Name: Demonstrowanie owłosionego i nagiego unerwienia skóry we wzorze 3D przy użyciu wielu metod barwienia fluorescencyjnego i oczyszczania tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: Poznaj technikę oczyszczania tkanek do wizualizacji włókien nerwowych w skórze szczura przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Metoda umożliwia szczegółowe badanie unerwienia skóry włosatej i nagiej w trójwymiarze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Fundusz Innowacji Chińskiej Akademii Nauk Medycznych (nr kodu projektu. CI2021A03404) oraz Narodowy Interdyscyplinarny Fundusz Innowacji Tradycyjnej Medycyny Chińskiej (nr sygnatury projektu). ZYYCXTD-D-202202).

Obecne badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Instytutu Akupunktury i Moxibustion, Chińskiej Akademii Chińskich Nauk Medycznych (numer referencyjny D2018-04-13-1). Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Waszyngton, D.C., 1996). W badaniu wykorzystano trzy dorosłe samce szczurów (Sprague-Dawley, waga 230 ± 15 g). Wszystkie zwierzęta były trzymane w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z kontrolowaną temperaturą i wilgotnością oraz miał swobodny dostęp do pożywienia i wody.
1. Perfuzja i przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Wstrzyknąć 250 mg/kg roztworu tribromoetanolu (patrz tabela materiałów) dootrzewnowo szczurowi w celu wywołania eutanazji.</li>
	<li>Gdy oddech przestanie oddychać, użyj nożyczek chirurgicznych ze stali nierdzewnej, aby otworzyć klatkę piersiową szczura. Użyj igieł 20 G do perfuzji przez lewą komorę serca13 z szybkością 3 ml / min ze 100 ml 0,9% soli fizjologicznej, a następnie 250-300 ml 4% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (PB, pH 7,4) (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1A,B).</li>
	<li>Po perfuzji użyj skalpela, aby usunąć skórę grzbietu i podeszwy z tylnej łapy.
	<ol>
		<li>W przypadku próbek wymagających zamrożonego skrawka, po utrwaleniu tkanek w 4% paraformaldehydzie w 0,1 M PB przez 2 godziny, a następnie krioprotekcję tkanek w 25% sacharozie w 0,1 M PB przez ponad 24 godziny w temperaturze 4 °C</li>
		<li>W przypadku próbek o grubym przekroju, który wymaga oczyszczenia tkanek, należy następnie utrwalić tkanki w 4% paraformaldehydzie w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS) przez 2 godziny; następnie kriochronić tkanki w 1x PBS w temperaturze 4 °C (ryc. 1C-E).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Potrójne barwienie fluorescencyjne za pomocą CGRP, falloidyny i LYVE1, a następnie zabieg oczyszczania tkanek
UWAGA: Potrójne barwienie fluorescencyjne za pomocą CGRP, falloidyny i LYVE1 zostało zastosowane w celu odsłonięcia włókien nerwowych, naczyń krwionośnych i limfatycznych w owłosionej i nagiej skórze na skrawkach tkanek o grubości 300 μm po zabiegu oczyszczania tkanek.
<ol>
	<li>Przygotuj 2% agarozy w 1x PBS, podgrzewając w kuchence mikrofalowej przez 2 minuty, aż agaroza się rozpuszcze (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Po umyciu zanurz tkanki skóry w 2% agarozie w temperaturze 37 °C i umieść je w zamrażalniku w celu schłodzenia (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1F,G).</li>
	<li>Przymocuj zamontowaną tkankę do mikrotomu wibracyjnego za pomocą lodowatej wody i pokrój je na grubość 500 μm w kierunku poprzecznym. Użyj następujących parametrów, aby ustawić krajalnicę wibracyjną i zakończyć krojenie: prędkość, 0,50 mm/s i amplituda, 1,5 mm (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1H-K).</li>
	<li>Po pokrojeniu usuń agarozę z kawałków i przechowuj je w sześciodołkowej płytce z 1x PBS (pH 7,4) (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1L).</li>
	<li>Inkubować skrawki tkanek w roztworze 2% Triton X-100 w 1x PBS (TriX-PB) przez noc w temperaturze 4 °C. Zobacz Rysunek 2, aby zapoznać się z następującą procedurą.</li>
	<li>Umieścić skrawki tkanki w buforze blokującym i obracać z prędkością 72 obr./min na wytrząsarce przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Skład buforu blokującego to 10% normalnej surowicy osła, 1% Triton-X 100 i 0,2% azydku sodu w 1x PBS (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Przenieść skrawki tkanki do roztworu zawierającego pierwszorzędowe przeciwciała monoklonalne anty-CGRP myszy (1:500) i owcze przeciwciało poliklonalne anty-LYVE1 (1:500) w buforze rozcieńczającym w probówce do mikrowirówek (patrz tabela materiałów) i obracać na wytrząsarce przez 2 dni w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Skład buforu rozcieńczającego to 1% normalna surowica osła, 0,2% Triton-X 100 i 0,2% azydek sodu w 1x PBS.</li>
	<li>Skrawki chusteczek należy dwukrotnie przemyć buforem myjącym w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywać je na wytrząsarce przez noc w temperaturze 4 °C w buforze do mycia. 
