Name: Oczyszczanie i kontrola jakości rekombinowanych kompleksów septynowych do rekonstytucji bezkomórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania wysokiej jakości kompleksów septynowych przy użyciu chromatografii afinitowej. Protokół ten umożliwia badanie ról septyn w podziale i migracji komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Cecilii de Agrela Pinto, Tomásowi de Garaya i Katharinie Häußermann za pomoc w eksperymentach z masową fotometrią (iSCAT); Arjen Jakobi i Wiel Evers za ich pomoc w TEM; Lucii Baldauf za pomoc w realizacji TIRF; Pascal Verdier-Pinard za rady dotyczące elektroforezy natywnej; Agata Szuba i Marjolein Vinkenoog za pomoc w organizacji działań na rzecz oczyszczania septyny Drosophila oraz obrazowania komórek i tkanek (PICT-IBiSA), Instytutu Curie, członka francuskiej Narodowej Infrastruktury Badawczej Francja-BioImaging (ANR10-INBS-04). Badania te otrzymały finansowanie z Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO/OCW) w ramach grantu Grawitacyjnego "BaSyC-Building a Synthetic Cell" (024.003.019) oraz z Agence Nationale pour la Recherche (ANR przyznaje ANR-17-CE13-0014: "SEPTIMORF"; ANR-13-JSV8-0002-01: "CZAS WRZEŚNIA"; oraz ANR-20-CE11-0014-01: "SEPTSCORT").

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych lub finansowych interesów.

Opisana tutaj metoda pozwala na solidne oczyszczanie i kontrolę jakości wstępnie uformowanych heterooligomerów septyny. Oto niektóre z kluczowych kwestii, które należy wziąć pod uwagę w celu prawidłowego zastosowania tej metody. Podczas etapów elucji w rozdziałach chromatograficznych ważne jest, aby stosować zalecane (lub niższe) natężenie przepływu, aby zminimalizować rozcieńczenie kompleksów septynowych. Dodatkowo, aby zmaksymalizować odzysk białka podczas końcowego etapu zagęszczania, kolumna koncentratora jest zorientowana w taki sposób, że roztwór nie jest dociskany do filtra (gdy filtr znajduje się tylko po jednej stronie). Jeśli roztwór trafi bezpośrednio do filtra, białko przykleja się do niego znacznie bardziej, znacznie zmniejszając końcową wydajność. Ważne jest również, aby wziąć pod uwagę, że etap koncentracji nie zawsze jest konieczny. Pobieranie frakcji tylko z wąskiego zakresu wokół piku na chromatogramie zwykle daje wystarczająco wysokie stężenie wyjściowe (>3000 nM) dla wielu zastosowań rekonstytucji (które zwykle działają w zakresie 10-300 nM). Wreszcie, w celu kontroli jakości funkcjonalności kompleksów septynowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, ważne jest prawidłowe pasywowanie powierzchni szkiełek mikroskopowych, ponieważ kompleksy septynowe chciwie przylegają do szkła. Pasywacja szkiełek może odbywać się albo poprzez funkcjonalizację PLL-PEG, albo przez tworzenie neutralnych (100% DOPC) dwuwarstw lipidowych11,32.
W porównaniu z pierwotnym protokołem oczyszczania opisanym po raz pierwszy w Iv i wsp.10 nastąpiła zmiana w składzie (Tabela 2). Stężenie MgCl2 zostało zmniejszone z 5 mM do 2 mM, a stężenie i pH Tris-HCl zostały zmniejszone odpowiednio z 50 mM do 20 mM i z 8,0 do 7,4. Zmiany te zostały wprowadzone, aby warunki buforowe były zgodne z badaniami interakcji ludzkich septyn z dwuwarstwami lipidowymi, włóknami aktynowymi i mikrotubulami 10,11,32. Dzieje się tak, ponieważ autorzy utworzyli wspierane dwuwarstwy lipidowe i spolimeryzowaną aktynę w buforze F, którego skład jest identyczny jak w darkSPB, z wyjątkiem obecności ATP w buforze F. Zmiana buforu nie spowodowała żadnych zmian w jakości ani żywotności oczyszczonych septyn w porównaniu z oryginalnymi.
Ta metoda oczyszczania ma jeszcze kilka ograniczeń. Po pierwsze, różne próby oczyszczania mogą różnić się wydajnością (0,5-1 ml 2-5 μM kompleksów septynowych) i jakością funkcjonalną, co sprawdza zdolność tworzenia wiązek oczyszczonych kompleksów septynowych. Dlatego bardzo ważne jest konsekwentne przeprowadzanie kontroli jakości opisanych w tym dokumencie. Bardzo dobra kontrola czasu ekspresji i gęstości optycznej kultury bakteryjnej może pomóc złagodzić różnicę w wydajności. Po drugie, ten rurociąg oczyszczania nie jest w stanie rozróżnić trimerów i heksamerów ani tetramerów i oktamerów (ryc. 1B). Jednak eksperymenty kontroli jakości można wykorzystać do udowodnienia, że większość kompleksów septynowych występuje w postaci długich oligomerów. W przypadku, gdy wymagany jest jeszcze węższy rozkład wielkości oligomerów, chromatografię wykluczania wielkości można wprowadzić pomiędzy krok 1.6. i krok 1.7. protokołu oczyszczania. Ten opcjonalny krok jednak drastycznie zmniejsza wydajność i nie jest zalecany, chyba że jest to absolutnie konieczne. Ostatnie, bardziej fundamentalne ograniczenie wynika z zastosowania E. coli jako systemu ekspresji dla rekombinowanych kompleksów septynowych. Oczywiście system ten nie pozwala na modyfikacje potranslacyjne (PTM), które zostały zgłoszone w komórkach zwierzęcych, takie jak fosforylacja, acetylacja i sumoilacja 6,51,52,53. Te modyfikacje potranslacyjne można dodać poprzez wdrożenie podobnej strategii oczyszczania w komórkach owadów lub ludzi. Co więcej, w artykule tym omówiono tylko rekonstytucję septyn jako takich, ale badania na komórkach wskazują, że białka regulatorowe, takie jak białka z rodziny Borg54,55 i anilina 24,25,56, mogą mieć znaczący, ale słabo poznany wpływ na tworzenie i funkcje septyn, a zatem są ważne do ostatecznego włączenia do in vitro studia. Protokoły oczyszczania białek Borg i aniliny zostały zgłoszone54,57.
Opisany tutaj protokół oczyszczania septyny oferuje ustandaryzowany sposób oczyszczania septyn w postaci oligomerów za pomocą prawidłowej stechiometrii podjednostek, oferując ważny postęp w stosunku do wielu wcześniejszych badań in vitro opierających się na pojedynczych podjednostkach septyny. Mimo że niektóre septyny w określonych kontekstach mogą działać jako pojedyncza podjednostka2, obecna literatura zdecydowanie sugeruje, że w komórkach zwierzęcych septyny funkcjonują głównie w kompleksach 9,58. W związku z tym zastosowanie wstępnie uformowanych heterooligomerów, takich jak te opisane w tym artykule i innych 10,11,18,32,35,36,37, ma ogromne znaczenie dla badania strukturalnych i biofizycznych właściwości septyn za pomocą in vitro rekonstytucji w celu przeanalizowania ich funkcji w komórce. Co więcej, septyny są samoorganizującymi się białkami z wieloma partnerami interakcji, w tym błoną i cytoszkieletem, co czyni je bardzo interesującymi dla oddolnej biologii syntetycznej 59,60,61 i badań wywołanych przez białka zmian we właściwościach biofizycznych błony, takich jak krzywizna 42,62,63.

