Name: Izolacja lizatów białkowych całych komórek z procesów twarzy myszy i hodowanych komórek mezenchymy podniebienia do analizy fosfoprotein (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj metodę izolacji lizatów białkowych z procesów twarzy myszy i komórek mezenchymy podniebienia do analizy fosfoprotein. Protokół zachowuje fosforylację białek dzięki inhibitorom fosfataz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

129S4 myszy były prezentem od dr Philippe'a Soriano, Icahn School of Medicine w Mount Sinai. Prace te były wspierane przez fundusze z National Institutes of Health (NIH)/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 i K02 DE028572 do K.A.F., F31 DE029976 do M.A.R. i F31 DE029364 do B.J.C.D.

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Kampusu Medycznego Anschutz Uniwersytetu Kolorado i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami instytucjonalnymi. Samice myszy 129S4 w wieku 1,5-6 miesięcy i trzymane w temperaturze sub-termoneutralnej 21-23 °C wykorzystano do pobierania zarodków. Schematyczny przebieg pracy protokołu jest przedstawiony w Rysunek 1. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, sprzętu, oprogramowania, odczynników i zwierząt użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.
1. Pobieranie embrionów myszy E11.5
<ol>
	<li>Eutanazja ciężarnej samicy myszy 11,5 dnia po wykryciu czopa pochwowego podczas krycia w czasie krycia w komorze CO2 przy użyciu zatwierdzonego przez IACUC natężenia przepływu CO2 wymaganego dla około 50% przemieszczenia (2,95 l / min w komorze 360 cali 3 komory) i czasu ekspozycji (patrz tabela materiałów). Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy jako wtórną metodę eutanazji. Natychmiast przystąp do sekcji.</li>
	<li>Połóż ciało myszy na desce sekcyjnej brzuszną stroną skierowaną do góry. Spryskaj brzuch myszy 70% etanolem.</li>
	<li>Otwórz jamę brzuszną, ściskając i unosząc skórę przed otworem pochwy za pomocą prostych kleszczy Semken i przecinając uniesioną skórę i leżące pod nią warstwy nożyczkami chirurgicznymi z prostym ostrzem pod kątem 45° po obu stronach, aby uzyskać kształt litery "V", który rozciąga się na każdą powierzchnię boczną mniej więcej w połowie odległości między kończynami przednimi i tylnymi.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy Semken chwyć jeden z rogów macicy i przetnij nożyczkami chirurgicznymi poniżej jajowodu i powyżej szyjki macicy. Odetnij mezometrium, aby umożliwić całkowite usunięcie rogu macicy.</li>
	<li>Przenieś wypreparowany róg macicy do 10 ml histologicznego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) [0,137 M NaCl, 2,68 mM KCl, 1,76 mM KH2PO4 monozasadowy, 10,14 mM Na2HPO4 dwuzasadowy, pH 7,4] na 10 cm szalce Petriego.</li>
	<li>Usuń drugi róg macicy po przeciwnej stronie jamy brzusznej, stosując tę samą procedurę opisaną w krokach 1.4-1.5.</li>
	<li>Umieścić 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą oba rogi macicy na lodzie, jeśli nie przystąpi się natychmiast do sekcji poszczególnych zarodków (tj. jeśli zostanie poddana sekcji drugiej samicy myszy).</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym ostrożnie wypreparuj każdy zarodek z rogów macicy za pomocą cienkich kleszczy Dumont #5. Powoli odciągnij mięśniówkę macicy, decidua i kosmówkę. Rozerwij i usuń stosunkowo przezroczystą owodnię otaczającą zarodek i przeciąć pępowinę łączącą zarodek z łożyskiem.</li>
	<li>Przenieść każdy wypreparowany zarodek do 2,5 ml PBS histologicznego w indywidualnym dołku 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej na lodzie za pomocą wyciętej plastikowej pipety transferowej lub łyżki do zarodków. 
	UWAGA: W przypadku pracy z miotem, który może zawierać zarodki o więcej niż jednym genotypie, zachowaj owodnię otaczającą każdy zarodek do genotypowania, umieszczając każdy z nich we własnej, wstępnie oznakowanej probówce do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml na lodzie.</li>
</ol>
2. Analiza wyrostków szczękowych z zarodków myszy E11.5
<ol>
	<li>Przygotować trzy 10-centymetrowe szalki Petriego zawierające 10 ml histologicznego PBS i przechowywać je na lodzie do stosowania na przemian między zarodkami.</li>
	<li>Przenieść jeden zarodek z pojedynczego dołka 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej na jedną z 10-centymetrowych szalek Petriego za pomocą histologicznej PBS na lodzie za pomocą wyciętej plastikowej pipety transferowej lub łyżki do zarodków.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym oddziel każdy wyrostek szczękowy od twarzy za pomocą cienkich kleszczy. Najpierw przetnij przednią stronę jednego wyrostka szczękowego wzdłuż naturalnego wgłębienia oddzielającego boczny wyrostek nosowy i wyrostek szczękowy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Po drugie, przeciąć tylną stronę wyrostka szczękowego wzdłuż naturalnego wgłębienia oddzielającego wyrostek szczękowy i wyrostek żuchwowy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Po trzecie, aby całkowicie oddzielić wyrostek szczękowy, wykonaj pionowe cięcie od przedniej do tylnej strony wyrostka szczękowego po stronie oka wyrostka szczękowego, gdzie kończą się naturalne wgłębienia, o których mowa powyżej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A-C).</li>
	<li>Powtórz te trzy cięcia dla wyrostka szczękowego po przeciwnej stronie twarzy.</li>
	<li>Używając 9-calowej pipety Pasteura z małą bańką lateksową o pojemności 2 ml, przenieś wypreparowaną parę wyrostków szczękowych i małą kropelkę około 30 μl histologicznego PBS na znakowaną szalkę Petriego o średnicy 35 mm na lodzie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Wykonaj kroki 2.3-2.7 dla każdego zarodka, obracając trzy 10-centymetrowe szalki Petriego zawierające histologiczną PBS na lodzie między zarodkami. Umieść pojedyncze pary wypreparowanych wyrostków szczękowych na oddzielnych szalkach Petriego o średnicy 35 mm na lodzie. 
	UWAGA: Rozdzielenie ektodermy wyrostka szczękowego i mezenchymy (kroki 2.9-2.17) można przeprowadzić po wypreparowaniu wyrostków szczękowych wszystkich zarodków w miocie. Jeśli pożądane są nienaruszone wyrostki szczękowe zawierające zarówno ektodermę, jak i mezenchymę, przejdź do kroku 2.18 poniżej.</li>
