Name: Znakowanie immunologiczne i zliczanie synaps wstęgowych u ślimaków młodych dorosłych i starszych myszoskoczków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Poznaj metodę znakowania immunologicznego i zliczania synaps wstęgowych w ślimaku u myszoskoczków różnych wieków. Protokół umożliwia ilościową ocenę integralności synaptycznej w badaniach nad presbiakuzją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Lichunowi Zhangowi za pomoc w ustanowieniu metody oraz Jednostce Obsługi Mikroskopii Fluorescencyjnej, Uniwersytetu Carla von Ossietzky'ego w Oldenburgu, za korzystanie z urządzeń do obrazowania. Badania zostały sfinansowane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) w ramach niemieckiej strategii doskonałości -EXC 2177/1.

<ol><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+and+age-related+hearing+loss%3A+new+perspectives+and+potential+therapies+%5Bversion+1%3B+peer+review%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review.</a> F1000Research. 6 (927), (2017).</li>
<li>Heeringa, A. N., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aging+cochlea%3A+Towards+unraveling+the+functional+contributions+of+strial+dysfunction+and+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing%22%5BJournal%5D)">The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy.</a> Hearing. 376, 111-124 (2019).</li>
<li>Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+gradients+of+ribbon+size+and+AMPA+receptor+expression+underlie+sensitivity+differences+among+cochlear-nerve%2Fhair-cell+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).</li>
<li>Khimich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+synaptic+ribbons+are+essential+for+synchronous+auditory+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling.</a> Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).</li>
<li>Pangršič, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+requires+otoferlin-dependent+efficient+replenishment+of+synaptic+vesicles+in+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells.</a> Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).</li>
<li>Meyer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+of+synapse+number%2C+structure+and+function+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea.</a> Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).</li>
<li>Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+gradients+of+ribbon+volume+and+AMPA-receptor+patch+volume+in+cochlear+afferent+synapses+on+gerbil+inner+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells.</a> Hearing Research. 364, 81-89 (2018).</li>
<li>Steenken, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+decline+in+cochlear+ribbon+synapses+and+its+relation+to+different+metrics+of+auditory-nerve+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity.</a> Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).</li>
<li>Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+differences+among+afferent+synapses+on+cochlear+hair+cells%3A+Correlations+with+spontaneous+discharge+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate.</a> Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).</li>
<li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li>
<li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li>
<li>Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olivocochlear+innervation+maintains+the+normal+modiolar-pillar+and+habenular-cuticular+gradients+in+cochlear+synaptic+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).</li>
<li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes%2C+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB%2FnJ+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6 (1), 25056(2016).</li>
<li>Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+gradients+in+inner+hair+cell-auditory+nerve+fiber+pre-+and+postsynaptic+proteins+differ+across+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains.</a> Hearing Research. 390, 107933(2020).</li>
<li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li>
<li>Bourien, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+auditory+nerve+fibers+to+compound+action+potential+of+the+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve.</a> Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).</li>
<li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+cochlear+synaptopathy%3A+An+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li>
<li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis%3A+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li>
<li>Batrel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+potentials+recorded+at+the+round+window+enable+the+detection+of+low+spontaneous+rate+fibers+in+gerbil+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0169890(2017).</li>
<li>Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -L., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss+in+gerbil%3A+Round+window+assays+of+synapse+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978(2021).</li>
<li>Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+auditory+thresholds+and+loss+of+ribbon+synapses+at+inner+hair+cells+in+aged+gerbils%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils.</a> Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).</li>
<li>Cheal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gerbil%3A+A+unique+model+for+research+on+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Aging+Research%22%5BJournal%5D)">The gerbil: A unique model for research on aging.</a> Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).</li>
<li>Gates, G. A., Mills, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presbycusis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Presbycusis.</a> The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).</li>
<li>Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+sensitivity+of+the+gerbil%2C+Meriones+unguiculatis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).</li>
<li>Müller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cochlear+place-frequency+map+of+the+adult+and+developing+gerbil%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+the+intact+rodent+organ+of+Corti+for+RNAscope+and+immunolabeling%2C+confocal+microscopy%2C+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100544(2021).</li>
<li>Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+migration+and+reorganization+after+noise+exposure+suggests+regeneration+in+a+mature+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19945(2020).</li>
<li>Gray, D. A., Woulfe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin+and+aging%3A+a+matter+of+toxic+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+Aging+Knowledge+Environment%3A+SAGE+KE%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste.</a> Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1(2005).</li>
<li>Li, H. -S., Hultcrantz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+degeneration+of+the+organ+of+Corti+in+two+genotypes+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22ORL%3B+Journal+for+Oto-rhino-laryngology+and+Its+Related+Specialties%22%5BJournal%5D)">Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice.</a> ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).</li>
<li>Kobrina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+anatomical+and+physiological+markers+of+auditory+system+degeneration+with+behavioral+hearing+assessments+in+a+mouse+%28Mus+musculus%29+model+of+age-related+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss.</a> Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).</li>
<li>Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+role+of+lipofuscin+in+age-related+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 464(2018).</li>
<li>Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+myocardial+tissue+with+digital+autofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+Informatics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy.</a> Journal of Pathology Informatics. 7, 15(2016).</li>
<li>Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+gradients+in+the+size+of+inner+hair+cell+ribbons+emerge+before+the+onset+of+hearing+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).</li>
<li>Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+neural+degeneration+in+the+human+cochlea%3A+Evidence+for+hidden+hearing+loss+in+the+aging+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear.</a> Neuroscience. 407, 8-20 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Dzięki metodzie opisanej w niniejszym protokole możliwe jest znakowanie immunologiczne IHC i struktur synaptycznych w ślimakach od młodych dorosłych i starszych myszoskoczków, identyfikacja przypuszczalnych funkcjonalnych synaps poprzez kolokalizację elementów pre- i postsynaptycznych, przypisanie ich do poszczególnych IHC oraz ilościowe określenie ich liczby, objętości i lokalizacji. Przeciwciała użyte w tym podejściu znakowały również zewnętrzne komórki rzęsate (OHC; myoVIIa) i ich wstęgi presynaptyczne. Co więcej, rea...

