Hodowla i genetyczna manipulacja nicieniami entomopatogennymi

Skuteczny protokół utrzymywania i wzmacniania nicieni entomopatogenicznych jest niezbędny do zrozumienia molekularnych podstaw patogeniczności nicieni i odporności antynicieni gospodarza. Protokół ten umożliwia nam produkcję dużej liczby symbiotycznych i aksenicznych bakterioforów Heterorhabditis bacteriophora i Steinernema carpocapsae IJ przy użyciu owadziego żywiciela, Galleria mellonella. Zacznij od przykrycia szalki Petriego kawałkiem bibuły filtracyjnej i dodaj około 10 do 15 larw Galleria mellonella.

Za pomocą pipety dozować dwa mililitry wody zawierającej około 25 do 50 zakaźnych młodych osobników na 10 mikrolitrów zawiesiny na robaki woskowe. I przechowuj szalkę Petriego w szafce w temperaturze pokojowej. W zależności od wilgotności bibuły filtracyjnej dodawaj od jednego do dwóch mililitrów wody co dwa dni.

Robaki woskowe zakażone zakaźnymi młodymi osobnikami zwykle giną w ciągu 48 godzin. Przygotuj pułapki wodne White's około 10 dni po zakażeniu robaków woskowych przez zakaźne młode osobniki. Ostrożnie przenieś martwe owady na nienamoczoną część bibuły filtracyjnej.

Użyj wody z kranu, aby napełnić dolną szalkę Petriego i umieść nakrętkę 15-mililitrowej rurki jako przekładkę do wentylacji. Używaj wody z kranu zamiast wody demineralizowanej lub dejonizowanej, aby uniknąć agregacji nicieni i upewnij się, że poziom wody w syfonie osiąga około połowy wysokości szalki Petriego. Gdy woda na małej szalce Petriego stanie się mętna z powodu nicieni, użyj pipety, aby przenieść nowe pokolenie zakaźnych młodych osobników do kolby do hodowli komórek T25 lub T75.

Później dolewaj wodę z kranu do 40% objętości lub do momentu osiągnięcia odpowiedniej gęstości. I przechowuj kolbę do hodowli komórkowych poziomo, aby uniknąć przekrwienia nicieni. Powtarzać przenoszenie zakaźnych młodocianych osobników do kolb do hodowli komórkowych i dodawanie wody, aż zakaźne młode osobniki przestaną wyłaniać się z tusz owadów w ciągu około trzech do pięciu dni.

Za pomocą pętli inokulacyjnej zeskrob kilka płatków zamrożonej kultury Photorhabdus temperata Ret16 na płytkę MacConkey i rozprowadź smugi w poszukiwaniu pojedynczych kolonii. Inkubuj płytkę przez dwa do trzech dni w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Po inkubacji zaszczepić 10 mililitrów bulionu LB kolonią na agarze MacConkey w 50-mililitrowej probówce i inkubować kulturę przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem.

Po inkubacji przenieść 100 mikrolitrów kultury przez noc z probówki o pojemności 50 mililitrów do nowej probówki do mikrowirówki, a następnie przepłukać 100 kultur przez noc 900 mikrolitrami PBS o pojedynczej mocy przez centryfuzję, w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra, w temperaturze 17 900 razy g. Zdekantować supernatant. Następnie rozcieńczyć kulturę 10 razy w PBS o pojedynczej mocy i pozostawić probówkę na lodzie.

Teraz zanurz robaki woskowe w 70% roztworze etanolu. Po osuszeniu owadów ręcznikiem papierowym umieść je w 50-mililitrowej tubie. Umieść probówkę na lodzie na 20 minut, aby unieruchomić robaki woskowe.

Użyj bibuły filtracyjnej, aby przykryć górną i dolną połowę szalki Petriego. Pokrywkę szalki Petriego pokrytą bibułą filtracyjną należy użyć jako podstawy do wstrzykiwań. Zwilż bibułę filtracyjną dolnej szalki Petriego i przenieś ją na lód, aby pomóc wstrzykniętym robakom woskowym w regeneracji.

Odpipetuj 50 mikrolitrów lodowatych bakterii na kawałku Parafilmu, a następnie przygotuj strzykawkę z igłą do rafinera o rozmiarze 22 i delikatnie naciśnij tłok, aby usunąć powietrze z końcówki igły. Trzymanie robaka woskowego blisko tylnego końca pod stereoskopem. Wstrzyknąć kulturę bakteryjną w grzbietową stronę klatki piersiowej.

Najlepiej na styku dwóch segmentów tuż pod naskórkiem, równolegle do robaka woskowego, aby zminimalizować uszkodzenia wewnętrzne i zwrócić uwagę na to, jak ciało larwy zaczyna się wybrzuszać. Następnie przenieś wstrzyknięte owady na regeneracyjną szalkę Petriego. A kiedy wszystkie owady zostaną wstrzyknięte i umieszczone w naczyniu regeneracyjnym, umieść szalkę Petriego w ciemności.

Robaki woskowe ulegają dwa dni po wstrzyknięciu i stają się ceglastoczerwone po około trzech do czterech dniach. Jednak brązowe owady wskazują na nieudaną infekcję bakteryjną. Po siedmiu dniach od infekcji przenieś owady o charakterystycznym ceglastoczerwonym kolorze na świeżą szalkę Petriego wyłożoną bibułą filtracyjną i powtórz produkcję symbiotycznych zakaźnych młodocianych nicieni.

Aby rozpocząć sterylizację powierzchniową, zbierz wystarczającą ilość symbiotycznych bakterioforów Heterorhabditis i kandydatów na akseniczne zakaźne osobniki młodociane przez odwirowanie. Aby zrobić osad w 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej, dodaj 500 mikrolitrów 5% wybielacza do granulki w każdej probówce do mikrowirówki i odwróć probówkę. Po inkubacji przez 10 minut odwirować przy 17 900 g przez jedną minutę i usunąć supernatant.

Następnie umyj granulkę jednym mililitrem sterylnej wody. Odwirować, usunąć supernatant i powtórzyć tę procedurę jeszcze cztery razy. Wykres przedstawia wyniki oceny stanu nicieni Heterorhabditis bacteriophora, które przeszły aksenizację.

Bakteriophora Heterorhabditis z hodowli podstawowej przenosiła symbiotyczne komórki Photorhabdus luminescens. Jednak nicienie pozbawione związanych z nimi bakterii Photorhabdus luminescens były akseniczne. Aby zachować powtarzalność eksperymentu, zawsze należy świeży wypraskę z podstawowej kultury bakteryjnej ze świeżej kolonii i wyjmować kulturę na noc, zanim dotrze do nieruchomej powierzchni.

Używaj tylko ceglastoczerwonego woskowego robaka Galleria do pułapki wodnej White'a, a resztę wyrzuć. Po tej procedurze nicienie można wykorzystać do zbadania interakcji z układem odpornościowym owadów. Technika ta toruje naukowcom drogę do zbadania molekularnych podstaw pasożytnictwa nicieni i odporności antynicieniowej gospodarza.