Name: Narzędzia mikroprzepływowe do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie komórkowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj mikroprzepływowe narzędzia do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych z wysoką rozdzielczością obrazowania. Ta metoda umożliwia obserwację dynamicznych procesów w mikrobiomie glebowym i rozwój biokontroli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie finansowe ze strony Wydziału Bioinżynierii w Imperial College London oraz The Leverhulme Trust (Numer grantu badawczego: RPG-2020-352).

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

W artykule przedstawiono protokół badania oddziaływań grzybowo-mikrobiologicznych z wykorzystaniem mikrofluidyki kanałowej. Autorzy dążą do wykazania wszechstronności tych urządzeń i zachęcają do adaptacji do zainteresowań badacza. Korzystając z przykładowych urządzeń BFI i FFI, można badać interakcje grzybowo-mikrobiologiczne bardziej szczegółowo niż było to wcześniej dostępne. Usuwając złożoność tła i niejednorodność gleby, moderując wzrost strzępek w taki sposób, że są one ograniczone do jednej warstwy i ściśle regulu...

Gleba jest wyjątkowo zróżnicowanym środowiskiem, zawierającym obfitość mikroorganizmów, które odgrywają kluczową rolę w cyklach węgla i fosforu1,2. Grzyby nitkowate stanowią główny składnik wielu ekosystemów jako destruenci materii organicznej i nieorganicznej oraz mogą poprawiać odżywianie roślin poprzez tworzenie relacji symbiotycznych3,4. W glebie grzyby wchodzą w dynamiczne interakcje z wieloma mikrobami, takimi jak inne grzyby5, bakterie6, wirusy7 i nicienie8. Interakcje te mają istotne konsekwencje dla zdrowia gleby i roślin. Jednak ze względu na brak odpowiednich systemów eksperymentalnych zdolnych do obrazowania oddziałujących ze sobą mikroorganizmów z wysoką rozdzielczością, wiele z nich pozostaje nieokreślonych.
Badania nad oddziaływaniami bakteria-grzyb (BFIs) oraz grzyb-grzyb (FFIs) znajdują cenne zastosowania w wielu dziedzinach, w tym w opracowywaniu środków przeciwdrobnoustrojowych w medycynie oraz biologicznych środków ochrony roślin w rolnictwie. Na przykład grzyb Coprinopsis cinerea produkuje peptyd copsynę, która wykazuje aktywność przeciwbakteryjną wobec ludzkiego patogenu Listeria monocytogenes9. Podobnie związek pochodzenia grzybowego, griseofulwina, jest powszechnie stosowany w leczeniu grzybic u ludzi i dodatkowo potrafi hamować wzrost fitopatogennego grzyba Alternaria solani10,11. Wykazano również, że kilka szczepów bytującej w glebie bakterii Bacillus subtilis stanowi skuteczne biologiczne środki kontroli grzybowego patogenu roślin Rhizoctonia solani12,13. Niemniej jednak, ze względu na ograniczenia związane z tradycyjnymi metodologiami, BFIs i FFIs są słabo poznane na poziomie pojedynczych komórek.
Konwencjonalne badania zazwyczaj analizują BFIs i FFIs w skali makro, wykorzystując płytki agarowe z dwoma lub więcej gatunkami w konfrontacji. Ich oddziaływanie ocenia się poprzez pomiar tempa wzrostu i produkcji metabolitów konfrontujących gatunków14,15,16; jednak metodologia ta ma rozdzielczość ograniczoną jedynie do poziomu kolonii. Aby badać interakcje na poziomie komórkowym, inokulaty bakteryjne i grzybowe można hodować na szklanych szkiełkach przedmiotowych pokrytych agarem, które następnie obrazuje się pod mikroskopem17. Niemniej jednak, śledzenie pojedynczej strzępki przy użyciu szkiełek przedmiotowych może być trudne ze względu na brak ograniczenia przestrzennego, co sprawia, że trudniej jest uzyskać obrazy time-lapse. Ponadto w takich układach nie ma możliwości przestrzennego ograniczenia innych mikroorganizmów w określonych obszarach grzybni lub stworzenia zdefiniowanych środowisk chemicznych, które można by na przykład modyfikować. Natura gleby jako „czarnej skrzynki” dodatkowo komplikuje badanie interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie pojedynczych komórek18. Obserwując oddziałujące gatunki w izolacji od ogromnej różnorodności mikrobiomu glebowego, można ocenić dokładny sposób interakcji poszczególnych członków. Zatem istnieje stałe zapotrzebowanie na wszechstronne platformy umożliwiające obrazowanie BFIs i FFIs na poziomie pojedynczych komórek z wysoką rozdzielczością.