	UWAGA: Skład buforu myjącego to 0,2% Triton-X 100 w 0,1 M PB (pH 7,4).</li>
	<li>Następnego dnia przenieś skrawki tkanek do zmieszanego roztworu zawierającego drugorzędowe przeciwciała przeciwko mysim IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) i IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), a także falloidynie Alexa-Flour594 (1:1000) (patrz tabela materiałów) w probówce do mikrowirówki i obracaj z prędkością 72 obr./min na wytrząsarce przez 5 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć skrawki tkanek na sześciodołkowej płytce z buforem do przemywania przez 1 godzinę dwa razy w temperaturze pokojowej. Przechowywać skrawki tkanek w buforze myjącym na wytrząsarce przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść skrawki tkanki do odczynnika do oczyszczania tkanek (patrz tabela materiałów, jego objętość była pięć razy większa niż objętość próbki) i delikatnie obracać z prędkością 60 obr./min na wytrząsarce przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Po tym zabiegu skrawki tkanek stają się przezroczyste (<silna klasa="xfig">Ryc. 2B).</li>
	<li>Zamontuj oczyszczone tkanki na szkiełku, okrąż chusteczki przekładką i przyklej szczelinę świeżym odczynnikiem do czyszczenia tkanek i szkiełkiem nakrywkowym.</li>
</ol>
3. Potrójne barwienie fluorescencyjne za pomocą CGRP, falloidyny i LYVE1 zgodnie z konwencjonalnym podejściem
UWAGA: Dla porównania, to samo barwienie przeprowadzono na skrawkach tkanek o grubości 30 μm zgodnie z konwencjonalnymi technikami.
<ol>
	<li>Pokrój skrawki tkanki na mikrotomie z prędkością 30 μm w kierunku poprzecznym i zamontuj je na szkiełku.</li>
	<li>Dodać roztwór blokujący z 3% normalną surowicą osła i 0,3% Triton X-100 w 0,1 M PB i inkubować skrawki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć roztwór blokujący i inkubować skrawki z roztworem zawierającym pierwszorzędowe przeciwciała monoklonalne anty-CGRP myszy (1:500) i owcze przeciwciało poliklonalne anty-LYVE1 (1:500) w buforze rozcieńczającym przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia przemyć skrawki tkanek trzykrotnie 0,1 M PB (pH 7,4), dodać zmieszany roztwór zawierający wtórne przeciwciała anty-mysie IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) i anty-owce IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), a także falloidyny Alexa-Flour594 (1:1000) na skrawki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przed obserwacją mikroskopową należy trzykrotnie umyć skrawki w 0,1 M PB (pH 7,4), a następnie przykryć je szkiełkami nakrywkowymi w 50% glicerynie.</li>
</ol>
4. Obrazowanie i analizy
<ol>
	<li>Obserwuj barwione próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym, a następnie wykonaj zdjęcia za pomocą mikroskopu konfokalnego.</li>
	<li>Uchwyć 30 obrazów (stosy Z), każdy w klatkach 10 μm, z każdego przekroju o grubości 300 μm i zintegruj pojedynczy obraz ostry za pomocą procesora obrazu systemu mikroskopii konfokalnej (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Wykonaj następujące czynności w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu konfiguracji konfokalnej do analizy trójwymiarowej (3D): Ustaw początkową płaszczyznę ogniskową | Ustaw końcową płaszczyznę ogniskowej | Ustawianie rozmiaru kroku | Wybierz wzór głębokości | Przechwytywanie obrazu | Seria Z. 
		UWAGA: Długości fal wzbudzenia i emisji sygnałów niebieskiej fluorescencji wynosiły odpowiednio 401 nm i 421 nm. Długości fal wzbudzenia i emisji sygnałów zielonej fluorescencji wynosiły odpowiednio 499 nm i 519 nm. Długości fal wzbudzenia i emisji sygnałów czerwonej fluorescencji wynosiły odpowiednio 591 nm i 618 nm. 152 μm to średnica otworka konfokalnego (soczewka obiektywu 10x, NA: 0,4). Rozdzielczość przechwytywania obrazu wynosiła 1024 × 1024 pikseli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku konwencjonalnych próbek (krok 3) należy wykonać 30 obrazów (stosów Z) w ramkach 1 μm z każdego odcinka o grubości 30 μm i dalej traktować te obrazy, jak wspomniano powyżej (kroki 4.1-4.2).</li>
	<li>Zademonstruj obrazy we wzorze rekonstrukcji 3D za pomocą systemu przetwarzania obrazu.</li>
	<li>Wykonuj rekonstrukcje 3D, importując obrazy konfokalne stosu Z do Imaris 9.0 (oprogramowanie do obrazowania komórek, patrz tabela materiałów) i twórz renderingi powierzchni na podstawie intensywności plam: Dodawanie nowych powierzchni | Wybierz kanał źródłowy | Określ parametry w opcji gładkiej w oknie Szczegóły powierzchni | Określ parametry w opcji progowej Intensywność bezwzględna | Klasyfikowanie powierzchni | Koniec.</li>
	<li>Zbieraj dane w obszarze dodatnich włókien nerwowych za pomocą oprogramowania do obrazowania komórek. Wybierz renderowany obraz | Statystyka | Szczegółowe | Konkretne wartości | Głośność.</li>
</ol>