	<li>Przygotować 250 μl świeżej 2% trypsyny w kulturze tkankowej PBS i 250 μl 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w kulturze tkankowej PBS i przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Umieścić drugą, małą kropelkę około 30 μl 2% trypsyny na szalce Petriego o średnicy 35 mm, oddzielnie od pierwszej, małej kropli histologicznego PBS zawierającej wyrostki szczękowe. Przenieś parę wyrostków szczękowych do małej kropelki 2% trypsyny za pomocą pipety Pasteura (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D).</li>
	<li>Inkubuj naczynie na lodzie przez 15 minut.</li>
	<li>Wyjąć szalkę Petriego o średnicy 35 mm z lodu i umieścić pod mikroskopem preparacyjnym</li>.
	<li>Za pomocą cienkich kleszczyków powoli i ostrożnie zdejmij warstwę ektodermy z każdego wyrostka szczękowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E). 
	UWAGA: Jeśli ektoderma nie oddziela się od mezenchymy w nienaruszonym arkuszu, inkubuj w 2% trypsyny w temperaturze pokojowej (RT) przez maksymalnie 5 dodatkowych minut przed kontynuowaniem separacji. Jeśli tkanka zacznie się rozpadać w 2% trypszynie, przenieś wyrostki szczękowe do 10% FBS, jak opisano poniżej, aby zneutralizować trypsynę i zakończyć oddzielanie ektodermy i mezenchymy.</li>
	<li>Po oddzieleniu ektodermy wyrostka szczękowego i mezenchymimy (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 2F), przenieś pożądane tkanki z pary wyrostków szczękowych do trzeciej, małej kropelki o objętości około 30 μl 10% FBS - oddzielonej od dwóch poprzednich małych kropelek - za pomocą pipety Pasteura (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2D).</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego o średnicy 35 mm na lodzie, aby zatrzymać trypsynizację.</li>
	<li>Inkubować tkanki wyrostka szczękowego na lodzie w 10% FBS przez 1-2 minuty, a następnie przenieść tkanki z obu wyrostków szczękowych do czwartej, małej kropelki około 30 μl wstępnie schłodzonego PBS histologicznego na lodzie - oddzielnie od trzech poprzednich małych kropelek - za pomocą pipety Pasteura (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Inkubować tkanki wyrostka szczękowego w histologii PBS przez 1 minutę, delikatnie obracając histologiczną PBS wokół tkanek wyrostka szczękowego końcówką pipety Pasteura, aby upewnić się, że cały FBS został wypłukany z tkanki.</li>
	<li>Przenieść parę tkanek wyrostka czasowego szczęki do znakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie za pomocą pipety Pasteura, minimalizując przenoszenie histologicznego PBS. Usunąć nadmiar histologicznego PBS z probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety Pasteura.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z powyższymi krokami, aby wypreparować wyrostki szczękowe z każdego zarodka w miocie.</li>
	<li>Próbki należy natychmiast przetworzyć w celu wyizolowania lizatów białkowych całych komórek (poniżej) lub przechowywać je przez długi czas w temperaturze -80 °C. Przed długotrwałym przechowywaniem należy zamrozić probówkę mikrowirówki o pojemności 1,5 ml w kąpieli 100% EtOH na suchym lodzie przez 5 minut.</li>
</ol>
3. Izolowanie lizatów białkowych całych komórek z procesów szczękowych myszy
<ol>
	<li>Jeśli wyrostki szczękowe zostały wcześniej zamrożone w temperaturze -80 °C, rozmrozić je na lodzie.</li>
	<li>Dodać 0,1 ml lodowatego buforu do lizy NP-40 (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10% glicerolu, 1% nonidetu P-40, 2 mM EDTA; przechowywane w temperaturze 4 °C) z inhibitorami proteazy i fosfatazy (1x kompletny koktajl inhibitorów mini proteazy [rozpuszczony w wodzie; przechowywany w temperaturze -20 °C], 1 mM PMSF [rozpuszczony w izopropanolu; przechowywany w temperaturze 4 °C], 10 mM NaF [przechowywany w temperaturze -20 °C; unikać zamrażania/rozmrażania], 1 mM Na3VO4 [przechowywany w temperaturze -20 °C], 25 mM β-glicerofosforan [przechowywany w temperaturze 4 °C]) dodawany bezpośrednio przed użyciem na lodzie. 
	UWAGA: Frakcjonowanie komórek można alternatywnie przeprowadzić w celu wyizolowania cytoplazmatycznych, jądrowych, błonowych lub mitochondrialnych frakcji białkowych.</li>
	<li>Pipetować w górę i w dół 10 razy za pomocą pipetara o pojemności 200 μl.</li>
	<li>Wirować przez 10 s, a następnie pipetować w górę i w dół 10 razy za pomocą pipetara o pojemności 200 μl. Unikaj generowania bąbelków.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 godziny, obracając się od końca do końca, używając łopatki o pojemności 1,5 ml/2 ml z rewolwerem z rurką.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 13 500 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać supernatant do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie za pomocą pipetara o pojemności 200 ml.</li>
	<li>Określić ilościowo stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek, używając 10 μl lizatu białkowego + 10 μl buforu do lizy NP-40 dla próbek doświadczalnych i 3-5 rozcieńczeń albuminy surowicy bydlęcej (frakcja V) (BSA) w buforze do lizy NP-40 w zakresie 0,25-2,0 mg/ml jako wzorce białka.</li>
	<li>Kontynuuj elektroforezę w żelu dodecylosiarczanowo-poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) (krok 5) lub szybko zamroź pozostałe lizaty na suchym lodzie i przechowuj w temperaturze -80 °C przez długi czas.</li>
</ol>
4. Izolowanie lizatów białkowych całych komórek z pierwotnych i/lub unieśmiertelnionych mysich embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej (MEPM)
UWAGA: Izolacja i hodowla pierwotnych komórek MEPM z zarodków myszy E13.5 i unieśmiertelnionych komórek MEPM zostały wcześniej opisane32,33,34. Stymulacja komórek czynnikiem wzrostu (kroki 4.1-4.7) może być przeprowadzona przed lizą komórek. Jeśli pożądane są komórki niestymulowane, przejdź do kroku 4.8 poniżej.
<ol>
	<li>Odessać pożywkę wzrostową [zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 50 U/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 10% FBS] z komórek MEPM przy ~70% zbiegu w 6-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych za pomocą pipety Pasteura 5,75" podłączonej do systemu próżniowego.</li>
	<li>Przemyć komórki 1 ml PBS do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Dodać 3 ml pożywki do głodzenia surowicy [DMEM z 50 U/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 0,1% FBS] wstępnie podgrzanej w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 23 godziny.</li>
	<li>Zastąp pożywkę do głodzenia surowicy 3 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki do głodzenia surowicy.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę.</li>
