Hodowle neuronów hipokampa w celu wykrywania i badania nowych patogennych przeciwciał zaangażowanych w autoimmunologiczne zapalenie mózgu

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwolił nam określić, czy próbka pacjenta zawierała przeciwciała chorobotwórcze. Główną zaletą tej techniki jest jej zdolność do różnicowania reaktywności między antygenami powierzchniowymi i wewnątrzkomórkowymi, których nie można łatwo rozróżnić innymi metodami. Kulturowe neurony hipokampa są wykorzystywane do identyfikacji nowych przeciwciał.

Identyfikacja tych nowych przeciwciał ostatecznie pozwala na rozpoczęcie stosowania specyfiku w monoterapii w celu poprawy wyników leczenia pacjentów. Technika ta jest ważna, ponieważ można ją rozszerzyć na całą dziedzinę chorób związanych z patogennymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko białkom powierzchniowym neuronów. Trzymając głowę zarodka cienkimi zakrzywionymi kleszczami, przebij oczodoły parą cienkich prostych kleszczy pod kątem 45 stopni.

Następnie zwolnij cienkie zakrzywione kleszcze. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wypreparuj skórę i czaszkę, zaczynając od kości potylicznej do kości czołowej. Następnie usuń mózg za pomocą pary cienkich zakrzywionych kleszczy i zbierz go w sześciocentymetrowym naczyniu z hibernacją i witaminą B27.

Gdy mózgi ze wszystkich zarodków zostaną odzyskane, użyj cienkich prostych kleszczy, aby strzałkowo oddzielić kresomózgowie. Następnie przygotuj 10-centymetrową miskę, umieszczając krople hibernacji i witaminy B27 w odległości jednego centymetra w okręgu i umieść jedną kresomózgowienie na kroplę, aby uwidocznić przez lunetę sekcyjną w powiększeniu 1,25 razy. Podczas pracy pod mikroskopem ostrożnie usuń wzgórze i obierz opony mózgowe, aby lepiej uwidocznić hipokamp.

Następnie wypreparuj hipokamp precyzyjnymi nożyczkami sprężynowymi. I umieść go w 3,5-centymetrowym naczyniu z hibernacją plus B27 i istrate dwa. Powtórz procedurę, aby zebrać wszystkie hipokampy.

W celu enzymatycznej dysocjacji hipokampa dodaj jeden mililitr 2,5% trypsyny do 50-mililitrowej probówki zawierającej hipokampy. Po doprowadzeniu objętości w probówce do pięciu mililitrów za pomocą HBSS, inkubować probówkę przez 15 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby jeszcze bardziej rozcieńczyć trypsynę, dodaj 10 mililitrów podgrzanego HBSS i umieść probówkę z powrotem w łaźni wodnej ustawionej na 37 stopni Celsjusza na pięć minut.

Następnie użyj mikropipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby przenieść hipokamp wyglądający jako masa śluzowa do 50-mililitrowej probówki. I inkubować tkankę z sześcioma mililitrami podgrzanego HBSS przez pięć minut, jak pokazano. Aby mechanicznie zdysocjować tkankę, przenieś masę hipokampa do dwumililitrowej rurki ze stożkowym dnem.

Po dodaniu jednego mililitra podgrzanej pożywki DMEM, homogenizuj osad za pomocą mikropipety o pojemności 1000 mikrolitrów, delikatnie zasysając w górę iw dół. Uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków, powtórz zasysanie w górę iw dół od 10 do 20 razy za pomocą wstępnie wyciągniętej szklanej pipety, której końcówka styka się ze stożkowym dnem probówki, aż mieszanina stanie się przezroczysta. Policz komórki przed równomiernym rozprowadzeniem ich na 3,5-centymetrowej patelni skrzyżowanymi ruchami potrząsania.

