować (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Wyrzucić sklarkatus i zabarwić komórki barwnikiem żywotności eFlour-780 (1:1 000, 15 min, 4 °C).</li>
	<li>Zebrać komórki, przemyć PBS (3x) i odwirować (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Zablokować niespecyficzne miejsca na komórkach za pomocą CD16/32 (1:100, 15 min, 4 °C).</li>
	<li>Zebrać komórki, przemyć PBS (3x) i odwirować (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Wybarwić (15 min, 4 °C) komórki anty-NK-1.1 BV421 (1:100), izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) anty-NKp46 (1:100) i fikoerytryną (PE) anty-GM-CSF (1:100).</li>
	<li>Zebrać komórki, przemyć PBS (3x) i odwirować (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w buforze FACS (500 μL) i immunofenotypować komórki NK za pomocą cytometrii przepływowej11. Zobacz Rysunek 1A dla strategii bramkowania.</li>
</ol>

<ol><li>Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+dorsal+root+ganglia+and+primary+sensory+neurons+for+the+treatment+of+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).</li>
<li>Baral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptor+sensory+neurons+suppress+neutrophil+and+gammadelta+T+cell+responses+in+bacterial+lung+infections+and+lethal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia.</a> Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).</li>
<li>Binshtok, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptors+are+interleukin-1beta+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nociceptors are interleukin-1beta sensors.</a> Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).</li>
<li>Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-immune+regulation+of+mucosal+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuro-immune regulation of mucosal physiology.</a> Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).</li>
<li>Samad, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-mediated+induction+of+Cox-2+in+the+CNS+contributes+to+inflammatory+pain+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity.</a> Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).</li>
<li>Godinho-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-entrained+and+brain-tuned+circadian+circuits+regulate+ILC3s+and+gut+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis.</a> Nature. 574, 254-258 (2019).</li>
<li>Talbot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding-dependent+VIP+neuron-ILC3+circuit+regulates+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier.</a> Nature. 579, 575-580 (2020).</li>
<li>Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ligands+for+the+NKG2D+activating+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor.</a> Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).</li>
<li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+or+adaptive+immunity%3F+The+example+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331, 44-49 (2011).</li>
<li>Davies, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Killer+Cells+Degenerate+Intact+Sensory+Afferents+following+Nerve+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury.</a> Cell. 176, 716-728 (2019).</li>
<li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2, 100333(2021).</li>
<li>Goswami, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+mouse+TRPV1-lineage+neurons+revealed+by+RNA-Seq+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis.</a> Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).</li>
<li>Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1-lineage+neurons+are+required+for+thermal+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation.</a> EMBO J. 30, 582-593 (2011).</li>
<li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+natural+killer+cell+functions+by+capsaicin+through+a+direct+and+TRPV1-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism.</a> Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Davies i wsp.11 odkryli, że uszkodzone neurony regulują w górę RAE1. Poprzez kontakt komórka-komórka, komórki NK wykazujące ekspresję NKG2D były następnie w stanie zidentyfikować i wyeliminować neurony RAE1 + , co z kolei ogranicza przewlekły ból11. Biorąc pod uwagę, że komórki NK również wyrażają różne receptory neuropeptydowe i że te neuropeptydy są znane ze swoich zdolności immunomodulacyjnych, coraz ważniejsze wydaje się badanie interakcji między kom...