Ubytek słuchu związany z wiekiem jest jedną z najbardziej rozpowszechnionych chorób na świecie, która dotyka ponad jedną trzecią światowej populacji w wieku 65 lat i starszych1. Podstawowe przyczyny są nadal przedmiotem dyskusji i są aktywnie badane, ale mogą obejmować utratę wyspecjalizowanych synaps łączących wewnętrzne komórki rzęsate (IHC) z aferentnymi włóknami nerwu słuchowego2. Te synapsy wstęgowe składają się ze struktury presynaptycznej, która ma pęcherzyki wypełnione połączonym z nią neuroprzekaźnikiem glutaminianem, a także postsynaptyczne receptory glutaminianu kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowego (AMPA)3,4,5. U myszoskoczka ~20 aferentnych włókien nerwowych słuchowych styka się z jednym IHC6,7,8. Włókna na IHC zwrócone w stronę modiolusu są przeciwstawne do dużych wstęg synaptycznych, podczas gdy włókna łączące się po stronie filaru IHC są skierowane w stronę małych wstążek synaptycznych (tj. w cats9, myszoskoczkach7, świnkach morskich10 i myszy3,11,12,13,14). Ponadto u myszoskoczka wielkość wstążek presynaptycznych i postsynaptycznych plam glutaminianu jest dodatnio skorelowana7,14. Włókna, które są przeciwstawne do dużych wstęg po stronie modiolarnej IHC, są małego kalibru i mają niskie spontaniczne wskaźniki i wysokie progi15. Istnieją dowody na to, że włókna o niskiej spontaniczności są bardziej podatne na ekspozycję na hałas10 i leki ototoksyczne16 niż włókna niskoprogowe o wysokiej spontaniczności, które znajdują się po stronie filaru IHCs15. 
Utrata synaps wstęgowych jest najwcześniejszym zdarzeniem zwyrodnieniowym w ubytku słuchu związanym z wiekiem nerwowym ślimaka, podczas gdy utrata spiralnych komórek zwojowych i ich aferentnych włókien nerwowych słuchowych pozostaje w tyle17,18. Korelaty elektrofizjologiczne obejmują zapisy słuchowych reakcji pnia mózgu17 i złożone potencjały czynnościowe8; Nie odzwierciedlają one jednak subtelności utraty synaps, ponieważ włókna o niskiej spontaniczności nie przyczyniają się do tych pomiarów<klasa SUP='xref'>16. Bardziej obiecującymi wskaźnikami elektrofizjologicznymi są indeks neuronalny pochodzący z potencjału masy19 oraz peristimulus time response20. Są one jednak wiarygodne tylko wtedy, gdy zwierzę nie ma innych patologii ślimakowych, poza utratą włókien nerwowych słuchowych, które wpływają na aktywność pozostałych włókien nerwowych słuchowych8. Co więcej, behawioralnie oceniane progi u myszoskoczka nie były skorelowane z liczbą synaps21. W związku z tym wiarygodna kwantyfikacja ocalałych synaps wstęgowych, a tym samym liczby funkcjonalnych włókien nerwowych słuchowych, jest możliwa tylko poprzez bezpośrednie badanie tkanki ślimaka.
Myszoskoczek mongolski (Meriones unguiculatus) jest odpowiednim modelem zwierzęcym do badania ubytków słuchu związanych z wiekiem. Ma krótką żywotność, ma słuch niskotonowy podobny do ludzkiego, jest łatwy w utrzymaniu i wykazuje podobieństwa do ludzkich patologii związanych z ubytkiem słuchu związanym z wiekiem2,22,23,24. Myszoskoczki są uważane za starsze, gdy osiągną wiek 36 miesięcy, czyli pod koniec ich średniej długości życia22. Co ważne, wykazano związaną z wiekiem utratę synaps wstęgowych u myszoskoczków wychowywanych i starzejących się w cichym otoczeniu8,21. 
Tutaj przedstawiono protokół do immunoznakowania, preparowania i analizowania ślimaków od myszoskoczków w różnym wieku, od młodych dorosłych do starszych. Stosuje się przeciwciała skierowane przeciwko składnikom presynapsy (CtBP2), postsynaptyczne plastry receptora glutaminianu (GluA2) i IHC (myoVIIa). Stosuje się wygaszacz autofluorescencji, który redukuje tło w starzejących się ślimakach i pozostawia nienaruszony sygnał fluorescencyjny. Ponadto podano opis, jak przeprowadzić sekcję ślimaka w celu zbadania zarówno nabłonka czuciowego, jak i prążkowia naczyniowego. Długość ślimaka jest mierzona, aby umożliwić wybór różnych lokalizacji ślimaka, które odpowiadają określonym najlepszym częstotliwościom25. Kwantyfikacja liczby synaps odbywa się za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania ImageJ26. Dodatkowa kwantyfikacja woluminów i lokalizacji synaps w obrębie poszczególnych HC jest wykonywana za pomocą oprogramowania napisanego specjalnie w Matlabie. To oprogramowanie nie jest publicznie dostępne, ponieważ autorzy nie mają zasobów, aby zapewnić profesjonalną dokumentację i wsparcie.