Technologie mikroprzepływowe, tzw. systemy lab-on-a-chip, stanowią idealną platformę do badania BFIs i FFIs na poziomie pojedynczych komórek. Dziedzina mikroprzepływów, wywodząca się z technologii opracowanych dla analizy chemicznej i mikroelektroniki, została zaadaptowana przez nauki biologiczne19. Technologie mikroprzepływowe regulują małe objętości płynów w ramach specjalnie zaprojektowanej sieci zminiaturyzowanych kanałów, posiadających co najmniej jeden wymiar w skali mikrometrów, a ich zastosowanie w badaniach biologicznych stale rośnie20. W szczególności opracowano urządzenia mikroprzepływowe do badania wzrostu grzybów nitkowatych21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Jedną z zalet stosowania tej technologii jest fakt, że ograniczenie strzępek oraz rozkład składników odżywczych w mikrokanałach bardziej przypominają strukturę środowiska glebowego niż konwencjonalne metody na agarze31. Niedawno platformy mikroprzepływowe wykorzystano do badania oddziaływań między ludzkimi neutrofilami a patogenami grzybiczymi32, bakteriami a korzeniami roślin33, a także grzybami i nicieniami34,35.
Jedną z wielu zalet wykorzystania mikrofluidyki do badania oddziaływań mikrobiologicznych jest możliwość precyzyjnej kontroli środowiska w mikrokanale. Na przykład przepływy laminarne mogą być wykorzystane do generowania określonych gradientów stężeń, co jest szczególnie przydatne podczas badania chemotaksji bakteryjnej36. Inną zaletą jest to, że przezroczystość poli(dimetylosiloksanu) (PDMS), niedrogiego, biokompatybilnego polimeru elastomerycznego powszechnie stosowanego w produkcji urządzeń mikrofluidycznych, ułatwia obrazowanie pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości przy użyciu mikroskopii w świetle przechodzącym i fluorescencyjnej37. Podobnie, ograniczenie mikroorganizmów w obrębie mikrokanałów umożliwia przeprowadzanie eksperymentów typu time-lapse z monitorowaniem pojedynczych komórek, co pozwala na rejestrację i kwantyfikację indywidualnych odpowiedzi komórkowych37. Wreszcie, ponieważ urządzenia mikrofluidyczne mogą być projektowane w sposób intuicyjny, mogą być one z łatwością wykorzystywane przez osoby niebędące ekspertami w tej dziedzinie38.