Ciała komórkowe neuronów czuciowych pochodzą ze zwojów korzenia grzbietowego (DRG). DRG znajdują się w obwodowym układzie nerwowym (PNS), między rogiem grzbietowym rdzenia kręgowego a zakończeniami nerwów obwodowych. Pseudo-unipolarna natura neuronów DRG pozwala na przekazywanie informacji z gałęzi obwodowej, która unerwia tkankę docelową, do gałęzi centralnej, która przenosi informacje somatosensoryczne do rdzenia kręgowego1. Korzystając z wyspecjalizowanych receptorów kanałów jonowych, neurony pierwszego rzędu wykrywają zagrożenia stwarzane przez patogeny, alergeny i zanieczyszczenia2, co prowadzi do napływu kationów (Na+, Ca2+) i generowania potencjału czynnościowego3,4,5.
Te neurony również wysyłają potencjał działania antydromicznego w kierunku peryferii, gdzie nastąpiło początkowe wyczucie niebezpieczeństwa, co prowadzi do lokalnego uwolnienia neuropeptydów1,4. Dlatego neurony nocyceptorowe służą jako mechanizm ochronny, ostrzegając gospodarza o zagrożeniu środowiskowym4,5,6,7. 
Aby komunikować się z neuronami drugiego rzędu, nocyceptory uwalniają różne neuroprzekaźniki (np. glutaminian) i neuropeptydy (np. peptyd związany z genem kalcytoniny (CGRP), substancja P (SP) i wazoaktywny peptyd jelitowy (VIP))6,7. Peptydy te działają na naczynia włosowate i sprzyjają wynaczynieniu osocza, obrzękowi oraz miejscowemu napływowi i modulacji komórek odpornościowych2,4,7.
Systemy somatosensoryczne i immunologiczne wykorzystują wspólny system komunikacji złożony z cytokin i neuropeptydów oraz ich pokrewnych receptorów4. Chociaż ta dwukierunkowa komunikacja pomaga chronić przed niebezpieczeństwem i zachować homeostazę, może również przyczyniać się do patofizjologii choroby4. 
Komórki NK są klasyfikowane jako wrodzone komórki limfoidalne i są wyspecjalizowane w eliminowaniu komórek zakażonych wirusem. Funkcja komórek NK jest regulowana przez równowagę receptorów stymulujących i hamujących, w tym receptora aktywującego NKG2D8. Endogenny ligand NKG2D, kwas retinowy wcześnie indukowalny1 (RAE1), ulega ekspresji przez komórki poddawane stresowi, takiemu jak nowotworzenie i infekcja8,9.
Ostatnie badania wykazały, że uszkodzenie nerwów obwodowych pobudza neurony czuciowe do ekspresji nieprzystosowawczych cząsteczek, takich jak stathmin 2 (STMN2) i RAE1. W ten sposób, poprzez kontakt komórka-komórka, komórki NK wykazujące ekspresję NKG2D były aktywowane przez interakcję z neuronami wykazującymi ekspresję RAE1. Z kolei komórki NK były w stanie wyeliminować uszkodzone neurony nocyceptorowe i nadwrażliwość na ból, zwykle związaną z uszkodzeniem nerwów10. Oprócz osi NKG2D-RAE1, komórki NK wyrażają pokrewne receptory dla różnych mediatorów wytwarzanych przez nocyceptory. Możliwe jest zatem, że mediatory te modulują aktywność komórek NK. W pracy przedstawiono metodę kohodowli w celu zbadania biologii interakcji neuron nocyceptorowy z komórką NK. Podejście to pomoże lepiej zrozumieć, w jaki sposób neurony nocyceptorowe modulują wrodzoną odpowiedź komórek odpornościowych na uraz, infekcję lub nowotwór złośliwy.

