Podejście oparte na spektrometrii mas do identyfikacji fosfataz fosfoproteinowych i ich interaktorów

PIB-MS to nowatorska technika stosowana do wzbogacania endogennych fosfataz fosforobiałkowych, które oddziałują z białkami z komórek i tkanek. Polega ona na identyfikacji i kwantyfikacji tych białek za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas. Technika ta nie wymaga egzogennej ekspresji znakowanych wersji fosfataz fosforoproteinowych, które mogłyby zmieniać aktywność lub lokalizację białek.

Nie wykorzystuje również przeciwciał, które mogą być niespecyficzne lub niezdolne do rozróżnienia określonych izoform. Ta metoda badania PPPM może być skalowana do stosowania na wszystkim, od komórek po próbki kliniczne. Na początek zbierz osad komórkowy przez odwirowanie 277 razy g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.

Usuń pożywkę i umyj komórki pięcioma mililitrami PBS. Przygotować bufor do lizy zgodnie z opisem w protokole tekstowym i przechowywać na lodzie. Dodaj jeden mililitr schłodzonego buforu do lizy do próbek, a następnie homogenizuj próbki przez sonifikację i utrzymuj komórki na lodzie między impulsami.

Przenieś lizaty do świeżych 1,5-mililitrowych probówek. Odwirować sonifikowaną próbkę w temperaturze 21, 130 razy g przez 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Użyć podwielokrotności lizatu do ilościowego określenia całkowitego stężenia białka za pomocą testu kwasu bicynkowego.

Ten etap jest niezbędny, aby zapewnić równe stężenie białka w każdej próbce. Do kontroli inhibitora fosfatazy fosfoproteinowej należy przygotować dwie porcje o równym stężeniu białka dla każdej próbki. Bufor do lizy może być używany do rozcieńczania próbek, tak aby każda probówka miała równe stężenie białka.

Dodać jeden mikromol wolnej mikrocystyny-LR do jednej podwielokrotności i równą objętość DMSO do drugiej. Próbki należy zawirować i inkubować na lodzie przez 15 minut. Przygotowanie kulek inhibitora fosfatazy powinno być przeprowadzone z wyprzedzeniem lub w trakcie etapów inkubacji opisanych w rozdziale dotyczącym przygotowania próbki.

Użyj 10 mikrolitrów stałych kulek inhibitora fosfatazy lub żywicy PIB na jeden miligram białka i dodaj je do 1,5-mililitrowej probówki. Umyj PIB trzykrotnie 0,5 mililitra buforu do lizy przez wirowanie, a następnie odwirowanie 376 razy g przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Dodaj odpowiednią ilość buforu do lizy do przemytych PIB, aby uzyskać 50% objętościowy roztwór buforowy PIB.

Wymieszać delikatnie pipetując i zakręcić końcówką pipety oraz zawiesiną, aby ponownie zawiesić PIB. Przenieś 20 mikrolitrów gnojowicy do 1,5-mililitrowej probówki zawierającej 0,5 mililitra buforu do lizy. Obracaj probówki 376 razy g przez 30 sekund.

Każda probówka zawiera równe objętości PIB. Odrzucić supernatant, pozostawiając tylko żywicę stałą i do 50 mikrolitrów buforu do lizy w każdej probówce. Przenieść lizaty do odpowiednio oznakowanych probówek zawierających PIB.

Inkubować lizat z PIB przez godzinę w temperaturze 4 stopni Celsjusza z obrotem z prędkością 8 obr./min. Po inkubacji z lizatem, odwirować PIB przy ciśnieniu 376 razy g przez 30 sekund w temperaturze 4 stopni Celsjusza i usunąć supernatant. Umyj kulki, dodając 0,5 mililitra buforu do lizy i odwracając probówki Zbierz kulki przez odwirowanie i usuń supernatant.

Powtórz ten krok, aby uzyskać łącznie trzy prania. Po ostatnim płukaniu należy w miarę możliwości usunąć bufor do lizy bez pipetowania PIB. Przygotować bufor elucyjny zawierający 2% SDS i dodać bufor elucyjny cztero- do pięciokrotności objętości PIB.

Inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez godzinę, aby wymyć fosfatazy fosfoproteinowe z kulek. Odwirować probówki pod ciśnieniem 376 razy g przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Zebrać eluat do oddzielnej probówki i przystąpić do analiz spektrometrii mas lub western blot.