<table><tbody><tr><td>Albumina Frakcja V bez biotyny</td><td>Carl Roth</td><td>0163.2</td><td></td></tr><tr><td>anty-CtBP2 (mysz monoklonalna IgG1)</td> <td>BD Biosciences, Eysins</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>anty-GluA2 (mysz monoklonalna IgG2a)</td> <td>Milipore</td><td>MAB39</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie (IgG1)-AF 488</td><td>Sondy molekularne Inc.</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>anty-miozynaVIIa (poliklonalny królik IgG)</td> <td>Proteus Biosciences</td><td>25e6790</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt ostrza i Breaker - Płaskie szczęki</td><td>Fine Science Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do tętnic Bonn - Końcówka kulkowa</td><td>Fine Science Tools</td><td>14086-09</td><td></td></tr><tr><td>Grubość szkiełka nakrywkowego 1,5 H, 24 x 60 mm</td><td>Carl Roth</td><td>LH26.1</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe ostrze chirurgiczne</td><td>Henry Schein</td><td>0473</td><td></td></tr><tr><td>osioł anty-królik (IgG)-AF647</td><td>Life Technologies-Sondy molekularne</td><td>A-31573</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Drobne kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td> precyzyjnej <td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do #5SF Dumont</td><td>Narzędzia do nauki o naprawie</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, absolut 99,8%</td><td>Fisher Scientific</td><td>12468750</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Carl Roth</td><td>8040.2</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Pióro Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ostrze obosieczne</td><td>PLANO</td><td>112-9</td><td></td></tr><tr><td>G19 Kaniula</td><td>Henry Schein</td><td>9003633</td><td></td></tr><tr><td>koza anty-mysia (IgG2a)-AF568</td><td>Invitrogen</td><td>A-21134</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Ratiopharm</td><td>N68542.04</td><td></td></tr><tr><td>Huygens Essentials</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Fidżi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersol, Olejek immersyjny 518F</td><td>Carl Zeiss</td><td>10539438</td><td></td></tr><tr><td>Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)</td><td>Braun</td><td>4062957E</td><td></td></tr><tr><td>ISM596D</td><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Ismatec</td><td></td></tr><tr><td>KL 1600 LED</td><td>Źródło światła Schott</td><td>150.600</td><td>do stereomikroskopu</td></tr><tr><td>Pakiet aplikacji Leica X</td><td>Leica Microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System Leica TCS SP8</td><td>Leica Microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The Mathworks Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Mayo Carbide Tungston ToghCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14512-17</td><td></td></tr><tr><td>Mini-100 Orbital-Genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-M100</td><td>do użytku w zimnym środowisku</td></tr><tr><td>Narcoren (pentobarbital)</td><td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ni-EI</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon Europe B.V.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego bez otworów wentylacyjnych</td><td>Avantor VWR</td><td>390-1375</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosforan disodowy</td><td>AppliChem</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan monopotasowy</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434-M</td><td></td></tr><tr><td>Pojemniki z nakrętkami</td><td>Sarstedt</td><td>75.562.300</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Carl Roth</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze studenckie Adson</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>91106-12</td><td></td></tr><tr><td>Student Halsted-Mosquito Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>91308-12</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost</td><td>Epredia</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X</td><td>Carl Roth</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher</td><td>Biotium</td><td>23007</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas, 3mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Średni montaż zapobiegający blaknięciu Vector</td><td>Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vibrax VXR basic</td><td>IKA</td><td>0002819000</td><td></td></tr><tr><td>VX 7 Nasadka do naczyń do Vibrax VXR basic</td><td>IKA</td><td>953300</td><td></td></tr><tr><td>Wild TYP 355110 (Stereoskop)</td><td>Wild Heerbrugg</td><td></td><td>nie jest już dostępny</td></tr></tbody></table>