<table><tbody><tr><td>Anty-mysie CD16/32</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Nr kat.:017769</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Nr kat.:009669</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA) klasa hodowli</td> World <td>Precision Instruments</td><td>Nr kat.:504167</td><td></td></tr><tr><td>BV421 anty-mysi NK-1.1</td><td>Fisher Scientific</td><td>Nr kat.:12430112</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek (50 &mu; m)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Nr kat.:A3160702</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Fisher Scientific</td><td>Nr kat.:15140148</td><td></td></tr><tr><td>Toksyna dyfteryjnafl/fl</td><td>Fisher Scientific</td><td>Nr kat.:SH3057402</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Fisher Scientific</td><td>Nr kat.:13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Nr kat.:: 07-200-95</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji komórek NK myszy EasySep</td><td>Nr</td><td>kat.:CLS2595</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>Nr kat.:C0130</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>Sigma</td><td>Nr kat.:04942078001</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Sigma</td><td>Nr kat.:806552</td><td></td></tr><tr><td>FITC anty-mysz NKp46</td><td>Sigma</td><td>Nr kat.:L2020</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa z płaskim dnem</td><td>Sigma</td><td>Nr kat.:03690</td><td></td></tr><tr><td>Szklana pipeta Pasteura</td><td>Sigma</td><td>Nr kat.:470236-274</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik neurotroficzny pochodzenia komórek glejowych (GDNF)</td><td>VWR</td><td>Nr kat.:02-0131</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Cedarlane</td><td>Nr kat.:03-50/31</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>Nr kat.:A14867-01</td><td></td></tr><tr><td>Mysz rekombinowany IL-15</td><td>Gibco</td><td>Nr kat.:22400-089</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany IL-2</td><td>dla myszy Gibco</td><td>Nr kat.:21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu nerwów (NGF)</td><td>Life Technologies</td><td>Nr kat.:13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka nerwowa</td><td>PeproTech</td><td>Nr kat.:450-51-10</td><td></td></tr><tr><td>PE anty-mysie GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>Nr kat.:212-12</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina i Streptomycyna</td><td>PeproTech</td><td>Nr kat.:210-15</td><td></td></tr><tr><td>Technologia komórek</td><td>macierzystych Tłem</td><td>nr: 19855</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Biolegend</td><td>Nr kat.:108732</td><td>Klon PK136</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Biolegend</td><td>Nr kat.:137606</td><td>Klon 29A1.4</td></tr><tr><td>TRPV1Cre</td><td>Biolegend</td><td>Nr kat.:505406</td><td>Klon MP1-22E9</td></tr><tr><td>Pęsety i narzędzia do preparowania.</td><td>Biolegend</td><td>Nr kat.:65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka w kształcie litery U</td><td>Biolegend</td><td>Nr kat.:101319</td><td></td></tr><tr><td>Viability Dye eFlour-780</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

odkrywanie wzajemnych oddziaływań między komórkami nk a neuronami nocyceptorowymi

Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons

Neurony somatosensoryczne ewoluowały, aby wykrywać szkodliwe bodźce i aktywować odruchy obronne. Dzieląc się środkami komunikacji, neurony nocyceptorowe dostrajają również mechanizmy obronne gospodarza, kontrolując aktywność układu odpornościowego. Komunikacja między tymi systemami jest w większości adaptacyjna, pomagając chronić homeostazę, może również prowadzić do wystąpienia chorób przewlekłych lub je promować. Oba systemy ewoluowały równocześnie, aby umożliwić taką miejscową interakcję, jaką można znaleźć w pierwotnych i wtórnych tkankach limfatycznych i błonie śluzowej. Ostatnie badania wykazały, że nocyceptory bezpośrednio wykrywają i reagują na obce antygeny, cytokiny pochodzące z komórek odpornościowych i drobnoustroje.
Aktywacja nocyceptora nie tylko powoduje nadwrażliwość na ból i swędzenie, ale także obniża próg zapłonu nocyceptora, prowadząc do miejscowego uwalniania neuropeptydów. Peptydy, które są wytwarzane i uwalniane z obwodowych zakończeń nocyceptorów, mogą blokować chemotaksję i polaryzację limfocytów, kontrolując lokalizację, czas trwania i rodzaj zapalenia. Najnowsze dowody wskazują, że neurony czuciowe oddziałują z wrodzonymi komórkami odpornościowymi poprzez kontakt komórka-komórka, na przykład angażując receptory grupy 2D (NKG2D) na komórkach NK (natural killer).
Biorąc pod uwagę, że komórki NK wyrażają pokrewne receptory dla różnych mediatorów wytwarzanych przez nocyceptory, można sobie wyobrazić, że nocyceptory używają neuropeptydów do kontrolowania aktywności komórek NK. Tutaj opracowujemy metodę wspólnej hodowli do badania interakcji neuronów nocyceptorowych z komórkami NK w naczyniu. Stosując to podejście, odkryliśmy, że neurony nocyceptorowe lędźwiowe zmniejszają ekspresję cytokin w komórkach NK. Ogólnie rzecz biorąc, taka redukcjonistyczna metoda może być przydatna do zbadania, w jaki sposób neurony unerwiające nowotwór kontrolują funkcję przeciwnowotworową komórek NK i jak komórki NK kontrolują eliminację uszkodzonych neuronów.

