Name: Ocena efektywności fotosyntezy w mutantach fotooddechowych za pomocą analizy fluorescencji chlorofilu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T12:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Poznaj metodę analizy fluorescencji chlorofilu do oceny efektywności fotosyntezy w mutantach fotooddechowych roślin. Technika umożliwia szybki przesiew genetyczny i identyfikację zmian w wydajności fotosyntezy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Radę Regentów Luizjany (AWD-AM210544).

1. Przygotowanie i sterylizacja nasion
UWAGA: Przygotowanie nasion składa się z nasiąknięcia nasionami i ich sterylizacji. Należy pamiętać, że wszystkie te czynności należy wykonać w okapie z przepływem laminarnym, aby utrzymać sterylne warunki. Wszystkie niezbędne materiały, odczynniki i podłoża wzrostowe muszą być sterylizowane w autoklawie (patrz Tabela materiałów).
<ol>
	<li>Wchłanianie i stratyfikacja nasion 
	UWAGA: Używane linie nasion to plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) i typ dziki (WT, Col-0).
	<ol>
		<li>Dozuj nasiona do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Nasiona należy zanurzyć w sterylnej wodzie w okapie z przepływem laminarnym i rozwarstwić w temperaturze 4 °C w ciemności przez 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sterylizacja nasion
	<ol>
		<li>W sterylnych warunkach przygotuj 10 ml 50% (v/v) roztworu wybielacza i dodaj około 20 μl Tween 20. W celu sterylizacji nasion usuń wodę z wchłoniętych nasion, dodaj 1 ml roztworu wybielacza do probówek mikrowirówek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Usuń roztwór wybielacza za pomocą pipety.</li>
		<li>Opłucz nasiona w 1 ml sterylnej wody, aby ponownie zawiesić. Usuń wodę, gdy nasiona osiądą na dnie. Powtórz krok 1.6 i krok 1.7 siedem razy.</li>
		<li>Ponownie zawiesić nasiona w sterylnym 0,1% roztworze agarozy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Posiewanie nasion
	<ol>
		<li>Przygotować 1 l roztworu Murashige & Skoog Basal Medium z witaminami i 1,0 g/l kwasu 2-(N-morfonio)etanosulfonowego (MS), dodając 5,43 g proszku do 500 ml wody destylowanej. Dostosuj pH w zakresie od 5,6 do 5,8 za pomocą wodorotlenku potasu (KOH). Napełnij do 1 litra wodą destylowaną.
		<ol>
			<li>Podzielić płynny roztwór na 500 ml i umieścić każdą połówkę w kolbie o pojemności 1 l zawierającej mieszadło magnetyczne. Dodać 5 g proszku agarowego, aby uzyskać 1% roztwór agaru w/v dla każdej kolby.</li>
			<li>Autoklaw w temperaturze 121 °C i ciśnieniu 15 psi przez 30 minut, a następnie umieścić w temperaturze pokojowej, powoli mieszając. Po schłodzeniu wlej 25 ml agaru MS do kwadratowej szalki Petriego. Pozwól mu zastygnąć. 
			UWAGA: Te płytki Murashige & Skoog Basal Medium zawierają 1% pożywki MS z witaminami i 1% agaru do hodowli mutantów testowych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odetnij końcówkę pipety o pojemności 200 μl żyletką. Umieść jedno ziarno na środku wyznaczonej kwadratowej siatki dla każdego badanego mutanta lub genotypu (1 cm2 kwadrat) kwadratowej płytki MS (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) za pomocą mikropipety o pojemności 200 μl. 
		UWAGA: Kwadratowa siatka o wymiarach 1 cm x 1 cm pomaga zachować jednolitą odległość między siewkami i uniknąć nakładania się, co będzie ważne w późniejszym obrazowaniu i analizie fluorescencji.</li>
		<li>Po platerowaniu nasion owiń pokrywkę taśmą chirurgiczną, aby ją uszczelnić, i umieść ją w komorze wzrostu w warunkach opisanych poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wzrost roślin i niskie stężenie CO2
<ol>
	<li>Uprawiaj rośliny przez 7-9 dni w temperaturze 20 °C w 8-godzinnym cyklu świetlnym 120 μmol·m−2s−1 i 16 godzinach ciemności w temperaturze 18 °C. Sprawdź rośliny 6 dnia, aby określić, czy są wystarczająco duże, aby można je było obrazować. W 8 dniu po posadzeniu należy wystawić rośliny na działanie niskiego poziomu CO2 .</li>
	<li>Oczyszczanie o niskiej zawartości CO2
	<ol>
		<li>Po 7-9 dniach umieść cztery z ośmiu płytek z warunków otoczenia komory wzrostowej w warunkach fotooddechowych 20 °C, ciągłym poziomie światła 200 μmol·m−2s−1 i niskim CO2 przez 12 godzin.</li>
		<li>Skonstruować warunki niskiego poziomu CO2 za pomocą hermetycznego przezroczystego pojemnika ze 100 g wapna sodowego umieszczonego na dnie pojemnika. Umieść pojemnik w tej samej komorze wzrostowej co kontrola. Utrzymywać instalacje kontrolne w temperaturze poniżej 120 μmol·m−2s−1 w otaczającym CO2 przez 12 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Konfiguracja systemu obrazowania fluorescencyjnego
<ol>
	<li>Umieść płytkę testową (przygotowaną zgodnie z sekcją 1 i sekcją 2) wyśrodkowaną pod kamerą w ustalonej odległości w systemie obrazowania fluorescencyjnego.</li>
	<li>W oprogramowaniu przyrządu przejdź do okna na żywo i zaznacz pole Błyski, aby włączyć nieaktyniczne błyski pomiarowe.</li>
