Ocena efektywności fotosyntezy w mutantach fotooddechowych za pomocą analizy fluorescencji chlorofilu

Celem tej metody jest identyfikacja mutantów w szlaku fotooddechowym przy użyciu badań przesiewowych o niskiej zawartości CO2. Przedstawiamy metodę identyfikacji mutantów, które zaburzają fotooddychanie po ekspozycji na niski poziom CO2. Zaletą tej metody jest to, że jest to wysokoprzepustowe przesiewanie sadzonek, które można wykonać w stosunkowo krótkim czasie.

Poniższe sekcje zawierają szczegółowe informacje na temat przygotowania i sterylizacji nasion, wzrostu roślin i zaprawiania niskim poziomem CO2, konfiguracji systemu obrazowania fluorescencyjnego, pomiaru wydajności kwantowej próbek poddanych działaniu substancji, reprezentatywnych wyników i wniosków. Przygotowanie i sterylizacja nasion. Przygotowanie nasion polega na wchłonięciu nasion i sterylizacji nasion.

Ważne jest, aby pamiętać, że wszystkie te kroki są wykonywane w okapie z przepływem laminarnym, aby utrzymać sterylne warunki. Wszystkie niezbędne materiały, odczynniki i pożywka wzrostowa są sterylizowane w autoklawie. Używane linie nasion to plgg1-1, abcb26 i WT lub typ dziki.

Wchłoń nasiona w sterylnej wodzie w okapie z przepływem laminarnym, a następnie rozwarstwiaj się w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez dwa dni. W sterylnych warunkach przygotuj 10 mililitrów roztworu wybielacza o objętości 50% objętości do objętości i dodaj około 20 mikrolitrów Tween 20. Usuń wodę z wchłoniętych nasion, a następnie dodaj jeden mililitr roztworu wybielacza do probówki mikrowirówkowej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Usuń roztwór wybielacza za pomocą pipety. Opłucz nasiona w jednym mililitrze sterylnej wody, aby ponownie zawiesić. Usuń wodę, gdy nasiona osiądą na dnie.

Ponownie zawiesić nasiona w sterylnym 0,1% roztworze agarozy. Do posiewu nasion, podstawowe płytki z 1%MS pożywką z witaminami i 1%agarem do hodowli badanych mutantów. Wytnij końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów za pomocą żyletki.

Za pomocą pipety umieść jedno ziarno w środku wyznaczonej kwadratowej siatki dla każdego testowanego mutanta lub genotypu. Tutaj używana jest kwadratowa płyta z siatką jeden na jeden centymetr. Pomaga to zachować jednolitą odległość między każdą sadzonką i uniknąć nakładania się, co będzie ważne później w obrazowaniu i analizie fluorescencyjnej.

Po platerowaniu nasion owiń taśmę chirurgiczną wokół pokrywy, aby ją uszczelnić, a następnie umieść ją w komorze wzrostowej. Wzrost roślin i niskie stężenie CO2. Uprawiaj rośliny przez siedem do dziewięciu dni w temperaturze 20 stopni Celsjusza w ośmiogodzinnym cyklu świetlnym 120 mikromoli na metr kwadratowy na sekundę i 16 godzinach ciemności w temperaturze 18 stopni Celsjusza.

Sprawdź rośliny szóstego dnia, aby określić, czy są wystarczająco duże, aby można je było obrazować. Ósmego dnia po posadzeniu wystawić rośliny na działanie niskiego poziomu CO2. Umieść oczyszczalnie w szczelnym pudełku w komorze wzrostowej o natężeniu światła 200 mikromoli na metr kwadratowy na sekundę przez 12 godzin.

Niski poziom emisji CO2 został skonstruowany przy użyciu hermetycznego przezroczystego pojemnika ze 100 gramami wapna sodowanego umieszczonego na dnie pojemnika. Pojemnik umieszczono w tej samej komorze wzrostowej co kontrola. Instalacje kontrolne pozostaną poniżej 120 mikromoli na metr kwadratowy na sekundę w otaczającym CO2 przez 12 godzin.

Skonfiguruj system obrazowania fluorescencyjnego. Umieść płytkę testową wyśrodkowaną pod aparatem w stałej odległości w systemie obrazowania fluorescencyjnego. W oprogramowaniu przyrządu przejdź do okna na żywo i zaznacz pole Błyski, aby włączyć nieaktyniczne błyski pomiarowe.

Kliknij narzędzia powiększania i ustawiania ostrości, aż zobaczysz pełny i ostry obraz. Ustaw wartość migawki EL na zero i dostosuj czułość, aby uzyskać sygnał fluorescencyjny w zakresie od 200 do 500 jednostek cyfrowych. Umieść światłomierz w tej samej pozycji, w której użyto go do regulacji ustawień aparatu.