	<li>Stymuluj komórki wybranym czynnikiem wzrostu w empirycznie określonym stężeniu przez pożądany okres czasu.</li>
	<li>Zassać pożywkę z komórek MEPM przy zbiegu 80%-100% za pomocą pipety Pasteura 5.75" podłączonej do systemu próżniowego.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie lodowatym PBS do hodowli tkankowej (1 ml na 6 cm naczynie do hodowli komórkowych); przechylić płytkę na bok podczas ostatniego płukania, aby upewnić się, że cała PBS kultury tkankowej została odessana.</li>
	<li>Poddać komórki lizie, dodając lodowaty bufor do lizy NP-40 z inhibitorami proteazy i fosfatazy dodanymi bezpośrednio przed użyciem (0,1 ml na 6 cm naczynie do hodowli komórkowych) na lodzie.</li>
	<li>Inkubować płytkę na lodzie przez 5 minut, obracając ją mniej więcej co minutę, aby zapewnić całkowite pokrycie płytki.</li>
	<li>Zeskrobać komórki z płytki za pomocą wstępnie schłodzonego podnośnika do komórek i przenieść zawiesinę komórek do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie.</li>
	<li>Inkubować zawiesinę komórek w temperaturze 4 °C przez 30 minut, obracając się od końca do końca, używając łopatki o pojemności 1,5 ml/2 ml z rewolwerem z rurką.</li>
	<li>Wykonaj kroki 3.6-3.9 opisane powyżej.</li>
</ol>
5. Western blot lizatów białkowych całych komórek z procesów twarzy myszy i/lub komórek MEPM pod kątem fosfoprotein
<ol>
	<li>Przygotuj próbki lizatu białek całych komórek do SDS-PAGE.
	<ol>
		<li>Określ ilość białka do obciążenia, w zależności od obfitości białka w tkance/komórce; 12,5 μg jest zwykle wystarczające dla białek o silnej ekspresji w lizatach białkowych całej komórki.</li>
		<li>Dodać równą objętość 2x buforu Laemmli [20% glicerolu, 4% SDS, 0,004% błękitu bromofenolowego, 0,125 M Tris HCl pH 6,8] z 10% β-merkaptoetanolem dodanym bezpośrednio przed użyciem. 
		UWAGA: β-merkaptoetanol działa żrąco na skórę lub oczy, jest toksyczny, niebezpieczny w przypadku połknięcia i działa toksycznie na organizmy wodne. Trzymaj się w rękawicach, fartuchu laboratoryjnym, osłonie twarzy i okularach ochronnych w osłonie przeciwchemicznej. Utylizować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi ochrony środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa.</li>
		<li>Wymieszaj przez wirowanie.</li>
		<li>Podgrzewać próbki w temperaturze 100 °C przez 5 minut w mini suchej kąpieli.</li>
		<li>Wymieszać przez wirowanie i umieścić próbki na lodzie.</li>
		<li>Wirować przy 9 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umieść próbki na krótko na lodzie przed załadowaniem do żelu SDS-PAGE lub przechowuj przez długi czas w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj SDS-PAGE przy użyciu ogniwa do elektroforezy z 4%-15% prefabrykowanym żelem białkowym i buforem do elektroforezy35.</li>
	<li>Elektrotransferuj białka do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) za pomocą buforu transferowego z 0%-20% metanolem (0%-10% dla białek większych niż 100 kDa; 20% dla białek mniejszych niż 100 kDa) dodanym bezpośrednio przed użyciem35.</li>
	<li>Zablokuj błonę i sondę pod kątem fosfoproteiny będącej przedmiotem zainteresowania.
	<ol>
		<li>Po przeniesieniu przemyć membranę w 1x soli fizjologicznej buforowanej tris (TBS) [20 mM Tris, 0,137 M NaCl, pH 7,6] przez 5 minut w pudełku western blot.</li>
		<li>Inkubować membranę w 5 ml buforu blokującego [1x TBS, 0,1% Tween 20, 5% w/v BSA; dobrze wymieszać i przefiltrować przez filtr strzykawkowy 25 mm z porami 0,2 μm za pomocą strzykawki 10 ml z końcówką typu luer] przez 1 godzinę w pudełku western blot z mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej. 
		UWAGA: Nie używaj mleka jako środka blokującego podczas charakteryzowania fosfoprotein, ponieważ zawiera ono fosfoproteinę kazeinę, która może powodować silny, niespecyficzny sygnał tła.</li>
		<li>Umyj membranę trzy razy przez 5 minut każdy w TBS-T [1x TBS, 0,1% Tween 20] w pudełku western blot z mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej.</li>
		<li>Inkubować błonę w 5 ml pierwszorzędowego przeciwciała rozcieńczonego w buforze blokującym w temperaturze 4 °C przez noc w stożkowej probówce o pojemności 50 ml za pomocą łopatki o pojemności 50 ml z rewolwerem do probówek. 
		UWAGA: Zapoznaj się z arkuszem danych przeciwciał, aby uzyskać informacje na temat odpowiedniego stężenia dla western blot.</li>
		<li>Umyć membranę trzy razy w temperaturze pokojowej przez 5 minut w TBS-T w pudełku western blot z mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej.</li>
		<li>Inkubować błonę w 5 ml odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP), rozcieńczonego w buforze blokującym przez 1 godzinę w pudełku Western Blot z mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej.</li>
		<li>Umyć membranę trzy razy przez 5 minut każdy w TBS-T w pudełku western blot z mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej.</li>
		<li>Inkubować błonę w podłożu western blotting o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) [mieszając równe objętości z butelek 1 i 2; po 0,5 ml każdej z nich dla dużych membran (8,6 cm x 6,7 cm)] przez 1 minutę, upewniając się, że cała membrana jest stale wystawiona na działanie substratu do western blottingu ECL.</li>
		<li>Opróżnij błonę z nadmiaru substratu ECL western blot i natychmiast rozwiń za pomocą obrazowania chemiluminescencyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń błonę i ponownie zbadaj w celu uzyskania całkowitego białka będącego przedmiotem zainteresowania.
	<ol>
		<li>Umieść membranę PVDF w przezroczystej torebce z wyściółką polietylenową zawierającą 5 ml buforu do oddzielania [2% SDS, 62,5 mM Tris HCl pH 6,8] z 8 μl/ml β-merkaptoetanolu dodanym bezpośrednio przed użyciem.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 50 °C przez 30 minut z kołysaniem w piecu do hybrydyzacji z prędkością 11 obrotów na minutę.</li>
		<li>Umyć membranę trzy razy w temperaturze pokojowej przez 5 minut w TBS-T w pudełku western blot z mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej.</li>
		<li>Wykonaj kroki 5.4.2-5.4.9 opisane powyżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ ilościowo gęstość pasma Western blot za pomocą oprogramowania ImageJ, normalizując poziomy baczącego nas fosforylowanego białka do poziomów całkowitego białka będącego przedmiotem zainteresowania36.</li>
</ol>

