Name: Podejście oparte na spektrometrii mas do identyfikacji fosfataz fosfoproteinowych i ich interaktorów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Poznaj metodę PIB-MS do wzbogacania endogennych fosfataz fosfoproteinowych i ich interaktorów z komórek oraz tkanek. Technika ta umożliwia identyfikację i ilościowe oznaczanie białek przy użyciu spektrometrii mas bez konieczności ekspresji egzogennej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.N.K. dziękuje za wsparcie ze strony NIH R33 CA225458 i R35 GM119455. Dziękujemy laboratoriom Kettenbach i Gerber za pomocną dyskusję.

<ol><li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatases+in+the+regulation+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatases in the regulation of mitosis.</a> Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).</li>
<li>Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Ser%2FThr+phosphatases--the+ugly+ducklings+of+cell+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).</li>
<li>Brautigan, D. L., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+serine%2Fthreonine+phosphatases%3A+keys+to+unlocking+regulators+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates.</a> Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).</li>
<li>Janssens, V., Goris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A%3A+A+highly+regulated+family+of+serine%2Fthreonine+phosphatases+implicated+in+cell+growth+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.</a> Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).</li>
<li>Virshup, D. M., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+promiscuity+to+precision%3A+protein+phosphatases+get+a+makeover%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover.</a> Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).</li>
<li>Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extended+PP1+toolkit%3A+designed+to+create+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The extended PP1 toolkit: designed to create specificity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).</li>
<li>Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D-networking+by+mitotic+phosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">4D-networking by mitotic phosphatases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).</li>
<li>Heroes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PP1+binding+code%3A+a+molecular-lego+strategy+that+governs+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).</li>
<li>Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+regulatory+subunits+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).</li>
<li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+chemical+proteomics+reveals+mechanisms+of+action+of+clinical+ABL+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).</li>
<li>Klaeger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+proteomics+reveals+ferrochelatase+as+a+common+off-target+of+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors.</a> ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).</li>
<li>Duncan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+reprogramming+of+the+kinome+in+response+to+targeted+MEK+inhibition+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer.</a> Cell. 149 (2), 307-321 (2012).</li>
<li>Cooper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+multiplexed+kinase+inhibitor+beads+to+study+kinome+adaptations+in+drug-resistant+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia.</a> PLoS ONE. 8 (6), 66755(2013).</li>
<li>Lyons, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+chemical+proteomic+strategy+for+profiling+phosphoprotein+phosphatases+from+yeast+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).</li>
<li>Nasa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+kinase+and+phosphatase+profiling+reveal+that+CDK1+phosphorylates+PP2Ac+to+promote+mitotic+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry.</a> Science Signaling. 13 (648), (2020).</li>
<li>Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+ser%2Fthr+protein+phosphatases%3A+specificity%2C+use+and+common+forms+of+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).</li>
<li>Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+use+of+the+protein+phosphatase+affinity+matrices+microcystin-sepharose+and+microcystin-biotin-sepharose%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).</li>
<li>Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-based+profiling+of+endogenous+phosphoprotein+phosphatases+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).</li>
<li>Hughes, C. S., Moggridge, S., Müller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-pot%2C+solid-phase-enhanced+sample+preparation+for+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.</a> Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMT+labeling+for+the+masses%3A+A+robust+and+cost-efficient%2C+in-solution+labeling+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li>
<li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li>
<li>Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet%3A+an+open-source+MS%2FMS+sequence+database+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool.</a> Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li>
<li>Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+Perseus+software+for+omics+data+analysis+With+custom+plugins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia ani nie mają konfliktu interesów.

PIB-MS to podejście proteomiki chemicznej stosowane do ilościowego profilowania PPPomu z różnych źródeł próbki w jednej analizie. Wiele pracy wykonano przy użyciu kulek inhibitorów kinaz do zbadania kinomu i jego zmian w raku i innych stanach chorobowych 10,11,12,13. Jednak badania nad PPPome pozostają w tyle. Przewidujemy, że takie podejście jest w stanie wypełnić tę lukę i rzucić światło na r...

