Name: Zintegrowane podejście do identyfikacji mikrobiałek i analizy sekwencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji mikrobiałek z użyciem narzędzia PhyloCSF w przeglądarce UCSC Genome Browser. Protokół umożliwia analizę potencjału kodującego regionów genomowych bez wcześniejszego doświadczenia w bioinformatyce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z National Institutes of Health (HL-141630 i HL-160569) oraz Cincinnati Children's Research Foundation (Trustee Award).

Protokół opisany poniżej szczegółowo opisuje kroki ładowania i nawigacji po ścieżkach przeglądarki PhyloCSF w przeglądarce UCSC Genome Browser (wygenerowanej przez Mudge et al.49). W przypadku ogólnych pytań dotyczących przeglądarki UCSC Genome Browser, obszerny podręcznik użytkownika przeglądarki genomu można znaleźć tutaj: <a href="https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html">https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html</a>.
1. Wczytywanie koncentratora śledzenia PhyloCSF do przeglądarki genomu UCSC
<ol>
	<li>Otwórz okno przeglądarki internetowej i przejdź do przeglądarki UCSC Genome Browser (<a href="https://genome.ucsc.edu/">https://genome.ucsc.edu/</a>).</li>
	<li>Pod nagłówkiem Nasze narzędzia wybierz opcję Śledź huby. 
	UWAGA: Opcję Śledź koncentratory można również znaleźć na karcie Moje dane.</li>
	<li>Na karcie Centra publiczne wpisz PhyloCSF w polu Wyszukiwane terminy. Kliknij przycisk Przeszukaj centra publiczne.</li>
	<li>Połącz się z PhyloCSF, klikając przycisk Połącz dla nazwy koncentratora PhyloCSF (Opis: Ewolucyjny potencjał kodowania białek mierzony przez PhyloCSF). 
	UWAGA: Ten koncentrator ścieżek można załadować do wielu zestawów, w tym ludzkich (hg19 i hg38) i myszy (mm10 i mm39).</li>
	<li>Po kliknięciu na connect poczekaj na przekierowanie na stronę UCSC Genome Browser Gateway (<a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway</a>).</li>
</ol>
2. Nawigacja do interesujących genów za pomocą identyfikatorów genów
<ol>
	<li>Wybierz gatunek i zestaw genomu do wykonania zapytania. Aby wysłać zapytanie do innego gatunku (np. myszy), wybierz interesujący Cię gatunek pod nagłówkiem Przeglądaj/Wybierz gatunek, klikając odpowiednią ikonę, lub wpisz gatunek w polu tekstowym o treści: Wprowadź gatunek, nazwę zwyczajową lub identyfikator zestawu. 
	UWAGA: Zespół jest wymieniony bezpośrednio pod nagłówkiem Znajdź pozycję. Zazwyczaj wartością domyślną jest Human Assembly (np. grudzień 2009 r. [GRCh37/hg19]).</li>
	<li>Wybierz zespół do przeszukania pod nagłówkiem Znajdź pozycję za pomocą menu rozwijanego.</li>
	<li>Wprowadź pozycję, symbol genu lub wyszukiwane terminy w polu Pozycja/Wyszukiwane hasło i kliknij Przejdź, aby przejść do interesującego genu w przeglądarce genomu.</li>
	<li>Jeśli wyszukiwanie wykazało wiele dopasowań, poczekaj na przekierowanie na stronę, która wymaga wyboru interesującej Cię pozycji. Kliknij na odpowiedni gen, który Cię interesuje.</li>
</ol>
3. Nawigowanie do interesujących regionów genomu za pomocą informacji o sekwencji
<ol>
	<li>Przejdź do przeglądarki genomu UCSC (<a href="https://genome.ucsc.edu/">https://genome.ucsc.edu/</a>) i wybierz narzędzie do wyrównania podobnego do BLAST (BLAT) pod nagłówkiem Nasze narzędzia, aby zapytać o określoną sekwencję DNA lub białka. Możesz też najechać kursorem na zakładkę Narzędzia i wybrać opcję Blat lub skorzystać z tego linku: <a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat</a>.</li>
	<li>Wybierz interesujący Cię gatunek (genom) i zestaw za pomocą menu rozwijanych.</li>
	<li>Zdefiniuj typ zapytania za pomocą menu rozwijanego.</li>
	<li>Wklej interesującą Cię sekwencję w polu tekstowym BLAT Search Genome i kliknij przycisk Prześlij.</li>
	<li>Kliknij łącze przeglądarki pod nagłówkiem DZIAŁANIA, aby przejść do interesującego Cię regionu genomu.</li>
</ol>
4. Identyfikacja zachowanych sORF-ów za pomocą danych śledzenia PhyloCSF
<ol>
	<li>Wizualnie przeskanuj obszar zainteresowania genomu pod kątem pozytywnie ocenianych regionów PhyloCSF (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe wyjaśnienie, jak wizualnie interpretować wyniki PhyloCSF w przeglądarce genomu UCSC, zobacz sekcję reprezentatywnych wyników poniżej.</li>
	<li>Użyj funkcji powiększania, aby powiększyć obszary zainteresowania w celu zbadania charakterystyki sekwencji i wyszukania kodonów start/stop. Aby powiększyć ręcznie, przytrzymaj Shift, a następnie kliknij i przytrzymaj przycisk myszy podczas przeciągania wzdłuż obszaru zainteresowania. Możesz też użyć przycisków powiększania i pomniejszania u góry strony, aby nawigować (dostępne są opcje powiększenia 1,5x, 3x, 10x lub powiększenia podstawowego). 
