Name: Hodowla i genetyczna manipulacja nicieniami entomopatogennymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Poznaj metody hodowli i genetycznej manipulacji nicieniami entomopatogennymi Heterorhabditis bacteriophora i Steinernema carpocapsae. Protokół umożliwia badanie patogeniczności nicieni i odporności gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom Wydziału Nauk Biologicznych Uniwersytetu George'a Washingtona za krytyczną lekturę manuskryptu. Wszystkie figury graficzne zostały wykonane przy użyciu BioRender. Badania w laboratoriach I. E., J. H. i D. O'H. były wspierane przez George Washington University i Columbian College of Arts and Sciences oraz fundusze na badania interdyscyplinarne.

<ol><li>Lacey, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+pathogens+as+biological+control+agents%3A+Back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Invertebrate+Pathology%22%5BJournal%5D)">Insect pathogens as biological control agents: Back to the future.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).</li>
<li>Ozakman, Y., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematode+infection+and+antinematode+immunity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila.</a> Trends in Parasitology. 37 (11), 1002-1013 (2021).</li>
<li>Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+virulence+factors+from+Heterorhabditis+bacteriophora+highlight+its+utility+as+a+model+parasite+among+Clade+V+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes.</a> International Journal of Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).</li>
<li>Bobardt, S. D., Dillman, A. R., Nair, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+faces+of+nematode+infection%3A+Virulence+and+immunomodulatory+molecules+from+nematode+parasites+of+mammals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The two faces of nematode infection: Virulence and immunomodulatory molecules from nematode parasites of mammals, insects and plants.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 2983(2020).</li>
<li>Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+immune+responses+to+nematode+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Insect immune responses to nematode parasites.</a> Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).</li>
<li>Eleftherianos, I., Heryanto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+insights+into+the+insect+immune+response+to+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic insights into the insect immune response to nematode infection.</a> Genes. 12 (2), 202(2021).</li>
<li>Ciche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+genome+of+Heterorhabditis+bacteriophora%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">The biology and genome of Heterorhabditis bacteriophora.</a> WormBook. , 1-9 (2007).</li>
<li>Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partners+in+crime%3A+symbiont-assisted+resource+acquisition+in+Steinernema+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Partners in crime: symbiont-assisted resource acquisition in Steinernema entomopathogenic nematodes.</a> Current Opinion in Insect Science. 32, 22-27 (2019).</li>
<li>Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+is+a+self-fertilizing+hermaphrodite+and+a+genetically+tractable+system+for+the+study+of+parasitic+and+mutualistic+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis.</a> Genetics. 220 (1), (2021).</li>
<li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutualism+and+pathogenesis+in+Xenorhabdus+and+Photorhabdus%3A+two+roads+to+the+same+destination%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination.</a> Molecular Microbiology. 64 (2), 260-268 (2007).</li>
<li>Abd-Elgawad, M. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorhabdus+spp.%3A+An+overview+of+the+beneficial+aspects+of+mutualistic+bacteria+of+insecticidal+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Photorhabdus spp.: An overview of the beneficial aspects of mutualistic bacteria of insecticidal nematodes.</a> Plants. 10 (8), 1660(2021).</li>
<li>Dreyer, J., Malan, A. P., Dicks, L. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+of+the+genus+Xenorhabdus%2C+a+novel+source+of+bioactive+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacteria of the genus Xenorhabdus, a novel source of bioactive compounds.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3177(2018).</li>
<li>Hallem, E. A., Rengarajan, M., Ciche, T. A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematodes%2C+bacteria%2C+and+flies%3A+a+tripartite+model+for+nematode+parasitism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Nematodes, bacteria, and flies: a tripartite model for nematode parasitism.</a> Current Biology. 17 (10), 898-904 (2007).</li>
<li>Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+infecting+Drosophila+adult+flies+with+insect+pathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">A novel method for infecting Drosophila adult flies with insect pathogenic nematodes.</a> Virulence. 3 (3), 339-347 (2012).</li>
<li>Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+gene+transcription+in+Drosophila+adult+flies+infected+by+entomopathogenic+nematodes+and+their+mutualistic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Immune gene transcription in Drosophila adult flies infected by entomopathogenic nematodes and their mutualistic bacteria.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 179-185 (2013).</li>
<li>Eleftherianos, I., Joyce, S., Ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+tri-trophic+interaction+between+insects%2C+nematodes+and+Photorhabdus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus.</a> Parasitology. 137 (11), 1695-1706 (2010).</li>
<li>Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lerelcus, D., Givaudan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+insect+pathogen+bacteria+Bacillus+thuringiensis+and+Xenorhabdus%2FPhotorhabdus+occupy+their+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts.</a> Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 220-231 (2012).</li>
<li>Waterfield, N. R., Ciche, T., Clarke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorhabdus+and+a+host+of+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Photorhabdus and a host of hosts.</a> Annual Review of Microbiology. 63, 557-574 (2009).</li>
<li>Ozakman, Y., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+interactions+between+Drosophila+and+the+pathogen+Xenorhabdus%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">Immune interactions between Drosophila and the pathogen Xenorhabdus.</a> Microbiological Research. 240, 126568(2020).</li>
<li>Yadav, S., Shokal, U., Forst, S., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+generating+axenic+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">An improved method for generating axenic entomopathogenic nematodes.</a> BMC Research Notes. 8 (1), 1-6 (2015).</li>
<li>Mitani, D. K., Kaya, H. K., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+the+entomopathogenic+nematode%2C+Steinernema+carpocapsae%2C+reared+on+mutant+and+wild-type+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Comparative study of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae, reared on mutant and wild-type Xenorhabdus nematophila.</a> Biological Control. 29 (3), 382-391 (2004).</li>
<li>McMullen, J. G., Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+rearing+of+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernematidae+and+Heterorhabditidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae).</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52096(2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Zrozumienie molekularnych podstaw zakażenia nicieniami entomopatogenicznymi i odporności przeciw nicieniom owadów wymaga oddzielenia pasożytów od wzajemnie powiązanych bakterii 13,15,16. Nicienie entomopatogeniczne H. bacteriophora i S. carpocapsae żyją razem z bakteriami Gram-ujemnymi P. luminescens i X. nematophila, odpowiednio17. Wykazano wcześniej, że oba gatunki ba...