Pogłębianie wiedzy na temat oddziaływań między mikroorganizmami glebowymi jest istotne dla usprawnienia zrównoważonych praktyk zarządzania ekosystemami, które utrzymują bioróżnorodność i łagodzą wpływ zmian klimatu na środowiska lądowe39. W związku z tym opracowanie nowych narzędzi mikrofluidycznych jest kluczowe dla rozszerzenia rozumienia grzybów i ich oddziaływań na poziomie komórkowym. Niniejszy protokół koncentruje się na dwóch urządzeniach mikrofluidycznych stworzonych do badania BFIs40&#160;oraz FFIs41&#160;, przedstawionych na Rysunku 1.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig01.jpg" /> 
Rycina 1: Przedstawienie wizualne i schematyczne urządzeń do badania interakcji bakterio-grzybowych (BFI) oraz interakcji grzybowo-grzybowych (FFI). (A) Zdjęcie urządzenia BFI. Korek z grzybnią jest umieszczany przy wlocie na jednym z końców mikrokanałów, aby umożliwić wzrost strzępek do wnętrza urządzenia. Wlot bakterii znajduje się na przeciwległym końcu. Pasek skali = 5 mm. (B) Schematyczny przegląd urządzenia BFI, przedstawiający rozmieszczenie wlotów bakterii oraz kierunek wzrostu strzępek przez mikrokanały interakcyjne. Kanały mają głębokość 10 µm, szerokość 100 µm i długość 7 mm; łącznie znajduje się 28 kanałów obserwacyjnych. (C) Test konfrontacyjny na płytce z agarem pomiędzy Coprinopsis cinerea a Bacillus subtilis NCIB 3610, pasek skali = 20 mm (lewo). Zdjęcia mikroskopowe pokazujące interakcję między C. cinerea a B. subtilis NCIB 3610 wewnątrz mikrokanału (środek i prawo), tzn. polarne przyleganie bakterii do strzępek grzyba. Pasek skali = 25 µm (środek) i 10 µm (prawo). (D) Zdjęcie urządzenia FFI przyklejonego do szalki Petriego z szklanym dnem, z podwójnym inokulum w postaci korków z grzybnią. Pasek skali = 1 cm. (E) Schematyczny przegląd urządzenia FFI. Dwa korki z inokulum grzybowym są wprowadzane do wlotów na obu końcach urządzenia, co umożliwia eksplorację mikrokanałów przez strzępki. Kanały kontrolne są połączone tylko z jednym wlotem grzybowym i kończą się ślepo, co zapobiega interakcjom między badanymi grzybami. Kanały interakcyjne łączą oba wloty grzybowe i umożliwiają interakcje strzępek między badanymi organizmami wewnątrz mikrokanału. Każdy kanał interakcyjny składa się z 18 sekcji w kształcie rombu o całkowitej długości 8,8 mm (490 x 430 µm na romb), głębokości 10 µm i obszarach łączących pomiędzy każdym rombem o szerokości 20 µm. Typy kanałów są powielone, paski skali = 1 mm. (F) Strefa interakcji między dwoma zbliżającymi się frontami strzępek, rosnącymi z przeciwległych końców połączonego kanału interakcyjnego. Zdjęcie z mikroskopii kontrastowej, pasek skali = 250 µm. Panele na tej rycinie zostały zmodyfikowane na podstawie Stanley et al., 2014 (A-C)40 oraz Gimeno et al., 2021 (D-F)41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63917/63917fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Difco Laboratories</td><td>214010</td><td>Służy do zestalania pożywki hodowlanej do hodowli bakterii i grzybów na szalkach Petriego</td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11759408</td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD 2021</td><td>Autodesk, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw (VX-75)</td>Wirówka <td>Systec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(5810R)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorotrimetysilan</td><td>Merck Life Sciences</td><td>386529</td><td>UWAGA: Chlorotrimetylosilian jest substancją niebezpieczną. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i obchodzić się z nimi ostrożnie. Unikać kontaktu ze skórą i oczami oraz zapobiegać wdychaniu. Przechowywać z dala od źródeł zapłonu i używać w dobrze wentylowanym miejscu.