<ol><li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+neuro-immuno-cutaneous+system+on+human+skin+equivalent+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design.</a> Cell Proliferation. 52 (6), 12677(2019).</li>
<li>Wu, H., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+diversity+of+cutaneous+sensory+afferents+revealed+by+genetically+directed+sparse+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling.</a> Elife. 1, 00181(2012).</li>
<li>Pomaville, M. B., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+genetic+labeling+of+hairy+and+glabrous+skin+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Currents+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation.</a> Currents Protocols. 1 (5), 121(2021).</li>
<li>Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+of+cutaneous+structures+in+the+mouse+hind+paw%3A+a+confocal+microscopy+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study.</a> Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).</li>
<li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51749(2014).</li>
<li>Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+confocal+microscopy+for+adult+ear+skin%3A+a+model+system+to+study+neuro-vascular+branching+morphogenesis+and+immune+cell+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57406(2018).</li>
<li>Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+hair+follicle+innervation+in+experimental+models%3A+a+guide+for+the+exact+and+reproducible+evaluation+of+neuronal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity.</a> Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).</li>
<li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+whole+mount%3A+a+novel+processing+and+imaging+protocol+for+thick%2C+three-dimensional+tissue+cross-sections+of+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e56106(2017).</li>
<li>Yokomizo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+three-dimensional+imaging+of+internally+localized+immunostained+cells+within+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos.</a> Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li>
<li>Pende, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+ultramicroscopy+of+the+developing+and+adult+nervous+system+in+optically+cleared+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster.</a> Nature Communications. 9 (1), 4731(2018).</li>
<li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e61742(2021).</li>
<li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+phallotoxin%2C+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li>
<li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LYVE-1%2C+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein%2C+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUBIC+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54401(2016).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li>
<li>Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neuromediators+and+innervation+in+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Dermato-Venereologica%22%5BJournal%5D)">The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing.</a> Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Histology%22%5BJournal%5D)">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li>
<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+cytoskeletal+F-actin+with+rhodamine+phalloidin+or+fluorescein+phalloidin+for+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).</li>
<li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+vessel+network+structure+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lymphatic vessel network structure and physiology.</a> Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).</li>
<li>Schwager, S., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+lymphatic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and lymphatic function.</a> Frontiers in Immunology. 10, 308(2019).</li>
<li>Hagan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+fission+yeast+filamentous+actin+with+fluorescent+phalloidin+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocol%22%5BJournal%5D)">Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates.</a> Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejsze badanie zapewnia szczegółową demonstrację włókien nerwowych skóry w owłosionej i nagiej skórze za pomocą immunofluorescencji na grubszych odcinkach tkanek z leczeniem oczyszczającym i widokiem 3D, aby lepiej zrozumieć unerwienie skóry. Ważny jest czas inkubacji przeciwciał do 1-2 dni i proces czyszczenia przez noc. Te dwa kluczowe etapy bezpośrednio wpływają na efekt barwienia immunofluorescencyjnego grubych skrawków. Kolejnym problemem był wybór przeciwciał, z których nie wszystkie nadają się do grubych odcink...