W oknie na żywo zaznacz pole Super, aby uruchomić impuls nasycający trwający 800 milisekund. Użyj suwaka, aby dostosować procent mocy względnej dla Super impulsu, aż światłomierz wskaże od 6 000 do 8 000 mikromoli na metr kwadratowy na sekundę. Pomiar wydajności kwantowej próbek poddanych działaniu substancji chemicznej

Bezpośrednio po zabiegu przykryj płytki folią aluminiową na 15 minut w celu adaptacji do ciemności. Usuń folię, aby zmierzyć wydajność kwantową fotosystemu dwa za pomocą fluorometru o zmodyfikowanej amplitudzie impulsów. Następnie umieść płytkę siewną bezpośrednio pod kamerą i uruchom protokół wydajności kwantowej, który znajduje się w naszym repozytorium GitHub.

Pobierz protokół Quantum Yield Protocol z usługi GitHub. Użyj oprogramowania fluorometru, aby otworzyć plik programu, klikając ikonę folderu i przechodząc do lokalizacji pliku. Uruchom protokół quantum yield, klikając ikonę czerwonej błyskawicy.

Po zakończeniu działania protokołu przejdź do okna wstępnej analizy. Podziel płytkę na pojedyncze sadzonki, podświetlając wszystkie piksele każdej sadzonki na obrazie talerza. Kliknij opcję Wykluczenie tła, aby usunąć wszystkie podświetlone piksele tła, pozostawiając tylko obszar sadzonki.

Kliknij przycisk Analizuj, aby wygenerować dane fluorescencji dla każdej sadzonki na obrazie płytki. Ręcznie dostosuj zakres wartości fluorescencji, aby wyświetlić spójne wartości minimalne i maksymalne dla wszystkich płytek. Na karcie Eksperyment kliknij Eksportuj, a następnie Liczbowe.

Kliknij Średnia liczbowa, aby wygenerować plik tekstowy zawierający plon kwantowy dla każdej sadzonki. Otwórz plik tekstowy i arkusz kalkulacyjny do analizy. Arkusz kalkulacyjny zawiera numer obszaru, rozmiar pikseli, Fm, Ft, Fq i QY. Po pierwsze, musimy zidentyfikować numer obszaru do odpowiadającego mu genotypu, niezależnie od tego, czy jest to typ dziki, czy mutant testowy, Wyniki.

Poniżej znajdują się zdjęcia płyt z surowymi i fluorescencyjnymi obrazami z badań przesiewowych w otoczeniu i o niskiej zawartości CO2 dzikich typów i mutantów testowych. Każda płytka jest oznaczona numerem obszaru z odpowiednimi odczytami fluorescencji jako wydajność kwantowa lub QY. Dane są eksportowane jako plik tekstowy i można je otworzyć w arkuszu kalkulacyjnym w celu analizy. Dostosowane do ciemności wydajności plonowania kwantowego Fv/Fm dzikich typów i mutantów są wizualizowane za pomocą wykresów pudełkowych i wąsów.

Aby przetestować różnicę statystyczną między typami dzikimi i mutantami, zastosowano test T-T parami z wartością P mniejszą niż 0,05. W tym przypadku używamy linii mutantów fotooddechowych o zmniejszonej wydajności kwantowej Fv/Fm jako mutanta testowego, aby sprawdzić skuteczność naszej metody badań przesiewowych. Nasze wyniki pokazują, że testowane mutanty mają znacznie niższą wydajność kwantową w porównaniu z typami dzikimi.

Oznacza to, że nasza metoda badań przesiewowych jest w stanie zidentyfikować mutanty fotooddechowe przy użyciu badań przesiewowych o niskiej zawartości CO2. Wnioski. Ważną rzeczą, o której należy pamiętać podczas korzystania z tego protokołu, jest upewnienie się, że siewki Arabidopsis są wystarczająco duże, aby mierzyć fluorescencję, ale nie na tyle duże, aby rośliny zachodziły na siebie podczas obrazowania. Preferowane jest wyobrażanie sobie sadzonek jako pierwszych prawdziwych liści, aby spróbować utrzymać jednolity rozmiar liści i kąty liści.

Protokół ten może być stosowany jako wysokoprzepustowe badanie przesiewowe sadzonek. Obrazowanie każdej płytki jest stosunkowo szybkie i może potencjalnie przesiać ponad 1000 sadzonek dziennie. Analiza fluorescencji chlorofilu pozwoliła nam zidentyfikować mutanty fotooddechowe za pomocą badań przesiewowych o niskiej zawartości CO2, co jest ważne dla utrzymania wydajności fotooddychania.

Protokół ten nie ogranicza się do rzodkiewnika i ma potencjalne zastosowanie w eksperymentach z abiotyczną reakcją na stres