</td></tr><tr><td>Świder korkowy</td><td>SLS</td><td>COR1000</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie deweloperskie (mr-Dev 600)</td><td>Microresist Technologies</td><td></td><td>UWAGA: roztwór wywoływacza mr-Dev 600 jest łatwopalny</td></tr><tr><td>Kolby Erlenmeyera</td><td>VWR</td><td>214-1108</td><td>np. 200 ml; wybierz rozmiar dokładnie dopasowany do swoich potrzeb</td></tr><tr><td>Etanol (70% v/v)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>E/0650DF/15</td><td>Rozcieńczony od 99,8% (klasa odczynnika analitycznego)</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Przykładowy pakiet oprogramowania do przetwarzania obrazowania</td></tr><tr><td>Filtrowane, sprężone powietrze</td><td></td><td></td><td>Dostępne w standardzie w większości laboratoriów. Alternatywnie można zastosować sprężarkę bezolejową z regulatorem powietrza.</td></tr><tr><td>Pęseta waflowa z płaską</td><td>główką SLS</td><td>INS5026</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10008051</td><td>Wygięta, ostra</td></tr><tr><td>Szalka Petriego ze szklanym dnem</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>Szalka Petriego ze szklanym dnem</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD5040-100</td><td>50 mm</td></tr><tr><td>Szklane naczynia krystalizacyjne</td><td>VWR</td><td>216-1865</td><td>Używany do mycia płyt PDMS</td></tr><tr><td>Szklane naczynia krystalizacyjne</td><td>VWR</td><td>216-1866</td><td>Stosowane przy opracowywaniu form wzorcowych</td></tr><tr><td>Szklane butelki na podłoża</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15456113</td><td>np. 250 ml; wybierz rozmiar dokładnie dopasowany do swoich potrzeb</td></tr><tr><td>Szklana strzykawka (Hamilton)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10625251</td><td>Służy do dozowania chlorotrimetylosilianu</td></tr><tr><td>Płyta grzejna (HP 160 III BM)</td><td>SAWATEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pętla inokulacyjna</td><td>VWR</td><td>COPA175CS01</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>Okap z przepływem laminarnym</td><td>Air Science (PCR)</td><td></td><td>Przykładowy okap z przepływem laminarnym używany do produkcji urządzeń</td></tr><tr><td>Pożywka LB</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>BP9723-500</td><td>Przykładowy bulion odżywczy do nocnej hodowli</td></tr> <tr><td>bakteriiSilnik świetlny z diodą elektroluminescencyjną (LedHUB)</td><td>Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH</td><td></td><td>Przykładowe źródło światła, które można wykorzystać do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych (fluorescencja)</td></tr><tr><td>MA6 Nakładka na maskę ultrafioletową</td><td>Suss Microtec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt słodowy</td><td>VWR</td><td>84618</td><td>Służy do produkcji przykładowej pożywki do hodowli grzybów (agar z ekstraktem słodowym)</td></tr><tr><td>Pisarz masek</td><td>Materiały stosowane</td><td>4700DP</td><td>Przykład edytora masek, który można wykorzystać do wydrukowania maski fotograficznej do fotolitografii</td></tr><tr><td>Uchwyt z tworzywa sztucznego</td><td></td><td></td> Master Mold <td>Uchwyt drukowany na zamówienie w 3D wyprodukowany na zamówienie</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa mikrobiologicznego&nbsp; (BioMat2)</td>Wzór roztworów <td></td><td>z zamkniętym powietrzem</td><td>MSC używany do hodowli drobnoustrojów i inokulacji urządzeń</td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td> oczyszczona Milli-Q <td>Dostępne w standardzie w laboratoriach biologicznych.&nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania NIS-Elements Advanced Research</td><td>Pakiet oprogramowania Nikon</td><td></td><td>Exemplar do akwizycji obrazów</td></tr><tr><td>NIS-Elements Free Viewer</td><td>Pakiet oprogramowania Nikon</td><td></td><td>Exemplar do przeglądania pozyskanych obrazów</td></tr><tr><td>Piekarnik (Binder BD115)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15602126</td><td>Służy do utwardzania poli(dimetylosiloksan)(PDMS)</td></tr> <tr><td>Piekarnik (CLO-2AH-S)</td><td>KOYO</td><td></td><td>Służy do przygotowania wafli krzemowych</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>HS234526B</td> przezroczyste <td></td></tr><tr><td>szalki Petriego z folii, kwadratowe sterylne</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11708573</td><td>szalki Petriego 120,5 mm</td></tr><tr><td>, sterylne</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15370366</td><td>90 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Maska fotolitograficzna</td><td>Micro Lithography Services Ltd. Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odkurzacz plazmowy (Zepto)</td><td>Diener Electronic</td><td>100012601</td><td></td></tr><tr><td>Kubek plastikowy</td><td>Semadeni</td><td>8323</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułka plastikowa</td><td>Semadeni</td><td>3340</td><td></td></tr><tr><td>Przenośna waga precyzyjna (OHAUS Scout)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15519631</td><td>Służy do ważenia PDMS, media komponenty itp.</td></tr><tr><td>Nóż precyzyjny</td><td>Syneo</td><td>HS1251135P1183</td><td>Średnica krawędzi tnącej: 3,18 mm</td></tr><tr><td>Nóż precyzyjny&nbsp;</td><td>Syneo</td><td>HS1871730P1183S</td><td>Średnica krawędzi tnącej: 4,75 mm</td></tr><tr><td>Profilometr&nbsp;</td><td>Bruker</td><td></td><td>Dektak XT-stylus</td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>H&auml; berle Labortechnik</td><td>9156110</td><td></td></tr><tr><td>Lodówka</td><td>Haden</td><td></td><td>4-6 &deg; C</td></tr><tr><td>Kamera CCD Retiga R1</td><td>Qimaging</td><td></td><td>Przykładowa kamera, która może być używana do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych</td></tr><tr><td>Magiczna taśma klejąca</td><td>Office Depot</td><td>3969954</td><td>19 mm niewidoczna taśma; przezroczysta taśma</td></tr><tr><td>Inkubator wstrząsający (Cole-Parmer SI500)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10257954</td><td></td></tr><tr><td>Wafel krzemowy</td><td>Inseto</td><td></td><td>100 mm</td></tr><tr><td>Szkło sodowo-wapniowe płytka</td><td>Inseto</td><td></td><td>125 mm x 125 mm x 2 mm. Służy do mocowania maski fotolitograficznej w nakładce</td></tr><tr><td>maski Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Spincoater&nbsp;</td><td>SAWATEC</td><td>SM-180-BM</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2010 fotorezystor</td><td>MicroChem</td><td></td><td>UWAGA: Fotorezystor SU-8 jest niebezpieczny, należy zachować ostrożność podczas obsługi i unikać wdychania i kontaktu ze skórą. Łatwopalny, potencjalnie rakotwórczy i toksyczny dla środowiska.</td></tr><tr><td>Zestaw elastomerów Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>634165S</td><td>Służy do przygotowania urządzeń z poli(dimetylosiloksanu)(PDMS)</td></tr><tr><td>Inkubator z kontrolowaną temperaturą</td><td>Inkubator Okolab</td><td></td><td>Exemplar, który może być używany do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych</td></tr><tr><td>Mikroskop odwróconej epifluorescencji Ti2-E</td><td>Mikroskop Nikon</td><td>MEA54000</td><td>Exemplar, który może być używany do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych</td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa S-Line</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>FB15050</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator próżniowy</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10528861</td><td>Odgazowanie silianizacji i PDMS należy przeprowadzać w oddzielnych eksykatorach</td></tr><tr><td>x10/0,3 NA Soczewka obiektywowa CFI Plan Fluor DL</td><td>Nikon</td><td>MRH20105</td><td>Exemplar soczewka obiektywowa, która może być używana do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych</td></tr><tr><td>x20/0,45 NA CFI Plan Fluor DL soczewka obiektywowa</td><td>Nikon</td><td>MRH48230</td><td>Exemplar soczewka obiektywowa, która może być używana do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych</td></tr></tbody></table>