Fosforylacja białek kontroluje większość procesów komórkowych, w tym między innymi odpowiedź na uszkodzenia DNA, sygnalizację czynników wzrostu oraz przejście przez mitozę1,2,3. W komórkach ssaków większość białek jest w pewnym momencie fosforylowana na jednym lub kilku resztach seryny, treoniny lub tyrozyny, przy czym fosfoseryny i fosfotreoniny stanowią około 98% wszystkich miejsc fosforylacji2,3. Podczas gdy kinazy były szeroko badane w kontekście sygnalizacji komórkowej, rola białek fosfataz białkowych (PPP) w regulacji dynamicznych procesów komórkowych jest wciąż odkrywana.
Dynamika fosforylacji jest kontrolowana przez dynamiczne oddziaływanie między kinazami a fosfatazami. W komórkach ssaków występuje ponad 400 kinaz białkowych katalizujących fosforylację seryny/treoniny. Ponad 90% tych miejsc jest defosforylowanych przez fosfatazy białkofosforanowe (PPPs), niewielką rodzinę enzymów składającą się z PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT i PPZ2,3. PP1 i PP2A odpowiadają za większość defosforylacji fosfoseryny i fosfotreoniny w komórce2,3,4. Znaczna różnica w liczbie kinaz i fosfataz oraz brak specyficzności podjednostek katalitycznych PPP in vitro prowadziły do przekonania, że kinazy są głównym determinantem fosforylacji2,3. Jednak liczne badania wykazały, że fosfatazy ustalają specyficzność substratową poprzez tworzenie multimerycznych holoenzymów5,6,7,8,9. Na przykład PP1 jest heterodimerem składającym się z podjednostki katalitycznej oraz, w danej chwili, jednej z ponad 150 podjednostek regulacyjnych6,7,8. Z kolei PP2A jest heterotrimerem utworzonym z podjednostki rusztowaniowej (A), regulacyjnej (B) i katalitycznej (C)2,3,9. Istnieją cztery odrębne rodziny podjednostek regulacyjnych PP2A (B55, B56, PR72 i striatyna), z których każda posiada wiele genów, wariantów splicingowych i wzorców lokalizacji2,3,9. Multimeryczna natura PPP niweluje różnicę w liczbie kinaz i podjednostek katalitycznych PPP. Tworzy ona jednak wyzwania analityczne w badaniu sygnalizacji PPP. Aby kompleksowo analizować sygnalizację PPP, kluczowe jest zbadanie różnych holoenzymów w komórce lub tkance. Znaczny postęp w badaniu ludzkiego kinomu osiągnięto dzięki zastosowaniu kulek z inhibitorami kinaz, zwanych kuleczkami inhibitorów multipleksowych lub kinobeads; jest to strategia proteomiki chemicznej, w której inhibitory kinaz są unieruchomione na kuleczkach, a spektrometria mas jest wykorzystywana do identyfikacji wzbogaconych kinaz oraz ich interaktorów10,11,12,13.