Cytoszkielet tradycyjnie opisywano jako system trójskładnikowy, składający się z filamentów aktynowych, mikrotubul i filamentów pośrednich1, jednak niedawno uznano septyny za czwarty składnik cytoszkieletu1. Septyny stanowią rodzinę białek wiążących GTP, które są konserwatywne u eukariontów2. Septyny uczestniczą w wielu funkcjach komórkowych, takich jak podział komórki3, adhezja międzykomórkowa4, ruchliwość komórek5, morfogeneza6, infekcja komórkowa7 oraz ustanawianie i utrzymywanie polarności komórki8. Pomimo ich istotnych funkcji, mechanizmy uczestnictwa septyn w tych procesach nie są jeszcze dobrze poznane.
Rodzina białek septyn jest podzielona na kilka podgrup (cztery lub siedem, w zależności od klasyfikacji) w oparciu o podobieństwo sekwencji białkowej2. Członkowie różnych podrodzin mogą tworzyć palindromiczne kompleksy hetero-oligomeryczne, które stanowią jednostki budulcowe filamentów, a te z kolei organizują się w struktury wyższego rzędu, takie jak wiązki, pierścienie i sieci1,9,10,11,12. Dalsza złożoność molekularna wynika z obecności różnych wariantów splicingowych; przykładem jest ludzka SEPT9, w przypadku której istnieją dowody na specyficzne funkcje poszczególnych wariantów splicingowych13,14,15. Ponadto długość hetero-oligomerów zależy od gatunku i typu komórki. Na przykład septyny Caenorhabditis elegans tworzą tetramery16, septyny Drosophila melanogaster tworzą heksamery17 (Rycyna 1A), septyny Saccharomyces cerevisiae tworzą oktamery18, a septyny ludzkie tworzą zarówno heksamery, jak i oktamery19 (Rycyna 1A). Zdolność izoform septyn, wariantów splicingowych i septyn zmodyfikowanych posttranslacyjnie z tej samej podrodziny do wzajemnego zastępowania się w kompleksie oraz (współ)istnienie hetero-oligomerów o różnej wielkości utrudniają precyzyjne określenie funkcji komórkowych poszczególnych kompleksów hetero-oligomerycznych12.
Kolejną interesującą właściwością septyn jest ich zdolność do oddziaływania z wieloma partnerami wiążącymi w komórce. Septyny wiążą błonę plazmatyczną i organella błonowe podczas interfazy oraz podziału komórki20,21,22. W dzielących się komórkach septyny współpracują z anilliną23,24,25 oraz z aktyną i miozyną podczas cytokinezy26,27. W późnych etapach cytokinezy septyny wydają się regulować kompleksy sortowania endosomalnego wymagane do transportu (system ESCRT) w procesie odsznurowania ciała środkowego28. Ponadto istnieją dowody na obecność septyn w kory aktynowej oraz w aktynowych włóknach stresowych komórek w interfazie29,30,31. W określonych typach komórek septyny wiążą i regulują również cytoszkielet mikrotubularny32,33.
Wszystkie te cechy sprawiają, że septyny stanowią bardzo interesujący, ale jednocześnie wymagający system białkowy do badania. Połączenie dużej liczby podjednostek septyn (13 genów u ludzi, nie licząc wariantów splicingowych2) z możliwością wzajemnego zastępowania się podjednostek z tej samej podrodziny i tworzenia hetero-oligomerów o różnych rozmiarach utrudnia wyciąganie wniosków na temat funkcji komórkowej konkretnej septyny za pomocą manipulacji genetycznych. Ponadto liczne oddziaływania septyn sprawiają, że interpretacja efektów powszechnie stosowanych w badaniach narzędzi, takich jak leki34 skierowane na komponenty cytoszkieletu lub błony, jest trudnym zadaniem.
Sposobem na rozwiązanie tego problemu jest uzupełnienie badań na komórkach rekonstrukcją septyn in vitro (bezkomórkową). Rekonstrukcja in vitro umożliwia wyizolowanie pojedynczego typu heterooligomerów septyn o określonym składzie podjednostek i długości18,35,36,37. Kompleks ten może być następnie badany w kontrolowanym środowisku — albo samodzielnie, aby odkryć podstawowe właściwości strukturalne i fizykochemiczne septyn38,39,40, albo w połączeniu z odpowiednimi partnerami, takimi jak modelowe biomembrany11,41,42, filamenty aktynowe10,27 lub mikrotubule32,36, w celu rozszyfrowania natury ich oddziaływań.
W związku z tym, dla badań nad septynami kluczowe jest opracowanie niezawodnej metody efektywnej puryfikacji różnych kompleksów septyn. Jednakże, nawet przy zastosowaniu tego samego protokołu, poszczególne puryfikacje mogą prowadzić do uzyskania białek o różnej aktywności, funkcjonalności, a nawet różnym stopniu integralności. W przypadku białek dostępnych komercyjnie, takich jak enzymy, funkcjonalność i aktywność enzymatyczna są starannie walidowane43. Wdrożenie rygorystycznej kontroli jakości dla białek cytoszkieletowych lub strukturalnych, takich jak septyny, może być trudne, lecz jest niezbędne, aby eksperymenty prowadzone w różnych laboratoriach były porównywalne.
Niniejszy artykuł opisuje niezawodną metodę oczyszczania wysokiej jakości rekombinowanych septyn w ich formie hetero-oligomerycznej, opartą na jednoczesnej ekspresji dwóch wektorów zawierających konstrukty mono- lub bi-cistroniczne (Tabela 1) w Escherichia coli komórki. Metoda polega na dwuetapowym podejściu z wykorzystaniem chromatografii powinowactwa w celu wychwycenia hetero-oligomerów septyn zawierających zarówno znacznik his6septynę z etykietą i septynę z etykietą Strep-II (Rysunek 1B,C). Protokół ten został po raz pierwszy opisany przez Iv et al.10zostało zastosowane do oczyszczenia Muszka owocówka heksamery septyn11,27,35, ludzkie heksamery septyn10oraz kilka ludzkich oktamerów septyn zawierających różne natywne izoformy (1, 3 i 5)10,32 lub zmutowane izoformy SEPT932Ponadto przedstawiono opis zestawu technik służących do oceny jakości oczyszczonych septyn. W pierwszej kolejności, za pomocą elektroforezy denaturującej oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), sprawdzana jest integralność i prawidłowa stechiometria podjednostek septyn. Następnie, za pomocą elektroforezy natywnej oraz fotometrii masowej z wykorzystaniem interferometryjnej mikroskopii rozproszonej (iSCAT), badana jest obecność heterooligomerów o prawidłowej masie cząsteczkowej, a także obecność monomerów lub mniejszych oligomerów świadczących o niestabilności kompleksu. Ostatnim krokiem jest ocena aktywności polimeryzacyjnej septyn z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej oraz TEM.