<ol><li>Bush, J. O., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palatogenesis%3A+morphogenetic+and+molecular+mechanisms+of+secondary+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development.</a> Development. 139 (2), 231-243 (2012).</li>
<li>Chai, Y., Ito, Y., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+and+its+functional+significance+in+regulating+the+fate+of+cranial+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oral+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells.</a> Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).</li>
<li>Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signalling+in+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22TheInternational+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">BMP signalling in craniofacial development.</a> TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+tyrosine+kinase+signaling%3A+regulating+neural+crest+development+one+phosphate+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time.</a> Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).</li>
<li>Xavier, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+receptor+function+during+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hedgehog receptor function during craniofacial development.</a> Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).</li>
<li>Grimsrud, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-6+is+an+autocrine+stimulator+of+chondrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).</li>
<li>MacArthur, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-8+isoforms+activate+receptor+splice+forms+that+are+expressed+in+mesenchymal+regions+of+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development.</a> Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).</li>
<li>Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf-8+determines+rostral-caudal+polarity+in+the+first+branchial+arch%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch.</a> Development. 126 (1), 51-61 (1999).</li>
<li>Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-mediated+gene+inactivation+demonstrates+that+FGF8+is+required+for+cell+survival+and+patterning+of+the+first+branchial+arch%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch.</a> Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).</li>
<li>Tabler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fuz+mutant+mice+reveal+shared+mechanisms+between+ciliopathies+and+FGF-related+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes.</a> Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).</li>
<li>Pakvasa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%3A+Its+essential+roles+in+bone+and+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development.</a> Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).</li>
<li>Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF-A+and+PDGFR-alpha+regulate+tooth+formation+via+autocrine+mechanism+during+mandibular+morphogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro.</a> Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).</li>
<li>Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PDGF+receptor+mutation+in+the+mouse+%28Patch%29+perturbs+the+development+of+a+non-neuronal+subset+of+neural+crest-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells.</a> Development. 115 (1), 133-142 (1992).</li>
<li>Orr-Urtreger, A., Lonai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor-A+and+its+receptor+are+expressed+in+separate%2C+but+adjacent+cell+layers+of+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo.</a> Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).</li>
<li>Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Pdgfc+gene%3A+dynamic+expression+in+embryonic+tissues+during+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis.</a> Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).</li>
<li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li>
<li>He, F., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+PDGFRalpha+signaling+in+medial+nasal+process+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development.</a> PLoS Genetics. 9 (9), 1003851(2013).</li>
<li>Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+by+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell signaling by receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 103 (2), 211-225 (2000).</li>
<li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+by+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell signaling by receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).</li>
<li>Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RUNX2-modifying+enzymes%3A+therapeutic+targets+for+bone+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases.</a> Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).</li>
<li>Firulli, B. A., Firulli, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+penetrant+cardiac+neural+crest+defects+in+Hand1+Phosphomutant+mice%3A+Dimer+choice+that+is+not+so+critical%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical.</a> Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).</li>
<li>Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt1+regulates+phosphorylation+and+osteogenic+activity+of+Dlx3%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).</li>
<li>Jeong, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+phosphorylates+and+regulates+the+function+of+Dlx5%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).</li>
<li>Seo, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin-dependent+kinase+II+regulates+Dlx5+during+osteoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).</li>
<li>Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+in+craniofacial+development%3A+From+receptor+signaling+to+transcriptional+and+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).</li>
<li>Schock, E. N., LaBonne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+sox%3A+Diverse+roles+for+sox+transcription+factors+during+neural+crest+and+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development.</a> Frontiers in Physiology. 11, 606889(2020).</li>
<li>Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Srsf3+mediates+alternative+RNA+splicing+downstream+of+PDGFRalpha+signaling+in+the+facial+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme.</a> Development. 148 (14), (2021).</li>
<li>Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alternative+splicing+by+reversible+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).</li>
<li>Szabo, A., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neural+crest+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neural crest migration.</a> Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).</li>
<li>Kindberg, A. A., Bush, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+boundary+formation+in+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and boundary formation in craniofacial development.</a> Genesis. 57 (1), 23271(2019).</li>
<li>Faundes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raine+syndrome%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Raine syndrome: an overview.</a> European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).</li>
<li>Bush, J. O., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephrin-B1+forward+signaling+regulates+craniofacial+morphogenesis+by+controlling+cell+proliferation+across+Eph-ephrin+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries.</a> Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+immortalized+mouse+embryonic+palatal+mesenchyme+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line.</a> PLoS One. 12 (6), 0179078(2017).</li>
<li>Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+time-lapse+imaging+of+primary+mouse+embryonic+palatal+mesenchyme+cells+to+analyze+collective+movement+attributes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151(2021).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Miller, L. Analyzing gels and western blots with ImageJ. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/">https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/</a> (2010).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K-mediated+PDGFRalpha+signaling+regulates+survival+and+proliferation+in+skeletal+development+through+p53-dependent+intracellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways.</a> Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+alteration+of+protein+phosphorylation+during+postmortem%3A+implication+in+the+study+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation.</a> Scientific Reports. 5, 15709(2015).</li>
<li>Sharma, S. K., Carew, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+of+phosphatase+inhibitors+during+Western+blotting+enhances+signal+detection+with+phospho-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies.</a> Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).</li>
<li>Bass, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+technical+considerations+for+Western+blotting+applications+to+physiological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Medicine+%26+Science+in+Sports%22%5BJournal%5D)">An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research.</a> Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).</li>
<li>Hooper, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+facial+development%3A+contributions+of+ectoderm+and+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme.</a> Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).</li>
<li>Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+contains+a+platelet-derived+transforming+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Serum contains a platelet-derived transforming growth factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).</li>
<li>Swaisgood, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+and+update+of+casein+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Review and update of casein chemistry.</a> Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).</li>
<li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fastest+Western+in+town%3A+a+contemporary+twist+on+the+classic+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149(2014).</li>
<li>Salinovich, O., Montelaro, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+staining+and+peptide+mapping+of+proteins+transferred+to+nitrocellulose+after+separation+by+sodium+dodecylsulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół pozwala naukowcom badać krytyczne zdarzenia sygnalizacyjne zależne od fosforylacji podczas rozwoju twarzoczaszki w solidny i powtarzalny sposób. W tym protokole znajduje się kilka krytycznych kroków, które zapewniają prawidłowe gromadzenie danych i analizę wyników. Niezależnie od tego, czy izoluje się fosfoproteiny z procesów twarzy myszy i/lub hodowanych komórek mezenchymy podniebienia, konieczne jest szybkie i wydajne poruszanie się, jednocześnie utrzymując wszystkie odczynniki i materiały na lod...