	<li>Klikaj narzędzia Powiększanie i Ostrość, aż zobaczysz pełny i ostry obraz. W tym celu użyj stolika lub półki, aby wyregulować odległość między roślinami a kamerą. Utrzymuj stałe przybliżenie, ostrość i odległość od kamery przez cały eksperyment.</li>
	<li>Ustaw wartość El. Shutter na 0 i dostosuj czułość, aby uzyskać sygnał fluorescencyjny w zakresie 200-500 jednostek cyfrowych. 
	UWAGA: Niższa wartość migawki (0-1) zapewni, że pomiarowe błyski nie będą aktyniczne, podczas gdy wyższa wartość (2) poprawi rozdzielczość obrazu.</li>
	<li>Umieść światłomierz w tej samej pozycji, w której użyto go do regulacji ustawień aparatu.</li>
	<li>W oknie na żywo zaznacz pole Super, aby uruchomić impuls nasycający trwający 800 ms. Pamiętaj, aby za każdym razem zaznaczyć pole dla nowego impulsu.</li>
	<li>Użyj suwaka, aby dostosować procent mocy względnej dla Super impulsu, aż światłomierz wskaże 6,000-8,000 μmol·m−2s−1.</li>
</ol>
4. Zaprojektuj program wydajności kwantowej
<ol>
	<li>Importowanie standardowych narzędzi operacyjnych dla systemu obrazowania. 
	Uwzględnij default.inc 
	Dołącz light.inc 
	UWAGA: Składnia programu używana jako odniesienie w tym eksperymencie dotyczy systemu obrazowania FluorCam.</li>
	<li>Zdefiniuj następujące zmienne globalne zgodnie ze skonfigurowanymi ustawieniami światła: 
	Migawka = 0 
	Czułość = 40 
	Super = 65</li>
	<li>Uwzględnij krok czasowy rejestrowania danych: 
	TS = 20ms</li>
	<li>Pobrać pomiar Fo, pobierając próbki fluorescencji w stanie przystosowanym do ciemności. 
	F0czas trwania = 2s; 
	F0period = 200ms; 
	UWAGA: F0duration określa zakres czasu, w którym rejestrowana jest fluorescencja przystosowana do ciemności. Okres F0 określa przedział czasu, w którym powtarzany jest pomiar fluorescencji dostosowany do ciemności.</li>
	<li>Zapisz pomiary Fo w tabelach danych. 
	<0,F0kropka.. F0duration>=>mfmsub 
	<0s>->punkt kontrolny,"startFo" 
	<F0duration - F0period>=>punkt kontrolny,"endFo"; 
	Gdzie < , > oznacza zbiór wartości fluorescencji indeksowanych czasem; => przechowuje pomiary w pliku systemowym; mfmsub reprezentuje cały zestaw danych dla eksperymentu; a checkpoint tworzy podzbiór danych o określonych pomiarach, takich jak startFo.</li>
	<li>Zebrać i zapisać pomiar Fm, pobierając próbki fluorescencji po impulsie nasycenia. 
	Czas trwania impulsu=960ms; ## 
	a1=F0czas trwania + 40ms 
	a2 = a1 + 480ms; 
	<a1>=>SatPulse(Czas trwania impulsu); 
	<a1 + 80ms, a1 + 160ms.a1 + PulseDuration>=>mfmsub 
	<a1 + Czas trwania impulsu + 80ms>=>mfmsub; 
	<a2>=>punkt kontrolny,"startFm" 
	<a1 + Czas trwania impulsu - 80ms>=>checkpoint,"endFm" 
	<a2 + 80ms>=>punkt kontrolny,"timeVisual"; 
	Gdzie a1 i a2 są zmiennymi koordynującymi czas pobierania próbek z impulsem nasycenia; a1 oznacza czas rozpoczęcia pomiaru Fm; a a2 reprezentuje czas środkowy impulsu.</li>
</ol>
5. Pomiar wydajności kwantowej próbek poddanych działaniu
<ol>
	<li>Bezpośrednio po zabiegu przykryj płytki folią aluminiową na 15 minut w celu adaptacji do ciemności. Usuń folię, aby zmierzyć wydajność kwantową fotosystemu II za pomocą fluorometru o zmodyfikowanej amplitudzie impulsów. Następnie umieść płytkę siewną bezpośrednio pod kamerą i uruchom protokół wydajności kwantowej znajdujący się w repozytorium GitHub</li>.
	<li>Pobierz protokół quantum_yield z GitHub (https://github.com/South-lab/fluorescent-screen) lub użyj podobnie zaprojektowanego programu z sekcji 4. Użyj oprogramowania fluorometru, aby otworzyć plik programu, klikając ikonę folderu i przechodząc do lokalizacji pliku.</li>
	<li>Uruchom program quantum yield, klikając ikonę czerwonej błyskawicy.</li>
	<li>Po zakończeniu działania protokołu przejdź do okna analizy wstępnej. Podziel płytkę na pojedyncze sadzonki za pomocą narzędzi do zaznaczania, aby podświetlić wszystkie piksele dla każdej sadzonki na obrazie płytki. Kliknij opcję Wykluczenie tła, aby usunąć wszystkie podświetlone piksele tła, pozostawiając tylko obszar sadzonki.</li>
	<li>Kliknij Analizuj, aby wygenerować dane fluorescencji dla każdej sadzonki na obrazie płytki. Ręcznie dostosuj zakres wartości fluorescencji, aby wyświetlić spójne wartości minimalne i maksymalne dla wszystkich płytek.</li>
	<li>Kliknij na Średnia liczbowa w zakładce Eksperyment | Eksport | Liczbowy. Zaznacz opcję Wszystkie dane i według kolumny, a następnie kliknij przycisk OK, aby wygenerować plik tekstowy zawierający pomiary QY dla każdej sadzonki.</li>
</ol>
6. Otwieranie pliku danych
<ol>
	<li>Otwórz plik tekstowy w arkuszu kalkulacyjnym do analizy. Spośród nagłówków pokazujących numer obszaru, rozmiar pikseli, Fm, Ft, Fq i QY, zidentyfikuj numer obszaru dla głównego genotypu (WT lub mutant testowy) i QYmax. Wykonaj test t parami w odniesieniu do typu dzikiego, aby określić istotność. Dane są interpretowane jako znacząco różne, gdy wartości p są niższe niż 0,05.</li>
</ol>