	UWAGA: Przed użyciem przycisków powiększania/pomniejszania konieczne jest przemieszczenie genu tak, aby obszar zainteresowania znajdował się na środku ekranu. Aby wykonać tę czynność, kliknij obraz i przeciągnij go w lewo lub w prawo, aby przesunąć region genomu w poziomie zgodnie z potrzebami lub użyj strzałek przenoszenia u góry strony.</li>
	<li>Powiększaj, aż sekwencja nukleotydów (zasad) będzie widoczna. 
	UWAGA: Sekwencja nukleotydowa pojawi się bezpośrednio nad wynikiem +1 Wygładzonego PhyloCSF.</li>
	<li>Wizualnie zeskanuj sekwencję nukleotydów w pobliżu początku i końca pozytywnie punktowanych regionów PhyloCSF, aby zidentyfikować domniemane kodony start (ATG) i stop (TGA/TAA/TAG). 
	UWAGA: Jeśli interesujący nas gen znajduje się na ujemnej nici DNA, kodony start i stop będą odwrotnym dopełnieniem (tj. CAT dla kodonu start i TCA / TTA / CTA dla kodonu stop).</li>
</ol>
5. Przeglądanie regionów homologicznych w innych genomach
<ol>
	<li>Najedź myszką na nagłówek Widok u góry strony i kliknij opcję W innych genomach (konwertuj). </li>
	<li>Zdefiniuj genom, który Cię interesuje, korzystając z menu rozwijanego poniżej nagłówka Nowy genom.</li>
	<li>Wybierz interesujący Cię zestaw genomowy za pomocą menu rozwijanego pod nagłówkiem Nowy zestaw, a następnie kliknij przycisk Prześlij.</li>
	<li>Gdy przeglądarka zwróci listę regionów w nowym zestawie z podobieństwem, kliknij link pozycji chromosomu, aby przejść do interesującego nas regionu homologicznego. 
	UWAGA: Procent całkowitych zasad (nukleotydów) i zakres, które są pokryte przez region, zostaną zdefiniowane dla każdego wymienionego regionu. Im wyższy procent pasujących zasad, tym wyższa jest ochrona dla regionu zainteresowania.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z tymi samymi strategiami nawigacyjnymi opisanymi w sekcji 4, aby przeanalizować sekwencję.</li>
</ol>
6. Generowanie wielogatunkowych dopasowań sekwencji dla interesujących mikroprotein
<ol>
	<li>Kliknij interesujący nas gen na ścieżce GENCODE w przeglądarce genomu UCSC (wskazany w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A z niebieskim polem), aby przejść do strony opisu genu.</li>
	<li>Pod nagłówkiem Sekwencja i linki do narzędzi i baz danych kliknij link w tabeli z napisem FASTA Inne gatunki.</li>
	<li>Kliknij pola powiązane z interesującymi Cię gatunkami, aby je wybrać. Kliknij Prześlij. Skopiuj i wklej sekwencje pojawiające się u dołu strony w formacie FASTA do dokumentu edytora tekstu.</li>
	<li>Otwórz drugie okno przeglądarki i przejdź do narzędzia Clustal Omega Multiple Sequence Alignment tool52 na stronie Europejskiego Instytutu Bioinformatyki (EMBL-EBI)53,54: <a href="https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/">https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/</a>.</li>
	<li>Wklej pliki sekwencji, które nadal znajdują się w schowku, do pola w KROKU 1, które odczytuje sekwencje w dowolnym obsługiwanym formacie. Przewiń do dołu strony i kliknij Prześlij. Spójrz poniżej wyrównanych wyników (czarną czcionką) na symbole, które wskazują stopień zachowania każdego aminokwasu (symbole są zdefiniowane w Tabeli 1). 
	UWAGA: Wygenerowanie wyrównania może potrwać kilka minut.</li>
	<li>Aby wyświetlić właściwości aminokwasów w kolorze, kliknij link Pokaż kolory bezpośrednio nad sekwencjami, aby pokolorować aminokwasy zgodnie z ich właściwościami (zdefiniowanymi w Tabeli 2).</li>
	<li>Skopiuj i wklej wyrównanie sekwencji do edytora tekstu lub programu do pokazu slajdów, aby wygenerować plik z rysunkiem lub ilustracją (np. <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2). 
	UWAGA: Do wyrównania należy użyć czcionki o stałej szerokości, takiej jak Courier.</li>
	<li>Aby wyświetlić inne wyniki ze strony wyników Clustal Omega, kliknij odpowiednie zakładki (np. Drzewo przewodnika lub Drzewo filogenetyczne).</li>
	<li>Kliknij kartę Podgląd wyników, aby wyświetlić informacje o sekwencji za pomocą Jalview, darmowego programu, który specjalizuje się w edycji, wizualizacji i analizie wyrównania wielu sekwencji55, lub aby uzyskać dostęp do bezpośrednich linków do MView i Simple Phylogeny56.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiony tutaj protokół zawiera szczegółowe instrukcje, jak badać interesujące regiony genomu pod kątem potencjału kodowania mikrobiałek za pomocą PhyloCSF w przyjaznej dla użytkownika przeglądarce UCSC Genome Browser 48,49,50,51. Jak opisano powyżej, PhyloCSF jest potężnym algorytmem genomiki porównawczej, który integruje modele filogenetyczne i częstotliwości substytucji kodonów w celu i...