Badania nad entomopatogenicznymi nicieniami (EPN) zintensyfikowały się w ciągu ostatnich kilku lat, głównie ze względu na użyteczność tych pasożytów w zintegrowanych strategiach ochrony przed szkodnikami i ich udział w podstawowych badaniach biomedycznych1,2. Ostatnie badania ustaliły, że EPN jest organizmem modelowym, w którym bada się składniki genetyczne nicieni, które są aktywowane na różnych etapach procesu infekcji. Informacje te dostarczają kluczowych wskazówek na temat natury i liczby cząsteczek wydzielanych przez pasożyty w celu zmiany fizjologii gospodarza i destabilizacji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej owadów3,4. Jednocześnie wiedza ta jest często uzupełniana przez nowe szczegóły dotyczące rodzaju szlaków sygnalizacji immunologicznej gospodarza owada i funkcji, które regulują w celu ograniczenia wnikania i rozprzestrzeniania się patogenów5,6. Zrozumienie tych procesów ma kluczowe znaczenie dla wyobrażenia sobie obu stron dynamicznej interakcji między EPN a ich owadzimi gospodarzami. Lepsze zrozumienie relacji EPN – owad żywiciel niewątpliwie ułatwi podobne badania na pasożytniczych nicieniach ssaków, które mogą prowadzić do identyfikacji i charakterystyki czynników infekcyjnych, które zakłócają działanie układu odpornościowego człowieka.
Nicienie EPN Heterorhabditis sp. i Steinernema sp. mogą infekować szeroką gamę owadów, a ich biologia była wcześniej intensywnie badana. Te dwa pasożyty nicieni różnią się sposobem rozmnażania, przy czym Heterorhabditis jest samozapłodniony, a Steinernema przechodzi rozmnażanie amfimityczne, chociaż ostatnio wykazano, że S. hermaphroditum rozmnaża się przez samozapłodnienie hermafrodytów lub przez partenogenezę7,8,9. Inną różnicą między nicieniami Heterorhabditis i Steinernema jest ich symbiotyczny mutualizm z dwoma odrębnymi rodzajami bakterii Gram-ujemnych, odpowiednio Photorhabdus i Xenorhabdus, które są silnymi patogenami owadów. Bakterie te znajdują się w wolno żyjącym i nieżerującym zakaźnym stadium młodocianym (IJ) EPN, które wykrywają podatnych gospodarzy, uzyskują dostęp do hemocoela owada, gdzie uwalniają związane z nimi bakterie, które szybko się replikują i kolonizują tkanki owadów. Zarówno EPN, jak i ich bakterie wytwarzają czynniki wirulencji, które rozbrajają obronę owadów i upośledzają homeostazę. Po śmierci owadów nicienie IJ rozwijają się, aby stać się dorosłym EPN i zakończyć swój cykl życiowy. Nowa kohorta IJ utworzona w odpowiedzi na brak pożywienia i przeludnienie w zwłokach owadów w końcu pojawia się w glebie, aby polować na odpowiednich gospodarzy9,10,11,12.
Tutaj opisany jest skuteczny protokół do utrzymywania, wzmacniania i genetycznego manipulowania nicieniami EPN. W szczególności protokół przedstawia replikację symbiotycznych H. bacteriophora i S. carpocapsae IJs, wytwarzanie IJ nicieni aksenowych, produkcję hermafrodytów H. bacteriophora do mikroiniekcji, przygotowanie dsRNA oraz technikę mikroiniekcji. Metody te są niezbędne do zrozumienia molekularnych podstaw patogeniczności nicieni i odporności antynieniowej gospodarza.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>VWR</td><td>97062-244</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Ambion Megascript T7</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>611770250</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych T75</td><td>Fisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>ChoiceTaq Mastermix</td><td>Denville Scientific</td><td>C775Y42</td><td></td></tr><tr><td>Olej kukurydziany</td><td>VWR</td><td>470200-112</td><td></td></tr><tr><td>Syrop kukurydziany</td><td>MP Biomedicals/VWR</td><td>IC10141301</td><td></td></tr><tr><td>Probówka hodowlana 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-14</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Końcówki do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Tuba Falcon 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz Femtojet</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>VWR</td><td>28320-100</td><td></td></tr><tr><td>Galleria mellonella waxorms</td><td>Petco-Glass</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553-464</td><td>50 x 24 mm</td></tr><tr><td>Olej halowęglowy 700</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Pętla inokulacyjna</td><td>VWR</td><td>12000-806</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>VWR</td><td>97062-956</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego Kwik-Fil</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-3</td><td>1,0 mm</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td>LB proszek młynka agarowego 500 g</td></tr><tr><td>LB Bulion</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td>LB młynek do rosołu w proszku 500 g</td></tr><tr><td>Leica DM IRB Odwrócony mikroskop badawczy</td><td>Mikroskop</td> <td>Central-MacConkey</td><td></td></tr> <tr><td>medium</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M7408-250G</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Zestaw do czyszczenia transkrypcji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek</td><td>VWR</td><td>76332-064</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spektrofotometr</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka igłowa</td><td>VWR</td><td>BD305155</td><td>22G</td></tr><tr><td>Bulion odżywczy</td><td>Millipore-Sigma</td><td>70122-100G</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-076</td><td></td></tr><tr><td>Podzielona szalka Petriego</td><td>VWR</td><td>490005-212</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>97062-732</td><td>Bufor PBS Tabletki biotechnologiczne startery PCR klasy 200 tab</td></tr><tr><td></td><td>Azenta-Pestle</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Millipore-Sigma</td><td>BAF199230001</td><td>Bel-Art Jednorazowy tłuczek</td></tr> szalka <tr><td>Petriego 6 cm</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>60 x 15 mm</td></tr><tr><td>szalka Petriego 10 mm</td><td>VWR</td><td>10799-192</td><td>35 x 10 mm</td></tr><tr><td>Proteose Peptone #3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>Drożdże ekstrakt</td><td>Millipore-Sigma</td><td>Y1625</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla i genetyczna manipulacja nicieniami entomopatogennymi