Komórki NK zostały oczyszczone magnetycznie ze splenocytów myszy kontrolnych z tego samego miotu (TRPV1wt::DTAfl/wt) i stymulowane (przez 48 h) za pomocą IL-2 oraz IL-15. Następnie komórki NK hodowano osobno lub w ko-kulturze z neuronami z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) pobranymi od myszy z nienaruszonymi neuronami nocyceptywnymi (kontrola z tego samego miotu; TRPV1wt::DTAfl/wt) lub z nimi abladowanymi (TRPV1cre::DTAfl/wt). Następnie komórki poddano dzi...

Neurony nocyceptorowe i komórki NK aktywnie oddziałują na siebie w kontekście zapalnym. Podejście oparte na współkulturze umożliwia badanie tej wzajemnej zależności.

Odkrywanie wzajemnych oddziaływań między komórkami NK a neuronami nocyceptorowymi

Somatosensory neurons have evolved to detect noxious stimuli and activate defensive reflexes. By sharing means of communication, nociceptor neurons also ...

Biorąc pod uwagę, że neuron nocyceptorowy wydziela różne neuropeptydy i że komórka NK wyraża receptor dla tych neuropeptydów, zdecydowaliśmy się opracować metodę wspólnej hodowli w celu zbadania wzajemnych oddziaływań między komórką NK a neuronami nocyceptorowymi. Taka redukcjonistyczna metoda może być przydatna do zbadania, w jaki sposób neurony nocyceptorowe kontrolują funkcję przeciwnowotworową komórki NK, a także może być interesująca do zbadania, w jaki sposób komórka NK kontroluje eliminację uszkodzonych neuronów. Procedurę zademonstruje Ali Ahmadi, były student studiów magisterskich z mojego laboratorium.Aby rozpocząć izolację i hodowlę komórek NK metodą NK lub NK należy zebrać śledzionę myszy w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej zawierającej 500 mikrolitrów sterylnego PBS, a następnie homogenizować śledzionę za pomocą tłuczka. Następnie rozcieńczyć komórki jednym mililitrem sterylnego PBS i przefiltrować mieszaninę przez sitko do komórek o średnicy 50 mikronów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Uzupełnij objętość przefiltrowanego homogenatu do 10 mililitrów za pomocą sterylnego PBS.Policz komórki w 10 mikrolitrach rozcieńczonego homogenatu za pomocą hemocytometru. Odwirować pozostałe komórki przez pięć minut w temperaturze 500 G i usunąć supernatant. Następnie ponownie zawieś komórki w ilości od 10 do ośmiu komórek na mililitr w uzupełnionym pożywce RPMI 1640.Oczyść magnetycznie komórki NK śledziony za pomocą mysiego zestawu do izolacji komórek NK i potwierdź czystość komórek NK za pomocą cytometrii przepływowej. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru, następnie odwirować po pięciu minutach w temperaturze 500 G, a następnie usunąć supernatant. W celu stymulacji granulowanych komórek NK należy ponownie zawiesić te komórki w pożywce hodowlanej RPMI 1640 uzupełnionej IL-2 i IL-15.Hoduj dwa razy od 10 do szóstego komórek NK na mililitr w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U przez 48 godzin. 24 godziny przed stymulacją komórek NK pokryj 96-dołkową płytkę 100 mikrolitrami na studzienkę blaszki i inkubuj ją przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji usunąć roztwór i pozostawić studzienki do wyschnięcia na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego.Następnie zabezpiecz uśpioną mysz na planszy w pozycji leżącej. Podnieś skórę i nacinij skórę wzdłuż kolumny grzbietowej. Odetnij staw lędźwiowo-krzyżowy i oddziel kość krzyżową od odcinka lędźwiowego kręgosłupa nożyczkami.Następnie oddziel kręgosłup, przecinając mięśnie i żebra po obu stronach w kierunku czaszki, aż do osiągnięcia podstawy czaszki. Użyj nożyczek, aby odciąć kręgosłup w stawie szczytowo-potylicznym. Następnie należy usunąć tkankę mięśniową i tłuszczową z kręgosłupa.Przypnij i otwórz kręgosłup, aby usunąć rdzeń kręgowy przed uzyskaniem dostępu do zwoju korzenia grzbietowego lub DRG w otworze międzykręgowym połączonym z rdzeniem kręgowym przez korzeń grzbietowy. Następnie zbierz DRG do 15-mililitrowej stożkowej rurki wypełnionej 10 mililitrami lodowatego DMEM. Następnie odwirować preparat przez pięć minut w temperaturze 200 G w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.Dodać 250 