<ol><li>Peterhansel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorespiration%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Photorespiration.</a> Arabidopsis Book. 8, 0130(2010).</li>
<li>Bordych, C., Eisenhut, M., Pick, T. R., Kuelahoglu, C., Weber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-expression+analysis+as+tool+for+the+discovery+of+transport+proteins+in+photorespiration%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-expression analysis as tool for the discovery of transport proteins in photorespiration.</a> Plant Biology. 15 (4), 686-693 (2013).</li>
<li>Eisenhut, M., Pick, T. R., Bordych, C., Weber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+closing+the+remaining+gaps+in+photorespiration--the+essential+but+unexplored+role+of+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards closing the remaining gaps in photorespiration--the essential but unexplored role of transport proteins.</a> Plant Biology. 15 (4), 676-685 (2013).</li>
<li>Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+costs+of+photorespiration+to+food+production+now+and+in+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The costs of photorespiration to food production now and in the future.</a> Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 107-129 (2016).</li>
<li>South, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acid+sodium+symporter+BASS6+can+transport+glycolate+and+is+involved+in+photorespiratory+metabolism+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Bile acid sodium symporter BASS6 can transport glycolate and is involved in photorespiratory metabolism in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell. 29 (4), 808-823 (2017).</li>
<li>Pick, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGG1%2C+a+plastidic+glycolate+glycerate+transporter%2C+is+required+for+photorespiration+and+defines+a+unique+class+of+metabolite+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PLGG1, a plastidic glycolate glycerate transporter, is required for photorespiration and defines a unique class of metabolite transporters.</a> Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 110 (8), 3185-3190 (2013).</li>
<li>Kuhnert, F., Schlüter, U., Linka, N., Eisenhut, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+proteins+enabling+plant+photorespiratory+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Transport proteins enabling plant photorespiratory metabolism.</a> Plants. 10 (5), 880(2021).</li>
<li>Badger, M. R., Fallahi, H., Kaines, S., Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyll+fluorescence+screening+of+Arabidopsis+thaliana+for+CO2+sensitive+photorespiration+and+photoinhibition+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Chlorophyll fluorescence screening of Arabidopsis thaliana for CO2 sensitive photorespiration and photoinhibition mutants.</a> Funct Plant Biology. 36 (11), 867-873 (2009).</li>
<li>Ogawa, T., Sonoike, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+mutants+using+chlorophyll+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">Screening of mutants using chlorophyll fluorescence.</a> Journal of Plant Research. 134 (4), 653-664 (2021).</li>
<li>Kleffmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+thaliana+chloroplast+proteome+reveals+pathway+abundance+and+novel+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis thaliana chloroplast proteome reveals pathway abundance and novel protein functions.</a> Current Biology. 14 (5), 354-362 (2004).</li>
<li>Hempel, J. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Molecular+characterization+of+the+plastid-localized+ABC+protein+TAP1+in+Arabidopsis+thaliana%22">Molecular characterization of the plastid-localized ABC protein TAP1 in Arabidopsis thaliana</a>. , University of Stavanger. Ph.D. thesis (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani konfliktów interesów.

Metody eksperymentalne przedstawione w tym artykule mają pewne zalety i ograniczenia. Jedną z zalet jest to, że ta metoda może przesiewać wiele sadzonek roślin, chociaż należy podjąć pewne środki ostrożności, aby zapobiec zanieczyszczeniu płytki podłoża roślinnego podczas procesu posiewu i uprawy. Dlatego tak ważne jest, aby uszczelnić płytki Arabidopsis taśmą chirurgiczną. Kolejną zaletą tego eksperymentu jest to, że ma on krótszy 12-godzinny okres stresu fotooddechowego w porównaniu z wcześniej opublikowaną pracą<sup c...