znakowanie immunologiczne i zliczanie synaps wstęgowych u ślimaków młodych dorosłych i starszych myszoskoczków

Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae

Zakłada się, że utrata synaps wstęgowych łączących wewnętrzne komórki rzęsate i doprowadzające włókna nerwów słuchowych jest jedną z przyczyn utraty słuchu związanej z wiekiem. Najpowszechniejszą metodą wykrywania utraty synaps wstęgowych jest znakowanie immunologiczne, ponieważ pozwala na ilościowe pobieranie próbek z kilku lokalizacji tonotopowych w pojedynczym ślimaku. Jednak interesujące struktury są zakopane głęboko w ślimaku kostnym. Myszoskoczki są używane jako model zwierzęcy dla ubytku słuchu związanego z wiekiem. W tym miejscu opisano rutynowe protokoły fiksacji, znakowania immunologicznego całych wierzchowców ślimaka myszoskoczka, obrazowania konfokalnego oraz ilościowego określania liczby i objętości synaps wstęgowych. Ponadto zwrócono uwagę na szczególne wyzwania związane z pozyskiwaniem dobrego materiału od cennych starzejących się osobników. 
Myszoskoczki są poddawane eutanazji i albo perfundowane sercowo, albo ich pęcherze bębenkowe są starannie wycinane z czaszki. Ślimaki są otwierane na wierzchołku i podstawie i bezpośrednio przenoszone do utrwalacza. Niezależnie od początkowej metody, ślimaki są postfiksowane, a następnie odkamieniane. Tkanka jest następnie znakowana pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko strukturom pre- i postsynaptycznym oraz komórkom rzęsatym. Następnie ślimaki są inkubowane z wtórnymi przeciwciałami znakowanymi fluorescencją, które są specyficzne wobec odpowiednich przeciwciał pierwotnych. Ślimaki starszych myszoskoczków są następnie poddawane działaniu środka wygaszającego autofluorescencję w celu zmniejszenia zazwyczaj znacznej fluorescencji tła tkanek starszych zwierząt. 
Na koniec, ślimaki są dzielone na 6-11 segmentów. Cała długość ślimaka jest rekonstruowana w taki sposób, aby można było wiarygodnie określić konkretne lokalizacje ślimaka u poszczególnych osób. Konfokalne stosy obrazów, pozyskiwane sekwencyjnie, pomagają wizualizować komórki rzęsate i synapsy w wybranych lokalizacjach. Stosy konfokalne są dekonwoluowane, a synapsy są albo liczone ręcznie za pomocą ImageJ, albo bardziej obszerna kwantyfikacja struktur synaptycznych jest przeprowadzana za pomocą procedur analizy obrazu napisanych specjalnie w Matlabie.

