Name: Generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Poznaj metodę generowania sferoid tkankowych za pomocą urządzenia drukowanego w 3D. Technika ta zapewnia wysoką żywotność komórek i jednorodną jakość sferoidów, co jest kluczowe dla inżynierii tkankowej i rozwoju leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundację Wspierania Badań Stanu Rio de Janeiro (FAPERJ, Brazylia), Koordynację na rzecz Doskonalenia Kadry Szkolnictwa Wyższego (CAPES, Brazylia) oraz Brazylijską Narodową Radę Rozwoju Naukowego i Technologicznego (CNPq, Brazylia). Dziękujemy firmie Bioedtech za dostarczenie urządzeń przypominających stemple użytych w tym badaniu oraz profesorowi Bartirze Bergmannowi z Laboratorium Immunofarmakologii za korzystanie z urządzeń do hodowli komórkowych.

Linia komórkowa L929, fibroblasty myszy, została wykorzystana w niniejszym badaniu. Przypominające pieczęć biourządzenie wydrukowane w 3D zostało uzyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). Dobra praktyka hodowli komórkowych i sterylne techniki były przestrzegane przez cały protokół. Sfabrykowane urządzenie zostało wysterylizowane poprzez przetarcie go 70% alkoholem i wystawienie na działanie światła UV przez 15 minut. Pożywki i roztwory do hodowli komórkowych podgrzano do temperatury 37 °C przed kontaktem z komórkami lub sferoidami tkankowymi. Schematyczne przedstawienie protokołu jest pokazane w Rysunek 1.
1. Przygotowanie nieprzylegających form z urządzenia przypominającego stempel
<ol>
	<li>Przygotuj 2% (w/v) żel agarozowy, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć proszek agarozy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS) i homogenizować powstałą zawiesinę ruchami okrężnymi. 
		UWAGA: Ten roztwór można umieścić w szklanej butelce. Na tym etapie roztwór agarozy nie będzie półprzezroczysty.</li>
		<li>Umieść szklaną butelkę w kuchence mikrofalowej i ustaw ją na 30 sekund. Co 5 s zatrzymaj kuchenkę mikrofalową, wyjmij szklaną butelkę i ręcznie homogenizuj roztwór okrężnymi ruchami. Proces ogrzewania należy przeprowadzać, aż roztwór osiągnie stan płynno-przezroczysty. 
		UWAGA: Płyta grzejna może być również używana jako alternatywa dla kuchenki mikrofalowej. Po procesie podgrzewania roztwór musi być półprzezroczysty/przezroczysty.</li>
		<li>Dodaj 1 ml roztworu agarozy do każdego dołka na 6-dołkowej płytce przewidzianej do eksperymentu.</li>
		<li>Odczekaj ~15 min lub do momentu, aż agaroza zastygnie. 
		UWAGA: W celu skrócenia czasu krzepnięcia można użyć płyty chłodzącej.</li>
		<li>Dodać 1-2 ml roztworu agarozy i delikatnie włożyć urządzenie nad płynną agarozę. 
		UWAGA: Umieszczenie urządzenia należy wykonać ostrożnie, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza na styku agarozy-urządzenia.</li>
		<li>Poczekaj ~30 min lub do momentu, aż agaroza zastygnie. 
		UWAGA: W celu skrócenia czasu krzepnięcia można użyć płyty chłodzącej.</li>
		<li>Delikatnie wyjmij urządzenie z agarozy. 
		UWAGA: Usunięcie ma kluczowe znaczenie. Należy go ostrożnie usunąć, aby zachować nienaruszone cechy agarozy; W przeciwnym razie agaroza może zostać zakłócona.</li>
		<li>Dodaj 2 ml pożywki DMEM, odczekaj 10 minut, wyrzuć pożywkę i zastąp ją świeżym DMEM. Powtórz to trzy razy, aby prawidłowo umyć studnię.</li>