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopatogeniczne nicienie z rodzajów Heterorhabditis i Steinernema są obowiązkowymi pasożytami owadów żyjących w glebie. Główną cechą ich cyklu życiowego jest wzajemne powiązanie z bakteriami Photorhabdus i Xenorhabdus. Nicienie są w stanie zlokalizować i wniknąć do odpowiednich gospodarzy owadów, obalić odpowiedź immunologiczną owadów i skutecznie się rozmnażać, aby wyprodukować następne pokolenie, które będzie aktywnie polować na nowe ofiary owadów w celu zarażenia. Ze względu na właściwości swojego cyklu życiowego nicienie entomopatogeniczne są popularnymi środkami kontroli biologicznej, które są stosowane w połączeniu z insektycydami do zwalczania destrukcyjnych szkodników owadzich w rolnictwie. Jednocześnie te pasożytnicze nicienie stanowią narzędzie badawcze do analizy patogenności nicieni i odpowiedzi anty-nicieni gospodarza. Badania te są wspomagane przez niedawny rozwój technik genetycznych i podejść transkryptomicznych w celu zrozumienia roli cząsteczek wydzielanych przez nicienie podczas infekcji. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół dotyczący utrzymywania nicieni entomopatogenicznych i stosowania procedury knockdown genu. Metodologie te dodatkowo wspierają funkcjonalną charakterystykę entomopatogenicznych czynników infekcji nicieniami.