Ślimaki pobierano albo po perfuzji układu sercowo-naczyniowego całego zwierzęcia utrwalaczem, albo poprzez szybką sekcję po uśmierceniu zwierzęcia i utrwaleniu przez imersję. W przypadku tej drugiej metody komórki IHC pozostawały na swoim miejscu podczas sekcji, podczas gdy w sytuacjach nieudanej perfuzji i tym samym niewystarczającego utrwalenia tkanki, nabłonek sensoryczny był często zniszczony. Należy zauważyć, że autorzy napotkali przypadki, w których utrwalenie ślimaków po perfuzji transkardialnej było niewystarczaj...

Przedstawiono protokół przetwarzania ślimaków młodych dorosłych i starszych myszoskoczków poprzez immunoznakowanie aferentnych struktur synaptycznych i komórek rzęsatych, wygaszanie autofluorescencji w starzejącej się tkance, preparowanie i szacowanie długości ślimaka oraz ilościowe określanie synaps w stosach obrazów uzyskanych za pomocą obrazowania konfokalnego.

Znakowanie immunologiczne i zliczanie synaps wstęgowych u ślimaków młodych dorosłych i starszych myszoskoczków

The loss of ribbon synapses connecting inner hair cells and afferent auditory nerve fibers is assumed to be one cause of age-related hearing loss. The ...