Warunki stresu abiotycznego często spotykane na polach rolników mogą negatywnie wpływać na plony, zmniejszając wydajność fotosyntezy. Niekorzystne warunki środowiskowe, takie jak fale upałów, zmiany klimatyczne, susza i zasolenie gleby, mogą powodować stresy abiotyczne, które zmieniają dostępność CO2 i zmniejszają reakcję rośliny na silny stres świetlny. Dwa największe strumienie węgla na Ziemi to fotosynteza i fotooddychanie, które są niezbędne dla wzrostu roślin i plonów. Wiele ważnych białek i enzymów biorących udział w tych procesach zostało scharakteryzowanych w warunkach laboratoryjnych i zidentyfikowanych na poziomie genetycznym1. Chociaż poczyniono znaczne postępy w zrozumieniu fotosyntezy i fotooddychania, wiele etapów, w tym transport między organellami roślinnymi, pozostaje niescharakteryzowanych2,3.
Fotooddychanie, drugi co do wielkości strumień węgla w roślinach po fotosyntezie, rozpoczyna się, gdy enzym Rubisco wiąże tlen zamiast dwutlenku węgla do rybulozo-1,5 bisfosforanu (RuBP), tworząc związek hamujący 2-fosfoglikolan (2PG)1. Aby zminimalizować hamujące działanie 2PG i poddać recyklingowi wcześniej związany węgiel, rośliny C3 wyewoluowały wieloorganelowy proces fotooddychania. Fotooddychanie przekształca dwie cząsteczki 2PG w jedną cząsteczkę 3-fosfoglicerynianu (3PGA), która może ponownie wejść w cykl wiązania węgla C31. W ten sposób fotooddychanie przekształca tylko 75% wcześniej ustalonego węgla z generacji 2PG i zużywa w tym procesie ATP. W rezultacie, proces fotooddychania jest znaczącym 10%-50% hamulcem procesu fotosyntezy, w zależności od dostępności wody i temperatur sezonu wegetacyjnego4.
Enzymy biorące udział w fotooddychaniu były przedmiotem badań od dziesięcioleci, ale tylko niewielka liczba białek transportowych została scharakteryzowana na poziomie genetycznym, mimo że co najmniej 25 etapów transportu jest zaangażowanych w ten proces5,6,7. Dwa białka transportowe, które są bezpośrednio zaangażowane w ruch węgla powstającego w procesie fotooddychania, to transporter glikolu plastydowego/glicerynu PLGG1 i symporter sodu kwasów żółciowych BASS6, z których oba są zaangażowane w eksport glikolanu z chloroplast5,6.
W otoczeniu [CO2], Rubisco przywiązuje cząsteczkę tlenu do RuBP w około 20% przypadków1. Kiedy rośliny są poddawane działaniu niskiego poziomu [CO2 ], tempo fotooddychania wzrasta, co sprawia, że niski poziom [CO2] jest idealnym środowiskiem do testowania mutantów, które mogą być ważne w warunkach podwyższonego stresu fotooddychania. Testowanie dodatkowych przypuszczalnych linii T-DNA białka transportującego chloroplasty pod niskim poziomem CO2 przez 24 godziny i pomiar zmian we fluorescencji chlorofilu doprowadziło do identyfikacji linii roślinnych bass6-1, które wykazały fenotyp zmutowanego fotooddychania5. Dalsza charakterystyka wykazała, że BASS6 jest transporterem glikolu w wewnętrznej błonie chloroplastu.
Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół podobny do tego, który początkowo był używany do identyfikacji BASS6 jako transportera fotooddychania, który pochodził z listy domniemanych białek transportowych znajdujących się w błonie chloroplastowej8 Ten protokół może być wykorzystany w wysokoprzepustowym eksperymencie charakteryzującym mutanty T-DNA Arabidopsis lub zmutowane rośliny generowane przez EMS jako sposób na identyfikację genów ważnych dla utrzymania wydajności fotosyntezy w zakresie stresy abiotyczne, takie jak upały, stres związany z silnym oświetleniem, susza i dostępność CO2 . Badania przesiewowe mutantów roślinnych za pomocą fluorescencji chlorofilu były stosowane w przeszłości w celu szybkiej identyfikacji genów ważnych dla pierwotnego metabolizmu9. Biorąc pod uwagę, że aż 30% genomu rzodkiewnika zawiera geny kodujące białka o nieznanej lub słabo scharakteryzowanej funkcji, wywołana stresem analiza wydajności fotosyntezy może dostarczyć wglądu w funkcje molekularne, których nie obserwuje się w kontrolowanych warunkach u zmutowanych roślin10. Celem tej metody jest identyfikacja mutantów szlaku fotooddechowego za pomocą badań przesiewowych o niskim poziomie CO2 . Przedstawiamy metodę identyfikacji mutantów, które zaburzają fotooddychanie po ekspozycji na niski poziomCO2. Zaletą tej metody jest to, że jest to wysokoprzepustowe przesiewanie sadzonek, które można wykonać w stosunkowo krótkim czasie. Sekcje protokołu wideo zawierają szczegółowe informacje na temat przygotowania i sterylizacji nasion, wzrostu roślin i traktowania niskim poziomem CO2 , konfiguracji systemu obrazowania fluorescencyjnego, pomiaru wydajności kwantowej próbek poddanych działaniu substancji, reprezentatywnych wyników i wniosków.