Identyfikacja kompletnego zestawu elementów kodujących w genomie była głównym celem od momentu rozpoczęcia Projektu Poznania Ludzkiego Genomu i pozostaje głównym celem w kierunku zrozumienia systemów biologicznych i etiologii chorób genetycznych1,2,3,4. Postępy w technikach NGS doprowadziły do wytworzenia całych sekwencji genomu dla dużej liczby organizmów, w tym kręgowców, bezkręgowców, drożdży i roślin5. Ponadto wysokoprzepustowe metody sekwencjonowania transkrypcji jeszcze bardziej ujawniły złożoność transkryptomu komórkowego i zidentyfikowały tysiące nowych cząsteczek RNA o funkcjach zarówno kodowania białek, jak i niekodowania6,7. Dekodowanie tej ogromnej ilości informacji o sekwencji jest procesem ciągłym, a wyzwania związane z kompleksowymi wysiłkami w zakresie adnotacji genów nadal istnieją8.
Niedawny rozwój metod profilowania translacyjnego, w tym profilowania rybosomów9,10 i sekwencjonowanie polirybosomów11, dostarczyły dowodów wskazujących, że setki niekanonicznych zdarzeń translacji mapują na obecnie nieoznaczone sORFy w całym genomie, z potencjałem do generowania małych białek zwanych mikroproteinami lub mikropeptydami12,13,14,15,16,17. Mikroproteiny pojawiły się jako nowa klasa wszechstronnych białek, wcześniej pomijanych przez standardowe metody adnotacji genów ze względu na ich mały rozmiar (<100 aminokwasów) i brak klasycznych cech genów kodujących białka8,12,18,19,20. Mikroproteiny zostały opisane praktycznie we wszystkich organizmach, w tym drożdżach21,22, flies17,23,24, and mammals25,26,27,28i wykazano, że odgrywają kluczową rolę w różnych procesach, w tym w rozwoju, metabolizmie i sygnalizacji stresu19,20,29,30,31,32,33,34. W związku z tym konieczne jest kontynuowanie eksploracji genomu w poszukiwaniu dodatkowych członków tej długo pomijanej klasy funkcjonalnych małych białek.
Pomimo powszechnego uznania biologicznego znaczenia mikrobiałek, ta klasa genów pozostaje zdecydowanie niedostatecznie reprezentowana w adnotacjach genomu, a ich dokładna identyfikacja nadal stanowi ciągłe wyzwanie, które hamuje postęp w tej dziedzinie. Ostatnio opracowano różne narzędzia obliczeniowe i metody eksperymentalne w celu przezwyciężenia trudności związanych z identyfikacją sekwencji kodujących mikrobiałka (omówione obszernie w kilku obszernych przeglądach8,35,36,37). Wiele ostatnich badań nad identyfikacją mikrobiałek38,39,40,41,42,43,44,45,46,47 w dużym stopniu polegały na użyciu jednego z takich algorytm o nazwie PhyloCSF48,49, potężne podejście genomiki porównawczej, które można wykorzystać do odróżnienia konserwatywnych regionów genomu kodujących białka od tych, które nie kodują.
PhyloCSF porównuje częstość substytucji kodonów (CSF) za pomocą wielogatunkowych dopasowań nukleotydów i modeli filogenetycznych do wykrywania ewolucyjnych sygnatur genów kodujących białka. To empiryczne podejście oparte na modelu opiera się na założeniu, że białka są przede wszystkim konserwatywne na poziomie aminokwasów, a nie sekwencji nukleotydów. Dlatego substytucje synonimiczne kodonów, które kodują ten sam aminokwas, lub substytucje kodonów do aminokwasów o konserwatywnych właściwościach (tj. ładunek, hydrofobowość, polarność) są oceniane pozytywnie, podczas gdy substytucje niesynonimiczne, w tym podstawienia missense i nonsensowne, są oceniane negatywnie. PhyloCSF jest szkolony na danych z całego genomu i okazał się skuteczny w ocenianiu krótkich fragmentów sekwencji kodującej (CDS) w izolacji od pełnej sekwencji, co jest niezbędne podczas analizy mikrobiałek lub pojedynczych eksonów standardowych genów kodujących białka48,49.
Warto zauważyć, że niedawna integracja węzłów śledzenia PhyloCSF w przeglądarce genomów Uniwersytetu Kalifornijskiego w Santa Cruz (UCSC)49,50,51 umożliwia badaczom ze wszystkich środowisk łatwy dostęp do przyjaznego dla użytkownika interfejsu w celu wyszukiwania informacji o potencjał kodowania białek w regionach genomu. Protokół opisany poniżej zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące ładowania koncentratorów śledzenia PhyloCSF w przeglądarce genomu UCSC, a następnie przesłuchiwania interesujących regionów genomowych w celu zbadania regionów kodujących białka o wysokim poziomie ufności (lub ich braku). Dodatkowo, w przypadku zaobserwowania dodatniego wyniku PhyloCSF, wyznaczane są kroki w celu dalszej analizy potencjału kodowania mikrobiałek i wydajnego generowania wielogatunkowych dopasowań zidentyfikowanych sekwencji aminokwasów w celu zilustrowania zachowania sekwencji międzygatunkowych. Wreszcie, w dyskusji przedstawiono kilka dodatkowych publicznie dostępnych zasobów i narzędzi w celu zbadania zidentyfikowanych cech mikrobiałek, w tym przewidywanych struktur domenowych i wglądu w przypuszczalną funkcję mikroprotein.