Skóra, największy organ w ciele, służący jako kluczowy interfejs do środowiska, jest gęsto unerwiona przez wiele włókien nerwowych1,2,3. Chociaż unerwienie skóry było wcześniej szeroko badane za pomocą różnych metod histologicznych, takich jak barwienie na całych skrawkach skóry i tkanek4,5,6, szczegółowa skuteczna demonstracja skórnych włókien nerwowych jest nadal wyzwaniem7,8. Biorąc to pod uwagę, w obecnym protokole opracowano unikalną technikę wyraźniejszego uwydatniania włókien nerwowych skóry w sekcji tkanki grubej.
Ze względu na ograniczenie grubością odcinków, obserwacja unerwionych włókien nerwowych skóry nie jest wystarczająco precyzyjna, aby dokładnie zobrazować związek między włóknami nerwowymi peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) a lokalnymi tkankami i narządami na podstawie uzyskanych informacji o obrazie. Pojawienie się technologii oczyszczania tkanek 3D zapewnia wykonalną metodę rozwiązania tego problemu9,10. Szybki rozwój metod oczyszczania tkanek zaoferował wiele narzędzi do badania struktur tkankowych, całych narządów, projekcji neuronalnych i całych zwierząt w ostatnich czasach11. Przezroczystą tkankę skórną można zobrazować w znacznie grubszym przekroju za pomocą mikroskopii konfokalnej, aby uzyskać dane do wizualizacji włókien nerwowych skóry.
W obecnym badaniu, podeszwowa i grzbietowa skóra tylnej stopy szczura zostały wybrane jako dwa docelowe miejsca owłosionej i nagiej skóry3,4,7. Aby prześledzić włókna nerwowe skóry na większą odległość, tkankę skórną przecięto na grubość 300 μm w celu barwienia immunohistochemicznego i histochemicznego, a następnie poddano zabiegowi oczyszczania tkanek. CGRP został użyty do oznaczenia włókien nerwu czuciowego12,13. Ponadto, aby podkreślić skórne włókna nerwowe na tle tkanki, falloidyna i receptor hialuronowy śródbłonka naczynia limfatycznego 1 (LYVE1) zostały dodatkowo użyte do oznaczenia naczyń krwionośnych i naczyń limfatycznych, odpowiednio14,15.
Te podejścia dostarczyły prostej metody, którą można zastosować do zademonstrowania widoku włókien nerwowych skóry w wysokiej rozdzielczości, a także do wizualizacji korelacji przestrzennej między włóknami nerwowymi, naczyniami krwionośnymi i naczyniami limfatycznymi w skórze, co może dostarczyć znacznie więcej informacji do zrozumienia homeostazy normalnej skóry i zmian skórnych w warunkach patologicznych.