Opracowaliśmy podobne podejście do badania biologii PPP. Technika ta polega na wychwytywaniu powinowactwa katalitycznych podjednostek PPP przy użyciu kulek z unieruchomionym, nieselektywnym inhibitorem PPP zwanym mikrocystyną-LR (MCLR), określanych jako kulki z inhibitorem fosfataz (PIB)14,15. W przeciwieństwie do innych metod wymagających znakowania endogennego lub ekspresji egzogennych podjednostek PPP, co mogłoby zmienić aktywność lub lokalizację białek, metoda PIB-MS pozwala na wzbogacanie endogennych katalitycznych podjednostek PPP, ich powiązanych podjednostek regulacyjnych i rusztowaniowych oraz białek oddziałujących (tzw. PPPome) z komórek i tkanek w danym punkcie czasowym lub w określonych warunkach traktowania. MCLR hamuje PP1, PP2A, PP4-6, PPT oraz PPZ w stężeniach nanomolarnych, co sprawia, że PIBs są wysoce skuteczne w wzbogacaniu PPPome16. Metodę tę można skalować do zastosowania w dowolnym materiale wyjściowym, od komórek po próbki kliniczne. W niniejszym opracowaniu szczegółowo opisujemy zastosowanie PIBs i spektrometrii mas (PIB-MS) w celu efektywnego wychwytywania, identyfikacji i kwantyfikacji endogennego PPPome oraz jego stanów modyfikacji.
<img alt="Schemat przepływu pracy proteomicznej: przygotowanie próbek, spektrometria mas, znakowanie TMT, analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Podsumowanie wizualne protokołu PIB-MS. W eksperymencie PIB-MS próbki mogą być pozyskiwane w różnych formach, od pojedynczych komórek po guzy. Próbka jest pobierana, lizowana i homogenizowana przed wzbogaceniem PPP. W celu wzbogacenia PPP, lizat inkubuje się z PIB w obecności luby braku inhibitora PPP, takiego jak MCLR. Następnie PIBy są płukane, a PPP są eluowane w warunkach denaturujących. Próbki są przygotowywane do analizy spektrometrycznej poprzez usunięcie detergentów za pomocą wzbogacania białek SP3, trawienia trypsyną i odsalania. Próbki mogą być następnie opcjonalnie znakowane metodą TMT przed analizą spektrometrią mas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Metoda PIB-MS obejmuje lizę i klarowanie komórek lub tkanek, inkubację lizatu z PIB, elucję oraz analizę eluatu za pomocą western blotingu lub metod opartych na spektrometrii mas (Rycina 1). Dodanie wolnego MCLR może służyć jako kontrola w celu odróżnienia specyficznych binderów PIB od interaktorów niespecyficznych. W większości zastosowań można wykorzystać podejście bez znakowania w celu bezpośredniej identyfikacji białek w eluatach. W przypadkach, gdy wymagana jest większa precyzja ilościowa lub identyfikacja gatunków o niskiej zawartości, można zastosować dalszą obróbkę z wykorzystaniem znakowania tandemowymi znacznikami masowymi (TMT), aby zwiększyć zakres pokrycia i zmniejszyć ilość materiału wejściowego.

