Name: Dostarczanie rybonukleoprotein Cas9 i mRNA za pośrednictwem elektroporacji do świeżo izolowanych pierwotnych hepatocytów myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj metodę edycji genów CRISPR-Cas9 w pierwotnych hepatocytach myszy za pomocą elektroporacji. Technika ta umożliwia tworzenie modeli chorób metabolicznych wątroby z wysoką skutecznością i żywotnością komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

RNC otrzymało finansowanie z pilotażowego grantu Centrum Bioinżynierii Południowej Karoliny wspieranego przez National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) of the National Institutes of Health, American Association for the Study of Liver Diseases Foundation oraz American Society of Gene & Cell Therapy pod numerami grantów P30 GM131959, 2021000920, i 2022000099. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy Amerykańskiego Towarzystwa Terapii Genowej i Komórkowej (American Society of Gene & Cell Therapy) lub Fundacji Amerykańskiego Towarzystwa Badań nad Chorobami Wątroby. Schemat do rysunku 1 został utworzony za pomocą BioRender.com.

<ol><li>Pampols, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+metabolic+rare+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Inherited metabolic rare disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).</li>
<li>Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+approach+to+treatable+inborn+metabolic+diseases%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).</li>
<li>Arnon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+transplantation+in+children+with+metabolic+diseases%3A+the+studies+of+pediatric+liver+transplantation+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience.</a> Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).</li>
<li>Maiorana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preemptive+liver+transplantation+in+a+child+with+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia.</a> Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).</li>
<li>OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx">https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx</a> (2019).</li>
<li>Fabris, L., Strazzabosco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+and+undiagnosed+liver+diseases%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities.</a> Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).</li>
<li>Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+translational+models+for+rare+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).</li>
<li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+lethality+and+vascular+defects+in+mice+lacking+the+notch+ligand+Jagged1%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1.</a> Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).</li>
<li>Lima, A., Maddalo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEMMs%3A+Somatically+engineered+mouse+models.+a+new+tool+for+in+vivo+disease+modeling+for+basic+and+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research.</a> Frontiers in Oncology. 11, 1117(2021).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seamless+modification+of+wild-type+induced+pluripotent+stem+cells+to+the+natural+CCR5Delta32+mutation+confers+resistance+to+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).</li>
<li>Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+knock-down+in+post-mitotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons.</a> PLoS One. 9 (8), 105584(2014).</li>
<li>Hoban, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+correction+of+the+sickle+mutation+in+human+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells.</a> Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).</li>
<li>Rathbone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-mediated+delivery+of+Cas9+ribonucleoproteins+results+in+high+levels+of+gene+editing+in+primary+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes.</a> The CRISPR Journal. , (2022).</li>
<li>Benchling [Biology Software]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://benchling.com">https://benchling.com</a> (2022).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+functional+hepatocyte-like+cells+from+mouse+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors.</a> Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).</li>
<li>Severgnini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+two-step+method+for+isolation+of+functional+primary+mouse+hepatocytes%3A+cell+characterization+and+asialoglycoprotein+receptor+based+assay+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development.</a> Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).</li>
<li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+analysis+of+hepatocytes+from+mice+with+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100222(2020).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+%283D%29+printing+of+mouse+primary+hepatocytes+to+generate+3D+hepatic+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgical+Treatment+and+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure.</a> Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).</li>
<li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li>
<li>Lattanzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CRISPR%2FCas9+delivery+to+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+for+therapeutic+genomic+rearrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements.</a> Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).</li>
<li>Dever, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+beta-globin+gene+targeting+in+human+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells.</a> Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).</li>
<li>Grompe, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGrompe%2C+M+%22Hereditary+Tyrosinemia%3A+Pathogenesis%2C+Screening+and+Management%22">Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management</a>. Tanguay, R. M. , Springer International Publishing. 215-230 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Kroki opisane w protokole izolacji hepatocytów są trudne i wymagają praktyki, aby osiągnąć biegłość. Istnieje kilka kluczowych etapów udanej izolacji hepatocytów z wątroby. Po pierwsze, prawidłowa kaniulacja żyły głównej dolnej jest niezbędna do całkowitej perfuzji wątroby. Brak blanszowania w wątrobie po perfuzji wskazuje na przemieszczenie cewnika (Tabela 1). Żyła główna dolna (perfuzja wsteczna) została kaniulowana w procedurze, ponieważ jest prostsza i bardziej dostępna niż żyła wrotna (perfuzja wste...

