Oddolne metody in vitro do oznaczania organizacji ultrastrukturalnej, kształtowania błony i zachowania wrażliwości na krzywiznę septyn

Korzystając z tego protokołu, zwizualizowaliśmy organizację białek nitkowatych cytoszkieletu na podłożach wzorcowych o różnych krzywiznach. Możemy przetestować czułość krzywizny. Rozdzielczość obrazów ze skaningowego mikroskopu elektronowego jest na tyle wysoka, że wizualizowane są organizacje w skali nanometrowej.

Metody, których używamy do utrwalania, są wystarczająco łagodne, aby zachować wewnątrzstrukturalną organizację białka. Pozostaje to w zakresie badań podstawowych mających na celu zrozumienie zachowania włókien cytoszkieletu. Zacznij od zaprojektowania falistego kleju optycznego Norland Optical Adhesive lub repliki NOA w środowisku pomieszczenia czystego z falistych falowanych wzorów polidimetylosiloksanu o amplitudzie 250 nanometrów i okresowości bocznej dwóch mikrometrów.

Aby to zrobić, umieść pięć mikrolitrów ciekłego NOA na okrągłym szklanym szkiełku nakrywkowym o średnicy jednego centymetra, a następnie umieść szablon PDMS na kropli. Traktuj zespół światłem UV o długości 320 nanometrów przez pięć minut, aby fotopolimeryzować ciekły NOA w cienką warstwę polimerową. Po zakończeniu delikatnie oderwij szablon PDMS od szkiełka nakrywkowego ze świeżo spolimeryzowanym NOA.

Folię NOA należy traktować za pomocą środka do czyszczenia plazmą powietrzną przez pięć minut, aby powierzchnia była hydrofilowa. Przygotować roztwór małych pęcherzyków jednowarstwowych lub SUV, jak opisano w manuskrypcie, i otrzymać SUV-y poprzez ponowne zawieszenie wysuszonego filmu lipidowego w buforze obserwacyjnym pod sonikacją w sonikatorze kąpielowym na pięć do 10 minut, aż roztwór stanie się przezroczysty. Później włóż szkiełka nakrywkowe podtrzymujące wzory NOA do studzienek skrzynek do hodowli komórkowych i inkubuj świeżo rozładowane wzory NOA ze 100 mikrolitrami jednego miligrama na mililitr roztworu SUV przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby wytworzyć podpartą dwuwarstwę lipidową.

Aby usunąć niestopiony SUV, należy dokładnie spłukać boki sześć razy buforem o niskiej zawartości soli septyny, nie dopuszczając do całkowitego wyschnięcia próbki między dwoma myciami. Rozcieńczyć oktomeryczny roztwór podstawowy septyny w buforze o niskiej zawartości soli septyny do końcowych stężeń w zakresie od 10 do 100 nanomolów i objętości jednego mililitra. Następnie inkubować roztwór białka na szkiełkach przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Umyć szkiełka NOA zawierające stopione dwuwarstwy lipidowe i inkubować białko z buforem o niskiej zawartości soli septyny. Zastąp septynę buforem o niskiej zawartości soli 2% roztworem utrwalającym aldehyd glutarowy w 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu, wstępnie podgrzanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozwól reakcji postępować przez 15 minut, a ustaloną próbkę przemyć trzykrotnie, po pięć minut kakodylanem sodu o stężeniu 0,1. Po umyciu próbkę inkubować w roztworze utrwalającym tetratlenku osmu, następnie przefiltrowany kwas garbnikowy, a na końcu przefiltrowany octan uranylu przez 10 minut każde.

Po każdym roztworze przemyć próbkę trzykrotnie w wodzie destylowanej. Próbkę inkubować seryjnie w roztworach etanolu, zaczynając od 50% do 100%, przez dwie do trzech minut każdy. Przenieś szkiełka podstawowe do wnętrza suszarki w punkcie krytycznym wstępnie napełnionej etanolem i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi suszenia.

Ponieważ wysuszone próbki są wysoce higroskopijne, należy je natychmiast pokryć, przyklejając szkiełko nakrywkowe do kikutów. Następnie dodaj pasek srebrnej farby do górnej powierzchni szkiełka nakrywkowego, nie tworząc deglomeratów farby. Upewnij się, że połączenie z króćcem jest zadowalające.

Gdy próbka całkowicie odparuje, należy użyć aparatury wyposażonej w plazmową głowicę magnetronową i obrotowy stolik planetarny, a następnie postępować zgodnie ze standardowymi protokołami dostarczonymi przez producenta. Wykonuj rozpylanie wstępne przy natężeniu 120 miliamperów przez 60 sekund, aby usunąć warstwę tlenku z powierzchni. Następnie umieść 1,5 nanometra wolframu za pomocą monitora grubości warstwy na 90 miliamperów i odległości roboczej 50 mililitrów.

Później należy przechowywać próbki w próżni, aby chronić je przed otaczającym powietrzem do czasu i w trakcie analiz SEM. Aby uzyskać obrazowanie o wysokiej rozdzielczości poprzez wykrywanie elektronów wtórnych za pomocą detektora śródlądowego, należy ustawić napięcie przyspieszające na trzy kilowolty, a prąd wiązki na aperturę 20 mikrometrów. Do obserwacji należy używać rozdzielczości od 21,25 nanometra na piksel do 1,224 nanometra na piksel.

Do analizy danych użyj rozdzielczości 5,58 nanometra na piksel. Ustaw odległość roboczą od jednego do dwóch milimetrów w przypadku obserwacji w wysokiej rozdzielczości i około trzech milimetrów, jeśli wymagana jest zwiększona głębia ostrości. Stale dostosowuj prędkość skanowania i integrację linii, aby zapewnić stały stosunek sygnału do szumu z czasem akwizycji około 30 do 45 sekund na obraz.

Reprezentatywna analiza ilustruje wpływ materiału osadzonego na włóknach septyny na faliste wzory PDMS z 1,5 nanometra platyny i 1,5 nanometra wolframu. Zaobserwowano, że nagie gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV) były idealnie kuliste. Po deformacji wywołanej septyną pęcherzyki wydawały się fasetowane, a deformacje pozostały statyczne, a zatem nie ulegały wahaniom.

Przy wyższych stężeniach septin obserwowano okresowe deformacje pęcherzyków. Samoorganizację włókien septyny związanych z dużymi pęcherzykami jednowarstwowymi lub LUV zbadano za pomocą obrazu z mikroskopii krioelektronowej, a rekonstrukcję 3D uzyskano z pochylonej serii. Zależny od krzywizny układ włókien septyny uwidoczniono za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.

Przy małym powiększeniu widoczny był falisty wzór z okresowością krzywizn ujemnych i dodatnich. Ultrastrukturalna organizacja włókien septyny była obserwowana w większym powiększeniu. NOA należy delikatnie odkleić, aby zapobiec degradacji.

Po zobrazowaniu można przeprowadzić pewną analizę obrazu w celu ilościowego określenia cech ultrastruktury wizualizowanych przez SCM, takich jak odstępy między włóknami i orientacja filamentu. Obecna metoda została zastosowana do septyn, ale może być również stosowana do innych białek cytoszkieletu lub białek, które organizują się jako długie włókna, a tym samym są wrażliwe na krzywiznę.