Protokół ten umożliwia ocenę integralności synaptycznej w ślimaku myszoskoczka w każdym wieku. Jest to ważne dla podstawowych badań nad problemami ze słuchem, w szczególności wynikającymi ze starzenia się. Protokół jest stosunkowo szybki i dostarcza danych ilościowych z kilku miejsc wzdłuż ślimaka.Ponadto rozwiązuje specyficzny problem starzenia się tkanek za pomocą gaszenia autofluorescencji. Zwyrodnienie synaps jest najwcześniejszą oznaką utraty funkcji ślimaka. Ilościowe określenie jest ważnym narzędziem w badaniach nad opracowaniem nieinwazyjnych narzędzi diagnostycznych dla synaptopatii.Rozwarstwienie ślimaka jest najważniejszą częścią, która wymaga praktyki, dlatego lepiej zacząć od nieeksperymentalnego cochli. Zacznij od usunięcia pęcherzy. Przetnij kość nożyczkami lub złam kość kleszczami i usuń ją kleszczami, aby dotrzeć do ślimaka.Usuń młoteczek, kowadełko i kanały półkoliste. Ostrożnie usuń kość pokrywającą wierzchołek ślimaka i podrap kość ślimaka kleszczami, aby zrobić małe otwory na wierzchołku i w zwoju podstawy lub ostrożnie przebij otwory w obu miejscach. Natychmiast przenieś pęcherze do co najmniej 50 mililitrów zimnego utrwalacza.Aby przeciąć cochli na pół, umieść kawałek żyletki dłuższy niż zwinięta długość ślimaka w uchwycie ostrza. Następnie umieść ślimak na szalce Petriego pod mikroskopem stereoskopowym. Odetnij nadmiar tkanki żyletką lub drobnymi nożyczkami.Przytrzymaj ślimak na miejscu za pomocą cienkich kleszczyków i przetnij na pół wzdłuż modiolus. Przygotować 5% roztwór wygaszacza autofluorescencji, mieszając go z 70% etanolem. Umieścić cochli w tym roztworze i inkubować przez jedną minutę w temperaturze pokojowej na shakerze, a następnie przemyć trzykrotnie jednym mililitrem PBS przez pięć minut.Do wypreparowania ślimaka zbierz dwa cienkie kleszcze, bardzo cienkie kleszcze, vanny, nożyczki sprężynowe, uchwyt ostrza, żyletkę i napełnij polistyrolową szalkę Petriego i jej pokrywkę PBS. Odłam kawałki żyletki, aby uzyskać powierzchnię cięcia od dwóch do czterech milimetrów. Przeciąć ślimak na pół, jak pokazano w części dotyczącej przygotowania tkanki.Ostrożnie przymocuj połówkę ślimaka kleszczami tak, aby krawędź cięcia była skierowana do góry. Użyj cienkich nożyczek sprężynowych, aby odciąć kość ślimaka powyżej helicotrema pokrywającego wierzchołek. Następnie użyj nożyczek, aby wyizolować skręt wierzchołkowy, przecinając modiolus i nerw słuchowy oraz przedsionek scala.Wykonaj dwa nacięcia z każdej strony kości ślimaka powyżej lub, jeśli prążek naczyniowy nie jest potrzebny do dalszej oceny, bezpośrednio przez prążek naczyniowy środkowego skrętu. Użyj żyletki, aby oddzielić kawałki ślimaka. Alternatywnie przetnij narząd Cortiego i prążek naczyniowy.Pozostaw prążek naczyniowy połączony z więzadłem spiralnym i usuń odwapnioną kość za pomocą kleszczy. Następnie przenieś kawałki ślimaka do pokrywki szalki Petriego wypełnionej PBS. Usuń nadmiar tkanki z boków słupka i modiolaru tak, aby całe mocowania leżały później na szkiełku jak najbardziej płasko.Duże kawałki ślimaka, w szczególności te pochodzące z skrętu podstawowego, należy przeciąć na dwie części. Ostrożnie usuń membranę tektorialną za pomocą bardzo cienkich kleszczyków. Umieść kawałki ślimaka na szkiełku w kropli podłoża montażowego, upewniając się, że narząd Cortiego jest skierowany do góry.Przesuń fragment ślimaka do płaszczyzny strzałkowej i poszukaj wgłębienia spiralnego rąbka w bliskiej odległości od wewnętrznych komórek rzęsatych. To wgłębienie spiralnego rąbka można wyraźnie zobaczyć w środkowych i podstawowych częściach