IMD wątroby to zaburzenia genetyczne charakteryzujące się niedoborem kluczowego enzymu wątrobowego biorącego udział w metabolizmie, co prowadzi do akumulacji toksycznych metabolitów. Bez leczenia IMD wątroby prowadzą do niewydolności narządowej lub przedwczesnej śmierci1,2. Jedyną opcją leczenia dla pacjentów z IMD wątroby jest ortotopowe przeszczepienie wątroby, które jest ograniczone ze względu na niską dostępność narządów dawcy i powikłania związane z leczeniem immunosupresyjnym po zabiegu3,4. Zgodnie z ostatnimi danymi zebranymi przez Sieć Pozyskiwania i Transplantacji Narządów, tylko 40%-46% dorosłych pacjentów znajdujących się na liście oczekujących na przeszczep wątroby otrzymuje narząd, podczas gdy 12,3% tych pacjentów umiera będąc na liście oczekujących5. Co więcej, tylko 5% wszystkich rzadkich chorób wątroby ma zatwierdzone przez FDA leczenie6. Oczywiste jest, że istnieje pilna potrzeba opracowania nowatorskich metod leczenia IMD wątroby. Potrzebne są jednak odpowiednie modele chorób do opracowania nowych opcji terapeutycznych.
Modelowanie chorób człowieka za pomocą systemów in vitro i in vivo pozostaje przeszkodą w opracowywaniu skutecznych terapii i badaniu patologii IMD wątroby. Hepatocyty od pacjentów z rzadkimi chorobami wątroby są trudne do uzyskania7. Modele zwierzęce mają kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia patologii choroby i testowania strategii terapeutycznych. Jednak jedną z przeszkód jest generowanie modeli z embrionów niosących śmiertelne mutacje. Na przykład próby stworzenia mysich modeli zespołu Alagille'a (ALGS) z zarodkami zawierającymi homozygotyczne delecje sekwencji 5 kb w pobliżu końca 5′ genu Jag1 doprowadziły do wczesnej śmierci zarodków8. Ponadto generowanie modeli myszy poprzez edycję genów w embrionalnych komórkach macierzystych może być czasochłonne i zasobożerne9. Wreszcie, mutacje pojawią się poza tkanką docelową, prowadząc do zmiennych zakłócających, które mogą utrudnić badanie choroby9. Edycja genów somatycznych pozwoliłaby na łatwiejszą edycję w tkance wątroby i ominęłaby wyzwania związane z generowaniem modeli z wykorzystaniem embrionalnych komórek macierzystych.
Elektroporacja umożliwia dostarczanie CRISPR-Cas9 bezpośrednio do jądra poprzez zastosowanie prądów o wysokim napięciu do przenikania przez błonę komórkową i jest kompatybilna z wieloma typami komórek, w tym z tymi, które są nieprzejednane wobec technik transfekcji, takich jak ludzkie embrionalne komórki macierzyste, pluripotencjalne komórki macierzyste i neurony10,11,12. Jednak niska żywotność jest potencjalną wadą elektroporacji; Optymalizacja procedury może zapewnić wysoki poziom dostarczania przy jednoczesnym ograniczeniu toksyczności13. Niedawne badanie wykazało wykonalność elektroportowania składników CRISPR-Cas9 do pierwotnych hepatocytów myszy i ludzi jako wysoce wydajnego podejścia14. Elektroporacja ex vivo w hepatocytach może zostać zastosowana do generowania nowych mysich modeli ludzkich IMD wątroby.
Ten protokół zawiera szczegółową procedurę krok po kroku do izolowania mysich hepatocytów z wątroby, a następnie elektroportowania CRISPR-Cas9 jako kompleksów RNP, składających się z białka Cas9 i syntetycznego jednoprowadnicowego RNA (sgRNA), lub mRNA Cas9 połączonego z sgRNA w celu uzyskania wysokiego poziomu edycji genów na miejscu. Ponadto protokół zapewnia metody ilościowego określania wydajności, żywotności i funkcjonalności edycji genów po elektroporacji CRISPR-Cas9 do świeżo wyizolowanych hepatocytów myszy.