<table><tbody><tr><td>Acetonitryl (ACN)</td><td>Honeywell</td><td>AH015-4</td><td>UWAGA: ACN jest łatwopalny i toksyczny; nosić rękawice i pracować w osłonie przeciwchemicznej.</td></tr><tr><td>Bezwodny acetonitryl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004-100ML UWAGA</td><td>: ACN jest łatwopalny i toksyczny; nosić rękawice i pracować w okapie oparów chemicznych.</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Eppendorf</td><td>nr modelu 5424</td><td></td></tr><tr><td>Kwas beta-glicerofosforowy, sól disodowa pentahydrat</td><td>Acros Organics</td><td>410991000</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>nr modelu 5810 R Wersja</td><td></td>15 amp</tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td><td></td>destylowana</tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Tkanka do skażenia młynek</td><td>Fisherbrand Pellet Pestles</td><td>12-141-363</td><td></td></tr><tr><td>Empore dysk do ekstrakcji fazy stałej, C18</td><td>CDS Analytical</td><td>76333-132</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td>KRYTYCZNE: Inne probówki mogą wypłukiwać polimer do próbki, zanieczyszczając analizę.</td></tr><tr><td>Probówki Eppendorfa, 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td>KRYTYCZNE: Inne probówki mogą wypłukiwać polimer do próbki, zanieczyszczając analizę.</td></tr><tr><td>Kolektor płytkowy ekstrakcyjny</td><td>Wody</td><td>WAT097944</td><td></td></tr><tr><td>probówki Falcon, 50 ml</td><td>VWR</td><td>21008</td><td></td></tr><tr><td>Ogólna igła i tłok</td><td></td><td></td><td></td>z końcem</tr><tr><td>Ogólny stojak</td><td></td><td></td><td></td>do separacji magnetycznej</tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodór (HCl)</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>BDH3028</td><td>UWAGA: HCl jest; Nosić rękawice i pracować w okapie oparów chemicznych.</td></tr><tr><td>Roztwór hydroksyloaminy 50% (wt/vol)</td>Inkubator <td>467804</td><td></td> <td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>, 65 &deg; C</td><td>VWR</td><td>model nr 1380FM</td><td></td></tr><tr><td>Koptec Czysty etanol, 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>Metanol do HPLC (MeOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-4L-R</td><td>UWAGA: MeOH jest łatwopalny i toksyczny; nosić rękawice i pracować w okapie chemicznym.</td></tr><tr><td>Mikrocystyna LR (MCLR) Cayman</td> <td>Chemical</td><td>10007188</td><td>UWAGA: MCLR jest toksyczny; Podczas obsługi należy nosić rękawice i unikać kontaktu ze skórą.</td></tr><tr><td>PBS, 1&x; bez wapnia i magnezu, pH 7,4 &plusmn; 0,1</td><td>Corning</td><td>&nbsp; Paski testowe pH 21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>, takie jak paski testowe pH MilliporeSigma MColorpHast i papierki wskaźnikowe</td><td>Fisher Scientific M1095310001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PIBs</td><td></td><td></td><td>Aby zapoznać się z protokołem generowania PIB, patrz Moorhead et al., 2007.</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet, 10 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>22491504</td><td>KRYTYCZNE: Inne końcówki mogą wypłukiwać polimer do próbek, zanieczyszczając analizę.</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet, 1000 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>22491555</td><td>KRYTYCZNE: Inne końcówki mogą wypłukiwać polimer do próbek, zanieczyszczając analizę.</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet, 200 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>22491539</td><td>KRYTYCZNE: Inne końcówki mogą wypłukiwać polimer do próbek, zanieczyszczając analizę.</td></tr><tr><td>plastikowa strzykawka, 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy III</td><td>Research Products International</td><td>P50700-1</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Hybrydowy spektrometr masowy kwadrupolowo-orbitrapowy, spektrometr masowy Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos lub spektrometr masowy Orbitrap Eclipse Tribrid&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>model nr 5424 R</td><td></td></tr><tr><td>Rotator (Labquake Shaker Rotisserie)</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-687-12Q</td><td>Obrót 8 obr./min</td></tr><tr><td>Płytka do pobierania próbek, 96-dołkowa, 1 ml</td><td>Wody</td><td>WAT058957</td><td></td></tr><tr><td>SDS Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP1311-1</td><td></td></tr><tr><td>Klasa sekwencjonowania zmodyfikowana trypsyna</td><td>Promega</td><td>V511C</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>EMD Chemicals</td><td>SX0299-1</td><td>UWAGA: Azydek sodu jest wybuchowy i toksyczny; nosić rękawice, pracować w dygestorium chemicznym i unikać kontaktu z metalami.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Chemical</td><td>S27110</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (cyfrowy sonizator Branson)</td><td></td><td>model nr. SFX 250</td><td></td></tr><tr><td>SPE C18 płyta odsalająca</td><td>Wody</td><td>186001828BA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedBeads magnetyczne cząstki modyfikowane karboksylanem (kulki SP3)</td><td>Cytiva</td><td>6.51521E+13</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>nr modelu 5350</td><td></td></tr><tr><td>TMT10plex Zestaw odczynników do etykiet izobarycznych plus odczynnik do etykiet TMT11-131C, 3 &razy; 0,8 mg na znacznik</td><td>ThermoFisher</td><td>A37725</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)</td><td>Honeywell</td><td>T6508-25ML</td><td>UWAGA: TFA jest i podrażnia skórę w kontakcie. Nosić rękawice i okulary ochronne oraz pracować w okapie oparów chemicznych.</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Research Products International</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka próżniowa i pułapka par</td><td>Thermo Scientific</td><td>nr modelu. SpeedVac SPD120 i RVT5105</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer (Vortex-Genie 2)</td><td>Scientific Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water LC-MS</td><td>Honeywell</td><td>LC365-4</td><td></td></tr></tbody></table>

