Szybka lepkosprężysta charakterystyka śluzu dróg oddechowych za pomocą reometru laboratoryjnego

Choroby śluzowo-obturacyjne charakteryzują się nieprawidłową lepkością śluzu dróg oddechowych. Protokół pokazuje, jak wykorzystać reologię do ilościowego określenia lepkości śluzu i analizy danych w celu przetestowania leczenia ukierunkowanego na śluz. Reologia śluzu dostarcza specyficznych biomarkerów ilościowych.

Korzystanie z urządzenia laboratoryjnego znacznie upraszcza logistykę pomiaru tych biomarkerów w próbkach klinicznych, takich jak próbki ludzkiej plwociny. Wykorzystanie reologii śluzu jako narzędzia diagnostycznego chorób obturacyjnych jest nadal wyzwaniem. Coraz więcej dowodów wskazuje na silną korelację między właściwościami reologicznymi, stanem zapalnym i infekcją bakteryjną.

Śluz jest zawsze obecny na styku ciała, gdzie smaruje i pełni rolę ochronną. Reologia śluzu może być stosowana do innych układów, takich jak drogi pokarmowe i płciowe. Aby uzyskać dokładne pomiary, kluczowe znaczenie ma prawidłowe obchodzenie się z próbką i jej umieszczenie.

Demonstracja wizualna może zwiększyć precyzję tego testu. Procedurę tę zademonstruje Kendall Shaffer, technik badawczy z laboratorium lotniczego. Rozpocznij od posortowania zebranej plwociny lub śluzu z dróg oddechowych w sterylnych kubkach na próbki.

W przypadku plwociny należy usunąć nadmiar śliny z próbki natychmiast po pobraniu. Umieścić próbki na lodzie na czas transportu. Ogranicz czas transportu do mniej niż czterech godzin.

Przeanalizować próbki w momencie ich pobrania. Homogenizować śluz, delikatnie pipetując w górę i w dół trzy do pięciu razy za pomocą pipety wyporowej. Lub pipetować bezpośrednio do probówek do mikrowirówek.

Próbki należy przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu ich przetworzenia. Podwielokrotnić próbki do przechowywania w objętościach większych lub równych 500 mikrolitrów, aby zapewnić wystarczającą objętość do eksperymentów. Przed porcjowaniem należy bezpośrednio odpipetować świeżą i mrożoną plwocinę lub śluz lub homogenizować próbki.

Napraw wymagane podwielokrotności do powtórnych pomiarów i zabiegów. Inkubować podwielokrotności, które mają być badane, w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej pięć minut przed pomiarem. Do testowania środków farmakologicznych należy używać roztworów podstawowych o wysokich stężeniach, aby zapobiec rozcieńczeniu próbki.

Dodaj od 1% do 10% objętości żądanego odczynnika bezpośrednio na próbkę. Upewnij się, że żadna kropla związku nie pozostała z boku tuby. Próbki należy inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez wymagany okres czasu, aby umożliwić reakcję chemiczną.

Wymieszaj próbkę śluzu i odczynnik, przesuwając dno probówki mikrowirówki co dwie minuty, aby umożliwić stopniowe przenikanie odczynnika do próbki śluzu bez naruszania sieci mucynowej. Porównując wiele odczynników do leków, upewnij się, że czas inkubacji jest podobny. Włącz urządzenie i zainicjuj oprogramowanie.

Wybierz nowy pomiar. Wprowadź numer identyfikacyjny próbki w polu Identyfikator środka oraz nazwę operatora w polu Operator, aby kontynuować. Wprowadź dodatkowe informacje lub komentarze w obszarze Komentarze.

Wybierz zestaw geometrii i dokładnie sprawdź duże i małe płyty, aby upewnić się, że są czyste i w idealnym stanie. Włóż mocno dużą płytę do dolnej ambony. Delikatnie włóż małą płytkę do górnej ambony i zablokuj płytkę, lekko obracając, aż usłyszysz kliknięcie, co oznacza, że płyta jest prawidłowo clamped.

Należy pamiętać, że swobodne oscylacje górnej płyty są normalne. Poczekaj, aż temperatura osiągnie docelową wartość 37 stopni Celsjusza. Następnie rozpocznij automatyczną kalibrację, zgodnie z monitem oprogramowania.