<table><tbody><tr><td>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>P1020</td><td>pH 7,2-7,4, 0,01 mol</td></tr><tr><td>2,2,2-tribromoetanol</td><td>Sigma Life Science</td><td>T48402-5G</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna</td><td>Olympus Corporation</td><td>Fluoview FV1200</td><td></td></tr><tr><td>Oślica przeciw myszom IgG H& L Alexa-Mąka488</td><td>Abcam plc.</td><td>ab150105</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała przeciw owcom IgG H& L Alexa-Flour405</td><td>Abcam plc.</td><td>ab175676</td><td></td></tr><tr><td>Rurka EP</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td><td>615001</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>System mikrotomów przesuwnych z fazą zamrażania</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1860</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Oxford Instruments</td><td>v.9.0.1</td><td></td></tr><tr><td>Standardowy standard nożycowy</td><td>IRIS WPI (World Precision Instruments Inc.)</td><td></td><td></td>503242</tr><tr><td>iSpacer</td><td>SunJin Lab co.</td><td>IS005</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokleszcze-Str</td><td>RWD</td><td>F11020-11</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne anty-CGRP</td><td>Santa cruz biotechnology, Inc.</td><td>sc-57053</td><td></td></tr><tr><td>Neutralnie buforowana formalina</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>G2161</td><td>10%</td></tr> <tr><td>normalna surowica osła</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>017-000-12</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Longer Precision Pump Co., Ltd</td><td>BT300-2J</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Alexa-Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear 1.52 rozwiązanie</td><td>SunJin Lab co.</td><td>RC152001</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Regularna agaroza</td><td>Gene Company Limited</td><td>G-10</td><td></td></tr><tr><td>SEMKEN 1 x 2 zęby Kleszczyki do tkanek-Str</td><td>RWD</td><td>F13038-12</td><td></td></tr><tr><td>Owcze poliklonalne przeciwciało anty-LYVE1</td><td>R& D Systems, Inc.</td><td>AF7939</td><td></td></tr><tr><td>Płytka sześciodołkowa</td><td>Corning Incorporated</td><td>3335</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma Life Science</td><td>S2002</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Life Science</td><td>V900116</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Henkel AG & Co.</td>Uchwyty chirurgiczne <td>Pattex 502</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RWD</td><td>S32003-12</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>9002-93-1</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Uretan</td><td>Sigma Life Science</td><td>U2500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe VANNAS</td><td>RWD</td><td>S1014-12</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom wibracyjny</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

demonstrowanie owłosionego i nagiego unerwienia skóry we wzorze 3d przy użyciu wielu metod barwienia fluorescencyjnego i oczyszczania tkanek

Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches

Unerwienie skóry jest ważną częścią obwodowego układu nerwowego. Chociaż badania skórnych włókien nerwowych postępują szybko, większość wiedzy na temat ich charakterystyki dystrybucyjnej i chemicznej pochodzi z konwencjonalnego barwienia histochemicznego i immunohistochemicznego na cienkich skrawkach tkanek. Wraz z rozwojem techniki oczyszczania tkanek możliwe stało się oglądanie włókien nerwowych skóry na grubszych odcinkach tkanki. Niniejszy protokół opisuje wielokrotne barwienie fluorescencyjne na skrawkach tkanek o grubości 300 μm od podeszwowej i grzbietowej skóry tylnej stopy szczura, dwóch typowych owłosionych i nagich miejsc skóry. W tym przypadku peptyd związany z genem kalcytoniny znakuje czuciowe włókna nerwowe, podczas gdy falloidyna i receptor hialuronianowy śródbłonka naczyń limfatycznych 1 znakują odpowiednio naczynia krwionośne i limfatyczne. Pod mikroskopem konfokalnym znakowane czuciowe włókna nerwowe były śledzone całkowicie na większą odległość, biegnąc w wiązkach w głębokiej warstwie skórnej i freestyle w warstwie powierzchownej. Te włókna nerwowe biegły równolegle do naczyń krwionośnych lub otaczały je, a naczynia limfatyczne tworzyły trójwymiarową (3D) sieć w owłosionej i nagiej skórze. Obecny protokół zapewnia bardziej efektywne podejście do badania unerwienia skóry niż istniejące konwencjonalne metody z perspektywy metodologicznej.