<table><tbody><tr><td>Website<</td><td>strong>Website Address</td><td>Requirements</td><td></td></tr><tr><td>Clustal Omega Multiple Sequence Alignment Tool</td><td><a href="https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/">https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/</a></td><td>Web browser</td><td>Program do wyrównywania wielu sekwencji do efektywnego dopasowywania sekwencji FASTA (tj. do międzygatunkowego porównywania zidentyfikowanych mikrobiałek)</td></tr><tr><td>COXPRESSdb</td><td><a href="https://coxpresdb.jp">https://coxpresdb.jp</a></td><td>Przeglądarka internetowa</td><td>Zapewnia współregulowane relacje genów w celu oszacowania funkcji genów</td></tr><tr><td>Narzędzia bioinformatyczne EMBL-EBI FAQs</td><td><a href="https://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/JDSAT/Bioinformatics+Tools+FAQ">https://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/JDSAT/Bioinformatics+Tools+FAQ</a></td><td>Często</td><td>zadawane pytania (FAQ) dotyczące narzędzi EMBL-EBI w przeglądarce internetowej. Zawiera klucz kodowania kolorami do dopasowania sekwencji białek</td></tr><tr><td>Europejski Instytut Bioinformatyki (EMBL-EBI), Narzędzia i zasoby danych</td><td><a href="https://www.ebi.ac.uk/services/all">https://www.ebi.ac.uk/services/all</a></td><td>Przeglądarka internetowa</td><td>Pełna lista ogólnodostępnych stron internetowych, narzędzi i zasobów danych</td></tr><tr><td>Expasy - Szwajcarski Portal</td> <td>Zasobów Bioinformatycznych<a href="https://www.expasy.org">https://www.expasy.org</a></td><td>Przeglądarka internetowa</td><td>Zestaw narzędzi i zasobów bioinformatycznych do analizy sekwencji białek, który jest utrzymywany przez Szwajcarski Instytut Bioinformatyki (SIB)</td></tr><tr><td>Narodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej (NCBI) Conserved Domain Search</td><td><a href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi</a>Przeglądarka</td> <td>internetowa</td><td>Narzędzie do identyfikacji konserwatywnych domen w obrębie sekwencji białkowych lub kodujących nukleotydy</td></tr><tr><td>Pfam 35</td><td><a href="http://pfam.xfam.org">http://pfam.xfam.org</a>Przeglądarka</td> <td>internetowa</td><td>Baza danych rodziny białek (Pfam), zapewnia wyrównanie i klasyfikację rodziny i domeny białek</td></tr><tr><td>PhyloCSF Track Hub Opis</td><td><a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?hgsid=1267045267_TEc99h2oW5QedaCd4ir8aZ65ryaD&amp; db=mm10& c=CHR2& g=hub_109801_PhyloCSF_smooth"> https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?hgsid=1267045267_TEc99h2oW5Q edaCd4ir8aZ65ryaD&db=mm10 &c=chr2&g=hub_109801_ PhyloCSF_smooth</a></td><td>Przeglądarka internetowa</td><td>Szczegółowy opis wygładzonych ścieżek PhyloCSF i PhyloCSF Track Hub &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td></tr><tr><td>SignalP 6.0</td><td><a href="https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? SignalP-6.0">https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? SignalP-6.0</a></td><td>Przeglądarka internetowa</td><td>Przewiduje obecność peptydów sygnałowych i lokalizację miejsc ich rozszczepienia</td></tr><tr><td>TMHMM - 2.0</td><td><a href="https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? TMHMM-2.0">https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? TMHMM-2.0</a></td><td>Przeglądarka internetowa</td><td>Przewidywanie helis transbłonowych w białkach</td></tr><tr><td>UCSC Genome Browser BLAT Search</td><td><a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat</a></td><td>Przeglądarka internetowa</td><td>Narzędzie służące do znajdowania regionów genomu na podstawie informacji o sekwencji DNA lub białka</td></tr><tr><td>UCSC Genome Browser Gateway</td><td><a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway</a></td><td>Przeglądarka internetowa</td><td>Bezpośredni link do UCSC Genome Browser Gateway</td></tr><tr><td>UCSC Genome Browser Home</td><td><a href="https://genome.ucsc.edu/">https://genome.ucsc.edu/</a></td><td>Web browser</td><td>Strona główna przeglądarki UCSC</td></tr><tr><td>Genome Browser UCSC Genome Browser Track Data Hubs</td><td><a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubs">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubs</a></td><td>Przeglądarka internetowa</td><td>Bezpośredni link do bazy danych Track Data Hubs/Public Hubs w celu wyszukania i załadowania PhyloCSF Tracks</td></tr><tr><td>UCSC Genome Browser User Guide</td><td><a href="https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html">https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html</ a></td><td>Web browser</td><td>Obszerny podręcznik użytkownika opisujący sposób poruszania się po UCSC Genome Browser</td></tr><tr><td>WoLF PSORT</td><<td>a href="https://wolfpsort.hgc.jp">https://wolfpsort.hgc.jp</a></td><td>Web browser</td><td>Narzędzie do przewidywania lokalizacji subkomórkowej białek</td></tr></tbody></table>

