Zintegrowane podejście do identyfikacji mikrobiałek i analizy sekwencji

Opisany tutaj protokół zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące analizowania regionów genomowych będących przedmiotem zainteresowania pod kątem potencjału kodowania białek przy użyciu phyloCSF w przyjaznej dla użytkownika przeglądarce genomu UCSC. PhloCSF może skutecznie identyfikować konserwatywne krótkie otwarte ramki odczytu z potencjałem kodowania mikrobiałek w regionach genomu, które są obecnie oznaczone jako niekodujące. Opisane tutaj metody są łatwe w użyciu i mogą być wdrażane przez badaczy ze wszystkich środowisk bez wcześniejszego szkolenia lub wiedzy specjalistycznej w zakresie bioinformatyki lub genomiki porównawczej.

Aby rozpocząć, otwórz okno przeglądarki internetowej i przejdź do przeglądarki genomu Uniwersytetu Kalifornijskiego w Santa Cruz lub UCSC. Pod nagłówkiem nasze narzędzia wybierz opcję piast torów. Na karcie Centra publiczne wpisz phyloCSF w polu wyszukiwanych terminów.

Następnie kliknij przycisk wyszukiwania w centrach publicznych. Połącz się z phyloCSF, klikając przycisk połączenia dla nazwy huba phyloCSF. Po kliknięciu przycisku połącz poczekaj na przekierowanie na stronę bramy przeglądarki genomu UCSC.

Aby zapytać o inny gatunek, wybierz interesujący Cię gatunek pod nagłówkiem przeglądaj lub wybierz gatunek, klikając odpowiednią ikonę, lub wpisz gatunek w polu tekstowym, które mówi, wprowadź nazwę zwyczajową gatunku lub identyfikator zespołu.Korzystając z menu rozwijanego, wybierz zestaw do wyszukiwania w zdefiniowanym nagłówku pozycji, a następnie wprowadź symbol genu pozycji lub wyszukiwane terminy w polu pozycji lub wyszukiwanego terminu i kliknij Przejdź, aby nawigować do genu będącego przedmiotem zainteresowania w przeglądarce genomu. Jeśli wyszukiwanie wykazało wiele dopasowań, poczekaj na przekierowanie na stronę, która wymaga wyboru interesującej Cię pozycji, a następnie kliknij odpowiedni gen zainteresowania. Po przejściu do przeglądarki genomu UCSC wybierz narzędzie do wyrównywania przypominające wybuch lub blat pod nagłówkiem nasze narzędzia, aby zapytać o określoną sekwencję DNA lub białka.

Alternatywnie najedź kursorem na zakładkę narzędzi i wybierz opcję blat lub skorzystaj z podanego linku. Korzystając z menu rozwijanego, wybierz interesujący Cię gatunek, genom i zestaw. Następnie zdefiniuj typ zapytania, wklej interesującą Cię sekwencję w polu tekstowym genomu wyszukiwania blat i kliknij przycisk Prześlij.

Następnie kliknij łącze przeglądarki pod nagłówkiem akcji, aby przejść do interesującego Cię regionu genomowego. Wizualnie skanuj obszar zainteresowania genomu pod kątem pozytywnie ocenianych regionów filoCSF. Użyj funkcji powiększania, aby powiększyć obszary zainteresowania w celu zbadania charakterystyki sekwencji i wyszukania kodonów start i stop.

Aby powiększyć ręcznie, przytrzymaj Shift oraz kliknij i przytrzymaj przycisk myszy podczas przeciągania wzdłuż obszaru zainteresowania. Możesz też użyć przycisków powiększania i pomniejszania u góry strony, aby nawigować. Powiększ, aż sekwencja nukleotydów lub zasad będzie widoczna.

Wizualnie zeskanuj sekwencję pływów jądrowych w pobliżu początku i końca pozytywnie punktowanych regionów filoCSF, aby zidentyfikować karne kodony startu i stopu. Najedź kursorem myszy na nagłówek widoku u góry strony i kliknij opcję konwersji w innych genomach, a następnie zdefiniuj interesujący Cię genom za pomocą menu rozwijanego poniżej nowego nagłówka genomu. Wybierz interesujący Cię zestaw genomiczny pod nagłówkiem nowego zestawu i kliknij przycisk Prześlij.