<img alt="Proces oczyszczania białek z użyciem HisTrap i StrepTrap; schematy wiązania i elucji białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Strategia oczyszczania. (A) Schematy hetero-oligomerów septyn występujących w komórkach ludzkich (lewo) i Drosophila (prawo). Numery oznaczają podjednostki septyn z wskazanych grup, a P oznacza Peanut. Ludzka SEPT9 może być dowolną z jej izoform. Podjednostki septyn mają asymetryczny kształt i są powiązane podłużnie poprzez dwa odrębne interfejsy: interfejs NC:NC oraz interfejs G:G, co zaznaczono odpowiednio jako NC i G na górze ludzkiego heksameru. (B,C) Schematyczny rysunek dwuetapowej strategii chromatograficznej, przedstawiony dla (B) ludzkich heksamerów septyn i (C) oktamerów. H oznacza znaczniki his, natomiast S oznacza znaczniki Strep-II. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig01v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Sumator laserowy 488nm Mikroskop iLAS2</td><td>Gataca</td><td>TIRF</td>488nm Szafirowe <td></td></tr><tr><td>linie laserowe</td><td>Koherentny</td><td></td><td>mikroskop konfokalny</td></tr><tr><td>4k X 4k F416 Kamera CMOS</td><td>TVIPS</td><td></td><td>Dla JEM-1400plus</td></tr><tr><td>4x bufor próbki nativePAGE</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>BN2003</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy (TROLOX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td>Aby zapobiec mruganiu</td></tr><tr><td>AKTA pure 25 M1</td><td>GE healthcare</td><td>1680311</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-25G</td><td></td></tr><tr><td>Węgiel Type-B, siatka EM 300</td><td>Ted pella</td><td>01813-F</td><td></td></tr><tr><td>Węgiel Type-B, siatka 300 EM</td><td>Nauka o mikokopii elektronowej</td><td>CF300-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe #1.5H</td><td>Thorslabs</td><td>CG15KH</td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1-M1 jednostka konfokalna</td> Mikroskop <td>konfokalny</td><td>Yokogawa</td><td></td></tr><tr><td>Desthiobiotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1411-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr>Instrumenty <td></td><td>Eclipse Ti2-E</td><td>Nikon</td><td>Mikroskop konfokalny</td></tr><tr><td>Koktajl hamujący proteazę bez EDTA</td><td>Roche</td><td>481761</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap HP, 5 mL</td><td>GE healthcare</td><td>29-0588-3</td><td></td></tr><tr><td>iLAS2 azymutalny system oświetlenia TIRF&nbsp;</td><td>Mikroskop Gataca</td><td></td><td>TIRF</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1202-1KG</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue Protein Gel Stain</td><td>Westburg Life Sciences</td><td>EP ab119211</td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Thermo Fisher</td><td>naukowy 10849040</td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 888 Kamera EMCCD</td><td>Mikroskop</td><td></td><td></td></tr> <tr>konfokalny<td>iXon Ultra 897 EM-CCD&nbsp;</td><td>Mikroskop Andor</td><td></td><td>TIRF</td></tr><tr><td>JEM-1400plus</td><td>Mikroskop JOEL</td><td></td><td>TEM TUDelft</td></tr><tr><td>kappa-cassein&nbsp;</td><td>Rosół Sigma-Aldrich</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022-6X1KG</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971-10G-F</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746452-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Metylokleloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8074844</td><td></td></tr><tr><td>System MilliQ (Integral 10)</td><td>Dozownik wody</td> <td>Merck-Millipore</td><td></td></tr><tr><td>Mini protean TGX</td><td>żele BIORAD</td><td>4561086</td><td></td></tr><tr><td>NativeMark niebarwiony wzorzec białka</td><td>Invitrogen</td><td>LC0725</td><td>Do iSCAT i Native żele</td></tr><tr><td>NativePAGE 4-16% ŻELE</td><td>Thermo Fisher BN1002BOX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Zestaw buforowy do biegania</td><td>Thermo Fisher naukowy</td><td>BN2007</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti2-E&nbsp;</td>Instrumenty <td></td><td>firmy Nikon</td><td>Mikroskop TIRF</td></tr><tr><td>Nr 1 Szkiełka nakrywkowe Menzel</td><td>Thermo Fisher 11961988</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy parafilm&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7668</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo i czasy; Obiektyw zanurzeniowy 100/1.45 NA</td><td>Instrumenty</td><td></td> Nikon <td>Mikroskop konfokalny</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>Poli(L-lizyna)-biotynylowany PEG (PLL-PEG</td><td>)sSuSoS</td><td>CHF560.00</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny 0,01%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td>Do szkiełek iSCAT</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz do natywnych żeli</td><td>CONSORT</td><td>S/N 71638</td><td></td></tr><tr><td>POWERPAC UNIVERSAL</td><td>BIORAD</td><td>042BR31206</td><td></td></tr><tr><td>Protokatechuat 3,4-dioksygenazy (PCD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279-25UN</td><td>pochłaniacz tlenu - enzym</td></tr><tr><td>Kwas protokatechowy (PCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03930590-50MG</td><td>pochłaniacz tlenu - odczynnik</td></tr><tr><td>Q500 Sonicator</td><td></td><td>Qsonica Q500-110</td><td></td></tr><tr><td>Kamera Quemesa</td><td>Olympus</td><td></td><td>For Tecnai Spirit</td></tr><tr><td>Refeyn OneMP</td><td>Refeyn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor do próbek, laemmli 2x koncentrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3401-10vl</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelki silikonowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL103250-10EA</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Kasety do dializy 30k MWCO 3mL</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>66381</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1441-1G</td><td></td></tr><tr><td>StrepTrap HP, 1 ml</td><td>GE healthcare</td><td>28-9075-46</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Tecnai Spirit</td><td>Thermo Scientific, mikroskop FEI</td><td></td><td>TEM Instytut Curie</td></tr><tr><td>Wspaniały bulion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0918-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Tris/Glyine/SDS</td><td>BIORAD</td><td>1610772</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa</td><td>Branson</td><td>CPX2800H-E</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 6, 30 000 MWCO PES</td><td>Sartorius</td><td>VS0622</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie i kontrola jakości rekombinowanych kompleksów septynowych do rekonstytucji bezkomórkowej

Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution

Septyny to rodzina konserwatywnych eukariotycznych białek wiążących GTP, które mogą tworzyć włókna cytoszkieletu i struktury wyższego rzędu z hetero-oligomerycznych kompleksów. Oddziałują z innymi składnikami cytoszkieletu i błoną komórkową, aby uczestniczyć w ważnych funkcjach komórkowych, takich jak migracja i podział komórek. Ze względu na złożoność wielu interakcji septyn, dużą liczbę genów septyny (13 u ludzi) oraz zdolność septyn do tworzenia heterooligomerycznych kompleksów o różnym składzie podjednostek, rekonstytucja bezkomórkowa jest niezbędną strategią zrozumienia podstaw biologii septyny. W niniejszej pracy po raz pierwszy opisano metodę oczyszczania rekombinowanych septyn w ich postaci heterooligomerycznej przy użyciu podejścia opartego na dwuetapowej chromatografii powinowactwa. Następnie szczegółowo omówiono proces kontroli jakości stosowany w celu sprawdzenia czystości i integralności kompleksów septynowych. Proces ten łączy w sobie elektroforezę w żelu natywnym i denaturującym, mikroskopię elektronową z barwieniem ujemnym i interferometryczną mikroskopię rozpraszania. Na koniec podano opis procesu sprawdzania zdolności polimeryzacji kompleksów septynowych przy użyciu mikroskopii elektronowej z ujemnym barwieniem i mikroskopii fluorescencyjnej. Pokazuje to, że możliwe jest wyprodukowanie wysokiej jakości ludzkich heksamerów septynowych i oktamerów zawierających różne izoformy septin_9, a także heksamerów septynowych Drosophila.