zintegrowane podejście do identyfikacji mikrobiałek i analizy sekwencji

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) popchnęło dziedzinę genomiki do przodu i stworzyło sekwencje całego genomu dla wielu gatunków zwierząt i organizmów modelowych. Jednak pomimo tego bogactwa informacji o sekwencjach, kompleksowe wysiłki w zakresie adnotacji genów okazały się wyzwaniem, zwłaszcza w przypadku małych białek. Warto zauważyć, że konwencjonalne metody adnotacji białek zostały zaprojektowane tak, aby celowo wykluczyć domniemane białka kodowane przez krótkie otwarte ramki odczytu (sORF) o długości mniejszej niż 300 nukleotydów, aby odfiltrować wykładniczo większą liczbę fałszywych niekodujących sORF w całym genomie. W rezultacie, setki funkcjonalnych małych białek zwanych mikroproteinami (o długości <100 aminokwasów) zostały błędnie sklasyfikowane jako niekodujące RNA lub całkowicie pominięte.
Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół wykorzystania darmowych, publicznie dostępnych narzędzi bioinformatycznych do przeszukiwania regionów genomu pod kątem potencjału kodowania mikrobiałek w oparciu o ewolucyjną ochronę. W szczególności udostępniamy instrukcje krok po kroku, jak badać potencjał zachowania i kodowania sekwencji przy użyciu częstotliwości substytucji kodonów filogenetycznych (PhyloCSF) w przyjaznej dla użytkownika przeglądarce genomu Uniwersytetu Kalifornijskiego Santa Cruz (UCSC). Ponadto szczegółowo opisujemy kroki w celu efektywnego generowania wielu gatunków dopasowań zidentyfikowanych sekwencji mikroprotein w celu wizualizacji zachowania sekwencji aminokwasów i zalecamy zasoby do analizy cech mikroprotein, w tym przewidywanych struktur domenowych. Te potężne narzędzia mogą być wykorzystane do identyfikacji przypuszczalnych sekwencji kodujących mikrobiałka w niekanonicznych regionach genomu lub do wykluczenia obecności konserwatywnej sekwencji kodującej o potencjale translacyjnym w niekodującym transkryptach będących przedmiotem zainteresowania.