Aby ocenić stan nicieni H. bacteriophora, które przeszły proces aksenizacji, określono obecność lub brak kolonii bakterii P. luminescens w larwach zakaźnych (IJ). W tym celu pobrano osad około 500 IJ, które zostały uprzednio wysterylizowane powierzchniowo i zhomogenizowano w PBS. Próba kontrolna pozytywna składała się z osadu około 500 IJ z hodowli nicieni zawierającej symbiotyczne bakterie P. luminescens. Osady nicieni aksenizowanych oraz kontroli pozytywnej zhomogenizowano w 1x PBS. Homogenat...

Nicienie entomopatogeniczne żyją w symbiozie z bakteriami i razem skutecznie infekują owady, osłabiając ich wrodzony układ odpornościowy. W celu wspierania badań nad genetycznymi podstawami zakażenia nicieniami opisano metody utrzymywania i genetycznej manipulacji nicieniami entomopatogenicznymi.

Hodowla i genetyczna manipulacja nicieniami entomopatogennymi

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

Skuteczny protokół utrzymywania i wzmacniania nicieni entomopatogenicznych jest niezbędny do zrozumienia molekularnych podstaw patogeniczności nicieni i odporności antynicieni gospodarza. Protokół ten umożliwia nam produkcję dużej liczby symbiotycznych i aksenicznych bakterioforów Heterorhabditis bacteriophora i Steinernema carpocapsae IJ przy użyciu owadziego żywiciela, Galleria mellonella. Zacznij od przykrycia szalki Petriego kawałkiem bibuły filtracyjnej i dodaj około 10 do 15 larw Galleria mellonella.Za pomocą pipety dozować dwa mililitry wody zawierającej około 25 do 50 zakaźnych młodych osobników na 10 mikrolitrów zawiesiny na robaki woskowe. I przechowuj szalkę Petriego w szafce w temperaturze pokojowej. W zależności od wilgotności bibuły filtracyjnej dodawaj od jednego do dwóch mililitrów wody co dwa dni.Robaki woskowe zakażone zakaźnymi młodymi osobnikami zwykle giną w ciągu 48 godzin. Przygotuj pułapki wodne White's około 10 dni po zakażeniu robaków woskowych przez zakaźne młode osobniki. Ostrożnie przenieś martwe owady na nienamoczoną część bibuły filtracyjnej.Użyj wody z kranu, aby napełnić dolną szalkę Petriego i umieść nakrętkę 15-mililitrowej rurki jako przekładkę do wentylacji. Używaj wody z kranu zamiast wody demineralizowanej lub dejonizowanej, aby uniknąć agregacji nicieni i upewnij się, że poziom wody w syfonie osiąga około połowy wysokości szalki Petriego. Gdy woda na małej szalce Petriego stanie się mętna z powodu nicieni, użyj pipety, aby przenieść nowe pokolenie zakaźnych młodych osobników do kolby do hodowli komórek T25 lub T75.Później dolewaj wodę z kranu do 40% objętości lub do momentu osiągnięcia odpowiedniej gęstości. I przechowuj kolbę do hodowli komórkowych poziomo, aby uniknąć przekrwienia nicieni. Powtarzać przenoszenie zakaźnych młodocianych osobników do kolb do hodowli komórkowych i dodawanie wody, aż zakaźne młode osobniki przestaną wyłaniać się z tusz owadów w ciągu około trzech do pięciu dni.Za pomocą pętli inokulacyjnej zeskrob kilka płatków zamrożonej kultury Photorhabdus temperata Ret16 na płytkę MacConkey i rozprowadź smugi w poszukiwaniu pojedynczych kolonii. Inkubuj płytkę przez dwa do trzech dni w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Po inkubacji zaszczepić 10 mililitrów bulionu LB kolonią na agarze MacConkey w 50-mililitrowej probówce i inkubować kulturę przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem.Po inkubacji przenieść 100 mikrolitrów kultury przez noc z probówki