Zgodnie z opisem w protokole, wyhodowano 5 L komórek E. coli kotransformowanych dwoma plazmidami kodującymi septyny, a ekspresję septyn indukowano poprzez dodanie IPTG. Po 3 h komórki zebrano poprzez wirowanie, zawieszono ponownie w buforze do lizy i poddano lizie za pomocą sonikacji. Lizat następnie klarowano przez wirowanie, a otrzymany roztwór nałożono na kolumnę HisTrap (Rycina 2A). Po pierwszej puryfikacji frakcje zawierające septyny połączono i nałożono na kolumnę StrepTrap (Rycina 2B). Zazwyczaj pozwala to na uzyskanie około 3-5 mL kompleksu septyn o stężeniu ~1 μM. Przed połączeniem frakcji zawierających septyny można zastosować denaturującą elektroforezę żelową, aby sprawdzić integralność podjednostek septyn oraz ekvimolarny stosunek stechiometryczny między różnymi podjednostkami septyn tworzącymi kompleks (Rycina 3A). Jeśli na żelu widoczne są prążki o podobnej intensywności odpowiadające masom cząsteczkowym (Tabela 3) podjednostek septyn, można kontynuować protokół. W przeciwnym razie zaleca się ponowne rozpoczęcie procedury. W przykładzie przedstawionym dla ludzkiego oktameru septyn z SEPT9_i1, na Rycynie 3A wyraźnie widoczne są prążki odpowiadające SEPT9_i1, SEPT6, SEPT7 i SEPT2 (w kolejności od góry do dołu) o podobnych intensywnościach; 99% przedział ufności znormalizowanej intensywności wynosił 1,128 ± 0,048 dla SEPT2, 1,092 ± 0,034 dla SEPT6, 1,108 ± 0,040 dla SEPT7 oraz 1,067 ± 0,029 dla SEPT9. Jeśli SEPT2 jest znakowany msfGFP, jego prążek przesunie się w górę, bardzo blisko poniżej SEPT9_i1. W zależności od zastosowanego systemu elektroforezy oraz obecności C-końcowego znacznika TEV-Strep dla SEPT7 (co powoduje jego wolniejszą migrację w porównaniu do nieznakowanego SEPT7), prążki SEPT7 i SEPT6 czasami zlewają się ze względu na zbliżone masy cząsteczkowe. Kolejnym krokiem jest połączenie frakcji i ich dializa przeciwko buforowi do septyn z DTT. Po dializie, jeśli stężenie jest zbyt niskie (&lt;2 μM) lub do eksperymentów wymagane jest wyższe stężenie, można przeprowadzić etap zagęszczania, zgodnie z opisem w protokole. Stężenia poniżej 1 μM zazwyczaj wskazują na niską jakość funkcjonalną septyn. Końcowe stężenie kompleksu septyn między 3,5 μM a 7 μM sprawdza się w większości testów in vitro. Takie stężenia są zazwyczaj osiągane, gdy objętość po zagęszczeniu wynosi 0,5-1 mL.
<img alt="Diagramy chromatogramów HisTrap i StrepTrap; oczyszczanie białek, eluowane kompleksy septyn." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przykładowe chromatogramy odpowiadające oczyszczaniu ciemnych ludzkich oktamerów septyn_9i1. (A) Chromatogram kolumny HisTrap. Po piku elucji septyn absorbancja nie powróciła do zera, prawdopodobnie ze względu na obecność imidazolu w buforze. Połączona frakcja obejmowała zakres od początku piku elucji do momentu stabilizacji absorbancji przy około 250 mL. (B) Chromatogram kolumny StrepTrap. Połączona frakcja obejmowała zakres od początku piku elucji do momentu powrotu absorbancji do wartości około 0 przy 50 mL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Aby kontynuować kontrolę jakości, przeprowadzono elektroforezę w warunkach natywnych, zgodnie z opisem w protokole (Rysunek 3B). W żelach można zaobserwować główny prążek odpowiadający nienaruszonym hetero-oligomerom oraz, zazwyczaj, prążek mniejszy odpowiadający dimerom. Heksamery ludzkie znajdują się nieco powyżej prążka markera 242 kDa, natomiast oktamery znajdują się powyżej prążka 480 kDa, powyżej ich obliczonej masy cząsteczkowej. Położenie tych prążków sprawdzono za pomocą analizy western blot ekstraktów z komórek eukariotycznych32. Oznakowanie białkiem msfGFP łączy każde białko SEPT2 z białkiem msfGFP. Powoduje to wzrost masy cząsteczkowej kompleksów septyn o 53,4 kDa (26,7 kDa/cząsteczka msGFP). Niemniej jednak, w żelu do elektroforezy natywnej pozorna masa cząsteczkowa kompleksów oznakowanych msfGFP jest nieodróżnialna od masy kompleksów nieoznakowanych.
Komplementarną techniką służącą do sprawdzenia, czy kompleksy septyn są nienaruszone, jest fotometria masowa z wykorzystaniem mikroskopii iSCAT. iSCAT monitoruje rozpraszanie światła cząsteczek osiadających na szklanym podstawce, wzmocnione interferencją ze światłem referencyjnym, zazwyczaj będącym odbiciem lasera od spodu szklanej podstawki. Następnie stosuje się metodę odejmowania tła, aby uzyskać kontrast cząstek. Dzięki tej korekcie sygnał przyjmuje wartości dodatnie i ujemne w zależności od tego, czy cząstki osiadają na szkle, czy od niego odchodzą49. Wykryty sygnał jest wprost proporcjonalny do masy cząsteczkowej białek50. Zatem kalibracja sygnału względem masy z użyciem standardu masy pozwala wyznaczyć masę białek w próbce. Rycina 3C przedstawia przykład ludzkich oktamerów septyn zawierających SEPT9_i1. Większość wykrytych pojedynczych cząstek (~50%) posiada masę cząsteczkową oczekiwaną dla kompletnych oktamerów zawierających SEPT9_i1 (423 kDa) (Rycina 3C). Występują również cząstki o masach od 150 do 300 kDa, jednak nie zaobserwowano wyraźnego piku, co wskazuje na możliwą obecność innych gatunków septyn w niskim stężeniu. Podobnie, większość wykrytych pojedynczych cząstek dla heksamerów Drosophila znakowanych mEGFP posiada masę cząsteczkową oczekiwaną dla nienaruszonych heksamerów (361 kDa) (Rycina 3D). Dodatkowy wyraźny pik przy 241 kDa wskazuje na obecność stabilnych tetramerów zawierających dwa białka peanut, jedno DSep1 i jedno mEGFP-DSep2. Wreszcie, zarówno ludzkie, jak i muchowe kompleksy septyn wykazują pik w okolicy 80 kDa, który może być mieszaniną monomerów i dimerów, prawdopodobnie wzmocnioną przez śladowe ilości DTT lub inną małą cząsteczkę ulegającą agregacji, co objawia się pikiem po dodatniej stronie wykresu45.