mikrolitrów PBS zawierających jeden miligram na mililitr kolagenazy IV i 2,4 jednostki na mililitr dypazy II. Inkubować ten DRG z roztworem kolagenazy i dypazy przez 80 minut z łagodnym mieszaniem. Aby dezaktywować enzymy, dodaj pięć mililitrów uzupełnionej pożywki DMEM i odwiruj roztwór o stężeniu 200 G. Po pięciu minutach delikatnie usuń supernatant za pomocą pipety i pozostaw około 100 mikrolitrów supernatantu, aby uniknąć niepożądanej utraty komórek. Następnie dodaj jeden mililitr uzupełnionej pożywki DMEM do komórek i użyj pistoletu do pipet i trzech szklanych pipet Pasteura o malejących rozmiarach, aby delikatnie rozprowadzić DRG na preparat z pojedynczą komórką.Podczas pracy w komorze bezpieczeństwa biologicznego rozcieńczyć albuminę surowicy bydlęcej lub BSA w sterylnym PBS do końcowego stężenia 15% i przechowywać jedną mililitrową porcję w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby utworzyć gradient BSA w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów, dodaj dwa mililitry sterylnego PBS, a następnie powoli dozuj jeden mililitr 15% roztworu BSA na dno probówki. Unikaj zakłócania gradientu, delikatnie wyjmując pipetę.Za pomocą pipety P200 dodaj zawiesinę zwojów nerwowych zawierających neurony z boku rurki do gradientu. Następnie ustaw przyspieszenie i opóźnienie na minimum, aby odwirować neuron zawierający gradient BSA przez 12 minut w temperaturze 200 G. Po odwirowaniu usuń cały supernatant za pomocą pipety i ponownie zawieś komórki w 500 mikrolitrach Neurobasal. Płytka 10 000 neuronów na studzienkę w 96-dołkowej płytce pokrytej blamininą z płaskim dnem.Aby umożliwić przyczepienie się neuronów, inkubuj 96-dołkową płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć kokulturację, powoli usuń Neurobasetal z hodowli neuronów. Po 48 godzinach stymulacji IL-2 i IL-15 ponownie zawiesić komórki NK i dodać 10 do piątej komórki NK na studzienkę do hodowli neuronów.Wspólna hodowla komórek w uzupełnionym Neurobasal MX w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 48 godzinach zebrać i przemyć komórki trzykrotnie PBS i odwirować je przez pięć minut w temperaturze 500 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant przed zabarwieniem komórek jednym do 1 000 rozcieńczonych barwników żywotności eFluor 780 przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Umyć i odwirować komórki, jak pokazano, a następnie poddać działaniu CD 1632 przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu zablokowania niespecyficznych miejsc na komórkach, a następnie trzykrotnie zebrać i przemyć komórki PBS. Po następnym cyklu mycia i wirowania wybarwić komórki BV421, anty-NK-1.1, izotiocyjanianem fluoresceiny anty-NKp46 i fikoerytryną anty-GM-CSF przez 15 minut. Ponownie zebrać i przemyć komórki trzykrotnie PBS, odwirować je i wyrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach buforu FACS i immunofenotypować komórki NK za pomocą cytometrii przepływowej.Podczas hodowli w monoterapii komórki NK wykazywały ekspresję podstawowych poziomów czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów lub GM-CSF i NKp46. Podczas wspólnej hodowli z neuronami DRG pobranymi od myszy z nienaruszonymi nocyceptorami, stymulacja kapsaicyny zmniejszyła ekspresję GM-CSF w komórkach NK. Kapsaicyna nie miała wpływu na aktywację komórek NK, gdy była hodowana wspólnie z neuronami DRG pobranymi od myszy z ablacją nocyceptorów.Poziom NKp46 pozostał niezmieniony. Kluczowymi krokami w tym protokole jest dysocjacja i izolacja DRG. Chodzi o to, aby utrzymać maksymalną żywotność neuronów poprzez unikanie tworzenia pęcherzyków i używanie pipety o odpowiednim rozmiarze.Po protokole badacz może użyć sekwencjonowania RNA lub qPCR do pomiaru zmiany transkryptu w oczyszczonych komórkach FACS lub może użyć ELISA do pomiaru wydzielania cytokin lub neuropeptydów. Takie wzajemne oddziaływanie ujawnia, że funkcja komórek NK jest prawdopodobnie dostrojona przez neuron nocyceptorowy. A ten przesłuch może być ważny w procesach biologicznych, począwszy od uszkodzenia nerwów, infekcji bakteryjnych i wirusowych, aż po nowotwory złośliwe.

