Izolacja lizatów białkowych całych komórek z procesów twarzy myszy i hodowanych komórek mezenchymy podniebienia do analizy fosfoprotein

Protokół ten może być wykorzystany do uzyskania lepszego wglądu w dynamikę i rolę fosfoprotein aktywnych podczas rozwoju twarzoczaszki u ssaków. Protokół ten pokonuje powszechną barierę defosforylacji podczas izolacji białek z dwóch fizjologicznie istotnych kontekstów, procesów twarzy myszy i hodowanych mysich embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej. Konieczne jest szybkie poruszanie się, trzymając wszystkie odczynniki i materiały na lodzie oraz stosowanie inhibitorów fosfatazy we wszystkich do lizy, aby zachować integralność fosforylowanych białek.

Na początek połóż ciało myszy na desce preparacyjnej brzuszną stroną skierowaną do góry i spryskaj brzuch myszy 70% etanolem. Następnie otwórz jamę brzuszną, ściskając i unosząc skórę przed otworem pochwy za pomocą prostych kleszczy Semken. Następnie przetnij uniesioną skórę w warstwach leżących pod spodem za pomocą nożyczek chirurgicznych z prostym ostrzem pod kątem 45 stopni po obu stronach, aby uzyskać kształt litery V, który rozciąga się na każdą powierzchnię boczną mniej więcej w połowie odległości między czterema kończynami a kończynami tylnymi.

Za pomocą kleszczyków Semken chwyć jeden z rogów macicy i przetnij nożyczkami chirurgicznymi poniżej jajowodu i powyżej szyjki macicy. Aby umożliwić całkowite usunięcie rogu macicy, odetnij mezometrium, a następnie przenieś wypreparowany róg macicy do 10 mililitrów histologicznego PBS na 10-centymetrowej szalce Petriego. Podobnie usuń drugi róg macicy po przeciwnej stronie jamy brzusznej.

Następnie umieść na lodzie 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą oba rogi macicy. Pod mikroskopem stereoskopowym dokładnie wypreparuj każdy zarodek z rogów macicy za pomocą cienkich kleszczy Dumont 5. Następnie powoli odciągnij mięśniówkę macicy, decidua i kosmówkę.

Następnie należy rozerwać i usunąć stosunkowo przezroczystą owodnię otaczającą zarodek i przeciąć pępowinę łączącą zarodek z łożyskiem. Następnie przenieś każdy wypreparowany zarodek do 2,5 mililitra PBS histologicznego w indywidualnym dołku 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej na lodzie za pomocą wyciętej plastikowej pipety transferowej. Przygotuj trzy 10-centymetrowe szalki Petriego zawierające 10 mililitrów PBS histologicznego i trzymaj je na lodzie, aby można je było stosować na przemian między zarodkami.

Następnie przenieść jeden zarodek z pojedynczego dołka 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej na jedną z 10-centymetrowych szalek Petriego z histologią PBS na lodzie za pomocą przeciętej plastikowej pipety do przenoszenia. Pod mikroskopem preparacyjnym oddziel każdy wyrostek szczękowy od twarzy za pomocą cienkich kleszczy, wykonując najpierw nacięcie po przedniej stronie jednego wyrostka szczękowego wzdłuż naturalnego wgłębienia oddzielającego boczny wyrostek nosowy w wyrostku szczękowym. Następnie przetnij tylną stronę wyrostka szczękowego wzdłuż naturalnego wgłębienia oddzielającego wyrostek szczękowy i wyrostek żuchwowy.

Następnie całkowicie oddziel wyrostek szczękowy, wykonując pionowe cięcie od przedniej do tylnej strony wyrostka szczękowego po stronie oka wyrostka szczękowego, gdzie kończą się naturalne wgłębienia, o których mowa powyżej. Używając dziewięciocalowej pipety Pasteura z dwumililitrową małą bańką lateksową, przenieś wypreparowaną parę wyrostków szczękowych w małej kropelce około 30 mikrolitrów histologicznego PBS na oznakowaną 35-milimetrową szalkę Petriego na lodzie. Następnie przenieś parę tkanek wyrostka szczękowego do znakowanej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej na lodzie za pomocą pipety Pasteura, minimalizując przenoszenie histologicznego PBS.

Ponadto usuń nadmiar histologicznego PBS z 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej za pomocą pipety Pasteura. Dodaj 0,1 mililitra lodowatego buforu do lizy NP40 z inhibitorami proteazy i fosfatazy dodanymi bezpośrednio przed użyciem na lodzie. Następnie pipetuj w górę i w dół 10 razy za pomocą PIPETMANA o pojemności 200 mikrolitrów.

Następnie wiruj przez 10 sekund, a następnie pipetuj w górę i w dół 10 razy za pomocą PIPETMANA o pojemności 200 mikrolitrów, unikając przy tym powstawania pęcherzyków. Inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny, obracając się od końca do końca za pomocą 1,5 mililitra lub dwumililitrowej łopatki z rewolwerem rurowym. Następnie odwirować próbki o masie 13 500 x g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej na lodzie za pomocą 200-mililitrowego PIPETMANA.

Najpierw odessaj pożywkę z embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej myszy za pomocą 5,75-calowej pipety Pasteura podłączonej do systemu próżniowego. Następnie dwukrotnie przemyj komórki lodowatą hodowlą tkankową PBS i przechyl płytkę na bok podczas ostatniego płukania, aby upewnić się, że cała hodowla tkankowa PBS została zasysana. Następnie dodaj lodowaty bufor do lizy NP40 z inhibitorami proteazy i fosfatazy dodanymi bezpośrednio przed użyciem na lodzie w celu lizy komórek.

Inkubować płytkę na lodzie przez pięć minut, obracając ją mniej więcej co minutę, aby zapewnić całkowite pokrycie płytki. Następnie zeskrob komórki z płytki za pomocą wstępnie schłodzonego podnośnika do komórek i przenieś zawiesinę komórek do wstępnie schłodzonej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej na lodzie. Następnie inkubuj zawiesinę komórek w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut, obracając się od końca do końca za pomocą łopatki o pojemności 1,5 mililitra lub dwóch mililitrów z rewolwerem rurowym.

Następnie odwirować próbki o masie 13 500 x g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej na lodzie za pomocą 200-mililitrowego PIPETMANA. Analiza Western blot lizatów całych komórek z unieśmiertelnionych embrionalnych komórek mezenchymy mysi po stymulacji ligandem PDFG-B od 2 do 15 minut ujawniła wyraźne odtwarzalne prążki dla fosfoprotein, które biegną na wysokości lub w pobliżu wysokości odpowiedniego całkowitego pasma białkowego. Po podaniu czynnika wzrostu zaobserwowano wzrost intensywności pasm fosfoproteinowych w porównaniu z komórkami nieleczonymi, podczas gdy całkowita intensywność pasma białkowego była stosunkowo równa między próbkami.

Protokół ten może być wykorzystany do zbadania, w jaki sposób zaburzenia i fosforylacja bezpośrednio wpływają na sygnalizację międzykomórkową, ekspresję genów i aktywność komórkową w kontekstach twarzoczaszki.