		<li>Dodać 2 ml DMEM i umieścić 6-dołkową płytkę w inkubatorze (w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i wilgotności 80%) aż do wysiewu komórek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A-F, Dodatkowe wideo 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Generowanie sferoidów tkankowych
UWAGA: Różne linie komórkowe mają różne właściwości adhezyjne. W związku z tym, stosując tę metodologię, niektóre typy komórek mogą nie tworzyć prawidłowo sferoid tkankowych.
<ol>
	<li>Hoduj komórki zgodnie z tradycyjną hodowlą jednowarstwową (tj. hoduj komórki w kolbach do hodowli komórkowych przy użyciu DMEM z niską glukozą uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) (patrz tabela materiałów). Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i monitoruj, aż osiągną 80% konfluencji.</li>
	<li>Po osiągnięciu pożądanego zbiegu, umyj komórki 1x PBS. 
	UWAGA: Zaleca się stosowanie 5 ml w przypadku kolb 2 cm, 10 ml w przypadku kolb 75 cm2 i 15 ml w przypadku kolb 2 150 cm.</li>
	<li>Dodać enzym dysocjacyjny i inkubować komórki przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i wilgotności 80%. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu użyto 0,125% trypsyny z 0,78 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) jako enzymu dysocjacji (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Obserwuj oderwanie komórek od kolb do hodowli komórkowych i dodaj pożywkę wzrostową uzupełnioną FBS w celu zneutralizowania enzymu dysocjacji komórek. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano DMEM z niskim poziomem glukozy (patrz Tabela materiałów) uzupełniony 10% FBS.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie policz komórki ręcznie.</li>
	<li>Weź 50 x 105 komórek na probówkę i dodaj 5 ml 1x PBS. 
	UWAGA: Liczba wysianych komórek wpływa na ostateczną średnicę sferoidy tkanki. W związku z tym można zwiększyć liczbę komórek, aby wygenerować sferoidy tkankowe o większych średnicach.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant za pomocą pipety, dodać 1 ml pożywki do hodowli komórkowych i homogenizować roztwór. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano kompletną pożywkę DMEM o niskiej zawartości glukozy, uzupełnioną 10% FBS, 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Usuń 2 ml pożywki z płytki 6-dołkowej (krok 1.1.9) i dodaj 1 ml zawiesiny komórkowej do środka formy agarozowej utworzonej przez biourządzenie wydrukowane w 3D (krok 1.1.7). Poczekaj, aż komórki osadzą się w mikroresekcjach (~20-30 min) i ostrożnie dodaj 1 ml pożywki do hodowli komórkowych do studzienki. 
	UWAGA: Na tym etapie należy zachować szczególną ostrożność. Zaleca się delikatne dodanie pożywki, umieszczenie końcówki pipety blisko ścianki studzienki i dozowanie w małych ilościach.</li>
	<li>Umieść 6-dołkową płytkę w inkubatorze (w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i wilgotności 80%) w celu utworzenia sferoid tkankowych (około 24-48 godzin, w zależności od typu komórki) (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). 
	UWAGA: Różne typy komórek (np. komórki rakowe, komórki pierwotne) mają różną kinetykę samoorganizacji11.</li>
</ol>