podejście oparte na spektrometrii mas do identyfikacji fosfataz fosfoproteinowych i ich interaktorów

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Większość procesów komórkowych jest regulowana przez dynamiczną fosforylację białek. Ponad trzy czwarte białek jest fosforylowanych, a fosfatazy fosfoproteinowe (PPP) koordynują ponad 90% całej komórkowej defosforylacji seryny/treoniny. Deregulacja fosforylacji białek jest związana z patofizjologią różnych chorób, w tym raka i neurodegeneracji. Pomimo ich powszechnej aktywności, mechanizmy molekularne kontrolujące środki ochrony roślin i mechanizmy kontrolowane przez środki ochrony roślin są słabo scharakteryzowane. W tym miejscu opisano podejście proteomiczne zwane kulkami inhibitora fosfatazy i spektrometrią mas (PIB-MS) w celu identyfikacji i ilościowego określenia PPP, ich modyfikacji potranslacyjnych i ich interaktorów w ciągu zaledwie 12 godzin przy użyciu dowolnej linii komórkowej lub tkanki. PIB-MS wykorzystuje nieselektywny inhibitor PPP, mikrocystynę-LR (MCLR), unieruchomiony na kulkach sefarozy w celu wychwytywania i wzbogacania endogennych PPP i powiązanych z nimi białek (określanych jako PPPome). Metoda ta nie wymaga egzogennej ekspresji znakowanych wersji PPP ani stosowania specyficznych przeciwciał. PIB-MS oferuje innowacyjny sposób badania ewolucyjnie konserwatywnych PPP i poszerzania naszej obecnej wiedzy na temat sygnalizacji defosforylacji.

<img alt="Analiza oddziaływań fosfataz, schemat kulek z inhibitorem fosfataz, LC-MS/MS, wykresy danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Identyfikacja specyficznych binderów PIBs. (A) Za pomocą metody PIB-MS można analizować różne typy tkanek lub komórek. Komórki HeLa w trzech powtórzeniach biologi...

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych fosfataz fosfoproteinowych i ich oddziałujących białek z komórek i tkanek oraz ich identyfikacji i kwantyfikacji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas.

Podejście oparte na spektrometrii mas do identyfikacji fosfataz fosfoproteinowych i ich interaktorów