<table><tbody><tr><td>Probówka do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>10810-070</td><td>pojemnik do sterylizacji nasion</td></tr><tr><td>agaroza</td><td>VWR</td><td>9012-36-6</td><td>substancja chemiczna służąca do zawieszania nasion w celu ułatwienia posiewu</td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana nasiona (abcb26)</td><td>ABRC, zamówione przez TAIR www.arabidopsis.org</td><td>SALK_085232</td><td>nasiona rzodkiewnika używane jako grupa doświadczalna</td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana nasiona (plgg1-1)</td><td>ABRC, zamówione przez TAIR www.arabidopsis.org</td><td>SALK_053469C</td><td>rodzicielskie nasiona rzodkiewnicy&nbsp;</td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana nasiona (WT)</td><td>ABRC, zamówione przez TAIR www.arabidopsis.org</td><td>Nasiona Arabidopsis typu dzikiego Col-0 stosowane jako grupa kontrolna</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; wybielać&nbsp;</td><td></td><td>Wybielacz generyczny Clorox&nbsp;</td><td>Substancja chemiczna używana do sterylizacji nasion</td></tr><tr><td>Absorbent karbolimowy</td><td>Produkty Medline</td><td>S232-104-001</td><td>Absorbent CO2</td></tr><tr><td>Zamknięty FluorCam</td><td>Photon Systems Instrumenty</td><td>FC 800-C</td><td>Obrazownik fluorescencyjny</td></tr><tr><td>FluoroCam FC 800-C</td><td>Photon Systems Instrumenty</td><td>Zamknięty FluorCam FC 800-C/1010-S</td><td></td></tr><tr><td>FluoroCam FluoroCam7</td><td>Photon Systems Instrumenty</td><td>Zamknięty FluorCam FC 800-C/1010- S</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Gelzan (agar roślinny)</td><td>Phytotech labs</td><td>71010-52-1</td><td>substancja chemiczna stosowana do zestalania pożywek MS w postaci płytek&nbsp;</td></tr><tr><td>szklana kolba 1 L</td><td>Fisherbrand</td><td>FB5011000</td><td>pojemnik do produkcji i autoklawowania MS pożywka</td></tr><tr><td>komora wzrostu</td><td>caron</td><td>7317-50-2</td><td>komora wzrostowa służąca do uprawy roślin</td></tr><tr><td>Murashige & Skoog Basal Medium z witaminami i witaminami 1,0 g/l MES (MS)</td><td>Phytotech labs</td><td>M5531&nbsp;</td><td>Pożywka wzrostowa dla siewek rzodkiewnika&nbsp;</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Phytotech labs</td><td>1310-58-3</td><td>wytwarza jako 1 M roztwór do regulacji pH</td></tr>, pająki <tr><td></td><td>Światła Mean Well Enterprises</td><td>XLG-100-H-AB</td><td>stosowane w teście świetlnym&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwadratowa szalka Petriego z siatką, sterylna</td><td>Simport Scientific</td><td>D21016</td><td>służy do przechowywania pożywki MS dla sadzonek rzodkiewnika</td></tr><tr><td>taśma chirurgiczna</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td>taśma służąca do uszczelniania płytek</td></tr><tr><td>teen 20</td><td>biorad</td><td>&nbsp; 9005-64-5</td><td>Środek powierzchniowo czynny stosowany do wspomagania sterylizacji nasion</td></tr></tbody></table>

ocena efektywności fotosyntezy w mutantach fotooddechowych za pomocą analizy fluorescencji chlorofilu

Evaluation of Photosynthetic Efficiency in Photorespiratory Mutants by Chlorophyll Fluorescence Analysis

Fotosynteza i fotooddychanie reprezentują największe strumienie węgla w pierwotnym metabolizmie roślin i są niezbędne do przetrwania roślin. Wiele enzymów i genów ważnych dla fotosyntezy i fotooddychania jest dobrze badanych od dziesięcioleci, ale niektóre aspekty tych szlaków biochemicznych i ich wzajemne oddziaływanie z kilkoma procesami subkomórkowymi nie są jeszcze w pełni poznane. Wiele prac, które pozwoliły zidentyfikować geny i białka ważne w metabolizmie roślin, przeprowadzono w ściśle kontrolowanych środowiskach, które mogą nie odzwierciedlać najlepiej funkcjonowania fotosyntezy i fotooddychania w środowisku naturalnym i rolniczym. Biorąc pod uwagę, że stres abiotyczny powoduje pogorszenie wydajności fotosyntezy, konieczne jest opracowanie wysokoprzepustowego badania przesiewowego, które może monitorować zarówno stres abiotyczny, jak i jego wpływ na fotosyntezę.
Dlatego opracowaliśmy stosunkowo szybką metodę badania przesiewowego pod kątem zmian w wydajności fotosyntezy wywołanych stresem abiotycznym, która może zidentyfikować niescharakteryzowane geny odgrywające rolę w fotooddychaniu za pomocą analizy fluorescencji chlorofilu i badań przesiewowych o niskiej zawartościCO2. W artykule opisano metodę badania zmian wydajności fotosyntezy u mutantów nokautujących z przeniesionym DNA (T-DNA) u Arabidopsis thaliana. Ta sama metoda może być stosowana do badań przesiewowych mutantów indukowanych metanosulfonianem etylu (EMS) lub badań przesiewowych supresorów. Wykorzystanie tej metody może zidentyfikować kandydatów na geny do dalszych badań nad pierwotnym metabolizmem roślin i reakcjami na stres abiotyczny. Dane z tej metody mogą dostarczyć informacji na temat funkcji genów, które mogą nie zostać rozpoznane, dopóki nie zostaną wystawione na działanie środowiska o zwiększonym stresie.