ślimaka. Przenieś cały ślimak i całe prążki naczyniowe na szkiełko mikroskopowe, powtarzając te kroki.Nasuń szkiełko nakrywkowe i dodaj lakier do paznokci wokół krawędzi w celu uszczelnienia. Suszyć w ciemności i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Otwórz kopię zdekonwoluowanych stosów w oprogramowaniu ImageJ załadowanym wtyczką BioVoxxel.Podziel kanały, klikając Obraz, następnie Kolor, a następnie Podziel kanały. Scal je, klikając Obraz, następnie Kolor, a następnie Scal kanały, aby przypisać różne kolory. Przekonwertuj obraz na stos RGB, klikając Obraz, a następnie przejdź do Kolor i kliknij Ułóż na RGB.Dostosuj jasność i kontrast, klikając Obraz, Dostosuj, a następnie Jasność/Kontrast. Użyj opcji auto lub suwaka, aby upewnić się, że struktury przed i po synapcie oraz wewnętrzne etykiety komórek rzęsatych różnią się od tła. Oznacz pięć wewnętrznych komórek włosowych za pomocą narzędzia tekstowego, klikając żądane miejsce w stosie.Następnie przejdź do Analizuj, a następnie Narzędzia i wybierz Menedżer ROI. Zaznacz etykiety pól wyboru, aby oznaczyć punkty liczbą. Powiększ interesującą nas wewnętrzną komórkę włosa.Kliknij prawym przyciskiem myszy narzędzie punkt, aby wybrać tryb Wielopunktowy. Przewiń wymiar Z i policz funkcjonalne synapsy wstęgowe, które są identyfikowane przez wstążkę presynaptyczną w zestawieniu z postsynaptyczną łatą glutaminianu. Po wybraniu wszystkich interesujących Cię struktur kliknij Dodaj menedżera ROI, a następnie kliknij dowolną nazwę i wybierz Zmień nazwę.Za pomocą narzędzia Rączka dostosuj obraz, aby w pełni wyświetlić następną wewnętrzną komórkę włosa. Zmień z narzędzia Wielopunktowy na Narzędzie Punkt, aby uniknąć dodawania większej liczby punktów punktowych do poprzednio zapisanych danych. Kliknij interesującą Cię strukturę w następnej wewnętrznej komórce włosa i zmień na narzędzie Wielopunktowe.Kontynuuj dodawanie funkcjonalnej synapsy wstęgowej w Menedżerze ROI, aż wszystkie wewnętrzne komórki rzęsate zostaną ocenione. Kliknij zestaw danych w Menedżerze zwrotu z inwestycji, a następnie kliknij Zmierz. Poczekaj, aż pojawi się nowe okno z listą zmierzonych punktów danych i kliknij Plik i Zapisz jako, aby zapisać tę listę jako arkusz kalkulacyjny.Zapisz obraz, aktywując opcję Pokaż wszystko w Menedżerze zwrotu z inwestycji. Kliknij Spłaszcz, aby trwale dodać etykiety punktów do stosu i kliknij Zgadzam się zamknąć, zapisując zmiany. Projekcje stosu Z ze ślimaka młodego myszoskoczka w wieku 10 miesięcy pokazują, że znakowane miozyną 7A wewnętrzne komórki rzęsate zaznaczone tutaj białymi przerywanymi liniami ostro kontrastowały z tłem.Wstęgi presynaptyczne zostały oznaczone anty-CtBP2 dwa pokazane na zielono, podczas gdy postsynaptyczne łaty glutaminianu zostały oznaczone anty-GluA2 pokazanym na czerwono. Ślimak starego myszoskoczka w wieku 38 miesięcy był leczony wygaszaczem autofluorescencji i wykazywał wyraźne wewnętrzne komórki rzęsate z wyraźnie widocznymi strukturami pre- i postsynaptycznymi. Aby przetestować stabilność znakowania immunologicznego, ten sam fragment ślimaka młodego myszoskoczka został zobrazowany po trzech miesiącach i 29 i pół miesiącach.Pomimo zmniejszonego stosunku sygnału do szumu, funkcjonalne synapsy były wyraźne i policzalne. Nawet jeśli cięcie się nie powiedzie, zamontuj pozostały fragment tkanki, aby później jak najdokładniej oszacować pełną długość ślimaka. Dane z tego protokołu są szczególnie cenne, jeśli są poprzedzone, a następnie indywidualnie skorelowane z elektrofizjologicznymi lub psychofizycznymi badaniami słuchu.