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

PIB-MS to nowatorska technika stosowana do wzbogacania endogennych fosfataz fosforobiałkowych, które oddziałują z białkami z komórek i tkanek. Polega ona na identyfikacji i kwantyfikacji tych białek za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas. Technika ta nie wymaga egzogennej ekspresji znakowanych wersji fosfataz fosforoproteinowych, które mogłyby zmieniać aktywność lub lokalizację białek.Nie wykorzystuje również przeciwciał, które mogą być niespecyficzne lub niezdolne do rozróżnienia określonych izoform. Ta metoda badania PPPM może być skalowana do stosowania na wszystkim, od komórek po próbki kliniczne. Na początek zbierz osad komórkowy przez odwirowanie 277 razy g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.Usuń pożywkę i umyj komórki pięcioma mililitrami PBS. Przygotować bufor do lizy zgodnie z opisem w protokole tekstowym i przechowywać na lodzie. Dodaj jeden mililitr schłodzonego buforu do lizy do próbek, a następnie homogenizuj próbki przez sonifikację i utrzymuj komórki na lodzie między impulsami.Przenieś lizaty do świeżych 1,5-mililitrowych probówek. Odwirować sonifikowaną próbkę w temperaturze 21, 130 razy g przez 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Użyć podwielokrotności lizatu do ilościowego określenia całkowitego stężenia białka za pomocą testu kwasu bicynkowego.Ten etap jest niezbędny, aby zapewnić równe stężenie białka w każdej próbce. Do kontroli inhibitora fosfatazy fosfoproteinowej należy przygotować dwie porcje o równym stężeniu białka dla każdej próbki. Bufor do lizy może być używany do rozcieńczania próbek, tak aby każda probówka miała równe stężenie białka.Dodać jeden mikromol wolnej mikrocystyny-LR do jednej podwielokrotności i równą objętość DMSO do drugiej. Próbki należy zawirować i inkubować na lodzie przez 15 minut. Przygotowanie kulek inhibitora fosfatazy powinno być przeprowadzone z wyprzedzeniem lub w trakcie etapów inkubacji opisanych w rozdziale dotyczącym przygotowania próbki.Użyj 10 mikrolitrów stałych kulek inhibitora fosfatazy lub żywicy PIB na jeden miligram białka i dodaj je do 1,5-mililitrowej probówki. Umyj PIB trzykrotnie 0,5 mililitra buforu do lizy przez wirowanie, a następnie odwirowanie 376 razy g przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Dodaj odpowiednią ilość buforu do lizy do przemytych PIB, aby uzyskać 50% objętościowy roztwór buforowy PIB.Wymieszać delikatnie pipetując i zakręcić końcówką pipety oraz zawiesiną, aby ponownie zawiesić PIB. Przenieś 20 mikrolitrów gnojowicy do 1,5-mililitrowej probówki zawierającej 0,5 mililitra buforu do lizy. Obracaj probówki 376 razy g przez 30 sekund.Każda probówka zawiera równe objętości PIB. Odrzucić supernatant, pozostawiając tylko żywicę stałą i do 50 mikrolitrów buforu do lizy w każdej probówce. Przenieść lizaty do odpowiednio oznakowanych probówek zawierających PIB.Inkubować lizat z PIB przez godzinę w temperaturze 4 stopni Celsjusza z obrotem z prędkością 8 obr./min. Po inkubacji z lizatem, odwirować PIB przy ciśnieniu 376 razy g przez 30 sekund w temperaturze 4 stopni Celsjusza i usunąć supernatant. Umyj kulki, dodając 0,5 mililitra buforu do lizy i odwracając probówki Zbierz kulki przez odwirowanie i usuń supernatant.Powtórz ten krok, aby uzyskać łącznie trzy prania. Po ostatnim płukaniu należy w miarę możliwości usunąć bufor do lizy bez pipetowania PIB. Przygotować bufor elucyjny zawierający 2% SDS i dodać bufor elucyjny cztero- do pięciokrotności objętości PIB.Inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez godzinę, aby wymyć fosfatazy fosfoproteinowe z kulek. Odwirować probówki pod ciśnieniem 376 razy g przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Zebrać eluat do oddzielnej probówki