Po potrójnym barwieniu fluorescencyjnym włókna nerwowe, naczynia krwionośne i naczynia limfatyczne zostały wyraźnie oznakowane odpowiednio CGRP, faloidyną i LYVE1 w skórze owłosionej i nieowłosionej (Rycina 3,4). Dzięki zastosowaniu metody utylizacji (clearing), włókna nerwowe dodatnie dla CGRP, naczynia krwionośne dodatnie dla faloidyny oraz naczynia limfatyczne dodatnie dla LYVE1 mogą być obrazowane na większej głębokości, co pozwala na uzyskanie pełnych informacji struktu...

Grubość skrawków tkanek ograniczała badanie morfologiczne unerwienia skóry. Niniejszy protokół opisuje unikalną technikę oczyszczania tkanek w celu wizualizacji włókien nerwowych skóry w grubych skrawkach tkanki o grubości 300 μm pod mikroskopią konfokalną.

Demonstrowanie owłosionego i nagiego unerwienia skóry we wzorze 3D przy użyciu wielu metod barwienia fluorescencyjnego i oczyszczania tkanek

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of ...

Nasz protokół zapewnił wykonalną metodę obserwacji sekcji synchronizacji za pomocą mikroskopu konfokalnego, co mogło zapewnić precyzję obserwacji włókien nerwowych. Prosty i łatwy protokół czyszczenia tkanek jest główną zaletą tej techniki. Proces czyszczenia tkanek jest wydajny i trwa około 30 minut do godziny.Przeprowadź perfuzję na szczurze poddanym eutanazji, jak wspomniano w rękopisie tekstu. Użyj skalpela, aby usunąć skórę grzbietu i podeszwy z tylnej łapy. W przypadku próbek wymagających zamrożonego skrawka, należy utrwalić tkanki w 4% z aldehydu w 0,1 molowym PB przez dwie godziny.Po umyciu zanurz tkanki skóry w 2% agarozie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i umieść je w pojemniku na lód w celu schłodzenia. Przymocuj zamontowaną tkankę do mikrotonu wibracyjnego za pomocą lodowatej wody i pokrój je na grubość 500 mikrometrów w kierunku poprzecznym. Po pokrojeniu usuń agarozę z kawałków i przechowuj je na sześciodołkowej płytce z 1x PBS.Inkubować skrawki tkanek w roztworze 2% trytonu X-100 w 1x PBS przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umieść skrawki tkanki w buforze blokującym i obracaj z prędkością 72 obrotów na minutę na wytrząsarce przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść skrawki tkanki do roztworu zawierającego pierwszorzędowe przeciwciała monoklonalne anty-CGRP myszy i poliklonalne przeciwciało anty-LYVE-1 owiec w buforze rozcieńczającym w probówce do mikrowirówki.Następnie obracaj na wytrząsarce przez dwa dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj skrawki chusteczki dwukrotnie buforem myjącym o temperaturze pokojowej, a następnie trzymaj je na shakerze przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w buforze do mycia. Następnego dnia przenieś skrawki tkanek do zmieszanego roztworu zawierającego przeciwciała drugorzędowe w probówce z mikrowirówką i obracaj z prędkością 72 obrotów na minutę na wytrząsarce przez pięć godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przemyć skrawki tkanek na sześciodołkowej płytce z buforem do przemywania dwa razy przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Skrawki tkanek należy przechowywać przez noc w buforze myjącym na shakerze w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś skrawki tkanki do odczynnika do usuwania tkanek i delikatnie obracaj z prędkością 60 obrotów na minutę na wytrząsarce przez godzinę w temperaturze pokojowej.Zamontuj przezroczyste chusteczki na szkiełku, a następnie okrąż tkanki przekładką i przyklej szczelinę świeżym odczynnikiem do czyszczenia tkanek i szkiełkiem nakrywkowym. Wzór 3D wykazał, że włókna nerwowe CGRP dodatnie przeszły przez tkankę podskórną i skórę właściwą do naskórka. Te włókna nerwowe biegły w wiązkach w tkance podskórnej, rozgałęziały się w skórze właściwej i kończyły się w naskórku.Natomiast falloidyna w dodatnich naczyniach krwionośnych i naczyniach limfatycznych LYVE-1 dodatnich jest rozprowadzana w tkance podskórnej i skórze właściwej. Ogólnie rzecz biorąc, włókna nerwowe dodatnie CGRP biegły równolegle do lub otaczały naczynia krwionośne i limfatyczne, tworząc sieć 3D w owłosionej i nagiej skórze. Przy konwencjonalnym podejściu, chociaż włókna nerwowe, naczynia krwionośne i naczynia limfatyczne były wyraźnie oznaczone CGRP falloidyną i LYVE-1 w cienkich odcinkach, obserwacja tych struktur była ograniczona przez grubość warstwy i nie można jej w pełni zaobserwować.W przekroju o grubości 30 mikrometrów nie stwierdzono różnicy między skórą owłosioną a skórą nagą w powierzchni włókien nerwowych CGRP dodatnich. W skrawkach tkanek o grubości 300 mikrometrów, w porównaniu ze skórą owłosioną, powierzchnia włókien nerwowych CGRP dodatnich w skórze nagiej była znacznie zwiększona. Ważne jest, aby po inkubacji przeciwciał stosować bufor czyszczący o wysokim ciśnieniu osmotycznym.Kilkakrotnie konieczny jest czas czyszczenia wymagany do barwienia immunofluorescencyjnego. Uważamy, że po tej procedurze istnieje możliwość barwienia i obserwacji innych tkanek i narządów w sześciu sekcjach. Technika ta może pomóc naukowcom zajmującym się neurobiologią w poznawaniu powierzchni i stanu włókien nerwowych.Pomaga nam również obserwować innowacyjność tkanek i narządów.