Po zakończeniu umieść naczynie w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. W przypadku fluorescencyjnego barwienia immunologicznego 14 dni na komórkach in vitro, dodać próbkę zawierającą przeciwciała anty-NMDAR do szkiełek nakrywkowych i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po godzinie potraktuj próbkę 4% formaldehydem i PBS jako roztwór utrwalający w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie przemyć próbkę PBS przez pięć minut, a następnie dodać drugorzędowe przeciwciało kozie anty-ludzkie Alexa Fluor 488 w rozcieńczeniu od jednego do 1000 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie zamocować szkiełka nakrywkowe zawierające próbkę za pomocą płynnego medium montażowego i odessać pozostałą ciecz. Wizualizuj neurony za pomocą obrazowania fluorescencyjnego.

Do obrazowania wapnia należy użyć komórek in vitro wyhodowanych na szkiełkach nakrywkowych przez 14 do 18 dni. Przed obrazowaniem należy potraktować komórki wektorem wirusowym kodującym pAAV2 CAG GCaMP 5G w ilości 2,5 razy od 10 do 10 kopii genomu na mililitr przez pięć do siedmiu dni. Na dzień przed obrazowaniem inkubować komórki z próbką pacjenta przez 24 godziny.

W dniu obrazowania przygotuj zestaw i ustaw komorę mikroskopu na 37 stopni Celsjusza. Napełnij tor wodą destylowaną, napełnij go 5% dwutlenkiem węgla, aby utrzymać fizjologiczne warunki komórki. Po pokryciu komórek zewnątrzkomórkowym roztworem fizjologicznym przenieś je do komory komórkowej mikroskopu.

Dodaj 10 mikromolowych NBQX, aby zablokować receptory AMPA i KA i uwidocznić odpowiedź receptora NMDA. Utrwal film trwający cztery minuty z klatkami rejestrowanymi co 100 milisekund. Krótko po rozpoczęciu akwizycji dodaj do naczynia roztwór stymulacyjny.

Po stymulacji wyodrębnij sygnał fluorescencyjny w czasie z hodowli inkubowanej z kontrolą i próbkami płynu mózgowo-rdzeniowego pacjenta lub płynu mózgowo-rdzeniowego pacjenta za pomocą oprogramowania do przetwarzania, takiego jak Image J.It zaobserwowano, że komórki jednego dnia in vitro były równomiernie rozmieszczone i przylegały do płytki z blaszką rozwijającą się wokół ciała komórki i niewielkimi neurytami zaczynającymi się rozciągać. Po kilku dniach w hodowli neuryty wydłużyły się na niewielką odległość, a komórki wykazały znaczną polaryzację. Sieć neuronalna wciąż się rozrastała i stawała się złożona.

Po 18 dniach neurony były dojrzałe, połączone ze sobą i zbudowały sieć neuronalną. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne pokazują dojrzałe neurony po 18 dniach przy użyciu selektywnych markerów. Inkubacja kultur z próbkami pacjentów wytworzyła intensywny sygnał fluorescencyjny, ponieważ zawiera on autoprzeciwciała, które rozpoznały receptor NMDA obecny na powierzchni neuronów.

W przeciwieństwie do tego, próbki kontrolne nie wytwarzały sygnału fluorescencyjnego po podaniu do kultur neuronalnych. Zastosowanie NMDA zwiększyło intensywność fluorescencji, na co wskazuje zmiana wewnątrzkomórkowej zielonej fluorescencji. Po zastosowaniu stymulatora neurony potraktowane kontrolną próbką płynu mózgowo-rdzeniowego wykazywały większą różnicę w intensywności fluorescencji niż komórki leczone próbką płynu mózgowo-rdzeniowego pacjenta.

Identyfikacja właściwości i rozbiór hipokampa decydują o czystości kultur. Agregacja komórek jest kluczowym czynnikiem, zwłaszcza w przypadku wykorzystania kultur do celów obrazowania. Ponadto wyhodowane neurony hipokampa można wykorzystać do identyfikacji nowych przeciwciał i ich antygenów docelowych w połączeniu z technikami immunoprecypitacji i spektrometrii mas.

Technika ta pozwoliła na scharakteryzowanie nowej kategorii chorób wywoływanych przez przeciwciała. Dlatego jest niezbędny w badaniu nowej dziedziny nanoimmunologii.