Demonstrowanie owłosionego i nagiego unerwienia skóry we wzorze 3D przy użyciu wielu metod barwienia fluorescencyjnego i oczyszczania tkanek

Nasz protokół zapewnił wykonalną metodę obserwacji sekcji synchronizacji za pomocą mikroskopu konfokalnego, co mogło zapewnić precyzję obserwacji włókien nerwowych. Prosty i łatwy protokół czyszczenia tkanek jest główną zaletą tej techniki. Proces czyszczenia tkanek jest wydajny i trwa około 30 minut do godziny.

Przeprowadź perfuzję na szczurze poddanym eutanazji, jak wspomniano w rękopisie tekstu. Użyj skalpela, aby usunąć skórę grzbietu i podeszwy z tylnej łapy. W przypadku próbek wymagających zamrożonego skrawka, należy utrwalić tkanki w 4% z aldehydu w 0,1 molowym PB przez dwie godziny.

Po umyciu zanurz tkanki skóry w 2% agarozie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i umieść je w pojemniku na lód w celu schłodzenia. Przymocuj zamontowaną tkankę do mikrotonu wibracyjnego za pomocą lodowatej wody i pokrój je na grubość 500 mikrometrów w kierunku poprzecznym. Po pokrojeniu usuń agarozę z kawałków i przechowuj je na sześciodołkowej płytce z 1x PBS.

Inkubować skrawki tkanek w roztworze 2% trytonu X-100 w 1x PBS przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umieść skrawki tkanki w buforze blokującym i obracaj z prędkością 72 obrotów na minutę na wytrząsarce przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść skrawki tkanki do roztworu zawierającego pierwszorzędowe przeciwciała monoklonalne anty-CGRP myszy i poliklonalne przeciwciało anty-LYVE-1 owiec w buforze rozcieńczającym w probówce do mikrowirówki.

Następnie obracaj na wytrząsarce przez dwa dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj skrawki chusteczki dwukrotnie buforem myjącym o temperaturze pokojowej, a następnie trzymaj je na shakerze przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w buforze do mycia. Następnego dnia przenieś skrawki tkanek do zmieszanego roztworu zawierającego przeciwciała drugorzędowe w probówce z mikrowirówką i obracaj z prędkością 72 obrotów na minutę na wytrząsarce przez pięć godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przemyć skrawki tkanek na sześciodołkowej płytce z buforem do przemywania dwa razy przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Skrawki tkanek należy przechowywać przez noc w buforze myjącym na shakerze w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś skrawki tkanki do odczynnika do usuwania tkanek i delikatnie obracaj z prędkością 60 obrotów na minutę na wytrząsarce przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Zamontuj przezroczyste chusteczki na szkiełku, a następnie okrąż tkanki przekładką i przyklej szczelinę świeżym odczynnikiem do czyszczenia tkanek i szkiełkiem nakrywkowym. Wzór 3D wykazał, że włókna nerwowe CGRP dodatnie przeszły przez tkankę podskórną i skórę właściwą do naskórka. Te włókna nerwowe biegły w wiązkach w tkance podskórnej, rozgałęziały się w skórze właściwej i kończyły się w naskórku.

Natomiast falloidyna w dodatnich naczyniach krwionośnych i naczyniach limfatycznych LYVE-1 dodatnich jest rozprowadzana w tkance podskórnej i skórze właściwej. Ogólnie rzecz biorąc, włókna nerwowe dodatnie CGRP biegły równolegle do lub otaczały naczynia krwionośne i limfatyczne, tworząc sieć 3D w owłosionej i nagiej skórze. Przy konwencjonalnym podejściu, chociaż włókna nerwowe, naczynia krwionośne i naczynia limfatyczne były wyraźnie oznaczone CGRP falloidyną i LYVE-1 w cienkich odcinkach, obserwacja tych struktur była ograniczona przez grubość warstwy i nie można jej w pełni zaobserwować.

W przekroju o grubości 30 mikrometrów nie stwierdzono różnicy między skórą owłosioną a skórą nagą w powierzchni włókien nerwowych CGRP dodatnich. W skrawkach tkanek o grubości 300 mikrometrów, w porównaniu ze skórą owłosioną, powierzchnia włókien nerwowych CGRP dodatnich w skórze nagiej była znacznie zwiększona. Ważne jest, aby po inkubacji przeciwciał stosować bufor czyszczący o wysokim ciśnieniu osmotycznym.

Kilkakrotnie konieczny jest czas czyszczenia wymagany do barwienia immunofluorescencyjnego. Uważamy, że po tej procedurze istnieje możliwość barwienia i obserwacji innych tkanek i narządów w sześciu sekcjach. Technika ta może pomóc naukowcom zajmującym się neurobiologią w poznawaniu powierzchni i stanu włókien nerwowych.

Pomaga nam również obserwować innowacyjność tkanek i narządów.