i przystąpić do analiz spektrometrii mas lub western blot.Aby zregenerować PIB, inkubuj je w 2% roztworze SDS z rotacją 8 obr./min przez godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj koraliki trzy do pięciu razy w 25 milimolowym Tris-HCl pH 7,5 z rotacją przez 30 minut na pranie. Przechowywać PIB w 25-milimolowym Tris HCL pH 7,5 z azydkiem sodu.W przypadku analizy spektrometrii mas metody filtrowania i analizy danych różnią się i mogą być wykonywane przez badacza lub główny ośrodek. Po przeszukaniu surowych danych w bazie danych proteomu specyficznego dla gatunku przefiltruj wyniki wyszukiwania i wyeksportuj je jako arkusz programu Microsoft Excel. Przeanalizuj dane w trzech egzemplarzach.W celu ilościowego określenia bez użycia znaczników należy użyć pomiarów powierzchni piku MS1 w celu ilościowego określenia danych. Aby zidentyfikować podjednostki PPP i ich wzajemne oddziaływanie de novo, należy porównać biologiczne trilikaty próbek hamowanych przez mikrocystynę-LR i poddanych działaniu DMSO. Przefiltruj dane tak, aby obecne były tylko białka o całkowitej liczbie peptydów większej niż jedno na co najmniej dwie z trzech próbek kontrolnych poddanych działaniu DMSO.Aby odfiltrować białka, które niespecyficznie wiążą się z żywicą, należy usunąć białka, w których całkowita liczba peptydów w warunkach traktowanych mikrocystyną-LR jest wyższa niż w przypadku jakiejkolwiek podjednostki katalitycznej PPP. Wyklucz z analizy powszechne zanieczyszczenia, takie jak keratyna, kolagen, białka rybosomalne i niejednorodne rybonukleoproteiny jądrowe. Plik CSV jest niezbędny do zaimportowania danych do Perseusa.Zaimportuj przefiltrowane dane do Perseusa, klikając opcję Generic matrix upload (Przesyłanie macierzy ogólnej) w sekcji Load (Załaduj). Przekształć dane, przechodząc do pozycji Przekształcenie podstawowe, wybierając dane i określając funkcję transformacji jako podstawę logarytmu 2 z x. Imputuj brakujące wartości z rozkładu normalnego, przechodząc do opcji Imputacja, Zastąp brakujące wartości z rozkładu normalnego, wybierając dane i określając szerokość oraz przesunięcie w dół dla obliczeń.Wykonaj normalizację kwantylu, przechodząc do pozycji Normalizacja, Normalizacja kwantylu. Dodaj adnotacje do danych, przechodząc do pozycji Wiersze adnotacji, Wiersze adnotacji kategorii. Wykonaj test T ucznia, przechodząc do Testy, Testy dla dwóch prób, wybierając grupy, test do wykonania i metodę korekty testowania wielu hipotez używaną do skracania.Ta funkcja oblicza również współczynniki logarytmu 2. Fosfoterany i ich interaktory zidentyfikowano w komórkach HeLa za pomocą eksperymentu PIB pull-down, a następnie bezznacznikowej kwantyfikacji obfitości białek w próbkach traktowanych DMSO i mikrocystyna-LR. Wykres wulkaniczny analizy spektrometrii mas zidentyfikował specyficzne spoiwa PIB pokazane na czerwono, podjednostki katalityczne na niebiesko, a nowe podjednostki PPP lub białka oddziałujące na biało.Spoiwa niespecyficzne zostały pokazane w kolorze szarym. Wykres punktowy obszaru log2 z lizatu komórkowego HeLa poddanego działaniu DMSO wykazał, że obfitość była silnie skorelowana, co wskazuje na odtwarzalność danych. Analiza sieciowa wszystkich podjednostek fosfatazy fosforoproteinowej i białek oddziałujących wykazała, że białka te były specyficznymi interaktorami w ściąganiu PIB.Można przeprowadzić globalne analizy proteomiczne, a ich wyniki porównać z analizą PIB w celu określenia, czy skład PPPome jest napędzany przez obfitość PPP, czy też regulowany przez mechanizmy potranslacyjne. PIB-MS jest narzędziem o szerokim zastosowaniu, które pozwoliło nam zidentyfikować różnice we wzorcach ekspresji PPP w różnych warunkach, takich jak próbki interfazowe i mitotyczne lub różnice między liniami komórek nowotworowych.