Wyniki przedstawiają obrazy płytek w świetle widzialnym oraz obrazy fluorescencyjne przy normalnym stężeniu CO oraz niskim stężeniu CO2 przesiewanie mutantów typu dzikiego (WT) i testowych. Każda sadzonka jest oznaczona numerem obszaru, a odpowiadające jej odczyty fluorescencji podano jako QY. Dane są eksportowane do pliku tekstowego, który można otworzyć w arkuszu kalkulacyjnym w celu analizy (patrz Tabela uzupełniająca S1). Linie mutantów plgg1-1 i abcb26 wybrano w celu wyk...

Opisujemy podejście do pomiaru zmian w wydajności fotosyntezy w roślinach po traktowaniu niskim poziomemCO2 za pomocą fluorescencji chlorofilu.

Ocena efektywności fotosyntezy w mutantach fotooddechowych za pomocą analizy fluorescencji chlorofilu

Photosynthesis and photorespiration represent the largest carbon fluxes in plant primary metabolism and are necessary for plant survival. Many of the ...

Celem tej metody jest identyfikacja mutantów w szlaku fotooddechowym przy użyciu badań przesiewowych o niskiej zawartości CO2. Przedstawiamy metodę identyfikacji mutantów, które zaburzają fotooddychanie po ekspozycji na niski poziom CO2. Zaletą tej metody jest to, że jest to wysokoprzepustowe przesiewanie sadzonek, które można wykonać w stosunkowo krótkim czasie.Poniższe sekcje zawierają szczegółowe informacje na temat przygotowania i sterylizacji nasion, wzrostu roślin i zaprawiania niskim poziomem CO2, konfiguracji systemu obrazowania fluorescencyjnego, pomiaru wydajności kwantowej próbek poddanych działaniu substancji, reprezentatywnych wyników i wniosków. Przygotowanie i sterylizacja nasion. Przygotowanie nasion polega na wchłonięciu nasion i sterylizacji nasion.Ważne jest, aby pamiętać, że wszystkie te kroki są wykonywane w okapie z przepływem laminarnym, aby utrzymać sterylne warunki. Wszystkie niezbędne materiały, odczynniki i pożywka wzrostowa są sterylizowane w autoklawie. Używane linie nasion to plgg1-1, abcb26 i WT lub typ dziki.Wchłoń nasiona w sterylnej wodzie w okapie z przepływem laminarnym, a następnie rozwarstwiaj się w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez dwa dni. W sterylnych warunkach przygotuj 10 mililitrów roztworu wybielacza o objętości 50% objętości do objętości i dodaj około 20 mikrolitrów Tween 20. Usuń wodę z wchłoniętych nasion, a następnie dodaj jeden mililitr roztworu wybielacza do probówki mikrowirówkowej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Usuń roztwór wybielacza za pomocą pipety. Opłucz nasiona w jednym mililitrze sterylnej wody, aby ponownie zawiesić. Usuń wodę, gdy nasiona osiądą na dnie.Ponownie zawiesić nasiona w sterylnym 0,1% roztworze agarozy. Do posiewu nasion, podstawowe płytki z 1%MS pożywką z witaminami i 1%agarem do hodowli badanych mutantów. Wytnij końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów za pomocą żyletki.Za pomocą pipety umieść jedno ziarno w środku wyznaczonej kwadratowej siatki dla każdego testowanego mutanta lub genotypu. Tutaj używana jest kwadratowa płyta z siatką jeden na jeden centymetr. Pomaga to zachować jednolitą odległość między każdą sadzonką i uniknąć nakładania się, co będzie ważne później w obrazowaniu i analizie fluorescencyjnej.Po platerowaniu nasion owiń taśmę chirurgiczną wokół pokrywy, aby ją uszczelnić, a następnie umieść ją w komorze wzrostowej. Wzrost roślin i niskie stężenie CO2. Uprawiaj rośliny przez siedem do dziewięciu dni w temperaturze 20 stopni Celsjusza w ośmiogodzinnym cyklu świetlnym 120 mikromoli na metr kwadratowy na sekundę i 16 godzinach ciemności w temperaturze 18 stopni Celsjusza.Sprawdź rośliny szóstego dnia, aby określić, czy są wystarczająco duże, aby można je było obrazować. Ósmego dnia po posadzeniu wystawić rośliny na działanie niskiego poziomu CO2. Umieść oczyszczalnie w szczelnym pudełku w komorze wzrostowej o natężeniu światła 200 mikromoli na metr kwadratowy na sekundę przez 12 godzin.Niski poziom emisji CO2 został skonstruowany przy użyciu hermetycznego przezroczystego pojemnika ze 100 gramami wapna sodowanego umieszczonego na dnie pojemnika. Pojemnik umieszczono w tej samej komorze wzrostowej co kontrola. Instalacje kontrolne pozostaną poniżej 120 mikromoli na metr kwadratowy na sekundę w otaczającym CO2 przez 12 godzin.Skonfiguruj system obrazowania fluorescencyjnego. Umieść płytkę testową wyśrodkowaną pod aparatem w stałej odległości w systemie obrazowania fluorescencyjnego. W oprogramowaniu przyrządu przejdź do okna na żywo i zaznacz pole Błyski, aby włączyć nieaktyniczne błyski pomiarowe.Kliknij narzędzia powiększania i ustawiania