Aby zregenerować PIB, inkubuj je w 2% roztworze SDS z rotacją 8 obr./min przez godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj koraliki trzy do pięciu razy w 25 milimolowym Tris-HCl pH 7,5 z rotacją przez 30 minut na pranie. Przechowywać PIB w 25-milimolowym Tris HCL pH 7,5 z azydkiem sodu.

W przypadku analizy spektrometrii mas metody filtrowania i analizy danych różnią się i mogą być wykonywane przez badacza lub główny ośrodek. Po przeszukaniu surowych danych w bazie danych proteomu specyficznego dla gatunku przefiltruj wyniki wyszukiwania i wyeksportuj je jako arkusz programu Microsoft Excel. Przeanalizuj dane w trzech egzemplarzach.

W celu ilościowego określenia bez użycia znaczników należy użyć pomiarów powierzchni piku MS1 w celu ilościowego określenia danych. Aby zidentyfikować podjednostki PPP i ich wzajemne oddziaływanie de novo, należy porównać biologiczne trilikaty próbek hamowanych przez mikrocystynę-LR i poddanych działaniu DMSO. Przefiltruj dane tak, aby obecne były tylko białka o całkowitej liczbie peptydów większej niż jedno na co najmniej dwie z trzech próbek kontrolnych poddanych działaniu DMSO.

Aby odfiltrować białka, które niespecyficznie wiążą się z żywicą, należy usunąć białka, w których całkowita liczba peptydów w warunkach traktowanych mikrocystyną-LR jest wyższa niż w przypadku jakiejkolwiek podjednostki katalitycznej PPP. Wyklucz z analizy powszechne zanieczyszczenia, takie jak keratyna, kolagen, białka rybosomalne i niejednorodne rybonukleoproteiny jądrowe. Plik CSV jest niezbędny do zaimportowania danych do Perseusa.

Zaimportuj przefiltrowane dane do Perseusa, klikając opcję Generic matrix upload (Przesyłanie macierzy ogólnej) w sekcji Load (Załaduj). Przekształć dane, przechodząc do pozycji Przekształcenie podstawowe, wybierając dane i określając funkcję transformacji jako podstawę logarytmu 2 z x. Imputuj brakujące wartości z rozkładu normalnego, przechodząc do opcji Imputacja, Zastąp brakujące wartości z rozkładu normalnego, wybierając dane i określając szerokość oraz przesunięcie w dół dla obliczeń.

Wykonaj normalizację kwantylu, przechodząc do pozycji Normalizacja, Normalizacja kwantylu. Dodaj adnotacje do danych, przechodząc do pozycji Wiersze adnotacji, Wiersze adnotacji kategorii. Wykonaj test T ucznia, przechodząc do Testy, Testy dla dwóch prób, wybierając grupy, test do wykonania i metodę korekty testowania wielu hipotez używaną do skracania.

Ta funkcja oblicza również współczynniki logarytmu 2. Fosfoterany i ich interaktory zidentyfikowano w komórkach HeLa za pomocą eksperymentu PIB pull-down, a następnie bezznacznikowej kwantyfikacji obfitości białek w próbkach traktowanych DMSO i mikrocystyna-LR. Wykres wulkaniczny analizy spektrometrii mas zidentyfikował specyficzne spoiwa PIB pokazane na czerwono, podjednostki katalityczne na niebiesko, a nowe podjednostki PPP lub białka oddziałujące na biało.

Spoiwa niespecyficzne zostały pokazane w kolorze szarym. Wykres punktowy obszaru log2 z lizatu komórkowego HeLa poddanego działaniu DMSO wykazał, że obfitość była silnie skorelowana, co wskazuje na odtwarzalność danych. Analiza sieciowa wszystkich podjednostek fosfatazy fosforoproteinowej i białek oddziałujących wykazała, że białka te były specyficznymi interaktorami w ściąganiu PIB.

Można przeprowadzić globalne analizy proteomiczne, a ich wyniki porównać z analizą PIB w celu określenia, czy skład PPPome jest napędzany przez obfitość PPP, czy też regulowany przez mechanizmy potranslacyjne. PIB-MS jest narzędziem o szerokim zastosowaniu, które pozwoliło nam zidentyfikować różnice we wzorcach ekspresji PPP w różnych warunkach, takich jak próbki interfazowe i mitotyczne lub różnice między liniami komórek nowotworowych.