W niniejszym przykładzie wykorzystamy zwalidowane mikrobiałko mitoregulinę (Mtln), aby zademonstrować, w jaki sposób konserwatywne sORF generuje dodatni wynik PhyloCSF, który można łatwo zwizualizować i przeanalizować w przeglądarce UCSC Genome Browser. Mitoregulina była wcześniej adnotowana jako niekodujące RNA (wcześniej ludzki identyfikator genu LINC00116 i mysi identyfikator genu 1500011K16Rik). Metody genomiki porównawczej i analizy konserwacji sekwencji odegrały kluczową rolę w jej początkowym od...

Opisany tutaj protokół zawiera szczegółowe instrukcje, jak analizować interesujące regiony genomu pod kątem potencjału kodowania mikrobiałek za pomocą PhyloCSF w przyjaznej dla użytkownika przeglądarce genomu UCSC. Ponadto zaleca się stosowanie kilku narzędzi i zasobów w celu dalszego zbadania charakterystyki sekwencji zidentyfikowanych mikrobiałek w celu uzyskania wglądu w ich przypuszczalne funkcje.

Zintegrowane podejście do identyfikacji mikrobiałek i analizy sekwencji

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model ...

Opisany tutaj protokół zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące analizowania regionów genomowych będących przedmiotem zainteresowania pod kątem potencjału kodowania białek przy użyciu phyloCSF w przyjaznej dla użytkownika przeglądarce genomu UCSC. PhloCSF może skutecznie identyfikować konserwatywne krótkie otwarte ramki odczytu z potencjałem kodowania mikrobiałek w regionach genomu, które są obecnie oznaczone jako niekodujące. Opisane tutaj metody są łatwe w użyciu i mogą być wdrażane przez badaczy ze wszystkich środowisk bez wcześniejszego szkolenia lub wiedzy specjalistycznej w zakresie bioinformatyki lub genomiki porównawczej.Aby rozpocząć, otwórz okno przeglądarki internetowej i przejdź do przeglądarki genomu Uniwersytetu Kalifornijskiego w Santa Cruz lub UCSC. Pod nagłówkiem nasze narzędzia wybierz opcję piast torów. Na karcie Centra publiczne wpisz phyloCSF w polu wyszukiwanych terminów.Następnie kliknij przycisk wyszukiwania w centrach publicznych. Połącz się z phyloCSF, klikając przycisk połączenia dla nazwy huba phyloCSF. Po kliknięciu przycisku połącz poczekaj na przekierowanie na stronę bramy przeglądarki genomu UCSC.Aby zapytać o inny gatunek, wybierz interesujący Cię gatunek pod nagłówkiem przeglądaj lub wybierz gatunek, klikając odpowiednią ikonę, lub wpisz gatunek w polu tekstowym, które mówi, wprowadź nazwę zwyczajową gatunku lub identyfikator zespołu.Korzystając z menu rozwijanego, wybierz zestaw do wyszukiwania w zdefiniowanym nagłówku pozycji, a następnie wprowadź symbol genu pozycji lub wyszukiwane terminy w polu pozycji lub wyszukiwanego terminu i kliknij Przejdź, aby nawigować do genu będącego przedmiotem zainteresowania w przeglądarce genomu. Jeśli wyszukiwanie wykazało wiele dopasowań, poczekaj na przekierowanie na stronę, która wymaga wyboru interesującej Cię pozycji, a następnie kliknij odpowiedni gen zainteresowania. Po przejściu do przeglądarki genomu UCSC wybierz narzędzie do wyrównywania przypominające wybuch lub blat pod nagłówkiem nasze narzędzia, aby zapytać o określoną sekwencję DNA lub białka.Alternatywnie najedź kursorem na zakładkę narzędzi i wybierz opcję blat lub skorzystaj z podanego linku. Korzystając z menu rozwijanego, wybierz interesujący Cię gatunek, genom i zestaw. Następnie zdefiniuj typ zapytania, wklej interesującą Cię sekwencję w polu tekstowym genomu wyszukiwania blat i kliknij przycisk Prześlij.Następnie kliknij łącze przeglądarki pod nagłówkiem akcji, aby przejść do interesującego Cię regionu genomowego. Wizualnie skanuj obszar zainteresowania genomu pod kątem pozytywnie ocenianych regionów filoCSF. Użyj funkcji powiększania, aby powiększyć obszary zainteresowania w celu zbadania charakterystyki sekwencji i wyszukania kodonów start i stop.Aby powiększyć ręcznie, przytrzymaj Shift oraz kliknij i przytrzymaj przycisk myszy podczas przeciągania wzdłuż obszaru zainteresowania. Możesz też użyć przycisków powiększania i pomniejszania u góry strony, aby nawigować. Powiększ, aż sekwencja nukleotydów lub zasad będzie widoczna.Wizualnie zeskanuj sekwencję