<img alt="Elektroforeza w żelu, rozkład masy białek, mikroskopia; oczyszczanie septyn, spektrometria mas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przykłady wyników kontroli jakości oligomerów. (A) Przykład żelu denaturującego pokazujący różne frakcje piku elucji z oczyszczania ciemnych ludzkich oktamerów septyny_9i1. (B) Przykład elektroforezy natywnej różnych kompleksów septyn. (C,D) Różne przykłady wyników histogramów fotometrii masowej przy stężeniu 12.5 nM kompleksów septyn: (C) ciemne ludzkie oktamery septyny_9i1 oraz (D) heksamery septyn Drosophila DSep1-msfGFP. Linie przedstawiają dopasowania Gaussa. (E) Obraz TEM ciemnych ludzkich oktamerów septyny_9i1 o stężeniu 25 nM w buforze do septyn. Pasek skali = 200 nm. (F) Obraz średniej klasy ludzkich oktamerów septyny_9i1 SEPT2-msfGFP. Znaczniki msfGFP są widoczne jako rozmyte gęstości na dwóch końcach. Pasek skali = 10 nm. Panele (E) i (F) są prawem autorskim The Company of Biologists i zostały zaadaptowane z Iv et al.10 za zgodą. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig03v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Biorąc pod uwagę, że zarówno żele rodzime, jak i iSCAT dostarczają jedynie informacji uśrednionych dla całego zespołu, w celu sprawdzenia integralności i czystości kompleksów poprzez bezpośrednią wizualizację zastosowano uśrednianie klas obrazów pojedynczych oligomerów septyn uzyskanych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Na obrazach TEM kompleksów septyn w buforze do septyn można zaobserwować pręty o długości 24 nm (heksamery) lub 32 nm (oktamerzy). Przykład ludzkiego oktameru septyn zawierającego SEPT9_i1 przedstawiono na Rysunku 3E. Podczas ich uśredniania klas można zaobserwować i policzyć każdą z podjednostek, co widać w przypadku ludzkiego oktameru z SEPT9_i1 znakowanego msfGFP na Rysunku 3F. W przypadku, gdy oligomer jest znakowany fluorescencyjnie, na końcach prętów można zaobserwować dodatkowe zagęszczenia odpowiadające SEPT2-msfGFP (Rysunek 3F).
Połączenie powyższych technik dowodzi, że oktamery (lub heksamery) o prawidłowym stosunku stechiometrycznym i wysokiej czystości mogą zostać oczyszczone przy użyciu opisanego protokołu. Ostatnim etapem kontroli jakości jest sprawdzenie funkcjonalności kompleksów septyn pod kątem ich zdolności do polimeryzacji. W obecności niskiego stężenia soli (&lt;150 mM KCl w opisanym buforze9), jeśli septyny nie znajdują się w obecności innych białek lub ujemnie naładowanych błon lipidowych, ulegają one samoorganizacji w pęczki9. Polimeryzacji septyn zapobiega utrzymywanie ich w buforze do przechowywania, który charakteryzuje się wysokim (300 mM) stężeniem KCl. Heterooligomery septyn są następnie rozcieńczane w stosunku objętościowym 1:6 w buforze o tym samym składzie, ale bez KCl, aby uzyskać końcowe stężenie KCl wynoszące 50 mM. W celu przeprowadzenia obrazowania fluorescencyjnego bufor ten jest uzupełniany o układ usuwający tlen w celu ochrony przed fotobieleniem oraz o supresor mrugania. W mikroskopii TIRF w płytkim polu TIRF (~100 nm) można zaobserwować małe klastry białek (Ryc. 4A,B). W mikroskopie konfokalnym w górnych warstwach roztworu widoczne są duże klastry struktur nitkowatych (Ryc. 4C). W końcu, za pomocą TEM, można zaobserwować małe pęczki septyn (Ryc. 4D), odpowiadające klastrom zaobserwowanym w TIRF, oraz duże pęczki (Ryc. 4E), odpowiadające strukturom zaobserwowanym w mikroskopii konfokalnej. Wstawki na Ryc. 4D,E ujawniają, że oba typy struktur składają się z długich, cienkich filamentów biegnących równolegle, tworzących pęczki o zwężających się końcach. Wspólnie obrazy fluorescencyjne i TEM dowodzą, że oczyszczone kompleksy septyn mogą polimeryzować w filamenty, które z kolei samoorganizują się w pęczki.
<img alt="Mikroskopia elektronowa struktur biomolekularnych; morfologia włókien białkowych; wstawka o wysokiej rozdzielczości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Przykłady wyników kontroli jakości zdolności do polimeryzacji. (A) Obraz TIRF ludzkich heksamerów septyny o stężeniu 300 nM (10% heksamerów znakowanych msfGFP) w buforze fluoSPB. (B) Obraz TIRF ludzkich oktamerów septyny o stężeniu 300 nM zawierających SEPT9_i1 (10% oktamerów9_i1 znakowanych msfGFP) w buforze fluoSPB. (C) Konfokalne projekcje maksymalnej intensywności stosów Z w zakresie ~30 μm z odstępem 0,5 μm dla ludzkich oktamerów septyny_9i3 o stężeniu 300 nM w buforze fluoSPB. (A-C) Pasek skali = 10 μm i odwrócona skala szarości. (D,E) Przykładowe obrazy TEM (D) małych i (E) dużych pęczków ludzkich oktamerów septyny_9i1 w buforze darkSPB. Wstawki pokazują obszary, w których widoczne są wyraźne filamenty biegnące równolegle wewnątrz pęczka. Paski skali = 500 nm. Panele (C-E) są chronione prawem autorskim The Company of Biologists i zostały opracowane na podstawie pracy Iv et al.10 za zgodą autorów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Lista plazmidów. Plazmidy do oczyszczania oligomerów septyn zgodnie z tym protokołem. Wszystkie plazmidy zostały zdeponowane w Addgene (pierwsza kolumna). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%201_V2.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Lista buforów. Składy buforów wykorzystywanych do oczyszczania i kontroli jakości oligomerów septyn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%202(1).xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Masy cząsteczkowe i współczynniki wymierania. Lista mas cząsteczkowych (MW) i optycznych współczynników wymierania (ε) przy długości fali 280 nm, obliczonych za pomocą ProtParam na podstawie sekwencji kompleksu, przy założeniu liniowej fuzji podjednostek septyn, różnych kompleksów septyn oraz unikalnych podjednostek septyn (tylko MW), które można oczyścić przy użyciu plazmidów wymienionych w Tabeli 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%203.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Rekonstrukcja in vitro białek cytoszkieletu jest kluczowym narzędziem do zrozumienia podstawowych właściwości funkcjonalnych tych białek. W niniejszej pracy opisano protokół oczyszczania i oceny jakości rekombinowanych kompleksów septynowych, które odgrywają kluczową rolę w podziale i migracji komórek.