Rozwój twarzoczaszki u ssaków to złożony proces morfologiczny, podczas którego wiele populacji komórek koordynuje swoje działania, aby wytworzyć szkielet czołowo-nosowy. U myszy proces ten rozpoczyna się w dniu embrionalnym (E) 9,5 dnia od utworzenia wypukłości czołowo-nosowej i par wyrostków szczękowych i żuchwowych, z których każdy zawiera postmigracyjne komórki grzebienia nerwowego czaszki. Boczne i przyśrodkowe wyrostki nosowe powstają z wypukłości czołowo-nosowej wraz z pojawieniem się dołów nosowych i ostatecznie łączą się, tworząc nozdrza. Ponadto przyśrodkowe wyrostki nosowe i wyrostki szczękowe łączą się, tworząc górną wargę. Jednocześnie palatogeneza rozpoczyna się od powstania wyraźnych wyrostków - drugorzędowych półek podniebiennych - od strony ustnej wyrostków szczękowych w E11.5. Z biegiem czasu półki podniebienne rosną w dół po obu stronach języka, unoszą się do przeciwnej pozycji nad językiem i ostatecznie łączą się w linii środkowej, tworząc ciągłe podniebienie, które oddziela jamę nosową i ustną przez E16.51.
Te zmiany morfologiczne w całym rozwoju twarzoczaszki są inicjowane i podtrzymywane przez różnorodne interakcje sygnalizacyjne, które często obejmują fosforylację białek przez kinazy. Na przykład receptory błony komórkowej, takie jak podrodziny receptorów β transformującego czynnika wzrostu (TGF), w tym receptory białek morfogenetycznych kości (BMPR) i różne rodziny receptorowych kinaz tyrozynowych (RTK), ulegają autofosforylacji po wiązaniu i aktywacji ligandów w komórkach grzebienia nerwowego czaszki2,3,4. Dodatkowo, wygładzony receptor transbłonowy sprzężony z białkiem G ulega fosforylacji w komórkach grzebienia nerwowego czaszki i ektodermie twarzoczaszki za ligandem Sonic hedgehog (SHH) wiążącym się z receptorem Patched1, co powoduje wygładzoną akumulację na błonie rzęskowej i aktywację szlaku SHH5. Takie interakcje ligand-receptor mogą zachodzić poprzez sygnalizację autokrynną, parakrynną i / lub jukstakrynową w kontekstach twarzoczaszki. Na przykład wiadomo, że BMP6 sygnalizuje w sposób autokrynny podczas różnicowania chondrocytów6, podczas gdy czynnik wzrostu fibroblastów (FGF) 8 ulega ekspresji w ektodermie łuku gardłowego i wiąże się z członkami rodziny FGF RTK wyrażonymi w mezenchymie łuku gardłowego w sposób parakrynny, aby zainicjować wzorzec i wzrost łuków gardłowych7, 8,9,10. Co więcej, sygnalizacja Notch jest aktywowana zarówno w chondrocytach, jak i osteoblastach podczas rozwoju szkieletu twarzoczaszki poprzez sygnalizację jukstarynową, gdy transbłonowe ligandy Delta i/lub Jagged wiążą się z transbłonowymi receptorami Notch na sąsiednich komórkach, które są następnie rozszczepiane i fosforylowane11. Istnieją jednak inne pary ligandów i receptorów ważne dla rozwoju twarzoczaszki, które mają elastyczność w funkcjonowaniu zarówno w sygnalizacji autokrynnej, jak i parakrynnej. Na przykład, podczas morfogenezy zębów myszy, wykazano, że ligand płytkowego czynnika wzrostu (PDGF)-AA sygnalizuje w sposób autokrynny, aby aktywować RTK PDGFRα w nabłonku narządu szkliwa 12. Natomiast w mysich procesach twarzowych w połowie ciąży transkrypty kodujące ligandy PDGF-AA i PDGF-CC ulegają ekspresji w ektodermie twarzoczaszki, podczas gdy receptor PDGFRα ulega ekspresji w mezenchymie pochodzącej z grzebienia nerwowego czaszki, co powoduje sygnalizację parakrynną13,14,15,16,17. Niezależnie od mechanizmu sygnalizacji, te zdarzenia fosforylacji receptorów często skutkują rekrutacją białek adaptorowych i/lub cząsteczek sygnałowych, które często same ulegają fosforylacji, aby zainicjować wewnątrzkomórkowe kaskady kinaz, takie jak szlak kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK)18,19.
Końcowe wewnątrzkomórkowe efektory tych kaskad mogą następnie fosforylować szereg substratów, takich jak czynniki transkrypcyjne, białka wiążące RNA, cytoszkielet i macierz zewnątrzkomórkowa. Runx220, Hand121, Dlx3/522,23,24, Gli1-325, oraz Sox926 należą do czynników transkrypcyjnych fosforylowanych w kontekście rozwoju twarzoczaszki. Ta modyfikacja potranslacyjna (PTM) może bezpośrednio wpływać między innymi na podatność na alternatywne PTM, dimeryzację, stabilność, rozszczepienie i/lub powinowactwo do wiązania DNA20,21,25,26. Dodatkowo, białko wiążące RNA Srsf3 ulega fosforylacji w kontekście rozwoju twarzoczaszki, co prowadzi do jego translokacji jądrowej27. Ogólnie wykazano, że fosforylacja białek wiążących RNA wpływa na ich subkomórkową lokalizację, interakcje białko-białko, wiązanie RNA i/lub specyficzność sekwencji28. Co więcej, fosforylacja aktomiozyny może prowadzić do przegrupowań cytoszkieletu podczas całego rozwoju twarzoczaszki29,30, a fosforylacja białek macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak małe glikoproteiny związane z integryną wiążącą integrynę, przyczynia się do biomineralizacji podczas rozwoju szkieletu31. Z powyższych i wielu innych przykładów jasno wynika, że istnieją szerokie implikacje dla fosforylacji białek podczas rozwoju twarzoczaszki. Dodając dodatkowy poziom regulacji, fosforylacja białek jest dodatkowo modulowana przez fosfatazy, które przeciwdziałają kinazom poprzez usuwanie grup fosforanowych.
Te zdarzenia fosforylacji zarówno na poziomie receptora, jak i cząsteczki efektorowej są kluczowe dla propagacji szlaków sygnałowych i ostatecznie skutkują zmianami w ekspresji genów w jądrze, napędzając określone działania komórki, takie jak migracja, proliferacja, przeżycie i różnicowanie, które skutkują prawidłowym kształtowaniem twarzy ssaka. Biorąc pod uwagę specyficzność kontekstową interakcji białek z kinazami i fosfatazami, wynikające z nich zmiany w PTM i ich wpływ na aktywność komórki, niezwykle ważne jest, aby parametry te były badane w fizjologicznie istotnych warunkach, aby uzyskać pełne zrozumienie udziału zdarzeń fosforylacji w rozwoju twarzoczaszki. W tym miejscu przedstawiono przykłady dwóch kontekstów, w których można badać fosforylację białek, a tym samym aktywację szlaków sygnałowych podczas rozwoju twarzoczaszki u ssaków: procesy twarzowe myszy, w szczególności wyrostki szczękowe E11.5, oraz hodowane embrionalne komórki mezenchymy podniebiennej myszy pochodzące z wtórnych półek podniebiennych E13.5 - oba primary32 i immortalized33. W E11.5 wyrostki szczękowe są w trakcie łączenia się z bocznymi i przyśrodkowymi wyrostkami nosowymi1, reprezentując tym samym krytyczny punkt czasowy podczas rozwoju twarzoczaszki myszy. Co więcej, wybrano tutaj wyrostki szczękowe i komórki pochodzące z półek podniebiennych, ponieważ te ostatnie struktury są pochodnymi pierwszej, dając tym samym naukowcom możliwość zbadania fosforylacji białek in vivo i in vitro w powiązanych kontekstach. Jednak protokół ten ma również zastosowanie do alternatywnych procesów twarzy i rozwojowych punktów czasowych.
Krytycznym problemem w badaniu fosforylowanych białek jest to, że są one łatwo defosforylowane podczas izolacji białek przez obfite fosfatazy środowiskowe. Aby pokonać tę barierę, omówiono adaptacje i modyfikacje standardowych metod laboratoryjnych, które pozwalają na izolację fosforylowanych białek. Ponadto przedstawiono najlepsze praktyki w zakresie prawidłowej analizy i kwantyfikacji fosforylowanych białek. Techniki te, szczególnie w połączeniu z inhibitorami farmakologicznymi i/lub mysimi modelami genetycznymi, mogą być wykorzystane do uzyskania lepszego wglądu w dynamikę i role różnych szlaków sygnałowych aktywnych podczas rozwoju twarzoczaszki.