immunolabeling-counting-ribbon-synapses-young-adult-aged-gerbil

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Prezentujemy zastosowanie pistoletu genowego do wprowadzania barwników fluorescencyjnych, takich jak DiI, do neuronów wyrytych z plastrów mózgu gryzoni oraz naczelnych innych niż człowiek w różnym wieku. W tym konkretnym przypadku wykorzystujemy dorosłe myszy (w wieku 3–6 miesięcy) oraz dorosłe makaki krabikowate (w wieku 9–15 lat). Technika ta, pierwotnie opisana przez laboratorium dr. Lichtmana (Gan et al., 2000), jest odpowiednia do badania rozgałęzień dendrytycznych oraz morfologii kolców...

DIOLISTYCzne znakowanie neuronów w skrawkach mózgu gryzoni i naczelnych niebędących ludźmi

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.

Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Rejestracje metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell z dendrytów włókien nerwu słuchowego w obrębie synaps wstążkowych komórek rzęskowych wewnętrznych w ślimaku ssaków.

Rejestracje postsynaptyczne w dendrytach aferentnych kontaktujących się z wewnętrznymi komórkami rzęskowymi ślimaka: monitorowanie uwalniania wielopęcherzykowego w synapsie wstążkowej

Ten film demonstruje metodę oceny synaps wstęgowych w określonych regionach ślimaka myszy. Wykorzystuje techniki barwienia immunologicznego i obrazowania konfokalnego w celu identyfikacji funkcjonalnych synaps w różnych regionach częstotliwości w każdym skręcie ślimaka.

Ocena synaps wstęgowych w określonych obszarach częstotliwości ślimaka myszy

Lokalizacja i dystrybucja białek dostarcza ważnych informacji dla zrozumienia ich funkcji komórkowych. Doskonała rozdzielczość przestrzenna mikroskopii elektronowej (EM) może być wykorzystana do określenia subkomórkowej lokalizacji danego antygenu po immunohistochemii. W przypadku tkanek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) zachowanie integralności strukturalnej przy jednoczesnym zachowaniu antygenowości było szczególnie trudne w badaniach EM. Tutaj przyjmujemy procedurę, która została...

Znakowanie białek synaptycznych po zatopieniu Immunogold w kulturach warstw hipokampa

Ten artykuł wideo ilustruje kompleksowy protokół do wykrywania i ilościowego określania wszystkich etapów neurogenezy dorosłego hipokampa w obrębie tego samego odcinka tkanki. Opracowaliśmy metodę przezwyciężania ograniczeń pośredniej immunofluorescencji mnogiej, które powstają, gdy odpowiednie przeciwciała od różnych gatunków gospodarzy są niedostępne.

Immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza w celu zbadania neurogenezy hipokampa u dorosłych

Przedstawiamy metodę izolowania dorosłego organu Cortiego jako trzech nienaruszonych zwojów ślimaka (wierzchołek, środek i podstawa). Demonstrujemy również procedurę barwienia immunologicznego za pomocą fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał. Razem techniki te pozwalają na badanie komórek rzęsatych, komórek podporowych i innych typów komórek znajdujących się w ślimaku.

Rozwarstwienie całej góry i immunofluorescencja ślimaka dorosłej myszy

Węchowe neurony czuciowe wyrażają szeroką gamę cząsteczek sortujących aksony, aby ustanowić prawidłowe obwody neuronowe. Protokół ten opisuje metodę barwienia immunohistochemicznego w celu wizualizacji kombinatorycznych ekspresji cząsteczek sortujących aksony na końcach aksonów węchowych neuronów czuciowych.

Poczwórne barwienie immunologiczne opuszki węchowej w celu wizualizacji węchowych kodów tożsamości molekularnej aksonu czuciowego

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalny protokół oceny cech morfologicznych i statusu funkcjonalnego synaps wstęgowych u normalnych myszy. Prezentowany model nadaje się również do modeli z ograniczeniami synaptopatii ślimakowej wywołanych hałasem i związanych z wiekiem. Omówiono również korelacyjne wyniki poprzednich badań na myszach.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

Ten artykuł przedstawia zmodyfikowaną metodę przygotowania powierzchni ślimaka, która wymaga odwapnienia i użycia kleju komórkowego i tkankowego do przyklejenia kawałków nabłonka ślimaka do 10 mm okrągłych szkiełek nakrywkowych do immunohistochemii u dorosłych ślimaków myszy.

Przygotowanie powierzchni ślimaka u dorosłej myszy

Mikroskop z arkuszami świetlnymi został opracowany do obrazowania i digitalizacji całego ślimaka.

Obrazowanie starzejącego się ślimaka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w arkuszach świetlnych

Poznaj metodę znakowania immunologicznego i zliczania synaps wstęgowych w ślimaku u myszoskoczków różnych wieków. Protokół umożliwia ilościową ocenę integralności synaptycznej w badaniach nad presbiakuzją.

Znakowanie immunologiczne i zliczanie synaps wstęgowych u ślimaków młodych dorosłych i starszych myszoskoczków

Przeglądaj więcej filmów