Oczyszczanie i kontrola jakości rekombinowanych kompleksów septynowych do rekonstytucji bezkomórkowej

Septins are a family of conserved eukaryotic GTP-binding proteins that can form cytoskeletal filaments and higher-order structures from hetero-oligomeric ...

Protokół ten umożliwia oczyszczanie wysokiej jakości kompleksów septynowych, co jest niezbędne do zbadania wielu ról septyn w komórce. Główną zaletą tego podejścia jest synteza prostej procedury oczyszczania wysokiej jakości septyny za pomocą plazmidów Addgene. Septyny są trudne do zbadania w komórkach ze względu na ich liczne interakcje.Rekonstytucja siarki pomaga nam rozwikłać tę złożoność, badając je w prostym systemie. Zalecamy oczyszczanie w ciągu jednego dnia, aby zapobiec degradacji. Z naszego doświadczenia wynika, że wydłuży to żywotność i jakość białka.Na początek hoduj przekształconą kulturę bakteryjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsarką, aż gęstość optyczna przy długości fali 600 nanometrów osiągnie od dwóch do trzech dla nieznakowanych septyn lub 0,6 do 0,8 dla septyn znakowanych msfGFP lub mEGFP. Po inkubacji indukuj ekspresję białka, dodając IPTG do końcowego stężenia 0,5 milimola i inkubuj komórki wyrażające nieznakowane heterooligomery septyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny przez trzy godziny lub komórki wykazujące ekspresję heterooligomerów znakowanych msfGFP w temperaturze 17 stopni Celsjusza przez noc. Następnie granuluj komórki w temperaturze 4000 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odrzucić supernatant i rozpuścić osad w 100 mililitrach buforu do lizy w celu lizy komórek. Następnie użyj sonikatora z końcówką o amplitudzie 30%, aby sonikować komórkę. Klarować lizat komórkowy przez odwirowanie w temperaturze 20 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zachować supernatant.Opcjonalnie należy pobrać próbkę do elektroforezy denaturującej zgodnie z opisem w manuskrypcie. W przypadku chromatografii powinowactwa septyn znakowanych Hisem, należy zrównoważyć wstępnie wypełnioną kolumnę do chromatografii wysokosprawnej sefarozy niklu ze wszystkimi wymaganymi. Załadować sklarowany supernatant do kolumny i uruchomić system chromatograficzny.Następnie eluować kompleksy septynowe za pomocą 50% buforu elucyjnego HisTrap przy natężeniu przepływu jednego mililitra na minutę. Aby uzyskać stężenie imidazolu 250 milimolów, zbierz frakcje 0,5 mililitra. Teraz monitoruj absorbancję optyczną eluatu przy 280 nanometrach za pomocą systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek i wybierz frakcje zawierające kompleksy septyny.W przypadku chromatografii powinowactwa białek znakowanych Strep-II należy zrównoważyć wstępnie upakowaną kolumnę do chromatografii wysokosprawnej Sepharose StrepTactin z buforem septyny. Załadować septynę zawierającą frakcje odzyskane z kolumny niklu z szybkością jednego mililitra na minutę i uruchomić system chromatograficzny. Następnie przemyć związane białko i wymyć kompleksy septyny 100% buforem elucyjnym StrepTrap przy natężeniu przepływu jednego mililitra na minutę.Aby uzyskać stężenie 2,5 milimolowej destiobiozyny, zbierz frakcje 0,5 mililitra. Wybrać frakcje zawierające kompleksy septyny, jak wskazuje absorbancja optyczna eluatu przy 280 nanometrach, monitorowana online za pomocą systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek. Po usunięciu destiobiotyny przez dializę podwielokrotność kompleksów białkowych do pożądanej podwielokrotności, zatrzaskowo zamrozić podwielokrotność i przechowywać ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.W przypadku interferometrycznej mikroskopii rozpraszania umyj szkiełka podstawowe nr 1.5, sonikując je w myjce ultradźwiękowej przez pięć minut w wodzie, izopropanolu i ponownie w wodzie dejonizowanej. Wysuszyć dwa szkiełka podstawowe delikatnym strumieniem azotu. Następnie umieść siedmiomikrolitrową kroplę 0,01% roztworu poli-L-lizyny na środku jednego z szkiełek i umieść środek drugiego szkiełka na kropli poli-L-lizyny, ustawiając obie szkiełka prostopadle w celu łatwego rozdzielenia.Po inkubacji przez 30 sekund umyć szkiełko, zanurzając je jednokrotnie w zlewce zawierającej wodę dejonizowaną i dwukrotnie bezpośrednio nanosząc strumień wody. Wysusz je strumieniem azotu, a szkiełka te można przechowywać przez około sześć tygodni w temperaturze pokojowej w suchych warunkach. Przed eksperymentem wytnij kawałek uszczelek dwa na dwa, trzy na dwa lub trzy na trzy i przyklej je do części szkła pokrytej poli-L-lizyną, unikając kontaktu szkiełka szkiełkowego i uszczelek z brudną powierzchnią, umieszczając szkiełko na lekkiej chusteczce do wycieraczek.Teraz dociśnij uszczelki końcówką pipety, aby przykleić je do ochronnego tworzywa sztucznego znajdującego się na uszczelkach. Następnie podgrzej bufor septyny do temperatury pokojowej. Rozmrozić białka w dłoni, a następnie trzymać je na lodzie.Następnie umieść szkiełko z uszczelkami na komercyjnym systemie fotometrii masowej zawierającym 19 mikrolitrów buforu septynowego i ustaw ostrość mikroskopu za pomocą opcji autofokusa. Ustaw ponownie ostrość z nowymi ustawieniami, korzystając z opcji autofokusa. Aby utworzyć folder projektu, kliknij Plik, a następnie Nowy projekt, a aby załadować folder projektu do przechowywania danych, kliknij Plik, a następnie Załaduj projekt.Następnie odpipetować jeden mikrolitr próbki do 19 mikrolitrów kropli buforu przegrody. Mieszaj, a podczas mieszania unikaj dotykania czegokolwiek, aby zapobiec ruchowi szkiełka. Następnie nagraj wideo o długości 6 000 klatek, klikając Nagraj.Przeanalizuj filmy za pomocą oprogramowania producenta, aby uzyskać rozkład masy białka. Jeśli piki o różnych rozmiarach heterooligomerów septyny nakładają się na siebie zbyt mocno lub zostanie wykrytych zbyt wiele zdarzeń, zmniejsz końcowe stężenie septyny i ponownie zmierz. A gdy nie zostanie zmierzona wystarczająca liczba pojedynczych cząsteczek, zwiększ stężenie septyny i zmierz ponownie.Do analizy septyny należy przygotować 5X darkSPB i mieszankę septyny składającą się ze 100% ciemnej septyny o sześciokrotnie wyższym stężeniu niż pożądane stężenie końcowe w buforze septynowym i jednym milimolowym ditiotreitolem. Następnie spolimeryzuj septynę, mieszając wodę, 20%5X darkSPB i 16,67% septynę, w określonej kolejności i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj od trzech do pięciu mikrolitrów próbki do siatki mikroskopii elektronowej z jarzeniem i inkubuj przez jedną minutę.Teraz umyj siatkę dwukrotnie, dodając kroplę buforu darkSPB i wchłonij płyn za pomocą bibuły filtracyjnej. Przemyć raz wodą i inkubować przez 30 sekund z 2% octanem uranylu. Następnie osusz plamę i wysusz próbkę na powietrzu przez kilka minut.Następnie zobrazuj wiązki septyny przy napięciu 120 kilowoltów i powiększeniach od 5 000X do 60 000X z rozmyciem od jednego do dwóch mikrometrów. Chromatogram HisTrap i StrepTrap wykazał, że frakcja zbiorcza przeszła od początku piku elucji do momentu, gdy absorbancja ustabilizowała się odpowiednio na poziomie około 250 mililitrów i 50 mililitrów. Pasma septyny wykazywały podobną intensywność w elektroforezie żelowej denaturacji, co sugeruje, że septyny są nienaruszone.W elektroforezie natywnej obserwowano główne pasmo odpowiadające nienaruszonym heterooligomerom i mniejsze pasmo odpowiadające trimorom lub tetramerom. Pozorna masa cząsteczkowa kompleksów znakowanych msfGFP jest nie do odróżnienia od masy cząsteczkowej kompleksów nieznakowanych. Fotometria masowa wykryła nienaruszone oktamery i heksamery septyn.Dodatkowy pik na poziomie 241 kilodaltonów wskazywał na obecność dwóch białek orzeszków ziemnych, DSep1 i mEGFP-DSep2. Obrazy kompleksów septynowych wykonane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej wykazały pręciki heksamerów i oktamerów. Znaczniki msfGFP są widoczne jako gęstości rozmyte na dwóch końcach w septynie 2 msfGFP ludzkiej septynie octamers_9i1.W płytkim polu TIRF można zaobserwować małe skupiska białek. Mikroskopia konfokalna ujawniła duże skupiska pływających nitkowatych struktur. Transmisyjna mikroskopia elektronowa wykazała małe i duże wiązki septyny odpowiadające klastrom obserwowanym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego i mikroskopii konfokalnej.Zalecamy pracę na lodzie przez cały czas oczyszczania i dodawanie świeżych odczynników, które określimy w protokole. Interesują nas interakcje septyn w kontekście cytokinezy. Odtworzyliśmy septynę wraz z nowoczesnymi membranami, aktyną i mikrotubulami, aby zbadać je za pomocą mikroskopii i kilku testów biofizycznych.Używamy oczyszczonych septyn do zbadania, w jaki sposób septyny oddziałują z filamentami aktyny, mikrotubulami i lipidami. Używamy również oczyszczonych septyn do budowy syntetycznych komórek, w których septyny ułatwiają podział komórek.