demonstrating-hairy-glabrous-skin-innervation-3d-pattern-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiamy metodę immunohistochemii całego preparatu oraz konfokalnej mikroskopii skaningowej z wielokrotnym znakowaniem w celu analizy tworzenia złożonej sieci naczyniowej w skórze kończyny zarodka myszy.

Analiza immunohistochemiczna całego preparatu dla naczyń krwionośnych skóry kończyny zarodkowej: model systemowy do badania morfogenezy rozgałęzień naczyniowych w zarodku

Immunocytochemiczna identyfikacja podtypów włókien obwodowych nerwów czuciowych (oraz wykrywanie ekspresji białek w ich obrębie) jest kluczowa dla zrozumienia molekularnych mechanizmów leżących u podstaw czucia obwodowego. W niniejszej pracy opisujemy metody przygotowania próbek tkanek obwodowych i trzewnych, takich jak skóra i kości kończyn, do specyficznego barwienia immunologicznego obwodowych włókien nerwów czuciowych.

Przygotowanie tkanek i immunobarwienie włókien nerwów czuciowych myszy unerwiających skórę i kości kończyn

Wizualizacja pojedynczych komórek w gęsto upakowanych tkankach, takich jak terminalne komórki Schwanna (SCs) w złączach nerwowo-mięśniowych (NMJs), jest trudna. „Sekwencyjne fotoblaknięcie” pozwala na wyodrębnienie pojedynczych terminalnych SCs, na przykład w eksplantacie mięśnia triangularis sterni — wygodnej preparacji nerwowo-mięśniowej, w której sekwencyjne blaknięcie można połączyć z obrazowaniem poklatkowym i post-hoc immunobarwieniem.

Sekwencyjne fotoblaknięcie w celu wyznaczenia pojedynczych komórek Schwanna w złączu neuromięśniowym

W celu zbadania zmian nocyceptywnych wewnątrznaskórkowych włókien nerwowych (IENF) w bolesnych neuropatiach (PN), opracowaliśmy protokoły, które mogłyby bezpośrednio badać trójwymiarowe zmiany morfologiczne obserwowane w nocyceptywnych IENFach.  Trójwymiarowa analiza IENF ma potencjał do oceny zmian morfologicznych IENF w PN.