<ol><li>Laschke, M., Menger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+is+3D%3A+Boosting+spheroid+function+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).</li>
<li>Mekhileri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+3D+bioassembly+of+micro-tissues+for+biofabrication+of+hybrid+tissue+engineered+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Automated 3D bioassembly of micro-tissues for biofabrication of hybrid tissue engineered constructs.</a> Biofabrication. 10 (2), 024103(2018).</li>
<li>Itoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+tubular+tissues+created+by+a+bio-3D+printer+undergo+remodeling+and+endothelialization+when+implanted+in+rat+aortae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free tubular tissues created by a bio-3D printer undergo remodeling and endothelialization when implanted in rat aortae.</a> PLoS One. 10 (12), 0145971(2015).</li>
<li>Kronemberger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypertrophic+cartilage+induction+influences+the+building-block+capacity+of+human+adipose+stem%2Fstromal+cell+spheroids+for+biofabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication.</a> Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).</li>
<li>Mironov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+Tissue+spheroids+as+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Organ printing: Tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).</li>
<li>Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid-on-a-chip+and+body-on-a-chip+systems+for+drug+screening+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling.</a> Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).</li>
<li>Garcez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+impairs+growth+in+human+neurospheres+and+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids.</a> Science. 352 (6287), 816-818 (2016).</li>
<li>Charelli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologically+produced+silver+chloride+nanoparticles+from+B.+megaterium+modulate+interleukin+secretion+by+human+adipose+stem+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Biologically produced silver chloride nanoparticles from B. megaterium modulate interleukin secretion by human adipose stem cell spheroids.</a> Cytotechnology. 70 (6), 1655-1669 (2018).</li>
<li>Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+multicellular+spheroids+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Advances in multicellular spheroids formation.</a> Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), 20160877(2017).</li>
<li>Achilli, T., Meyer, J., Morgan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+formation%2C+use+and+understanding+of+multi-cellular+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 12 (10), 1347-1360 (2012).</li>
<li>Rolver, M., Elingaard-Larsen, L., Pedersen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+cell+viability+and+death+in+3D+spheroid+cultures+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assessing cell viability and death in 3D spheroid cultures of cancer cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59714(2019).</li>
<li>Quan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-curing+3D+printing+technique+and+its+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Bioactive+Materials%22%5BJournal%5D)">Photo-curing 3D printing technique and its challenges.</a> Bioactive Materials. 5 (1), 110-115 (2020).</li>
<li>Rodriguez-Salvador, M., Perez-Benitez, B., Padilla-Aguirre, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+the+latest+scientific+pathways+on+tissue+spheroids%3A+Opportunities+to+innovate%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Bioprinting%22%5BJournal%5D)">Discovering the latest scientific pathways on tissue spheroids: Opportunities to innovate.</a> International Journal of Bioprinting. 7 (1), 331(2021).</li>
<li>Baptista, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+stem+cells+spheroids+to+optimize+cell+colonization+in+scaffolds+for+cartilage+and+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adult stem cells spheroids to optimize cell colonization in scaffolds for cartilage and bone tissue engineering.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1285(2018).</li>
<li>Shakeri, A., Khan, S., Didar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+and+emerging+strategies+for+the+fabrication+and+functionalization+of+PDMS-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Conventional and emerging strategies for the fabrication and functionalization of PDMS-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 21 (16), 3053-3075 (2021).</li>
<li>vander Valk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+bovine+serum+%28FBS%29%3A+Past+-+present+-+future%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Fetal bovine serum (FBS): Past - present - future.</a> ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).</li>
<li>vander Valk, J., Brunner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+chemically+defined+cell+culture+media+-+Replacing+fetal+bovine+serum+in+mammalian+in+vitro+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Optimization of chemically defined cell culture media - Replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods.</a> Toxicology in Vitro. 24 (4), 1053-1063 (2010).</li>
<li>Smyrek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microtubules+and+FAK+dominate+different+spheroid+formation+phases+and+important+elements+of+tissue+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">microtubules and FAK dominate different spheroid formation phases and important elements of tissue integrity.</a> Biology Open. 8 (1), 037051(2018).</li>
<li>McMillen, P., Holley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+cell-cell+and+cell-ECM+adhesion+in+vertebrate+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Integration of cell-cell and cell-ECM adhesion in vertebrate morphogenesis.</a> Current Opinion in Cell Biology. 36, 48-53 (2015).</li>
<li>Tung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+3D+spheroid+culture+and+drug+testing+using+a+384+hanging+drop+array%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array.</a> The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).</li>
<li>Guo, X., Li, S., Ji, Q., Lian, R., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+viability+and+neural+differential+potential+in+poor+post-thaw+hADSCs+by+agarose+multi-well+dishes+and+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced viability and neural differential potential in poor post-thaw hADSCs by agarose multi-well dishes and spheroid culture.</a> Human Cell. 28 (4), 175-189 (2015).</li>
<li>Andréa Dernowsek, J., Rezende, R., Lopes daSilva, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+information+technology+in+the+future+of+3D+biofabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+3D+Printing+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">The role of information technology in the future of 3D biofabrication.</a> Journal of 3D Printing in Medicine. 1 (1), 63-74 (2017).</li>
<li>Garcez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+impairs+growth+in+human+neurospheres+and+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids.</a> Science. 352 (6287), 816-818 (2016).</li>
<li>Skardal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-tissue+interactions+in+an+integrated+three-tissue+organ-on-a-chip+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multi-tissue interactions in an integrated three-tissue organ-on-a-chip platform.</a> Scientific Reports. 7, 8837(2017).</li>
<li>Armoiry, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chondrocyte+implantation+with+chondrosphere+for+treating+articular+cartilage+defects+in+the+knee%3A+An+evidence+review+group+perspective+of+a+NICE+single+technology+appraisal%5BTitle%5D)+AND+%22PharmacoEconomics%22%5BJournal%5D)">Autologous chondrocyte implantation with chondrosphere for treating articular cartilage defects in the knee: An evidence review group perspective of a NICE single technology appraisal.</a> PharmacoEconomics. 37 (7), 879-886 (2018).</li>
<li>Nakamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-3D+printing+iPSC-derived+human+chondrocytes+for+articular+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Bio-3D printing iPSC-derived human chondrocytes for articular cartilage regeneration.</a> Biofabrication. 13 (4), 044103(2021).</li>
<li>Mesquita, C., Charelli, L., Baptista, L., Naveira-Cotta, C., Balbino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous-mode+encapsulation+of+human+stem+cell+spheroids+using+droplet-based+glass-capillary+microfluidic+device+for+3D+bioprinting+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Continuous-mode encapsulation of human stem cell spheroids using droplet-based glass-capillary microfluidic device for 3D bioprinting technology.</a> Biochemical Engineering Journal. 174, 108122(2021).</li>
</ol>