o pojemności 50 mililitrów do nowej probówki do mikrowirówki, a następnie przepłukać 100 kultur przez noc 900 mikrolitrami PBS o pojedynczej mocy przez centryfuzję, w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra, w temperaturze 17 900 razy g. Zdekantować supernatant. Następnie rozcieńczyć kulturę 10 razy w PBS o pojedynczej mocy i pozostawić probówkę na lodzie.Teraz zanurz robaki woskowe w 70% roztworze etanolu. Po osuszeniu owadów ręcznikiem papierowym umieść je w 50-mililitrowej tubie. Umieść probówkę na lodzie na 20 minut, aby unieruchomić robaki woskowe.Użyj bibuły filtracyjnej, aby przykryć górną i dolną połowę szalki Petriego. Pokrywkę szalki Petriego pokrytą bibułą filtracyjną należy użyć jako podstawy do wstrzykiwań. Zwilż bibułę filtracyjną dolnej szalki Petriego i przenieś ją na lód, aby pomóc wstrzykniętym robakom woskowym w regeneracji.Odpipetuj 50 mikrolitrów lodowatych bakterii na kawałku Parafilmu, a następnie przygotuj strzykawkę z igłą do rafinera o rozmiarze 22 i delikatnie naciśnij tłok, aby usunąć powietrze z końcówki igły. Trzymanie robaka woskowego blisko tylnego końca pod stereoskopem. Wstrzyknąć kulturę bakteryjną w grzbietową stronę klatki piersiowej.Najlepiej na styku dwóch segmentów tuż pod naskórkiem, równolegle do robaka woskowego, aby zminimalizować uszkodzenia wewnętrzne i zwrócić uwagę na to, jak ciało larwy zaczyna się wybrzuszać. Następnie przenieś wstrzyknięte owady na regeneracyjną szalkę Petriego. A kiedy wszystkie owady zostaną wstrzyknięte i umieszczone w naczyniu regeneracyjnym, umieść szalkę Petriego w ciemności.Robaki woskowe ulegają dwa dni po wstrzyknięciu i stają się ceglastoczerwone po około trzech do czterech dniach. Jednak brązowe owady wskazują na nieudaną infekcję bakteryjną. Po siedmiu dniach od infekcji przenieś owady o charakterystycznym ceglastoczerwonym kolorze na świeżą szalkę Petriego wyłożoną bibułą filtracyjną i powtórz produkcję symbiotycznych zakaźnych młodocianych nicieni.Aby rozpocząć sterylizację powierzchniową, zbierz wystarczającą ilość symbiotycznych bakterioforów Heterorhabditis i kandydatów na akseniczne zakaźne osobniki młodociane przez odwirowanie. Aby zrobić osad w 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej, dodaj 500 mikrolitrów 5% wybielacza do granulki w każdej probówce do mikrowirówki i odwróć probówkę. Po inkubacji przez 10 minut odwirować przy 17 900 g przez jedną minutę i usunąć supernatant.Następnie umyj granulkę jednym mililitrem sterylnej wody. Odwirować, usunąć supernatant i powtórzyć tę procedurę jeszcze cztery razy. Wykres przedstawia wyniki oceny stanu nicieni Heterorhabditis bacteriophora, które przeszły aksenizację.Bakteriophora Heterorhabditis z hodowli podstawowej przenosiła symbiotyczne komórki Photorhabdus luminescens. Jednak nicienie pozbawione związanych z nimi bakterii Photorhabdus luminescens były akseniczne. Aby zachować powtarzalność eksperymentu, zawsze należy świeży wypraskę z podstawowej kultury bakteryjnej ze świeżej kolonii i wyjmować kulturę na noc, zanim dotrze do nieruchomej powierzchni.Używaj tylko ceglastoczerwonego woskowego robaka Galleria do pułapki wodnej White'a, a resztę wyrzuć. Po tej procedurze nicienie można wykorzystać do zbadania interakcji z układem odpornościowym owadów. Technika ta toruje naukowcom drogę do zbadania molekularnych podstaw pasożytnictwa nicieni i odporności antynicieniowej gospodarza.