ostrości, aż zobaczysz pełny i ostry obraz. Ustaw wartość migawki EL na zero i dostosuj czułość, aby uzyskać sygnał fluorescencyjny w zakresie od 200 do 500 jednostek cyfrowych. Umieść światłomierz w tej samej pozycji, w której użyto go do regulacji ustawień aparatu.W oknie na żywo zaznacz pole Super, aby uruchomić impuls nasycający trwający 800 milisekund. Użyj suwaka, aby dostosować procent mocy względnej dla Super impulsu, aż światłomierz wskaże od 6 000 do 8 000 mikromoli na metr kwadratowy na sekundę. Pomiar wydajności kwantowej próbek poddanych działaniu substancji chemicznej.Bezpośrednio po zabiegu przykryj płytki folią aluminiową na 15 minut w celu adaptacji do ciemności. Usuń folię, aby zmierzyć wydajność kwantową fotosystemu dwa za pomocą fluorometru o zmodyfikowanej amplitudzie impulsów. Następnie umieść płytkę siewną bezpośrednio pod kamerą i uruchom protokół wydajności kwantowej, który znajduje się w naszym repozytorium GitHub.Pobierz protokół Quantum Yield Protocol z usługi GitHub. Użyj oprogramowania fluorometru, aby otworzyć plik programu, klikając ikonę folderu i przechodząc do lokalizacji pliku. Uruchom protokół quantum yield, klikając ikonę czerwonej błyskawicy.Po zakończeniu działania protokołu przejdź do okna wstępnej analizy. Podziel płytkę na pojedyncze sadzonki, podświetlając wszystkie piksele każdej sadzonki na obrazie talerza. Kliknij opcję Wykluczenie tła, aby usunąć wszystkie podświetlone piksele tła, pozostawiając tylko obszar sadzonki.Kliknij przycisk Analizuj, aby wygenerować dane fluorescencji dla każdej sadzonki na obrazie płytki. Ręcznie dostosuj zakres wartości fluorescencji, aby wyświetlić spójne wartości minimalne i maksymalne dla wszystkich płytek. Na karcie Eksperyment kliknij Eksportuj, a następnie Liczbowe.Kliknij Średnia liczbowa, aby wygenerować plik tekstowy zawierający plon kwantowy dla każdej sadzonki. Otwórz plik tekstowy i arkusz kalkulacyjny do analizy. Arkusz kalkulacyjny zawiera numer obszaru, rozmiar pikseli, Fm, Ft, Fq i QY. Po pierwsze, musimy zidentyfikować numer obszaru do odpowiadającego mu genotypu, niezależnie od tego, czy jest to typ dziki, czy mutant testowy, Wyniki.Poniżej znajdują się zdjęcia płyt z surowymi i fluorescencyjnymi obrazami z badań przesiewowych w otoczeniu i o niskiej zawartości CO2 dzikich typów i mutantów testowych. Każda płytka jest oznaczona numerem obszaru z odpowiednimi odczytami fluorescencji jako wydajność kwantowa lub QY. Dane są eksportowane jako plik tekstowy i można je otworzyć w arkuszu kalkulacyjnym w celu analizy. Dostosowane do ciemności wydajności plonowania kwantowego Fv/Fm dzikich typów i mutantów są wizualizowane za pomocą wykresów pudełkowych i wąsów.Aby przetestować różnicę statystyczną między typami dzikimi i mutantami, zastosowano test T-T parami z wartością P mniejszą niż 0,05. W tym przypadku używamy linii mutantów fotooddechowych o zmniejszonej wydajności kwantowej Fv/Fm jako mutanta testowego, aby sprawdzić skuteczność naszej metody badań przesiewowych. Nasze wyniki pokazują, że testowane mutanty mają znacznie niższą wydajność kwantową w porównaniu z typami dzikimi.Oznacza to, że nasza metoda badań przesiewowych jest w stanie zidentyfikować mutanty fotooddechowe przy użyciu badań przesiewowych o niskiej zawartości CO2. Wnioski. Ważną rzeczą, o której należy pamiętać podczas korzystania z tego protokołu, jest upewnienie się, że siewki Arabidopsis są wystarczająco duże, aby mierzyć fluorescencję, ale nie na tyle duże, aby rośliny zachodziły na siebie podczas obrazowania. Preferowane jest wyobrażanie sobie sadzonek jako pierwszych prawdziwych liści, aby spróbować utrzymać jednolity rozmiar liści i kąty liści.Protokół ten może być stosowany jako wysokoprzepustowe badanie przesiewowe sadzonek. Obrazowanie każdej płytki jest stosunkowo szybkie i może potencjalnie przesiać ponad 1000 sadzonek dziennie. Analiza fluorescencji chlorofilu pozwoliła nam zidentyfikować mutanty fotooddechowe za pomocą badań przesiewowych o niskiej zawartości CO2, co jest ważne dla utrzymania wydajności fotooddychania.Protokół ten nie ogranicza się do rzodkiewnika i ma potencjalne zastosowanie w eksperymentach z abiotyczną reakcją na stres.

evaluation-photosynthetic-efficiency-photorespiratory-mutants

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten protokół szczegółowo opisuje odtwarzanie kompleksów zbierających światło in vitro. Te integralne białka błonowe koordynują chlorofile i karotenoidy i są odpowiedzialne za zbieranie światła w roślinach wyższych i zielonych algach.