<table><tbody><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 mL 8-tubowy pasek FLEX-FREE do PCR, dołączone przezroczyste płaskie nakrętki, naturalne</td><td>USA Scientific</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki kolagenowe</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5073</td><td></td></tr><tr><td>accuSpin Micro 17R</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>Wielofunkcyjny mikroskop fluorescencyjny</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>Analogowy mieszalnik wirowy</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>ART Końcówki z filtrem o szerokim otworze 1,000 &mikro; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>TC20</td><td></td></tr><tr><td>Niebieska taca do wywarstwiania</td><td>wosku Braintree Scientific Inc.</td><td>DTW1</td><td>9" x 6,5" x 1/2"+F21</td></tr><tr><td>Skrobak/podnośnik do komórek</td><td>Argos Technologies</td><td>UX-04396-53</td><td>Niepirogenne, sterylne</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe (15 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe (50 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory bawełniane</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-170</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki</td><td>Cooper Surgical</td><td>62131</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe szalki Petriego</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>100mm, sterylne</td></tr><tr><td>jednorazowe szalki Petriego</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td>35mm, sterylny</td></tr><tr><td>spektrofotometr mikropłytkowy Epoch</td><td>Instrumenty BioTek</td><td>250082</td><td></td></tr><tr><td>Filtr siatkowy Falcon Cell (70 &micro; m)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Cooper Surgical</td><td>61864</td><td>Euro-Med Adson Kleszcze do tkanek</td></tr><tr><td>Cewniki IV&nbsp;</td>Zestaw do infuzji <td>dożylnej BD</td><td>382612</td><td>24 G x 0,75 cala</td></tr><tr><td></td><td>Baxter</td><td>2C6401</td><td></td></tr><tr><td>MyFuge 12 Mini wirówka</td><td>Benchmark Scientific</td><td>1220P38</td><td></td></tr><tr><td>Igły</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-20</td><td>25 G</td></tr><tr><td>Nucleofector 2b Urządzenie</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>Program T-028 został użyty do elektroporacji w hepatocytach myszy</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Masterflex</td><td>&nbsp; HV-77120-42</td><td>Od 10 do 60 obr./min; 90 do 260 VAC</td></tr><tr><td>Rurki pompy precyzyjnej</td><td>Masterflex</td><td>HV-96410-14</td><td>25 ft, silikonowe</td></tr><tr><td>Płytki hodowlane Primaria</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353846</td><td>Płytki do hodowli tkankowych zawierające azot</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne (25 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-567-604</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki</td><td>BD</td><td>329464</td><td>1 mL, sterylne</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>ALT</td><td>27577</td><td>Thermo Scientific Precyzyjny mikroprocesor sterowany serią 280, 2,5 l</td></tr><tr><td><mocne>odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9959336</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap Cas9 mRNA</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>L-7606-100</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap&nbsp; EGFP mRNA</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>L-7201-100</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matrix</td><td>Corning Life Sciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885076</td><td>Niski poziom glukozy, pirogronian</td></tr><tr><td>Etanol 70%</td> <td>VWR</td><td>71001-652</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Thermoscientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Utrzymanie hepatocytów Medium (MM)</td><td>Lonza</td><td>MM250</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do powlekania hepatocytów (PM)</td><td>Lonza</td><td>MP100</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ELISA do albuminy myszy</td><td>Fisher Scientific NC0010653</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw nukleofektorów hepatocytów myszy/szczura Lonza</td><td></td><td>VPL-1004</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA OneTaq HotStart</td><td>New England Biolabs</td><td>M0481L</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x pH 7,4&nbsp;</td><td>Thermoscientific</td><td>70011-044</td><td>Bez chlorku wapnia lub magnezu</td></tr><tr><td>Percoll (roztwór PVP)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-500790A</td><td></td></tr><tr><td>Kwas okresowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7875-25G</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe Permount</td><td>VWR</td><td>100496-550</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do ekstrakcji DNA QuickExtract</td><td>Lucigen Corporation</td><td>QE05090</td><td></td></tr><tr><td>Schiff' s odczynnik siarczynowo-fuksynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5133</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td> Test żywotności komórek MTT <td>w czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>Vybrant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V13154</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór perfuzyjny 1 (pH 7,4, sterylizowany filtrem)&nbsp; </mocny></td><td></td><td></td><td>stabilny przy 4 stopniach; C przez 2 miesiące</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Fisher Scientific 14155063</td><td></td><td>Complete do 200 mL</td></tr><tr><td>EGTA (0,5 M)</td><td>Bioworld</td><td>40520008-1</td><td>200 &mikro; L</td></tr><tr><td>HEPES (pH 7,3, 1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ16924AE</td><td>2 mL&nbsp;</td></tr><tr><td><silny>Roztwór perfuzyjny 2 (pH 7,4, sterylizowany filtrem)&nbsp; </mocny></td><td></td><td></td><td>stabilny przy 4 stopniach; C przez 2 miesiące</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H20 (1,8 mM)</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td>360 &micro; L z 1 M zapasów&nbsp;</td></tr><tr><td>EBSS (bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-155-063</td><td>Kompletny do 200 ml</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ16924AE</td><td>2 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>MgSO4 i kropka środkowa; 7H20 (0,8 mM)</td><td>Sigma</td><td>30391-25G</td><td>160 &mikro; L z 1 M zapasu</td></tr><tr><td><mocny>Roztwór perfuzyjny 3&nbsp; </td><td></td><td></td><td>Przygotowany świeżo przed użyciem</td></tr><tr><td>Roztwór 2</td><td></td><td></td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td>0,094 jednostek Wunsch / ml</td></tr><tr><td>Koktajl znieczulający dla myszy&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acepromzine</td><td></td><td></td><td>0,25 mg/ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td></td><td></td><td>7,5 mg/ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td></td><td></td><td>1,5 mg/ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Software</td><td>URL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchling</td><td>https://www.benchling.com/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ImageJ</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>TIDE: Śledzenie indeli przez dekompozycję</td><td>https://tide.nki.nl/</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dostarczanie rybonukleoprotein cas9 i mrna za pośrednictwem elektroporacji do świeżo izolowanych pierwotnych hepatocytów myszy

Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes

Ten protokół opisuje szybką i skuteczną metodę izolacji pierwotnych hepatocytów myszy, a następnie za pośrednictwem elektroporacji dostarczania CRISPR-Cas9 w postaci rybonukleoprotein (RNP) i mRNA. Pierwotne hepatocyty myszy wyizolowano przy użyciu trzystopniowej metody perfuzji wstecznej, co dało wysoką wydajność do 50 × 106 komórek na wątrobę i żywotność komórek na poziomie >85%. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące posiewu, barwienia i hodowli hepatocytów. Wyniki wskazują, że elektroporacja zapewnia wysoką skuteczność transfekcji wynoszącą 89%, mierzoną procentem komórek dodatnich pod względem zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) i skromną żywotnością komórek wynoszącą >35% w hepatocytach myszy.
Aby zademonstrować użyteczność tego podejścia, CRISPR-Cas9 ukierunkowany na gen dioksygenazy hydroksyfenylopirogronianowej został elektroporowany do pierwotnych hepatocytów myszy jako dowód słuszności edycji genów w celu zakłócenia terapeutycznego genu związanego z dziedziczną chorobą metaboliczną (IMD) wątroby. W przypadku RNP zaobserwowano wyższą edycję on-target wynoszącą 78% w porównaniu z 47% wydajnością edycji z mRNA. Funkcjonalność hepatocytów oceniono in vitro przy użyciu testu albuminowego, który wykazał, że dostarczanie CRISPR-Cas9 w postaci RNP i mRNA skutkuje porównywalną żywotnością komórek w pierwotnych hepatocytach myszy. Obiecującym zastosowaniem tego protokołu jest generowanie mysich modeli chorób genetycznych człowieka wpływających na wątrobę.