Wydrukowane w 3D urządzenia przypominające stemple zostały zaoferowane przez startup Bioedtech, w którym Janaína Dernovsek jest współzałożycielką i dyrektorem ds. innowacji. Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Niniejszy protokół opisuje prostą, szybką i niedrogą metodę produkcji sferoid tkankowych na dużą skalę. Jako forma główna użyto urządzenia wydrukowanego w 3D przypominającego stempel, które wygenerowało do 4,716 sferoid na płytkę 6-dołkową. Wykazano, że komórki hodowane jako sferoidy mają bardziej realistyczne reakcje biologiczne, które bardzo przypominają środowisko in vivo 1. Ze względu na swoje zalety, sferoidy tkankowe reprezentują wyłaniający się trend w kierunku lepszych, bardziej w...

Sferoidy tkankowe to mikro-tkanki 3D utworzone przez zawiesiny komórek, które ulegają samoorganizacji bez użycia sił zewnętrznych1. Te sferoidy są szeroko stosowane w protokołach biofabrykacji ze względu na ich podobieństwo do kluczowych cech ludzkiego układu fizjologicznego2,3. Sferoidy tkankowe zapewniają bardziej podobny metabolizm, dynamikę cytoszkieletu, żywotność komórek oraz aktywność metaboliczną i wydzielania niż tradycyjna hodowla komórkowa jednowarstwowa1. Ze względu na ich zdolność do fuzji, mogą być również używane jako elementy budulcowe (np. protokoły biodruku) do tworzenia złożonych konstruktów inżynierii tkankowej o zwiększonym znaczeniu biologicznym4,5.
Ze względu na ich biologiczne znaczenie, sferoidy tkankowe były używane jako narzędzie biotechnologiczne dla protokołów obejmujących inżynierię tkankową, rozwój leków, modelowanie chorób i ocenę nanotoksykologiczną, redukując czas, koszty przestrzeni i testy na zwierzętach3,6,7,8. Niemniej jednak, aby w pełni zbadać i wykorzystać potencjał sferoid tkankowych, bardzo potrzebne są niezawodne i powtarzalne metody mające na celu ich produkcję na dużą skalę, które pozostają ciągłym wyzwaniem.
Kilka metodologii tworzy sferoidy, takie jak wiszące krople, powlekane studnie denne w kształcie litery U, mikrofluidyka i użycie matrycy polimerowej9,10. Chociaż metodologie te utorowały drogę na rynku produkcji sferoidów, nadal są złożone, czasochłonne, pracochłonne lub drogie10.
Obecny protokół informuje o produkcji na dużą skalę sferoidów jednorodnych tkanek przy użyciu taniej i efektywnej czasowo metodologii. Opracowaliśmy wydrukowane w 3D urządzenie przypominające stempel, aby wygenerować do 4,716 sferoid na płytkę 6-dołkową. Co więcej, urządzenie przypominające stempel można dostosować do wytwarzania większej liczby sferoid na studzienkę, co jest odpowiednie dla różnych płytek do hodowli komórkowych. Jest łatwy do sterylizacji i może być ponownie używany przez długi czas. Wydajna produkcja sferoid tkankowych o wysokiej wydajności na dużą skalę jest niezbędna do zastosowania ich w klinikach, przyczyniając się do rozwoju wielu dziedzin przemysłu, takich jak inżynieria tkankowa, opracowywanie leków, modelowanie chorób i medycyna spersonalizowana na żądanie.

