Indukowanie ratowania polipów w koloniach koralowców w celu uzyskania zindywidualizowanych mikropropagatów do laboratoryjnego użytku eksperymentalnego

Mikrorozmnażanie koralowców jest wciąż w powijakach. Optymalizacja protokołów ratowania polipów jest kluczem do wypełnienia tej luki, umożliwiając naukowcom wykorzystanie polipów jako modeli do badania koralowców w środowiskach laboratoryjnych. Ratowanie polipów umożliwia tworzenie wielu propagatów z małych fragmentów koralowców.

Polipy mogą być wykorzystywane w różnych eksperymentach, ułatwiając na przykład obserwację procesów mikroskopowych u koralowców. Rafy koralowe są zagrożone. Naszym celem jest wykorzystanie tego powtarzalnego modelu do opracowania strategii ochrony koralowców przed blaknięciem i innymi zagrożeniami środowiskowymi w skuteczny i nieinwazyjny sposób.

Metoda ta może pomóc w badaniu fizjologii koralowców, interakcji mikrobiomu gospodarza i mechanizmów związanych z bieleniem. Takie odkrycia mogą przyczynić się na przykład do optymalizacji probiotyków koralowych. Kluczowe jest stosowanie wody morskiej o odpowiednim zasoleniu.

Zasolenie musi zaczynać się na poziomie naturalnego środowiska koralowca i powoli wzrastać, aby stres nie był nadmiernie szkodliwy. Zbieranie polipów w odpowiednim momencie i wybieranie tych, które są najbardziej nienaruszone, ma kluczowe znaczenie dla ich przetrwania. Demonstracja wizualna może być niezbędna do zrozumienia tych wskazówek.

Najpierw użyj ukośnych szczypiec do cięcia, aby wyciąć małe fragmenty z kolonii koralowców, a następnie umieść je na małych szalkach Petriego wypełnionych 12 mililitrami wody morskiej, do której kolonia koralowców została zaaklimatyzowana. Pozostaw płytkę otwartą na około 24 godziny w temperaturze otoczenia, aby woda odparowała, a jej zasolenie stopniowo wzrosło. Gdy trawienie tkanek jest widoczne między polipami, użyj 1-mililitrowej pipety transferowej, aby stworzyć delikatny przepływ w pobliżu tkanki koralowca.

Przepływ powoli pomoże zakończyć odklejanie polipów, które już strawiły otaczającą je tkankę ze szkieletu, a następnie za pomocą pipety powoli wymieniaj wodę na szalce Petriego na wodę izosmotyczną. Aby przygotować wodę morską o wysokim zasoleniu, weź zwykłą wodę morską i dodaj chlorek sodu do wody morskiej, aby przygotować trzy litry wody morskiej o wysokim zasoleniu, aż zasolenie wzrośnie o 85%Po pocięciu małych fragmentów koralowca, jak pokazano wcześniej, umieść je w 10-litrowym pojemniku z trzema litrami izosmotycznej wody morskiej podłączonej do pompy perystaltycznej. Napełnij ten pojemnik trzema litrami wcześniej przygotowanej wody morskiej o wysokim zasoleniu przez 24 godziny w tempie 126 mililitrów na godzinę, aby zwiększyć zasolenie o około 40%Za pomocą pipety stwórz delikatny przepływ wody, aby uwolnić polipy ze szkieletu.

Powoli wymieniaj wodę w pojemniku na izosmotyczną wodę morską. Dodaj 26,29 grama chlorku sodu, 0,872 grama chlorku potasu, 2,16 grama siarczanu magnezu, 11,94 grama chlorku magnezu, 3,42 grama siarczanu sodu i 0,26 grama wodorowęglanu sodu do jednego litra wody dejonizowanej, aby przygotować wodę morską bez wapnia, a następnie napełnij szalki Petriego tą bezwapniową wodą morską. Po wycięciu małych fragmentów koralowców zanurz je w bezwapniowej wodzie morskiej na szalkach Petriego.