Izolacja pierwotnych hepatocytów z wątroby do hodowli na płytkach 
Cały proces perfuzji wątroby i izolacji hepatocytów przedstawiono na Rysunku 1. W tym doświadczeniu wykorzystano myszy szczepu C57BL6/6J typu dzikiego w wieku 8-10 tygodni. Przewiduje się, że procedura pozwoli na uzyskanie 20-50 × 106 komórek na mysz, przy żywotności od 85% do 95%. Jeśli żywotność wynosi &lt;70%, należy przeprowadzić zabieg z użyciem Percoll w celu usunięcia martwych komórek. Św...

Ten protokół opisuje techniki izolowania pierwotnych mysich hepatocytów z wątroby i elektroportowania CRISPR-Cas9 jako rybonukleoprotein i mRNA w celu zakłócenia terapeutycznego genu docelowego związanego z dziedziczną chorobą metaboliczną wątroby. Opisane metody skutkują wysoką żywotnością i wysokim poziomem modyfikacji genów po elektroporacji.

Dostarczanie rybonukleoprotein Cas9 i mRNA za pośrednictwem elektroporacji do świeżo izolowanych pierwotnych hepatocytów myszy

This protocol describes a fast and effective method for isolating primary mouse hepatocytes followed by electroporation-mediated delivery of CRISPR-Cas9 ...

