Oczyszczanie i kontrola jakości rekombinowanych kompleksów septynowych do rekonstytucji bezkomórkowej

Protokół ten umożliwia oczyszczanie wysokiej jakości kompleksów septynowych, co jest niezbędne do zbadania wielu ról septyn w komórce. Główną zaletą tego podejścia jest synteza prostej procedury oczyszczania wysokiej jakości septyny za pomocą plazmidów Addgene. Septyny są trudne do zbadania w komórkach ze względu na ich liczne interakcje.

Rekonstytucja siarki pomaga nam rozwikłać tę złożoność, badając je w prostym systemie. Zalecamy oczyszczanie w ciągu jednego dnia, aby zapobiec degradacji. Z naszego doświadczenia wynika, że wydłuży to żywotność i jakość białka.

Na początek hoduj przekształconą kulturę bakteryjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsarką, aż gęstość optyczna przy długości fali 600 nanometrów osiągnie od dwóch do trzech dla nieznakowanych septyn lub 0,6 do 0,8 dla septyn znakowanych msfGFP lub mEGFP. Po inkubacji indukuj ekspresję białka, dodając IPTG do końcowego stężenia 0,5 milimola i inkubuj komórki wyrażające nieznakowane heterooligomery septyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny przez trzy godziny lub komórki wykazujące ekspresję heterooligomerów znakowanych msfGFP w temperaturze 17 stopni Celsjusza przez noc. Następnie granuluj komórki w temperaturze 4000 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odrzucić supernatant i rozpuścić osad w 100 mililitrach buforu do lizy w celu lizy komórek. Następnie użyj sonikatora z końcówką o amplitudzie 30%, aby sonikować komórkę. Klarować lizat komórkowy przez odwirowanie w temperaturze 20 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zachować supernatant.

Opcjonalnie należy pobrać próbkę do elektroforezy denaturującej zgodnie z opisem w manuskrypcie. W przypadku chromatografii powinowactwa septyn znakowanych Hisem, należy zrównoważyć wstępnie wypełnioną kolumnę do chromatografii wysokosprawnej sefarozy niklu ze wszystkimi wymaganymi. Załadować sklarowany supernatant do kolumny i uruchomić system chromatograficzny.

Następnie eluować kompleksy septynowe za pomocą 50% buforu elucyjnego HisTrap przy natężeniu przepływu jednego mililitra na minutę. Aby uzyskać stężenie imidazolu 250 milimolów, zbierz frakcje 0,5 mililitra. Teraz monitoruj absorbancję optyczną eluatu przy 280 nanometrach za pomocą systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek i wybierz frakcje zawierające kompleksy septyny.

W przypadku chromatografii powinowactwa białek znakowanych Strep-II należy zrównoważyć wstępnie upakowaną kolumnę do chromatografii wysokosprawnej Sepharose StrepTactin z buforem septyny. Załadować septynę zawierającą frakcje odzyskane z kolumny niklu z szybkością jednego mililitra na minutę i uruchomić system chromatograficzny. Następnie przemyć związane białko i wymyć kompleksy septyny 100% buforem elucyjnym StrepTrap przy natężeniu przepływu jednego mililitra na minutę.

Aby uzyskać stężenie 2,5 milimolowej destiobiozyny, zbierz frakcje 0,5 mililitra. Wybrać frakcje zawierające kompleksy septyny, jak wskazuje absorbancja optyczna eluatu przy 280 nanometrach, monitorowana online za pomocą systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek. Po usunięciu destiobiotyny przez dializę podwielokrotność kompleksów białkowych do pożądanej podwielokrotności, zatrzaskowo zamrozić podwielokrotność i przechowywać ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

W przypadku interferometrycznej mikroskopii rozpraszania umyj szkiełka podstawowe nr 1.5, sonikując je w myjce ultradźwiękowej przez pięć minut w wodzie, izopropanolu i ponownie w wodzie dejonizowanej. Wysuszyć dwa szkiełka podstawowe delikatnym strumieniem azotu. Następnie umieść siedmiomikrolitrową kroplę 0,01% roztworu poli-L-lizyny na środku jednego z szkiełek i umieść środek drugiego szkiełka na kropli poli-L-lizyny, ustawiając obie szkiełka prostopadle w celu łatwego rozdzielenia.

Po inkubacji przez 30 sekund umyć szkiełko, zanurzając je jednokrotnie w zlewce zawierającej wodę dejonizowaną i dwukrotnie bezpośrednio nanosząc strumień wody. Wysusz je strumieniem azotu, a szkiełka te można przechowywać przez około sześć tygodni w temperaturze pokojowej w suchych warunkach. Przed eksperymentem wytnij kawałek uszczelek dwa na dwa, trzy na dwa lub trzy na trzy i przyklej je do części szkła pokrytej poli-L-lizyną, unikając kontaktu szkiełka szkiełkowego i uszczelek z brudną powierzchnią, umieszczając szkiełko na lekkiej chusteczce do wycieraczek.