Za pomocą pipety wyporowej powoli nanieś od 250 do 500 mikrolitrów próbki na środek dużej płyty dolnej. Po osadzeniu na płytce lepkie próbki przyjmą kształt kopuły, podczas gdy próbki wysoce elastyczne mogą wymagać fizycznego odcięcia. Opuść głowicę pomiarową, w której znajduje się mała płytka, za pomocą oprogramowania i obserwuj próbkę.

Jeśli próbka zostanie prawidłowo załadowana na dolną płytę, zetknie się i zostanie wyśrodkowana między dwiema płytkami. Aby upewnić się, że próbka wypełni szczelinę, należy użyć funkcji zmniejszonej przerwy, dopóki próbka nie będzie już dwuwklęsła lub wyrównana z krawędzią płytki. Funkcja zmniejszonej szczeliny obniża krawędź pomiarową w krokach co 0,1 milimetra i jest ograniczona do 7 kroków.

Jeśli po wykonaniu 7 przyrostów pozostanie przerwa, kliknij przycisk Ponów instalację, aby powrócić do pozycji początkowej i dostosować pozycję i objętość próbki. Jeżeli przerwa jest znacznie zmniejszona, usunąć nadmiar próbki szpatułką, wykonując okrężne ruchy wzdłuż krawędzi górnej płytki. Delikatnie przyciąć nadmiar próbki, aby uniknąć naprężeń ścinających.

Opuść pokrywę ochronną, aby uniknąć przypadkowego rozprysku zanieczyszczonych płynów podczas oscylacji. Aby rozpocząć pomiar, kliknij przycisk Rozpocznij analizę. Cały cykl zajmie od czterech do siedmiu minut.

Unikaj głośnych rozmów i dotykania urządzenia lub ławki przez cały czas trwania cyklu. Ciche otoczenie ma kluczowe znaczenie przez pierwsze dwie minuty. Po zakończeniu cyklu kliknij przycisk Dalej, aby podnieść głowicę pomiarową i wygenerować raport z analizy próbki.

Gdy głowica pomiarowa zostanie całkowicie schowana, podnieś pokrywę ochronną. Wyrzucić próbkę i ostrożnie wyjąć płytki. Wyczyść i zdezynfekuj talerze ciepłą wodą z mydłem.

Właściwości lepkosprężyste ośmiu megadaltonowych PEO zmierzono przy pięciu stężeniach i bezpośrednio porównano między ocenianym reometrem laboratoryjnym a tradycyjnym reometrem masowym. W przeciwieństwie do rozwiązań PEO, śluz status asthmaticus reprezentuje ciało stałe, elastyczne zachowanie zdominowane przy niskim odkształceniu i charakteryzuje się krzyżowaniem przy wysokim odkształceniu. Ponadto trzykrotne pomiary przeprowadzone w 1,5% roztworze PEO i próbce śluzu w teście klinicznym potwierdziły, że liniowe charakterystyki lepkosprężyste były wysoce powtarzalne dla wartości uzyskanych z próbki biologicznej.

Mierzono zmiany właściwości lepkosprężystych śluzu po leczeniu środkiem mukolitycznym . Wpływ TCEP na lepkosprężystość śluzu testowano w warunkach klinicznych przy użyciu reometru laboratoryjnego. Leczenie mukolityczne spowodowało uzyskanie bardziej płynnej próbki ze spadkiem modułu zespolonego o 4,6 razy, modułem sprężystości o 5,1 razy, modułem lepkości o 1,9 razy, odkształceniem krzyżowym o 3,3 razy i granicą plastyczności krzyżowania o 5,7 razy oraz wzrostem współczynnika tłumienia o 2,8 razy.

Pomiar lepkosprężystości śluzu w drogach oddechowych w szybko zmieniających się warunkach klinicznych może pomóc w dostosowaniu leczenia pacjentów do indywidualnych przypadków, a także zapewnić ustandaryzowany protokół testowania nowych związków farmakologicznych. Technika ta jest obecnie stosowana do badania wpływu wysoce skutecznych modulatorów CFTR na plwocinę mukowiscydozy oraz do testowania siły działania różnych leków mających na celu zmianę właściwości śluzu.