pływów jądrowych w pobliżu początku i końca pozytywnie punktowanych regionów filoCSF, aby zidentyfikować karne kodony startu i stopu. Najedź kursorem myszy na nagłówek widoku u góry strony i kliknij opcję konwersji w innych genomach, a następnie zdefiniuj interesujący Cię genom za pomocą menu rozwijanego poniżej nowego nagłówka genomu. Wybierz interesujący Cię zestaw genomiczny pod nagłówkiem nowego zestawu i kliknij przycisk Prześlij.Gdy przeglądarka zwróci listę regionów w nowym zestawie z podobieństwem. Kliknij link do pozycji chromosomu, aby przejść do homologicznego regionu zainteresowania. Postępuj zgodnie ze strategiami nawigacyjnymi opisanymi wcześniej, aby przeanalizować sekwencję.Aby przejść do strony z opisem genu, kliknij interesujący nas gen na ścieżce kodu genu w przeglądarce genomu UCSC. Pod nagłówkiem sekwencja i linki do narzędzi i baz danych kliknij link w tabeli, który szybciej odczytuje inne gatunki. Kliknij pola powiązane z interesującymi Cię gatunkami, aby je wybrać.Następnie kliknij Prześlij. Skopiuj i wklej sekwencje pojawiające się u dołu strony w szybszym formacie do dokumentu edytora tekstu. Następnie otwórz drugie okno przeglądarki i przejdź do narzędzia do wyrównywania wielu sekwencji clustal omega na stronie Europejskiego Instytutu Bioinformatyki.Wklej pliki sekwencji ze schowka do pola w kroku pierwszym, które odczytuje sekwencje w dowolnym obsługiwanym formacie. Przewiń do dołu strony i kliknij Prześlij. Obserwuj poniżej wyrównane wyniki dla symboli, które wskazują stopień zachowania każdego aminokwasu.Aby wyświetlić właściwości i kolor aminokwasów, kliknij link pokaż kolory bezpośrednio nad sekwencjami, aby pokolorować aminokwasy zgodnie z ich właściwościami. Następnie skopiuj i wklej wyrównanie sekwencji do edytora tekstu lub programu do pokazu slajdów, aby wygenerować plik rysunku lub ilustracji. Aby wyświetlić inne wyniki ze strony wyników clustal omega, kliknij na zakładki drzewo przewodnika lub drzewo genetyczne phylo.Na koniec kliknij zakładkę przeglądarki wyników, aby wyświetlić informacje o sekwencji za pomocą jalview lub uzyskać dostęp do bezpośrednich linków do mview i prostej filogenezy. Reprezentatywna analiza filoCSF genu mitoreguliny wskazuje na region o wysokiej zachowaniu sekwencji odpowiadający zwalidowanemu mikrobiałku. Pełna sekwencja kodująca mitoregulinę jest zawarta w eksonie pierwszym i osiąga bardzo wysokie wyniki na filoCSF minus jedna ścieżka.Zachowany kodon start można zaobserwować na początku obszaru dodatnio punktowanego w filoCSF minus jedna ścieżka. Obszar dodatnio punktowany w pierwszym eksonie mitoreguliny zaczyna się bezpośrednio nad kodonem start i kończy się na kodonie stop. Pokazano tutaj wielosekwencyjne wyrównanie mikrobiałkowej mitoreguliny dla ośmiu różnych gatunków.Analiza długiego, niekodującego gorącego powietrza RNA wykazała ujemny wynik w całym genie na wszystkich sześciu ścieżkach, co wskazuje na brak zachowania sekwencji i potwierdza, że gorące powietrze jest poprawnie oznaczone jako niekodujące RNA. Analiza phyloCSF mysiego genu jeden, osiem, jeden, zero, zero, pięć, osiem, I 24 rike wykazała, że zachowana otwarta ramka odczytu obejmuje trzy eksony, a dodatni wynik filoCSF przeskakuje z toru plus dwa w eksonie pierwszym do toru plus trzy w eksonie drugim, a następnie z powrotem do toru plus dwa w eksonie trzecim. Analiza phyloCSF locus genu meet one została również skutecznie wykorzystana do identyfikacji wielu odrębnych kodujących otwartych ramek odczytu w pojedynczej cząsteczce RNA.Ważne jest, aby zauważyć, że chociaż dodatni wynik filoCSF jest wysoce sugerujący zdolność kodowania mikrobiałek, ta linia dowodów nie może być samodzielna i musi zostać zweryfikowana eksperymentalnie. Po zidentyfikowaniu okresu mikrobiałka sekwencja aminokwasów może być analizowana pod kątem konserwatywnych domen lub cech sekwencji, aby zapewnić wgląd w jej funkcję. PhyloCSF został skutecznie wykorzystany do identyfikacji nowych mikrobiałek w regionach genomu, które wcześniej uważano za niekodujące, i będzie nadal pomocnym narzędziem w przyszłych badaniach nad identyfikacją mikrobiałek.