Teraz dociśnij uszczelki końcówką pipety, aby przykleić je do ochronnego tworzywa sztucznego znajdującego się na uszczelkach. Następnie podgrzej bufor septyny do temperatury pokojowej. Rozmrozić białka w dłoni, a następnie trzymać je na lodzie.

Następnie umieść szkiełko z uszczelkami na komercyjnym systemie fotometrii masowej zawierającym 19 mikrolitrów buforu septynowego i ustaw ostrość mikroskopu za pomocą opcji autofokusa. Ustaw ponownie ostrość z nowymi ustawieniami, korzystając z opcji autofokusa. Aby utworzyć folder projektu, kliknij Plik, a następnie Nowy projekt, a aby załadować folder projektu do przechowywania danych, kliknij Plik, a następnie Załaduj projekt.

Następnie odpipetować jeden mikrolitr próbki do 19 mikrolitrów kropli buforu przegrody. Mieszaj, a podczas mieszania unikaj dotykania czegokolwiek, aby zapobiec ruchowi szkiełka. Następnie nagraj wideo o długości 6 000 klatek, klikając Nagraj.

Przeanalizuj filmy za pomocą oprogramowania producenta, aby uzyskać rozkład masy białka. Jeśli piki o różnych rozmiarach heterooligomerów septyny nakładają się na siebie zbyt mocno lub zostanie wykrytych zbyt wiele zdarzeń, zmniejsz końcowe stężenie septyny i ponownie zmierz. A gdy nie zostanie zmierzona wystarczająca liczba pojedynczych cząsteczek, zwiększ stężenie septyny i zmierz ponownie.

Do analizy septyny należy przygotować 5X darkSPB i mieszankę septyny składającą się ze 100% ciemnej septyny o sześciokrotnie wyższym stężeniu niż pożądane stężenie końcowe w buforze septynowym i jednym milimolowym ditiotreitolem. Następnie spolimeryzuj septynę, mieszając wodę, 20%5X darkSPB i 16,67% septynę, w określonej kolejności i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj od trzech do pięciu mikrolitrów próbki do siatki mikroskopii elektronowej z jarzeniem i inkubuj przez jedną minutę.

Teraz umyj siatkę dwukrotnie, dodając kroplę buforu darkSPB i wchłonij płyn za pomocą bibuły filtracyjnej. Przemyć raz wodą i inkubować przez 30 sekund z 2% octanem uranylu. Następnie osusz plamę i wysusz próbkę na powietrzu przez kilka minut.

Następnie zobrazuj wiązki septyny przy napięciu 120 kilowoltów i powiększeniach od 5 000X do 60 000X z rozmyciem od jednego do dwóch mikrometrów. Chromatogram HisTrap i StrepTrap wykazał, że frakcja zbiorcza przeszła od początku piku elucji do momentu, gdy absorbancja ustabilizowała się odpowiednio na poziomie około 250 mililitrów i 50 mililitrów. Pasma septyny wykazywały podobną intensywność w elektroforezie żelowej denaturacji, co sugeruje, że septyny są nienaruszone.

W elektroforezie natywnej obserwowano główne pasmo odpowiadające nienaruszonym heterooligomerom i mniejsze pasmo odpowiadające trimorom lub tetramerom. Pozorna masa cząsteczkowa kompleksów znakowanych msfGFP jest nie do odróżnienia od masy cząsteczkowej kompleksów nieznakowanych. Fotometria masowa wykryła nienaruszone oktamery i heksamery septyn.

Dodatkowy pik na poziomie 241 kilodaltonów wskazywał na obecność dwóch białek orzeszków ziemnych, DSep1 i mEGFP-DSep2. Obrazy kompleksów septynowych wykonane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej wykazały pręciki heksamerów i oktamerów. Znaczniki msfGFP są widoczne jako gęstości rozmyte na dwóch końcach w septynie 2 msfGFP ludzkiej septynie octamers_9i1.

W płytkim polu TIRF można zaobserwować małe skupiska białek. Mikroskopia konfokalna ujawniła duże skupiska pływających nitkowatych struktur. Transmisyjna mikroskopia elektronowa wykazała małe i duże wiązki septyny odpowiadające klastrom obserwowanym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego i mikroskopii konfokalnej.

Zalecamy pracę na lodzie przez cały czas oczyszczania i dodawanie świeżych odczynników, które określimy w protokole. Interesują nas interakcje septyn w kontekście cytokinezy. Odtworzyliśmy septynę wraz z nowoczesnymi membranami, aktyną i mikrotubulami, aby zbadać je za pomocą mikroskopii i kilku testów biofizycznych.

Używamy oczyszczonych septyn do zbadania, w jaki sposób septyny oddziałują z filamentami aktyny, mikrotubulami i lipidami. Używamy również oczyszczonych septyn do budowy syntetycznych komórek, w których septyny ułatwiają podział komórek.