Gdy przeglądarka zwróci listę regionów w nowym zestawie z podobieństwem. Kliknij link do pozycji chromosomu, aby przejść do homologicznego regionu zainteresowania. Postępuj zgodnie ze strategiami nawigacyjnymi opisanymi wcześniej, aby przeanalizować sekwencję.

Aby przejść do strony z opisem genu, kliknij interesujący nas gen na ścieżce kodu genu w przeglądarce genomu UCSC. Pod nagłówkiem sekwencja i linki do narzędzi i baz danych kliknij link w tabeli, który szybciej odczytuje inne gatunki. Kliknij pola powiązane z interesującymi Cię gatunkami, aby je wybrać.

Następnie kliknij Prześlij. Skopiuj i wklej sekwencje pojawiające się u dołu strony w szybszym formacie do dokumentu edytora tekstu. Następnie otwórz drugie okno przeglądarki i przejdź do narzędzia do wyrównywania wielu sekwencji clustal omega na stronie Europejskiego Instytutu Bioinformatyki.

Wklej pliki sekwencji ze schowka do pola w kroku pierwszym, które odczytuje sekwencje w dowolnym obsługiwanym formacie. Przewiń do dołu strony i kliknij Prześlij. Obserwuj poniżej wyrównane wyniki dla symboli, które wskazują stopień zachowania każdego aminokwasu.

Aby wyświetlić właściwości i kolor aminokwasów, kliknij link pokaż kolory bezpośrednio nad sekwencjami, aby pokolorować aminokwasy zgodnie z ich właściwościami. Następnie skopiuj i wklej wyrównanie sekwencji do edytora tekstu lub programu do pokazu slajdów, aby wygenerować plik rysunku lub ilustracji. Aby wyświetlić inne wyniki ze strony wyników clustal omega, kliknij na zakładki drzewo przewodnika lub drzewo genetyczne phylo.

Na koniec kliknij zakładkę przeglądarki wyników, aby wyświetlić informacje o sekwencji za pomocą jalview lub uzyskać dostęp do bezpośrednich linków do mview i prostej filogenezy. Reprezentatywna analiza filoCSF genu mitoreguliny wskazuje na region o wysokiej zachowaniu sekwencji odpowiadający zwalidowanemu mikrobiałku. Pełna sekwencja kodująca mitoregulinę jest zawarta w eksonie pierwszym i osiąga bardzo wysokie wyniki na filoCSF minus jedna ścieżka.

Zachowany kodon start można zaobserwować na początku obszaru dodatnio punktowanego w filoCSF minus jedna ścieżka. Obszar dodatnio punktowany w pierwszym eksonie mitoreguliny zaczyna się bezpośrednio nad kodonem start i kończy się na kodonie stop. Pokazano tutaj wielosekwencyjne wyrównanie mikrobiałkowej mitoreguliny dla ośmiu różnych gatunków.

Analiza długiego, niekodującego gorącego powietrza RNA wykazała ujemny wynik w całym genie na wszystkich sześciu ścieżkach, co wskazuje na brak zachowania sekwencji i potwierdza, że gorące powietrze jest poprawnie oznaczone jako niekodujące RNA. Analiza phyloCSF mysiego genu jeden, osiem, jeden, zero, zero, pięć, osiem, I 24 rike wykazała, że zachowana otwarta ramka odczytu obejmuje trzy eksony, a dodatni wynik filoCSF przeskakuje z toru plus dwa w eksonie pierwszym do toru plus trzy w eksonie drugim, a następnie z powrotem do toru plus dwa w eksonie trzecim. Analiza phyloCSF locus genu meet one została również skutecznie wykorzystana do identyfikacji wielu odrębnych kodujących otwartych ramek odczytu w pojedynczej cząsteczce RNA.

Ważne jest, aby zauważyć, że chociaż dodatni wynik filoCSF jest wysoce sugerujący zdolność kodowania mikrobiałek, ta linia dowodów nie może być samodzielna i musi zostać zweryfikowana eksperymentalnie. Po zidentyfikowaniu okresu mikrobiałka sekwencja aminokwasów może być analizowana pod kątem konserwatywnych domen lub cech sekwencji, aby zapewnić wgląd w jej funkcję. PhyloCSF został skutecznie wykorzystany do identyfikacji nowych mikrobiałek w regionach genomu, które wcześniej uważano za niekodujące, i będzie nadal pomocnym narzędziem w przyszłych badaniach nad identyfikacją mikrobiałek.