Trójwymiarowe obrazowanie nocyceptywnych śródnaskórkowych włókien nerwowych w biopsjach ludzkiej skóry

Skóra ssaków zawiera różnorodny wachlarz struktur - takich jak mieszki włosowe i zakończenia nerwowe - które wykazują charakterystyczne wzorce organizacji przestrzennej. Analiza skóry jako płaskiego mocowania wykorzystuje dwuwymiarową geometrię tej tkanki do tworzenia pełnowymiarowych obrazów struktur skóry o wysokiej rozdzielczości.

Obrazowanie skóry myszy metodą flat mount i jego zastosowanie do analizy wzorca mieszków włosowych i morfologii aksonów czuciowych

Ten protokół wykorzystuje trójwymiarowe (3D) techniki obrazowania i analizy do wizualizacji i ilościowego określenia mitochondriów specyficznych dla nerwów. Techniki te mają zastosowanie w innych sytuacjach, w których jeden sygnał fluorescencyjny jest używany do odizolowania podzbioru danych od innego sygnału fluorescencyjnego.

Trójwymiarowe obrazowanie i analiza mitochondriów w obrębie śródnaskórkowych włókien nerwowych człowieka

Tutaj opisujemy nowatorskie przygotowanie do obrazowania żywych lancetowatych końcówek czuciowych końcówek palisadowych, które unerwiają mieszki włosowe skóry uszu myszy podczas barwienia i odbarwiania barwnikami styrylowo-pirydyniowymi.

Monitorowanie optyczne znakowania żywych zakończeń nerwowych w lancetowatych zakończeniach mieszków włosowych skóry ucha myszy ex vivo

Ten raport opisuje protokół CUBIC do wyjaśniania pełnej grubości biopsji skóry myszy i wizualizacji wzorców ekspresji białek, proliferujących komórek i sebocytów w rozdzielczości pojedynczej komórki w 3D. Metoda ta umożliwia dokładną ocenę anatomii i patologii skóry oraz nieprawidłowych fenotypów naskórka w genetycznie zmodyfikowanych liniach myszy.

Protokół CUBIC wizualizuje ekspresję białek w rozdzielczości pojedynczej komórki w preparatach skórnych z całego montażu

Ta praca przedstawia nowatorski protokół przetwarzania i obrazowania dla grubej, trójwymiarowej analizy przekroju poprzecznego tkanki, który umożliwia pełne wykorzystanie modalności obrazowania konfokalnego. Protokół ten zachowuje antygenowość i stanowi solidny system do analizy histologii skóry i potencjalnie innych typów tkanek.

Horizontal Whole Mount: nowatorski protokół przetwarzania i obrazowania dla grubych, trójwymiarowych przekrojów tkanek skóry

Tutaj prezentujemy niedrogie i proste procedury wprowadzania różnych modeli 3D skóry do rutynowych badań w laboratorium hodowli komórkowych. Badacze mogą tworzyć modele dostosowane do ich potrzeb bez konieczności polegania na modelach dostępnych na rynku.

Tworzenie modeli skóry do wielu zastosowań - od dwuwymiarowej (2D) monokultury do trójwymiarowej (3D) wielokulturowości

Badanie to przedstawia podejście in vivo do obrazowania dwufotonowego do wizualizacji struktur niskoprogowych zakończeń aksonów mechanoreceptorów (LTMR) w skórze przedniej łapy myszy. Wykorzystując powtarzalne, wysokorozdzielcze obrazowanie poszczególnych aksonów, metoda ta stanowi nową platformę do badania struktury i funkcji skórnego obwodu czuciowego podczas rozwoju oraz u dorosłych.

Dwufotonowe obrazowanie wewnątrzżyciowe morfologii aksonów dotykowych u skóry myszy

Poznaj technikę oczyszczania tkanek do wizualizacji włókien nerwowych w skórze szczura przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Metoda umożliwia szczegółowe badanie unerwienia skóry włosatej i nagiej w trójwymiarze.

Demonstrowanie owłosionego i nagiego unerwienia skóry we wzorze 3D przy użyciu wielu metod barwienia fluorescencyjnego i oczyszczania tkanek (Wideo) | JoVE Journal

Demonstrowanie owłosionego i nagiego unerwienia skóry we wzorze 3D przy użyciu wielu metod barwienia fluorescencyjnego i oczyszczania tkanek

Przeglądaj więcej filmów