In vitro Rekonstytucja kompleksów roślin i zielonych alg zbierających światło

Tutaj prezentujemy protokół do badania zachowań związanych ze wzrostem roślin, a zwłaszcza fenotypów w powtarzalny sposób. Pokazujemy, jak zapewnić zmienne, a jednocześnie stabilne warunki oświetleniowe. Prawidłowe analizy zależą od wystarczającej liczby prób i prawidłowych ocen statystycznych.

Analiza zachowania wzrostu Arabidopsis thaliana w różnych jakościach światła

Opisujemy nowe techniczne podejście do badania reakcji fotosyntezy u wyższych roślin, obejmujące jednoczesne pomiary fluorescencji chlorofilu a i reflektancji liści za pomocą PAM i radiometru spektralnego do wykrywania sygnałów z tego samego obszaru liści u Arabidopsis.

Ocena zachowań fotosyntetycznych poprzez jednoczesne pomiary współczynnika odbicia liści i analizy fluorescencji chlorofilu

Szybki fluorometr powtarzalności (FRRf) jest korzystną metodą pomiaru fotofizjologii II fotosystemu i produktywności pierwotnej. W tym miejscu opisujemy protokół pomiaru fotofizjologii PSII alg epizoicznych, Colacium sp. na zooplanktonie substratowym za pomocą FRRf typu kuwetowego.

Pomiar fotofizjologii dołączonego stadium Colacium sp. za pomocą fluorometru kuwetowego o dużej częstotliwości powtarzania

Protokół wprowadza wysokoprzepustową metodę pomiaru relaksacji niefotochemicznego wygaszania za pomocą modulowanej amplitudą impulsów fluorometrii chlorofilu. Metodę tę stosuje się do Glycine max uprawianej na polu i można ją dostosować do innych gatunków w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem różnorodności genetycznej lub populacji hodowlanych.

Wysokoprzepustowa analiza niefotochemicznego hartowania w uprawach przy użyciu fluorometrii chlorofilu z modulacją amplitudy impulsów

Większość pływających organizmów fotoautotroficznych wykazuje wywołane foto zmiany zachowania (fotozachowanie). W niniejszym protokole zaobserwowano wspomniane fotozachowanie w organizmie modelowym Chlamydomonas reinhardtii.

Obserwacja fotozachowania u Chlamydomonas reinhardtii

Obecny protokół opisuje krok po kroku obrazowanie autofluorescencyjne i ocenę zmian fikobiliproteinowych u czerwonych alg na podstawie analizy spektralnej. Jest to bezznacznikowa i nieniszcząca metoda oceny adaptacji komórkowej do ekstremalnych siedlisk, gdy dostępny jest tylko rzadki materiał, a komórki rosną powoli lub wcale w warunkach laboratoryjnych.

Obrazowanie autofluorescencyjne w celu oceny fizjologii czerwonych alg

Tutaj opisujemy zaawansowane narzędzie przeznaczone do monitorowania biosyntezy chlorofilu podczas wczesnych etapów deetiolacji siewek rzodkiewnika. Nowatorska metodologia umożliwia nieinwazyjne obrazowanie fluorescencji chlorofilu w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Nieinwazyjny test do oznaczania kinetyki biosyntezy chlorofilu we wczesnych stadiach deetiolacji rzodkiewnika

Niniejszy manuskrypt opisuje niedestrukcyjne, wysokoprzepustowe podejście do autonomicznych pomiarów terenowych o wydajności kwantowej fotosystemu II, odbiciu spektralnym oraz architekturze roślin, umożliwiając wielkoskalowe fenotypowanie fotosyntezy korony w próbach polowych agronomicznych i hodowlanych.

Wysokoprzepustowe, terenowe badania wydajności fotosyntetycznej roślin uprawnych z wykorzystaniem autonomicznego robota

Za pomocą elektrycznej stymulacji o wysokiej częstotliwości w organizmach Drosophila można wywołać aktywność przypominającą napady drgawkowe. Aktywność ta jest łatwo rejestrowana z systemu włókien olbrzymich.

Analizy obwodów neuronowych w celu badania napadów u mutantów Drosophila z epilepsją

Poznaj metodę analizy fluorescencji chlorofilu do oceny efektywności fotosyntezy w mutantach fotooddechowych roślin. Technika umożliwia szybki przesiew genetyczny i identyfikację zmian w wydajności fotosyntezy.

Ocena efektywności fotosyntezy w mutantach fotooddechowych za pomocą analizy fluorescencji chlorofilu

Przeglądaj więcej filmów