culturing-and-genetically-manipulating-entomopathogenic-nematodes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przesiewowe poszukiwanie mutantów z defektami fenotypowymi jest prostą metodą identyfikacji genów funkcjonujących w danym procesie biologicznym. W niniejszym artykule opisujemy sposób hodowli wolnożyjących nicieni (np. Pristionchus pacificus) w warunkach laboratoryjnych i przedstawiamy dwie różne metody mutagenezy: EMS oraz TMP/UV.

Wprowadzenie do laboratorium nicieni: od hodowli nicieni do mutagenezy

C. elegans jest zwykle uprawiany na solidnych płytkach agarowych lub w płynnych kulturach z wysiewem E. coli. Aby zapobiec zakłóceniom w badaniach toksykologicznych i żywieniowych bakteryjnych produktów ubocznych, wykorzystaliśmy płynne podłoże akseniczne, CeHR, do hodowli i synchronizacji dużej liczby robaków do szeregu dalszych zastosowań.

Hodowla Caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych i tworzenie transgenicznych robaków przez bombardowanie mikrocząsteczkami

Nicienie entomopatogeniczne to glisty zamieszkujące glebę, które pasożytują na szerokiej gamie owadów.  Pokazujemy metody pobierania próbek stosowane do izolacji tych nicieni z gleby przy użyciu dwóch technik: przynęty na owady i zmodyfikowanej białej pułapki, do odzyskiwania nicieni odpowiednio z próbek gleby i zakażonych zwłok owadów.

Pobieranie próbek z gleby i izolacja nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Celem tej prezentacji jest zademonstrowanie in vivo i in vitro technik hodowli nicieni entomopatogenicznych. Metody in vivo uwzględniają hodowlę tych nicieni z owadem żywicielem, podczas gdy metody in vitro wykorzystują bogate podłoża agarowe.