<table><tbody><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Merck</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>Biodevice&nbsp;</td>Szafa bezpieczeństwa <td>biologicznego Bioedtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>51029701 Wirówka</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>75004031</tr><tr><td>Probówki wirówkowe Corning 50 ml Merck</td><td></td><td>CLS430829-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych Corning Powierzchnia 75 cm2</td><td>Merck</td><td>CLS430641</td><td></td></tr><tr><td>Draft Resin&nbsp;</td><td>FormLabs</td><td>FLDRBL01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Zmodyfikowany Orzeł i liczba pierwsza; s Medium - niska glukoza</td><td>Merck</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16000044 Form 2</td><td>Inkubator FormLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>51033782</tr><tr><td>Linie komórkowe L929</td><td>Umieszczone w laboratorium&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina i Streptomycyna (PS)</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Merck</td><td>806552</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna z EDTA</td><td>Merck</td><td>T3924</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3d urządzenia przypominającego stempel

Generation of Tissue Spheroids via a 3D Printed Stamp-Like Device

Postępy w hodowli komórek 3D pozwoliły na opracowanie bardziej fizjologicznie istotnych modeli in vitro, takich jak sferoidy tkankowe. Komórki hodowane jako sferoidy mają bardziej realistyczne reakcje biologiczne, które przypominają środowisko in vivo. Ze względu na swoje zalety, sferoidy tkankowe reprezentują wyłaniający się trend w kierunku lepszych, bardziej wiarygodnych i bardziej predykcyjnych modeli badawczych o szerokim zakresie zastosowań biotechnologicznych. Jednak powtarzalne platformy, które mogą umożliwić produkcję sferoidów tkankowych na dużą skalę, stały się niezaspokojoną potrzebą w pełnym zbadaniu i zwiększeniu ich potencjału. W tym przypadku produkcja na dużą skalę jednorodnych sferoidów tkankowych jest raportowana przy użyciu taniej i efektywnej czasowo metodologii. Wydrukowane w 3D urządzenie przypominające stempel zostało opracowane w celu wygenerowania do 4,716 sferoid na płytkę 6-dołkową. Urządzenie wytwarzane jest metodą stereolitografii przy użyciu żywicy fotoutwardzalnej. Końcowe urządzenie składa się z cylindrycznych mikroszpilek o wysokości 1,3 mm i szerokości 650 μm. Takie podejście pozwala na szybkie generowanie jednorodnych sferoid i sferoid z kokulturą o jednolitym kształcie i wielkości oraz żywotności komórek na poziomie >95%. Co więcej, urządzenie przypominające stempel jest dostrajalne dla różnych rozmiarów płytek studzienkowych i szalek Petriego. Jest łatwy do sterylizacji i może być ponownie używany przez długi czas. Wydajna produkcja na dużą skalę jednorodnych sferoidów tkankowych jest niezbędna do wykorzystania ich translacji w wielu dziedzinach przemysłu, takich jak inżynieria tkankowa, opracowywanie leków, modelowanie chorób i medycyna spersonalizowana na żądanie.

Generowanie jednorodnych mikroresekcji przy użyciu urządzenia przypominającego stempel wydrukowanego w technologii 3D 
Urządzenie przypominające stempel wydrukowane w technologii 3D zostało z sukcesem wykonane metodą stereolitografii12 z wykorzystaniem żywicy światłoutwardzalnej (Rycina 2A). Końcowe urządzenie składało się z cylindrycznych mikropinów o wysokości 1,3 mm i szerokości 650 µm (Rycina 2A). Zastosowanie go j...

Obecny protokół opisuje technikę wytwarzania sferoidów tkankowych na dużą skalę przy użyciu wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel.

Generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have ...