Główną zaletą naszej techniki jest to, że jest to łatwe, szybkie i powtarzalne podejście do edycji genów w pierwotnych hepatocytach myszy jako sposób na generowanie modeli chorób in vitro i in vivo. Korzystając z naszej techniki, możliwe jest strącenie docelowego genu w izolowanych hepatocytach, a następnie przeszczepienie ich z powrotem pacjentowi, aby zastąpić chore komórki hepatocytami z edytowanym genem Niedoświadczeni badacze mogą mieć problemy z kaniulacją i utrzymaniem cewnika stabilnie przez cały czas perfuzji. Użytkownikom zaleca się uważne przeczytanie i przećwiczenie procedury oraz metod rozwiązywania problemów przed rozpoczęciem.Na przykładzie perfuzji wątroby i izolacji hepatocytów zademonstrują Tina Parker, kierownik placówki klinicznej, oraz Ilayda Ates, asystentka naukowa. Procedura elektroporacji zostanie zademonstrowana przez Callie Stuart, asystentkę naukową z mojego laboratorium. Pod chirurgiczną płaszczyzną znieczulenia.Rozpocznij perfuzję wątroby, wykonując boczne nacięcie w kształcie litery U w skórze brzucha za pomocą nożyczek i rozszerz otwór po bokach. Kontynuuj otwieranie skóry do klatki piersiowej. Za pomocą nożyczek przeciąć otrzewną, aby odsłonić jamę brzuszną aż do klatki piersiowej.Uważając, aby nie naciąć żadnych narządów. Przesuń jelita na prawą stronę za pomocą grzbietu kleszczy lub powierzchni nożyczek. Zidentyfikuj żyłę wrotną i żyłę główną dolną.Uruchomić pompę, aby przepłukać wstępnie podgrzany roztwór perfuzyjny przez cewnik. Zatrzymaj pompę i wyjmij cewnik. Następnie włóż końcówkę igły połączonej z cewnikiem do żyły głównej dolnej pod kątem 10 do 20 stopni do żyły, wyjmij igłę z cewnika.Następnie delikatnie wepchnij cewnik do żyły ruchem równoległym do żyły. Podłącz rurkę do cewnika bez przesuwania cewnika głębiej do żyły. Uruchom pompę z natężeniem przepływu dwóch mililitrów na minutę.Zwróć uwagę, że wątroba natychmiast blednie jako znak, że perfuzja się powiodła. Przetnij żyłę wrotną za pomocą nożyczek. Stopniowo zwiększaj natężenie przepływu do pięciu mililitrów na minutę.Gdy roztwór perfuzyjny przepłynie trzy, uważnie monitoruj elastyczność wątroby. Aby ustalić, czy wątroba zmiękła, delikatnie naciśnij wątrobę bawełnianym wacikiem lub kleszkami i sprawdź, czy na wątrobie nie tworzą się wgłębienia. Uważaj, aby nie przelać perfuzji, aby uniknąć utraty żywotności komórek.Gdy wątroba zmięknie po przepłynięciu od 30 do 50 mililitrów roztworu perfuzyjnego trzech, zatrzymaj pompę, usuń cewnik i woreczek żółciowy. Uważaj, aby nie rozlać jego zawartości. Następnie ostrożnie wypreparuj wątrobę.Umieść wątrobę na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej lodowaty DME M z 10% pożywką FBS. Delikatnie zakręć szalką Petriego, aby usunąć ewentualne skrzepy krwi. Przenieś wątrobę na nową szalkę Petriego zawierającą lodowaty DME M i 10% pożywkę FBS.Aby uwolnić komórki z torebki wątrobowej, umieść szalkę Petriego na lodzie, a następnie za pomocą dwóch par sterylnych kleszczy delikatnie rozerwij kapsułkę wątrobową na wszystkich płatach. Delikatnie obracaj wątrobę w pożywce za pomocą podnośnika komórek, aby uwolnić hepatocyty. Kontynuuj ten ruch, aż wątroba stanie się bardzo mała, a zawiesina stanie się brązowa i nieprzezroczysta.Usunąć resztki tkanki wątroby z płytki i za pomocą 25-mililitrowej pipety serologicznej ustawionej na niską prędkość, ostrożnie przenieść zawiesinę komórek do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, wstępnie schłodzonej na lodzie i wyposażonej w sitko o średnicy 100 mikrometrów. Dodaj świeży, lodowaty DMEM i 10% pożywkę FBS na szalkę Petriego, aby wypłukać i zebrać pozostałe komórki z powierzchni. Następnie przenieś do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.Powtarzaj ten krok, aż wszystkie komórki zostaną zebrane. Aby umyć i oczyścić hepatocyty z komórek niemiąższowych, odwiruj komórki zebrane w 50-mililitrowej stożkowej probówce o temperaturze 50 RCF w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut przy niskim opóźnieniu lub bez żadnych przerw. Wyrzuć super-naton zawierający szczątki i komórki niemiąższowe.Następnie ponownie zawiesić granulat w pozostałym super-natonie, delikatnie obracając rurkę. Po