Hodowla in vivo i in vitro nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae i Heterorhabditidae)

Trans- i wielopokoleniowe skutki trwałych chemikaliów są niezbędne do oceny ich długoterminowych konsekwencji dla środowiska i zdrowia ludzkiego. Udostępniamy nowatorskie szczegółowe metody badania efektów trans- i wielopokoleniowych z wykorzystaniem wolno żyjących nicieni Caenorhabditis elegans.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badania trans- i wielopokoleniowych skutków substancji toksycznych

Tutaj prezentujemy protokół oparty na systemie przynęty na mącznika mącznika (Tenebrio molitor), który był używany do izolowania i selekcji grzybów entomopatogenicznych (EPF) z próbek gleby. Skuteczna formuła liczby konidiów (ECN) jest stosowana do wyboru EPF o wysokiej tolerancji na stres w oparciu o cechy fizjologiczne do zwalczania mikrobiologicznego szkodników na polu.

Izolacja i selekcja grzybów entomopatogenicznych z próbek glebowych oraz ocena zjadliwości grzybów wobec szkodników owadzich

Dzikie nicienie Caenorhabditis są związane z wieloma drobnoustrojami, często w świetle jelit lub infekującymi jelita. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę wzbogacania niekulturowych drobnoustrojów kolonizujących jelito, wykorzystując odporność naskórka dauer.

Selektywne czyszczenie dzikich nicieni Caenorhabditis w celu wzbogacenia o bakterie mikrobiomu jelitowego

Entomopatogeniczne kolonie grzybów są izolowane z próbek gleby tropikalnej za pomocą przynęty Tenebrio, przynęty Galleria, a także selektywnego sztucznego podłoża, tj. agaru z dekstrozą ziemniaczaną wzbogaconego ekstraktem drożdżowym uzupełnionym chloramfenikolem, tiabendazolem i cykloheksymidem (pożywka CTC).

Porównanie metod izolowania grzybów entomopatogenicznych z próbek gleby

Caenorhabditis elegans jest jednym z głównych gatunków modelowych w biologii, jednak prawie wszystkie badania są prowadzone pod nieobecność naturalnie związanych z nim mikrobów. Opisane tutaj metody pomogą lepiej zrozumieć różnorodność powiązanych mikroorganizmów jako podstawę przyszłych badań funkcjonalnych nad C. elegans.

Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans

Ten artykuł demonstruje inżynierię genomu pośredniczoną przez CRISPR-Cas9 w Steinernema hermafroditum, nicieniu entomopatogenicznym (EPN: pasożytniczym owadziem) oraz rozwijającym się modelem genetycznym. Opisana technologia jest przydatna do tworzenia mutantów, umożliwiając wyjaśnienie funkcji genów w biologii nicieni, które są istotne dla symbiozy mutualistycznej i pasożytniczej.

Mutageneza oparta na CRISPR-Cas9 w nicieniu entomopatogenicznym Steinernema hermafroditum oraz utrzymanie linii mutantów

Przedstawiamy dwie metody masowego rozmnażania nicieni entomopatogenicznych jako bioinsektycydów dla rolników. Pierwsza metoda wykorzystuje żel poliakrylamidu jako podłoże do hodowli nicieni, podczas gdy druga metoda wykorzystuje bawełnę polimerową jako podłoże do hodowli. Obie metody opierają się na in vivo rozmnażaniu nicieni wewnątrz padlin owadów.

Uprawa oparta na hodowli in vivo nicieni entomopatogenicznych

Poznaj metody hodowli i genetycznej manipulacji nicieniami entomopatogennymi Heterorhabditis bacteriophora i Steinernema carpocapsae. Protokół umożliwia badanie patogeniczności nicieni i odporności gospodarza.

Hodowla i genetyczna manipulacja nicieniami entomopatogennymi

Przeglądaj więcej filmów