Nasz protokół jest istotny, ponieważ umożliwia wydajną produkcję na dużą skalę jednorodnych sferoidów tkankowych, które mają kluczowe znaczenie dla naszej zaawansowanej inżynierii tkankowej, opracowywania leków i modelowania chorób. Główną zaletą tej techniki jest jej zdolność do szybkiego i ekonomicznego wytwarzania dużych ilości jednolitej sferoidy tkankowej, zapewnia wysoką żywotność komórek i jakość sferoidów, co ma kluczowe znaczenie dla naszych różnych zastosowań biomedycznych Wytwarzając sterydy specyficzne dla pacjenta, technika ta oferuje fizjologicznie dokładny model, umożliwiając precyzyjne modelowanie choroby oraz zrozumienie mechanizmów molekularnych i behawioralnych, w tym raka. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat badań nad rakiem, chorobami neurodegeneracyjnymi i inżynierią tkankową, a także może być stosowana do opracowywania leków i medycyny spersonalizowanej, pogłębiając naszą wiedzę na temat różnych systemów biologicznych.Nasza demonstracja wizji ma kluczowe znaczenie, ponieważ wyraźnie ilustruje skomplikowane kroki, takie jak wprowadzanie urządzenia i wysiewanie komórek, pomagając zapobiegać typowym błędom i zapewniając, że właściwa technika jest poduszką dla spójnych wyników. Zacznij od dodania proszku agarozy do jednego x PBS, aby przygotować 2% żel agarozowy w szklanym pojemniku. Homogenizuj zawiesinę ruchami okrężnymi.Umieść szklany pojemnik w kuchence mikrofalowej i ustaw czas na 30 sekund. Zatrzymaj kuchenkę mikrofalową co pięć sekund, wyjmij szklaną butelkę i ręcznie homogenizuj roztwór okrężnymi ruchami. Wykonuj proces podgrzewania, aż roztwór osiągnie płynny stan przezroczysty.Następnie dodaj sześć mililitrów roztworu agarozy do każdego dołka płytki sześciodołkowej i odczekaj 15 minut lub do momentu, gdy agaroza zastygnie. Następnie delikatnie włóż wydrukowane w 3D bio urządzenie nad płynną agarozę i odczekaj 30 minut lub do momentu, aż agaroza zastygnie. Następnie delikatnie wyjmij urządzenie z agarozy i dodaj dwa mililitry pożywki DMEM.Odczekaj 10 minut przed wyrzuceniem nośnika i zastąpieniem go świeżym DMEM. Powtórz pranie trzy razy. Po zakończeniu dodaj dwa mililitry DMEM i umieść sześciodołkową płytkę do wysiewu komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla i wilgotnością 80%.Hoduj mysie komórki fibroblastów w kolbach do hodowli komórkowych i utrzymuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla, aż do osiągnięcia 80% konfluencji. Następnie umyj komórki jednym x PBS i dodaj enzym dysocjacyjny. Inkubuj komórki przez dwie do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla i 80% wilgotności.Po odłączeniu komórek od kolby do hodowli komórkowej dodać pożywkę wzrostową, aby zneutralizować enzym dysocjacji komórek. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 400 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i policzyć komórki. Do 50 razy 10 do mocy pięciu komórek pobranych w probówce, dodaj pięć mililitrów jednego x PBS.Następnie odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 400 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant za pomocą pipety przed dodaniem jednego mililitra pożywki do hodowli komórkowych i homogenizacją roztworu. Z przygotowanej wcześniej płytki sześciodołkowej usuń dwa mililitry pożywki i dodaj jeden mililitr zawiesiny komórkowej do środka formy agarozowej utworzonej przez wydrukowane w 3D urządzenie bio.Odczekaj 20 do 30 minut, aż komórki osiądą w mikroresekcjach przed dodaniem jednego mililitra pożywki do hodowli komórkowej do studzienki. Umieść sześciodołkową płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na około 24 do 48 godzin w celu wytworzenia sferoidów tkankowych. Wydrukowane w 3D urządzenie przypominające stempel, składające się z cylindrycznych mikroszpilek, zostało z powodzeniem wyprodukowane metodą stereolitografii przy użyciu żywicy utwardzanej foto.Urządzenie było proste, łatwe do sterylizacji, wielokrotnego użytku i można je było dostosować do różnych rozmiarów płytek dołkowych i szalek Petriego. Wygenerowano 750 jednorodnych mikroresekcji studzienek, czyli 4 716 na płytki sześciodołkowe. Wczesne wyjęcie urządzenia z płytki zakłóciło nieprzylegającą formę i zdeformowało geometrię mikroresekcji.Komórki wysiane na nieprzylegających pleśniach agarozowych osadzały się i tworzyły sferoidy tkankowe po około 24 godzinach. Metodologia ta z powodzeniem wykazała produkcję sferoidów na dużą skalę poprzez utrzymanie ich kształtu, rozmiaru i żywotności, a także wspierała hodowlę steroidów przez wiele miesięcy. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać, gdy myślę o tej procedurze, jest ostrożne włożenie urządzenia, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza i delikatne dodanie pożywki hodowlanej, aby uniknąć naruszenia komórek.Po tej procedurze można przeprowadzić testy leków i analizę ekspresji genów. Odpowiedzi na pytania dotyczące skuteczności leków, cząbru i odpowiedzi genetycznej na leczenie. Technika ta umożliwi nowe badania w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej, umożliwiając produkcję sferoidów na dużą skalę, która ma kluczowe znaczenie dla biodruku 3D, a także poprawi jakość i ilość komórek do testów toksyczności farmaceutycznej i kosmetycznej.

generation-of-tissue-spheroids-via-a-3d-printed-stamp-like-device

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy prostą i szybką metodę generowania trójwymiarowych sferoid tkankopodobnych oraz ich potencjalne zastosowanie w ilościowym określaniu różnic w oddziaływaniach międzykomórkowych.