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Block do mini suchej kąpieli</td><td>Research Products International Corp</td><td>400783</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania ChemiDoc XRS+ z oprogramowaniem Image Lab</td><td>Inkubator chemiluminescencyjny</td><td>Bio-Rad</td><td></td></tr><tr><td>1708265 Inkubator CO2, płaszcz powietrzny</td><td>VWR</td><td>10810-902</td><td></td></tr><tr><td>Preparacja płyta, 11 x 13 cali</td><td>Fisher Scientific</td><td>09 002 12</td><td></td></tr><tr><td>Komórka do elektroforezy, 4-żelowa, do mini żeli prefabrykowanych z modułem mini trans-blot</td><td></td> Piec do hybrydyzacji <td>Bio-Rad</td> 1658030 <td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>UVP95003001</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka 5415 D z wirnikiem F45-24-11 (Eppendorf)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z604062</td><td></td></tr><tr><td>Mini sucha kąpiel</td><td>Produkty badawcze International Corp</td><td>400780</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>VWR</td><td>89231-662</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz do SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Prostokątna miska na lód, maxi 9 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-093</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Stemi 508 ze stojakiem K LAB, lampa pierścieniowa LED</td><td>Zeiss</td><td>4350649020000000</td><td>mikroskop preparacyjny</td></tr><tr><td>Timer</td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td></td></tr><tr><td>Rewolwer rurowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>11 676 341</td><td></td></tr><tr><td>Mikser wirowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>02 215 414</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>VWR</td><td>89501-472</td><td></td></tr><tr><td>Pudełko Western blot</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9358182</td><td></td></tr><tr><td> Materiały</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szalki do hodowli komórkowych, 6 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-95</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych, 12-dołkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>Podnośniki komórkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-240</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Airgas</td><td>CD USP50</td><td></td></tr><tr><td>Rurki stożkowe, polipropylenowe, 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze drobnoziarniste Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Łyżka do zarodków</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, 0,5 ml</td><td>VWR</td><td>89000-010</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura, 5,75"</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura, 9"</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego, 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego, 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711YZ</td><td></td></tr><tr><td>Woreczki, przezroczyste, wyściółka polietylenowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-25B</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Fisher Naukowe</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Semken</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>Mała bańka lateksowa, 2 ml</td><td>VWR</td><td>82024-554</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy, 25 mm, 0,2 &mu; m wielkość porów</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-108</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka z końcówką typu luer, 10 ml</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-22</td><td></td></tr><tr><td>Dźwignia otwierania kasety Western blot</td><td>Bio-Rad</td><td>4560000</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła chromatograficzna Whatmann 3MM chr</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td> Odczynniki</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-15% Prefabrykowane żele białkowe, 10-dołkowe, 30 i mikro; L</td><td>Bio-Rad</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosforan sól disodowa hydrat Sigma</td><td>Aldrich</td><td>G5422-25G</td><td>stężenie fabryczne 1 M</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, frakcja V, testowana na szok termiczny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>AC403140050</tr><tr><td>Kompletny mini koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11836153001</td><td>stężenie standardowe 25x</td></tr><tr><td>zestaw do oznaczania białek DC II</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>E7, mysie monoklonalne przeciwciało pierwszorzędowe beta tubuliny, koncentrat 0,1 ml</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>E7</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>Podłoże do blottingu ECL</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI32106</td><td>zakres niskich pikogramów</td></tr><tr><td>Podłoże do blottingu zachodniego ECL</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-302B</td><td>niski zakres femtogramów</td></tr><tr><td>Bufor do elektroforezy, 5 L</td><td>Bio-Rad</td><td>1610772</td><td>stężenie zapasowe 10x</td></tr><tr><td>etanol, 200 proof, 1 galon</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2705HC</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy, Di Na sól dihydrat. (krystaliczny powd./elektrofor)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, scharakteryzowana, pochodzenie amerykańskie, 500 ml</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol (certyfikowany ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne sprzężone z HRP, kozie przeciwciało anty-mysie IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>115-035-146</td><td>1:20 000</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne sprzężone z HRP, koza anty-królicze IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-003</td><td>1:20 000</td></tr><tr><td>Roztwór kwasu solnego, 6N (certyfikowany)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA56-500</td><td>HCl</td></tr><tr><td>Igepal Ca - 630 niejonowy detergent</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19859650</td><td>Nonidet P-40</td></tr><tr><td>Izopropanol (HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-1</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>stężenie zapasowe 200 mM</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (Erk1/2)</td> przeciwciało pierwotne <td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9102S</td><td>1:1,000; rekombinowany ligand anty-Erk1/2</td></tr><tr><td>PDGF-BB, szczur</td><td>Fisher Scientific</td><td>520BB050</td><td></td></tr><tr><td>Receptor PDGF i beta; pierwotne przeciwciało</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>3169S</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>stężenie podstawowe 100 U/mL, 100 &mikro; g / ml</td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC215740100</td><td>PMSF; stężenie podstawowe 100 mM</td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 Przeciwciało pierwotne MAPK (Erk1/2)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9101S</td><td>1:1,000, anty-fosfo-Erk1/2</td></tr><tr><td>Receptor fosfo-PDGF &alfa; /PDGF Receptor &beta; pierwotne przeciwciało</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>3170S</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (białe kryształy)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy (białe kryształy)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>roztwór SDS, 10%</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (krystaliczny / biologiczny, certyfikowany)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Fluorek sodu (proszek/certyfikowany ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S299-100</td><td>NaF; podwielokrotność do jednorazowego użytku; stężenie podstawowe 1 M</td></tr><tr><td>Ortowanadan sodu, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC205330500</td><td>Na3VO4; stężenie 100 mM</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny (granulowany lub proszkowy/certyfikowany ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>Kultura tkankowa PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Bufor transferowy, 5 L</td><td>Bio-Rad</td><td>1610771</td><td>stężenie podstawowe 10x</td></tr><tr><td>Baza Tris (białe kryształy lub krystaliczny proszek/biologia molekularna)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>BioWorld</td><td>21560033</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Marker masy cząsteczkowej Western blot</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Female 129S4 myszy</td><td></td><td></td><td>dar dr Philippe'a Soriano, Icahn School of Medicine na Górze Synaj</td></tr></tbody></table>