teasing-out-interplay-between-natural-killer-cells-nociceptor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Komórki Natural Killer T (NKT) są kluczowymi czynnikami determinującymi odpowiedź immunologiczną na nowotwory, regulację autoimmunizacji, eliminację infekcji oraz rozwój blaszek miażdżycowych. W tym wywiadzie Mitch Kronenberg omawia wysiłki swojego laboratorium mające na celu zrozumienie mechanizmu, poprzez który komórki NKT są aktywowane przez antygeny glikolipidowe.

Wywiad: Prezentacja antygenów glikolipidowych przez CD1d oraz potencjał terapeutyczny aktywacji komórek NKT

Immunocytochemiczna identyfikacja podtypów włókien obwodowych nerwów czuciowych (oraz wykrywanie ekspresji białek w ich obrębie) jest kluczowa dla zrozumienia molekularnych mechanizmów leżących u podstaw czucia obwodowego. W niniejszej pracy opisujemy metody przygotowania próbek tkanek obwodowych i trzewnych, takich jak skóra i kości kończyn, do specyficznego barwienia immunologicznego obwodowych włókien nerwów czuciowych.

Przygotowanie tkanek i immunobarwienie włókien nerwów czuciowych myszy unerwiających skórę i kości kończyn

Ten film opisuje izolację neuronów DRG poprzez trawienie enzymatyczne, dysocjację mechaniczną i wirowanie gradientowe. Komórki DRG są hodowane wspólnie z komórkami NK na macierzy zewnątrzkomórkowej w celu zbadania interakcji między komórkami odpornościowymi a neuronami czuciowymi.