Prosty protokół hodowli komórkowej metodą wiszącej kropli do generowania sferoidów 3D

Sferoidy to rodzaj modelu 3D hodowli komórkowej używany do dokładniejszego reprezentowania środowiska komórki w porównaniu do jednowarstwowych modeli hodowli komórkowych 2D. W przykładowym protokole zobaczymy, jak naukowcy generują sferoidy z linii komórkowej raka jelita grubego i stosują obrazowanie żywych komórek do śledzenia wzrostu sferoid.

Generowanie sferoidów z linii komórkowych: trójwymiarowa (3D) metoda hodowli komórek

Ten film pokazuje transformację ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w sferyczne organoidy mózgu. Stosując specyficzne inhibitory, hPSC są kierowane do różnicowania się w kierunku linii neuronalnej, tworząc kolonie neuroektodermalne. Następnie wprowadzane są specjalne czynniki wzrostu, które sprzyjają samoorganizacji i proliferacji kolonii, co ostatecznie prowadzi do powstania sferycznych organoidów mózgowych.

Generowanie sferoid z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje biodrukowanie 3D tkanki serca bez użycia biomaterials. 3D biodrukowane plastry serca wykazują mechaniczną integrację sferoid składowych i są bardzo obiecujące w regeneracji tkanki serca oraz jako modele 3D chorób serca.

Tworzenie tkanki serca wykazującej mechaniczną integrację sferoid za pomocą biodruku 3D

Prezentujemy napędzane silnikiem odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe, które może hodować sferoidy komórek. Za pomocą tego urządzenia sferoidy jednego lub wielu typów komórek mogą być łatwo hodowane w warunkach wysokiej grawitacji.

Platforma lab-on-a-CD do generowania wielokomórkowych trójwymiarowych sferoid

Protokół opisuje wysokoprzepustowe generowanie sferoidów do biodruku przy użyciu wieloparametrycznej analizy ich natlenienia i śmierci komórki pod standardowym mikroskopem fluorescencyjnym. Podejście to można zastosować do kontrolowania żywotności sferoid i przeprowadzania standaryzacji, co jest ważne w modelowaniu tkanki 3D, mikrośrodowiska guza i udanej biofabrykacji (mikro)tkanek.

Przystępna cenowo biofabrykacja sferoid wielokomórkowych wspomagana mikroskopią tlenową

Tutaj opisujemy produkcję na dużą skalę sferoidów zrębu/komórek macierzystych (ASC) pochodzących z tkanki tłuszczowej przy użyciu automatycznego systemu pipetowania do zasiewania zawiesiny komórkowej, zapewniając w ten sposób jednorodność wielkości i kształtu sferoidy. Te sferoidy ASC mogą być używane jako elementy budulcowe dla podejść do biodruku 3D.

Wielkoskalowa, zautomatyzowana produkcja sferoid komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej do biodruku 3D

Ten artykuł demonstruje ustandaryzowaną metodę konstruowania trójwymiarowych sferoid nowotworowych. Opisano również strategię obserwacji sferoidy i analizy głębokiego uczenia opartego na obrazach przy użyciu zautomatyzowanego systemu obrazowania.

Generowanie sferoid 3D guza do badań oceny leków

To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Endopeptydaza prolinowo-prolinowa-1 (PPEP-1) jest wydzielaną metaloproazą i obiecującym celem leku od ludzkiego patogenu Clostridium difficile. Poniżej opisujemy wszystkie metody niezbędne do produkcji i określenia struktury tego białka.

Produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury C. difficile PPEP-1 metodą mikrosiewu i-SAD

Poznaj metodę generowania sferoid tkankowych za pomocą urządzenia drukowanego w 3D. Technika ta zapewnia wysoką żywotność komórek i jednorodną jakość sferoidów, co jest kluczowe dla inżynierii tkankowej i rozwoju leków.

Generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel

Przeglądaj więcej filmów