an-integrated-approach-for-microprotein-identification-sequence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Związki wychwytujące (Capture Compounds) to trifunkcyjne małe cząsteczki służące do redukcji złożoności proteomu poprzez funkcjonalną, odwracalną oddziaływanie małej cząsteczki z białkiem, a następnie fotousieciowanie i oczyszczanie. W niniejszej procedurze wykorzystujemy związek wychwytujący z funkcją selektywności wiązania S-adenozylo-L-homocysteiny w celu wyizolowaniay metylotransferaz z lizatu całych komórek Escherichia coli oraz ich identyfikacji metodą MS.

Profilowanie metylotransferaz i innych białek wiążących S-adenozylo- L-homocysteinę za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związków wychwytujących (CCMS)

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Ten protokół służy do ekstrakcji i koncentracji białka i DNA z biomasy mikrobiologicznej zebranej z wody morskiej, a następnie do generowania peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy proteomicznej opartej na tandemowej spektrometrii mas.

Przebieg metaproteomiki mikrobiologicznej organizmów wodnych: od komórek do peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy opartej na tandemowej spektrometrii mas

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Architektura kompleksów białkowych jest niezbędna dla ich funkcjonowania. Połączenie różnych technik spektrometrii mas okazało się skuteczne w badaniu ich składania. Udostępniamy protokoły sieciowania chemicznego i natywnej spektrometrii mas oraz pokazujemy, w jaki sposób te uzupełniające się techniki pomagają wyjaśnić architekturę wielopodjednostkowych zespołów białkowych.

Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych

Udostępniamy krok po kroku protokół dla split-BioID, testu komplementacji fragmentów białek opartego na technice znakowania zbliżeniowego BioID. Aktywowany w wyniku interakcji dwóch podanych białek, umożliwia analizę proteomiczną zależnych od kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym. Metoda jest prosta, opłacalna i wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Split-BioID — Analiza proteomiczna specyficznych dla kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym

Tutaj prezentujemy protokół szybkiej identyfikacji białek wytwarzanych przez genomowo sekwencjonowane bakterie chorobotwórcze za pomocą tandemowej spektrometrii mas MALDI-TOF-TOF i odgórnej analizy proteomicznej za pomocą oprogramowania opracowanego przez nas. Metastabilne jony białkowe fragmentują się ze względu na działanie kwasu asparaginowego i ta specyficzność jest wykorzystywana do identyfikacji białek.

Identyfikacja białek odporności przeciwbakteryjnej w Escherichia coli za pomocą MALDI-TOF-TOF-MS/MS i odgórnej analizy proteomicznej

Metaproteomika kliniczna oferuje wgląd w ludzki mikrobiom i jego wpływ na choroby. Wykorzystaliśmy moc obliczeniową platformy Galaxy do opracowania modułowego przepływu pracy bioinformatycznego, który ułatwia złożoną analizę metaproteomiczną opartą na spektrometrii mas i charakteryzację różnych typów próbek klinicznych istotnych dla badań nad chorobami.

Przepływ pracy metaproteomiki klinicznej wdrożony w ramach platformy bioinformatycznej Galaxy w celu analizy interakcji gospodarz-mikrobiom leżących u podstaw chorób człowieka

Poznaj metodę identyfikacji mikrobiałek z użyciem narzędzia PhyloCSF w przeglądarce UCSC Genome Browser. Protokół umożliwia analizę potencjału kodującego regionów genomowych bez wcześniejszego doświadczenia w bioinformatyce.

Zintegrowane podejście do identyfikacji mikrobiałek i analizy sekwencji

Przeglądaj więcej filmów