izolacja lizatów białkowych całych komórek z procesów twarzy myszy i hodowanych komórek mezenchymy podniebienia do analizy fosfoprotein

Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

Rozwój twarzoczaszki u ssaków to złożony proces morfologiczny, podczas którego wiele populacji komórek koordynuje swoje działania, aby wytworzyć szkielet czołowo-nosowy. Te zmiany morfologiczne są inicjowane i utrzymywane przez różne interakcje sygnalizacyjne, które często obejmują fosforylację białek przez kinazy. W tym miejscu przedstawiono dwa przykłady fizjologicznie istotnych kontekstów, w których można badać fosforylację białek podczas rozwoju twarzoczaszki u ssaków: procesy twarzy myszy, w szczególności wyrostki szczękowe E11.5, oraz hodowane embrionalne komórki mezenchymy podniebienia myszy pochodzące z wtórnych półek podniebiennych E13.5. Aby pokonać powszechną barierę defosforylacji podczas izolacji białek, omówiono adaptacje i modyfikacje standardowych metod laboratoryjnych, które pozwalają na izolację fosfoprotein. Ponadto przedstawiono najlepsze praktyki w zakresie prawidłowej analizy i kwantyfikacji fosfoprotein po zachodnim blotowaniu lizatów białek całych komórek. Techniki te, szczególnie w połączeniu z inhibitorami farmakologicznymi i/lub mysimi modelami genetycznymi, mogą być wykorzystane do uzyskania lepszego wglądu w dynamikę i role różnych fosfoprotein aktywnych podczas rozwoju twarzoczaszki.

Podczas próby charakterystyki fosforylacji białek wyizolowanych z wyrostków twarzowych myszy i/lub hodowlanych komórek mezenchymy podniebienia, reprezentatywne wyniki powinny w idealnym przypadku wykazać wyraźny, powtarzalny prążek po przeprowadzeniu western blossomingu z użyciem przeciwciała przeciwko fosfoproteinie, znajdujący się na tej samej wysokości lub blisko wysokości odpowiadającego prążka całkowitego białka (Rycina 3). Jednakże, jeśli białko uległo intensywnej fosforylacji, może wy...

Protokół przedstawia metodę izolowania lizatów białkowych całych komórek z wypreparowanych procesów twarzy zarodków myszy lub hodowanych mysich embrionalnych komórek mezenchymy zarodkowej i przeprowadzania następnie western blot w celu oceny poziomu fosforylowanego białka.

Izolacja lizatów białkowych całych komórek z procesów twarzy myszy i hodowanych komórek mezenchymy podniebienia do analizy fosfoprotein

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...

Protokół ten może być wykorzystany do uzyskania lepszego wglądu w dynamikę i rolę fosfoprotein aktywnych podczas rozwoju twarzoczaszki u ssaków. Protokół ten pokonuje powszechną barierę defosforylacji podczas izolacji białek z dwóch fizjologicznie istotnych kontekstów, procesów twarzy myszy i hodowanych mysich embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej. Konieczne jest szybkie poruszanie się, trzymając wszystkie odczynniki i materiały na lodzie oraz stosowanie inhibitorów fosfatazy we wszystkich do lizy, aby zachować integralność fosforylowanych białek.Na początek połóż ciało myszy na desce preparacyjnej brzuszną stroną skierowaną do góry i spryskaj brzuch myszy 70% etanolem. Następnie otwórz jamę brzuszną, ściskając i unosząc skórę przed otworem pochwy za pomocą prostych kleszczy Semken. Następnie przetnij uniesioną skórę w warstwach leżących pod spodem za pomocą nożyczek chirurgicznych z prostym ostrzem pod kątem 45 stopni po obu stronach, aby uzyskać kształt litery V, który rozciąga się na każdą powierzchnię boczną mniej więcej w połowie odległości między czterema kończynami a kończynami tylnymi.Za pomocą kleszczyków Semken chwyć jeden z rogów macicy i przetnij nożyczkami chirurgicznymi poniżej jajowodu i powyżej szyjki macicy. Aby umożliwić całkowite usunięcie rogu macicy, odetnij mezometrium, a następnie przenieś wypreparowany róg macicy do 10 mililitrów histologicznego PBS na 10-centymetrowej szalce Petriego. Podobnie usuń drugi róg macicy po przeciwnej stronie jamy brzusznej.Następnie umieść na lodzie 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą oba rogi macicy. Pod mikroskopem stereoskopowym dokładnie wypreparuj każdy zarodek z rogów macicy za pomocą cienkich kleszczy Dumont 5. Następnie powoli odciągnij mięśniówkę macicy, decidua i kosmówkę.Następnie należy rozerwać i usunąć stosunkowo przezroczystą owodnię otaczającą zarodek i przeciąć pępowinę łączącą zarodek z łożyskiem. Następnie przenieś każdy wypreparowany zarodek do 2,5 mililitra PBS histologicznego w indywidualnym dołku 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej na lodzie za pomocą wyciętej plastikowej pipety transferowej. Przygotuj trzy 10-centymetrowe szalki Petriego zawierające 10 mililitrów PBS histologicznego i trzymaj je na lodzie, aby można je było stosować na przemian między zarodkami.Następnie przenieść jeden zarodek z pojedynczego dołka 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej na jedną z 10-centymetrowych szalek Petriego z histologią PBS na lodzie za pomocą przeciętej plastikowej pipety do przenoszenia. Pod mikroskopem preparacyjnym oddziel każdy wyrostek szczękowy od twarzy za pomocą cienkich kleszczy, wykonując najpierw nacięcie po przedniej stronie jednego wyrostka szczękowego wzdłuż naturalnego wgłębienia oddzielającego boczny wyrostek nosowy w wyrostku szczękowym. Następnie przetnij tylną stronę wyrostka szczękowego wzdłuż naturalnego wgłębienia oddzielającego wyrostek szczękowy i wyrostek żuchwowy.Następnie całkowicie oddziel wyrostek szczękowy, wykonując pionowe cięcie od przedniej do tylnej strony wyrostka szczękowego po stronie oka wyrostka szczękowego, gdzie kończą się naturalne wgłębienia, o których mowa powyżej. Używając dziewięciocalowej pipety Pasteura z dwumililitrową małą bańką lateksową, przenieś wypreparowaną parę wyrostków szczękowych w małej kropelce około 30 mikrolitrów histologicznego PBS na oznakowaną 35-milimetrową szalkę Petriego na lodzie. Następnie przenieś parę tkanek wyrostka szczękowego do znakowanej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej na lodzie za pomocą pipety Pasteura, minimalizując przenoszenie histologicznego PBS.Ponadto usuń nadmiar histologicznego PBS z 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej za pomocą pipety Pasteura. Dodaj 0,1 mililitra lodowatego buforu do lizy NP40 z inhibitorami proteazy i fosfatazy dodanymi bezpośrednio przed użyciem na lodzie. Następnie pipetuj w górę i w dół 10 razy za pomocą PIPETMANA o pojemności 200 mikrolitrów.Następnie wiruj przez 10 sekund, a następnie pipetuj w górę i w dół 10 razy za pomocą PIPETMANA o pojemności 200 mikrolitrów, unikając przy tym powstawania pęcherzyków. Inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny, obracając się od końca do końca za pomocą 1,5 mililitra lub dwumililitrowej łopatki z rewolwerem rurowym. Następnie odwirować próbki o masie 13 500 x g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej na lodzie za pomocą 200-mililitrowego PIPETMANA.Najpierw odessaj pożywkę z embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej myszy za pomocą 5,75-calowej pipety Pasteura podłączonej do systemu próżniowego. Następnie dwukrotnie przemyj komórki lodowatą hodowlą tkankową PBS i przechyl płytkę na bok podczas ostatniego płukania, aby upewnić się, że cała hodowla tkankowa PBS została zasysana. Następnie dodaj lodowaty bufor do lizy NP40 z inhibitorami proteazy i fosfatazy dodanymi bezpośrednio przed użyciem na lodzie w celu lizy komórek.Inkubować płytkę na lodzie przez pięć minut, obracając ją mniej więcej co minutę, aby zapewnić całkowite pokrycie płytki. Następnie zeskrob komórki z płytki za pomocą wstępnie schłodzonego podnośnika do komórek i przenieś zawiesinę komórek do wstępnie schłodzonej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej na lodzie. Następnie inkubuj zawiesinę komórek w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut, obracając się od końca do końca za pomocą łopatki o pojemności 1,5 mililitra lub dwóch mililitrów z rewolwerem rurowym.Następnie odwirować próbki o masie 13 500 x g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej na lodzie za pomocą 200-mililitrowego PIPETMANA. Analiza Western blot lizatów całych komórek z unieśmiertelnionych embrionalnych komórek mezenchymy mysi po stymulacji ligandem PDFG-B od 2 do 15 minut ujawniła wyraźne odtwarzalne prążki dla fosfoprotein, które biegną na wysokości lub w pobliżu wysokości odpowiedniego całkowitego pasma białkowego. Po podaniu czynnika wzrostu zaobserwowano wzrost intensywności pasm fosfoproteinowych w porównaniu z komórkami nieleczonymi, podczas gdy całkowita intensywność pasma białkowego była stosunkowo równa między próbkami.Protokół ten może być wykorzystany do zbadania, w jaki sposób zaburzenia i fosforylacja bezpośrednio wpływają na sygnalizację międzykomórkową, ekspresję genów i aktywność komórkową w kontekstach twarzoczaszki.