ponownym zaparowaniu granulek dodać 30 mililitrów świeżego, lodowatego DMEM i 10% pożywki FBS. Rozpocznij przygotowanie podłoża CRISPR CAS 9, mediów, ogniw i przyrządu do elektroporacji, włączając przycisk zasilania na urządzeniu do elektroporacji.Następnie ustaw program elektroporacji, naciskając przycisk X, a następnie przycisk strzałki w dół, aż na ekranie pojawi się program T 0 28. Przygotowano dołki docelowe dla elektroporowanych hepatocytów, dodając 1,5 mililitra PM do sześciu dołków kolagenowych pokrytych jedną płytką. Inkubuj płytki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do użycia.W probówkach z dzieloną paską PCR należy przygotować kompleksy CAS 9 RMP i mRNA zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Przechowywać mieszaninę mRNA sg RNA na lodzie do czasu elektroporacji. Oddzielnie przygotuj probówkę zawierającą jeden mikrogram mRNA E, GFP, aby zweryfikować powodzenie elektroporacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.Odwirować reakcję elektroporacji w temperaturze 100 RCF przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń supernaton z osadu komórkowego i dodaj 100 mikrolitrów roztworu nucleoffekcji na reakcję wzdłuż boku ścianki probówki. Ponownie zawiesić hepatocyty w roztworze do elektroporacji, delikatnie kołysząc rurką ręką.Gdy hepatocyty zostaną równomiernie rozproszone w roztworze do elektroporacji, przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny hepatocytów do probówek paskowych zawierających dziewięć kompleksów CAS. Przenieść zawartość paska do naczynia do elektroporacji. Umieść naczynie nukleo-weterynaryjne w szczelinie w urządzeniu do elektroporacji.Elektropoturuj hepatocyty, naciskając przycisk X. Po elektroporacji poczekaj, aż na urządzeniu pojawi się ekran z napisem:W porządku. Ponownie naciśnij przycisk X i wyjmij naczynie.Inkubować naczynie poddane elektroporacji na lodzie przez 15 minut. Dodaj 500 mikrolitrów cząstek stałych uzbrojonych w prewację do naczynia do elektroporacji. Przenieś 300 mikrolitrów reakcji elektroporacji do każdego dołka docelowego na wstępnie podgrzanej płytce.Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj macierz błonową do lodowatej pożywki podtrzymującej hepatocyty i mieszaj, pipetując w górę iw dół 10 razy. Usunąć pożywkę z dołków przeznaczonych do analizy edycji genów 24 godziny po posianiu komórek.Powoli odpipetować nałożoną mieszaninę na wierzch komórek i umieścić płytkę z powrotem w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach od posiewu przenieść kondycjonowaną pożywkę z dołka przeznaczonego do oznaczania MTT i albuminy i przechowywać w probówce do mikrofuge do czasu przygotowania do przeprowadzenia testu albuminowego. Kontynuuj analizę docelowej aktywności CAS 9, ekstrahując genomowe DNA i ustawiając PCR zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym.W ciągu 3 do 12 godzin od posiewu hepatocyty przylgnęły do płytki, a morfologia komórek przybrała typowy wielokątny lub sześciokątny wygląd w ciągu 24 godzin Czystość izolowanych komórek zweryfikowano poprzez barwienie glikogenem przy użyciu odczynnika do przesunięcia kwasu okresowego po 24 godzinach od posiania. Cytoplazma barwionych hepatocytów wydawała się purpurowa. Hepatocyty zostały zobrazowane 24 godziny po elektroporacji i średnio 89,8% hepatocytów było GFP dodatnich.Trzy dni po elektroporacji CAS dziewięć indukowanych w locus HPD, gdzie analizowano, a wyniki wykazały na docelowych indelach 47,4% w hepatocytach elektropomulowanych CRISPR Cas dziewięć mRNA i 78,4% indeli dla CAS dziewięć RNP. Test MTT wykazał 35,4 i 45,9% żywotności w hepatocytach traktowanych CRISPR, Cas, dziewięcioma mRNA i R N, P. Zgodnie z wynikami MTT, znormalizowane poziomy albuminy wynosiły 31,8% w hepatocytach traktowanych CAS dziewięcioma RNA i 34,5% w CAS dziewięć rp. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać, jest to, że prawidłowa kaniulacja wpływa na wszystkie późniejsze etapy i powodzenie zabiegu.Po tej procedurze hepatocyty mogą zostać przeszczepione, a myszy w celu zbadania ich wszczepienia. Co więcej, genomowe DNA platerowanych hepatocytów można wyekstrahować w celu analizy wydajności i swoistości edycji CAS nine.