a-mass-spectrometry-based-approach-to-identify-phosphoprotein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opis ilościowej procedury fosforylacji z wykorzystaniem kriolizy, solubilizacji mocznikiem, frakcjonowania HILIC oraz wzbogacania peptydów fosforylowanych metodą IMAC.

Ilościowa fosfoproteomika w Saccharomyces cerevisiae stymulowanych kwasami tłuszczowymi

Opisujemy tutaj protokół oczyszczania i charakterystyki kompleksów białek roślinnych. Pokazujemy to, immunoprecypitując pojedyncze białko w kompleksie, dzięki czemu możemy zidentyfikować jego modyfikacje potranslacyjne i oddziałujących partnerów.

Identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych kompleksów białek roślinnych

Fosforylacja białek jest główną cechą tego, jak komórki interpretują i reagują na informacje w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu przedstawiamy wysokoprzepustowy protokół badań przesiewowych wykorzystujący kinazy oczyszczone z komórek ssaków w celu szybkiej identyfikacji kinaz, które fosforylują substrat (substraty) będący przedmiotem zainteresowania.

Identyfikacja par kinaza-substrat za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Testy konkurencji peptydowej są szeroko stosowane w różnych eksperymentach molekularnych i immunologicznych. W artykule opisano szczegółową metodę testu kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro i związane z nią procedury walidacyjne, które mogą być przydatne do znalezienia określonych miejsc fosforylacji.

Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

Ten protokół opisuje procedurę ekstrakcji i wzbogacania fosfopeptydów z linii komórkowych lub tkanek raka prostaty w celu analizy fosfoproteomu za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas.

Wzbogacanie fosfopeptydem w połączeniu z bezznacznikową ilościową spektrometrią mas w celu zbadania fosfoproteomu w raku prostaty

Tutaj prezentujemy protokół koimmunoprecypitacji i test aktywności enzymatycznej na koraliku, aby jednocześnie badać udział specyficznych domen białkowych receptorów błony komórkowej zarówno w rekrutacji enzymów, jak i ich aktywności.

Test koimmunoprecypitacji do badania funkcjonalnych interakcji między receptorami i enzymami

Scharakteryzowaliśmy nowe białko kinazy za pomocą solidnych podejść biochemicznych: analiza Western Blot z dedykowanym specyficznym przeciwciałem na różnych liniach komórkowych i tkankach, interakcje za pomocą eksperymentów z koimmunoprecypitacją, aktywność kinazy wykryta przez Western Blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla fosfy oraz znakowanie γ[32P] ATP.

Charakterystyka na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych nowego białka kinazy

Ten protokół skupia się na identyfikacji białek, które wiążą się z fosforanami inozytolu lub fosfonozytydami. Wykorzystuje chromatografię powinowactwa z biotynylowanymi fosforanami inozytolu lub fosfoinozytydami, które są unieruchamiane przez streptawidynę do agarozy lub kulek magnetycznych. Fosforan inozytolu lub białka wiążące fosfoinozytol są identyfikowane za pomocą Western blot lub spektrometrii mas.

Identyfikacja białek oddziałujących z fosforanem inozytolu lub fosfoinozytylem za pomocą chromatografii powinowactwa sprzężonej ze spektrometrią Western Blot lub spektrometrią mas

Obecny protokół opisuje przygotowanie próbki i analizę danych w celu ilościowego określenia fosforylacji białek za pomocą ulepszonego testu ściągania pojedynczych cząsteczek (SiMPull).

Zoptymalizowany test typu pull-down dla pojedynczych cząsteczek do ilościowego oznaczania fosforylacji białek

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) zmieniają struktury i funkcje białek. Metody jednoczesnego wzbogacania wielu typów PTM mogą maksymalizować pokrycie w analizach. Przedstawiamy protokół wykorzystujący dwufunkcyjną chromatografię powinowactwa do metali immobilizowaną Ti(IV), a następnie spektrometrię mas do jednoczesnego wzbogacania i analizy N-glikozylacji i fosforylacji białek w tkankach trzustki.

Strategia wzbogacania spin-tip do jednoczesnej analizy N-glikopeptydów i fosfopeptydów z ludzkich tkanek trzustki

Poznaj metodę PIB-MS do wzbogacania endogennych fosfataz fosfoproteinowych i ich interaktorów z komórek oraz tkanek. Technika ta umożliwia identyfikację i ilościowe oznaczanie białek przy użyciu spektrometrii mas bez konieczności ekspresji egzogennej.

Podejście oparte na spektrometrii mas do identyfikacji fosfataz fosfoproteinowych i ich interaktorów

Przeglądaj więcej filmów