isolation-whole-cell-protein-lysates-from-mouse-facial-processes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Film przedstawia analizę stanu palmitoilacji białek błony komórkowej wyizolowanych z tkanki mózgowej myszy. Proces ten polega na wystawieniu niepalmitoilowanych cystein i zablokowaniu ich, a następnie użyciu polimeru, który wiąże się z cysteinami palmitoilowanymi, pomagając w ocenie stanu palmitoilacji wyizolowanych białek.

Ocena stanu palmitoylacji białek błony komórkowej z tkanki mózgowej myszy

Opisano protokół separacji ektodermy twarzy i mezenchymy zarodka. Używamy Dispase II do leczenia najpierw całych zarodków, następnie wycinamy całe wypukłości twarzy, a następnie oddzielamy ektodermę twarzy i mezenchymę.

Oddzielenie embrionalnej ektodermy twarzy myszy i mezenchymy

Analiza proteomiczna dowolnego typu komórek jest wysoce zależna zarówno od czystości, jak i wstępnego frakcjonowania materiału wyjściowego w celu de-kompleksizacji próbki przed chromatografią cieczową metodą spektrometrii mas (MS). Stosując techniki płukania wstecznego, można uzyskać czyste plemniki od gryzoni. Po trawieniu fosfopeptydy można wzbogacić za pomocą TiO2.

Analiza fosfopeptydowa plemników najądrzy gryzoni

Analiza ekspresji białek w młodych embrionalnych zastawkach myszy została utrudniona przez ograniczoną dostępną tkankę. Manuskrypt ten zawiera protokół przygotowania białka z rozwijających się embrionalnych obszarów zastawki myszy do analizy western blot.

Izolacja białka z rozwijającego się zarodkowego regionu zastawki serca myszy

W tej metodzie prezentujemy procedury biochemiczne do szybkiej i efektywnej izolacji pośrednich białek filamentowych (IF) z wielu tkanek myszy. Izolowane IFs mogą być wykorzystywane do badania zmian w modyfikacjach potranslacyjnych za pomocą spektrometrii mas i innych testów biochemicznych.

Izolacja pośrednich białek filamentowych z wielu tkanek myszy w celu zbadania modyfikacji potranslacyjnych związanych ze starzeniem się

Ten protokół opisuje, jak izolować keratynocyty skóry od modeli mysich, barwić przeciwciałami znakowanymi metalem oraz analizować barwione komórki za pomocą cytometrii masowej w celu profilowania wzorca ekspresji interesujących białek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Izolacja i barwienie keratynocytów skóry myszy do specyficznej dla cyklu komórkowego analizy ekspresji białek komórkowych za pomocą cytometrii masowej

Przedstawiamy protokół izolacji i hodowli pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymalnych podniebienia myszy do obrazowania poklatkowego dwuwymiarowego (2D) wzrostu i gojenia ran. Udostępniamy również metodologię analizy danych z obrazowania poklatkowego w celu określenia powstawania strumienia komórkowego i ruchliwości kierunkowej.

Izolacja i obrazowanie poklatkowe pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej myszy w celu analizy zbiorowych atrybutów ruchowych

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę keratynocytów jamy ustnej pochodzących z podniebienia dorosłej myszy. Podano również metodę oceny z wykorzystaniem barwienia immunologicznego.

Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów jamy ustnej z podniebienia dorosłej myszy

Ten protokół przedstawia dwie techniki izolowania subkomórkowych przedziałów fotoreceptorów mysich pręcików do analizy białek. Pierwsza metoda wykorzystuje żywe siatkówki i celulozową bibułę filtracyjną do oddzielenia zewnętrznych segmentów pręcika, podczas gdy druga wykorzystuje liofilizowane siatkówki i taśmę klejącą do odklejania wewnętrznych i zewnętrznych warstw segmentów pręcika.

Dwie metody peelingu do izolacji przedziałów komórek fotoreceptorowych w siatkówce myszy w celu analizy białek

Obecny protokół opisuje przygotowanie próbki i analizę danych w celu ilościowego określenia fosforylacji białek za pomocą ulepszonego testu ściągania pojedynczych cząsteczek (SiMPull).

Zoptymalizowany test typu pull-down dla pojedynczych cząsteczek do ilościowego oznaczania fosforylacji białek

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych fosfataz fosfoproteinowych i ich oddziałujących białek z komórek i tkanek oraz ich identyfikacji i kwantyfikacji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas.

Podejście oparte na spektrometrii mas do identyfikacji fosfataz fosfoproteinowych i ich interaktorów

Poznaj metodę izolacji lizatów białkowych z procesów twarzy myszy i komórek mezenchymy podniebienia do analizy fosfoprotein. Protokół zachowuje fosforylację białek dzięki inhibitorom fosfataz.

Izolacja lizatów białkowych całych komórek z procesów twarzy myszy i hodowanych komórek mezenchymy podniebienia do analizy fosfoprotein (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja lizatów białkowych całych komórek z procesów twarzy myszy i hodowanych komórek mezenchymy podniebienia do analizy fosfoprotein

Przeglądaj więcej filmów