electroporation-mediated-delivery-cas9-ribonucleoproteins-mrna-into

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Artykuł szczegółowo opisuje protokół swoistej miejscowo transfekcji komórek ssaków w hodowli adherentnej za pomocą matrycy mikroelektrod (MEA) z wykorzystaniem siRNA o sekwencji scrambled.

Wysokoefektywna, specyficzna lokalnie transfekcja komórek adherentnych siRNA przy użyciu macierzy mikroelektrod (MEA)

Hydrodynamiczne wstrzykiwanie wektorów integracji opartych na transpozonach do żyły ogonowej umożliwia stabilną transfekcję mysich hepatocytów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy praktyczny protokół dla systemów transfekcji, który umożliwia długotrwałą konstytutywną ekspresję pojedynczego transgenu lub połączoną konstytutywną i indukowaną doksycykliną ekspresję transgenu lub miR-shRNA w wątrobie.

Konstytutywne i indukowalne systemy do genetycznej modyfikacji in vivo mysich hepatocytów za pomocą hydrodynamicznej iniekcji żyły ogonowej

Zgrupowany, regularnie rozmieszczony, krótki powtórzeń palindromicznych/system białka związanego z CRISPR 9 (CRISPR/Cas9) stanowi obiecujące narzędzie dla inżynierii genetycznej i otwiera możliwość celowej integracji transgenów. Opisujemy strategię opartą na łączeniu końców za pośrednictwem homologii (HMEJ) dla efektywnej ukierunkowanej integracji DNA in vivo i celowanych terapii genowych przy użyciu CRISPR/Cas9.

Ukierunkowana integracja in vivo za pośrednictwem CRISPR/Cas9 przy użyciu strategii opartej na łączeniu końcowym za pośrednictwem homologii

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Tutaj prezentujemy protokół izolacji zdrowych i funkcjonalnych pierwotnych hepatocytów myszy. Opracowano instrukcje dotyczące wykrywania powstającej syntezy białek wątrobowych za pomocą nieradioaktywnego substratu znakującego, aby pomóc w zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw syntezy białek w kontekście homeostazy metabolizmu energetycznego w wątrobie.

Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy do analizy powstającej syntezy białek metodą znakowania nieradioaktywnej L-azydohomoalaniny

Prezentowany jest tutaj protokół do efektywnej edycji genów za pośrednictwem rybonukleoproteiny CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków za pomocą elektroporacji rurkowej.

CRISPR/Cas9 Precyzyjna edycja genów za pośrednictwem rybonukleoprotein za pomocą elektroporacji rurkowej

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) umożliwia szybką i efektywną izolację mRNA translującego specyficznego dla typu komórki. Tutaj demonstrujemy metodę, która łączy hydrodynamiczne wstrzykiwanie żyły ogonowej w mysim modelu ponownego zasiedlania wątroby i TRAP w celu zbadania profilu ekspresji repopulujących hepatocytów.

Profilowanie ekspresji genów specyficzne dla typu komórki w wątrobie myszy

Prezentowany tutaj jest protokół elektroporacji pojedynczej komórki, który może dostarczyć geny zarówno w neuronach pobudzających, jak i hamujących w różnych epokach hodowli in vitro w warstwach hipokampa. Nasze podejście zapewnia precyzyjną i wydajną ekspresję genów w poszczególnych komórkach, które można wykorzystać do badania funkcji autonomicznych i międzykomórkowych.

Elektroporacja jednokomórkowa w różnych organotypowych kulturach warstwowych mysich neuronów pobudzających hipokampa i specyficznych dla klasy neuronów hamujących

Ten protokół opisuje procedurę edycji genomu w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy przy użyciu kompleksów rybonukleoprotein Cas9-sgRNA składanych in vitro i dostarczanych przez elektroporację.

Wysokowydajne rozrywanie genów w pierwotnych makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego przy użyciu elektroporowanych kompleksów Cas9-sgRNA

Biokompatybilne nanoczujniki zol-żel reagujące na pH mogą być wbudowane w elektrowirowane rusztowania z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA). Wyprodukowane rusztowania samoraportujące mogą być wykorzystywane do monitorowania warunków mikrośrodowiskowych in situ podczas hodowli komórek na rusztowaniu. Jest to korzystne, ponieważ konstrukt komórkowy 3D może być monitorowany w czasie rzeczywistym bez zakłócania eksperymentu.

Rusztowania samoraportujące do trójwymiarowej hodowli komórkowej

Poznaj metodę edycji genów CRISPR-Cas9 w pierwotnych hepatocytach myszy za pomocą elektroporacji. Technika ta umożliwia tworzenie modeli chorób metabolicznych wątroby z wysoką skutecznością i żywotnością komórek.

Dostarczanie rybonukleoprotein Cas9 i mRNA za pośrednictwem elektroporacji do świeżo izolowanych pierwotnych hepatocytów myszy

Przeglądaj więcej filmów