Izolowanie neuronów czuciowych i współhodowla z komórkami NK

W celu zbadania zmian nocyceptywnych wewnątrznaskórkowych włókien nerwowych (IENF) w bolesnych neuropatiach (PN), opracowaliśmy protokoły, które mogłyby bezpośrednio badać trójwymiarowe zmiany morfologiczne obserwowane w nocyceptywnych IENFach.  Trójwymiarowa analiza IENF ma potencjał do oceny zmian morfologicznych IENF w PN.

Trójwymiarowe obrazowanie nocyceptywnych śródnaskórkowych włókien nerwowych w biopsjach ludzkiej skóry

Test Cold Plantar (CPA) mierzy reakcję na zimno w zakresie od 30 °C do 5 °C, a także może mierzyć adaptację do zimna. Protokół ten opisuje, jak używać CPA do pomiaru nadwrażliwości na zimno, analgezji i adaptacji u myszy.

Prosta i niedroga metoda określania wrażliwości na zimno i adaptacji u myszy

Unikanie eliminacji za pośrednictwem komórek NK przez komórki rakowe jest ważne dla inicjacji i progresji raka. Tutaj przedstawiamy dwa protokoły nieoparte na radioaktywności do oceny cytotoksyczności komórek NK w stosunku do komórek nowotworowych wątroby. Dodatkowo przedstawiono trzeci protokół do analizy migracji komórek NK.

Pomiar cytotoksyczności i migracji komórek NK w kontekście komórek nowotworowych wątroby

APTrack to wtyczka oprogramowania opracowana dla platformy Open Ephys, która umożliwia wizualizację danych w czasie rzeczywistym i śledzenie potencjałów czynnościowych neuronów w pętli elektrycznej. Z powodzeniem zastosowaliśmy to w mikroneurografii dla ludzkich nocyceptorów z włókna C oraz mysich nocyceptorów z włókna C i Aδ.

Śledzenie progów elektrycznych w czasie rzeczywistym do translacyjnych badań nad bólem

Proteasom błony neuronalnej (NMP) został niedawno zidentyfikowany w podzbiorze neuronów somatosensorycznych jako kluczowy regulator percepcji dotyku, bólu i swędzenia. W tym artykule przedstawiono solidny przepływ pracy do analizy ekspresji i funkcji NMP specyficznej dla typu komórki przy użyciu sortowania komórek, profilowania transkryptomu i analiz immunofluorescencyjnych opartych na hodowlach.

Specyficzna dla podtypu komórki analiza proteasomu błony neuronalnej w neuronach somatosensorycznych

Opisujemy protokół umożliwiający obrazowanie mitochondriów w żywych neuronach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przez dłuższy czas. Obrazowanie w wydłużonych przedziałach czasowych osiągnięto dzięki ekspresji białka fluorescencyjnego skierowanego do mitochondriów za pomocą lentiwirusa oraz zastosowaniu niedrogiego inkubatora nakładanego na stolik mikroskopu, który został zaprojektowany i zbudowany w naszym laboratorium.

Neuromodulacja i transport mitochondriów: obrazowanie żywych neuronów hipokampa w długich odstępach czasu

W tym filmie opisujemy metodę obrazowania żywych komórek w celu obserwacji asymetrycznego podziału komórek progenitorowych organów sensorycznych oraz komórek epidermy w nienaruszonych poczwarkach...

Obrazowanie żywych komórek prekursorowych organów zmysłowych w nienaruszonych poczwarkach Drosophila

Odkryj metodę współkultury komórek NK i neuronów nocyceptorowych w badaniu interakcji neuroimmunologicznych. Technika ta pozwala analizować wpływ neuronów na funkcje przeciwnowotworowe komórek NK oraz ich rolę w eliminacji uszkodzonych neuronów.

Odkrywanie wzajemnych oddziaływań między komórkami NK a neuronami nocyceptorowymi

Przeglądaj więcej filmów