purification-quality-control-recombinant-septin-complexes-for-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Biofizyczne i biochemiczne badania interakcji między domenami białek osadzonych w błonie napotykają wiele wyzwań technicznych, z których pierwszym jest uzyskanie odpowiedniego materiału do badań. W artykule opisano protokół wytwarzania i oczyszczania stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych, które nadają się do analizy strukturalnej za pomocą roztworu magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i innych zastosowań analitycznych.

Wytwarzanie stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych do badań strukturalnych

Opisano metodę skutecznego oczyszczania białek fuzyjnych znakowanych podwójnie Strep-Strep-i ich specyficznych kompleksów na zmodyfikowanej żywicy streptawidyny (Strep-Tactin) kowalencyjnie usieciowanej z suberianem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3). Zaletą metody jest duża szybkość, dobry odzysk białka docelowego i wysoka czystość, a także jest kompatybilna z późniejszą analizą za pomocą spektrometrii mas.

Jednoetapowe oczyszczanie białek znakowanych podwójnymi paciorkowcami i ich kompleksów na żywicy Strep-Tactin usieciowanej suberatrynem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3)

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

Metoda Tandem Affinity Purification (TAP) była szeroko stosowana do izolowania natywnych kompleksów z ekstraktu komórkowego, głównie eukariotycznego, do proteomiki. W tym miejscu przedstawiamy protokół metody TAP zoptymalizowany pod kątem oczyszczania kompleksów natywnych do badań strukturalnych.

Oczyszczanie kompleksów natywnych do badań strukturalnych za pomocą metody tandemowego znacznika powinowactwa

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Opisujemy tutaj nowatorską, solidną i efektywną metodę tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) do ekspresji, izolacji i charakterystyki kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych. Protokół ten może być wykorzystany do biochemicznej charakterystyki dyskretnych kompleksów, a także do identyfikacji nowych interaktorów i modyfikacji potranslacyjnych, które regulują ich funkcję.

Tandemowe oczyszczanie kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych

Ten artykuł przedstawia szereg następujących po sobie metod ekspresji i oczyszczania syntazy tryptofanu Salmonella typhimurium w tym protokole, szybkim systemie do oczyszczania kompleksu białkowego w ciągu jednego dnia. Omówione metody to mutageneza ukierunkowana na miejsce, ekspresja białek w Escherichia coli, chromatografia powinowactwa, chromatografia filtracji żelowej i krystalizacja.

Mutageneza PCR, klonowanie, ekspresja, protokoły szybkiego oczyszczania białek oraz krystalizacja typu dzikiego i zmutowanych form syntazy tryptofanu

Septyny to białka cytoszkieletu. Oddziałują z błonami lipidowymi i mogą wykrywać, ale także generować krzywiznę błony w skali mikronów. W tym protokole opisujemy oddolne metodologie in vitro do analizy deformacji błony, wrażliwego na krzywiznę wiązania septyny i ultrastruktury włókien septyny.

Oddolne metody in vitro do oznaczania organizacji ultrastrukturalnej, kształtowania błony i zachowania wrażliwości na krzywiznę septyn

Rekonstytucja bez komórek była kluczowym narzędziem do zrozumienia montażu cytoszkieletu, a prace w ostatniej dekadzie ustaliły podejścia do badania dynamiki septyny w systemach minimalnych. Przedstawiono tutaj trzy uzupełniające się metody obserwacji montażu septyny w różnych kontekstach membranowych: dwuwarstwy płaskie, podpory sferyczne i podpory prętowe.

Rekonstrukcja zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych

Ten protokół szczegółowo opisuje procedury rekombinacyjnego wytwarzania ludzkiego holoenzymu miozyny-7a za pomocą systemu MultiBac Baculovirus oraz badania jego ruchliwości za pomocą dostosowanego testu ślizgowego in vitro.

Oczyszczanie oparte na systemie MultiBac i biofizyczna charakterystyka ludzkiej miozyny-7a

Poznaj metodę oczyszczania wysokiej jakości kompleksów septynowych przy użyciu chromatografii afinitowej. Protokół ten umożliwia badanie ról septyn w podziale i migracji komórek.

Oczyszczanie i kontrola jakości rekombinowanych kompleksów septynowych do rekonstytucji bezkomórkowej

Przeglądaj więcej filmów