Umieść szalki w inkubatorze orbitalnym na trzy godziny z prędkością obrotową 80 obr./min, a następnie przenieś fragmenty na szalki Petriego wypełnione 20% DMEM przygotowanym ze sztuczną wodą morską o 40 praktycznych jednostkach zasolenia i zawierającymi 100 miligramów na litr ampicyliny. Inkubuj fragmenty w temperaturze 26 stopni Celsjusza i 80 obr./min. Wymieniaj pożywkę codziennie, aż do zaobserwowania trawienia tkanek między polipami, a poszczególne polipy zaczynają odrywać się od szkieletu, a następnie przenieś polipy do wysterylizowanej wody morskiej i inkubuj przez godzinę.

Gdy polipy zostaną zwrócone do przefiltrowanej wody morskiej o niestresującym zasoleniu, wybierz żywotne polipy, obserwując integralność tkanek i ruch spowodowany przepływem rzęsek pod mikroskopem stereoskopowym. Umieść wybrane polipy na szalce Petriego i przykryj szalkę Petriego siatką planktonową o rozmiarze oczek 200 mikrometrów, tak aby polipy nie odpłynęły od szalki. Umieść szalkę Petriego w akwarium o odpowiednich warunkach dla użytych gatunków koralowców.

Aby zapobiec przerostowi glonów, otwieraj szalkę Petriego co najmniej raz w tygodniu, aby odnowić wodę i wyczyścić naczynie. Po wybraniu polipów, jak pokazano wcześniej, za pomocą pipety transferowej umieść je w kolbie komórkowej o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych wypełnionej 50 mililitrami izosmotycznej wody morskiej, a następnie zamknij kolbę i umieść je w inkubatorze ustawionym na 12-godzinne cykle świetlne, 26 stopni Celsjusza i 40 obr./min. Jeśli kolba zostanie wypełniona glonami lub biofilmem, przenieść zawartość do czystej kolby.

W tym badaniu ratowanie polipów zostało wywołane trzema różnymi metodami. Metoda odparowywania wody doprowadziła do całkowitego uratowania w ciągu 24 godzin od inkubacji, a zasolenie wzrosło z 40 do 59 praktycznych jednostek zasolenia po 24 godzinach. Metoda dostarczania słonej wody spowodowała również uwolnienie polipów po 24 godzinach inkubacji.

Tutaj zasolenie wzrosło z 40 do 52 praktycznych jednostek zasolenia po 12 godzinach inkubacji, a następnie do 59 praktycznych jednostek zasolenia po 24 godzinach. Indukcja ratunku poprzez inkubację w wodzie morskiej wolnej od wapnia została zakończona po trzech godzinach inkubacji polipów w niej, a następnie po 20 godzinach inkubacji w pożywce 20% DMEM, We wszystkich trzech metodach można było wygenerować zindywidualizowane polipy koralowców. Polipy koralowców powstałe w wyniku odparowania mogą przetrwać sześć tygodni, podczas gdy te wytworzone metodą dostarczania wody morskiej o wysokim zasoleniu mogą przetrwać osiem tygodni na szalkach Petriego w akwariach.

Polipy uzyskane metodą odparowania wody morskiej trzymane w kolbach do hodowli komórkowych wewnątrz inkubatorów przetrwały do trzech tygodni bez całkowitej dysocjacji ich tkanek. Podczas odłączania polipów od szkieletu ważne jest, aby być delikatnym. Jeśli nie zostaną całkowicie odłączone, wymuszenie odłączenia przez silne pipetowanie wody spowoduje uszkodzenia i obniży wskaźniki przeżycia.

Za pomocą tych metod można indukować osiadanie polipów. Osiadanie polipów może odpowiedzieć na pytania dotyczące procesów ich zwapnienia i wzrostu. Po opracowaniu indukcji ratowania polipów naukowcy byli w stanie zbadać początkową formację szkieletu koralowca i bezpośrednio zwizualizować blaknięcie koralowców w skali polipów.