narzędzia mikroprzepływowe do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie komórkowym

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Grzyby strzępkowe są skutecznymi mieszkańcami gleby i odgrywają główną rolę w ekosystemach glebowych, takich jak rozkład materii organicznej i nieorganicznej, a także regulacja poziomu składników odżywczych. Znajdują tam również wiele możliwości interakcji z wieloma innymi drobnoustrojami, takimi jak bakterie lub inne grzyby. Badanie interakcji grzybów na poziomie komórkowym może być jednak trudne ze względu na przypominającą czarną skrzynkę naturę gleby. Opracowywane są nowe narzędzia mikroprzepływowe do badania oddziaływań grzybów; Wyróżniono dwie platformy przeznaczone do badania interakcji bakteryjno-grzybowych i grzybowo-grzybowych. W obrębie tych mikrokanałów interakcje grzybowo-mikrobiologiczne mogą być monitorowane w kontrolowanych środowiskach fizykochemicznych przy wyższej rozdzielczości czasowej i przestrzennej niż było to wcześniej możliwe. Zastosowanie tych narzędzi przyniosło wiele nowych informacji biologicznych, takich jak obserwacja polarnego przyczepiania się bakterii do strzępek lub ujawnienie niescharakteryzowanych antagonizmów grzybów. Kluczową cechą tych metodologii jest łatwość użycia tego narzędzia przez osoby niebędące ekspertami, co pozwala na opracowanie wysoce przekładalnych technologii do wykorzystania w laboratoriach mikrobiologicznych.

Przedstawiono reprezentatywne wyniki uzyskane przy użyciu egzemplarzowych urządzeń BFI40 oraz FFI41. Pomiary tempa wzrostu strzępek można łatwo przeprowadzić za pomocą tych urządzeń w połączeniu z podstawowymi technikami mikroskopowymi. Rysunek 3A-B ilustruje interakcje bakteryjno-grzybowe między strzępkami C. cinerea a B. subtilis NCIB 3610. Obecność B. subtilis hamuje wzrost C. ...

Ze względu na nieprzezroczystość gleby, interakcje między jej składowymi mikroorganizmami nie mogą być łatwo zobrazowane za pomocą rozdzielczości komórkowej. Zaprezentowano tu dwa narzędzia mikroprzepływowe, które dają nowe możliwości badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych. Urządzenia są wszechstronne i proste w użyciu, umożliwiając wysoką kontrolę czasoprzestrzenną i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości na poziomie komórkowym.

Narzędzia mikroprzepływowe do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie komórkowym

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Za pomocą prezentowanych urządzeń mikroprzepływowych możemy badać dynamiczne oddziaływania pomiędzy grzybami a innymi drobnoustrojami z precyzyjną kontrolą przestrzenną i środowiskową, a także obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości na poziomie pojedynczej komórki. Co ważne, wzrost grzybów może być ograniczony i ukierunkowany w kanale mikroprzepływowym. Umożliwia uzyskanie wysokiej jakości zdjęć poklatkowych.W związku z tym można badać złożoność interakcji grzyb-grzyb i grzyb-bakteria. Zrozumienie interakcji mikrobiologicznych grzybów jest niezbędnym krokiem w definiowaniu i ochronie mikrobiomu glebowego. Wiedza ta może zostać wykorzystana do opracowania nowych środków kontroli biologicznej w zrównoważonym rolnictwie.Na początek przygotuj około 40 gramów poli(dimetylosiloksanu) lub PDM, dokładnie mieszając bazę i utwardzacz w stosunku 10 do 1 za pomocą szpatułki w czystym plastikowym kubku. Aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza, umieść kubek w komorze próżniowej na godzinę. Następnie, za pomocą przezroczystej taśmy, przymocuj formę wzorcową do plastikowego uchwytu i użyj sprężonego, przefiltrowanego powietrza, aby usunąć wszelkie cząsteczki kurzu, a następnie wylej PDM na środek formy głównej i pozwól jej się osadzić.Aby zapobiec osadzaniu się cząsteczek kurzu na powierzchni PDM, luźno przykryj formę główną plastikową pokrywką, a następnie przenieś formę wzorcową do piekarnika i utwardź przez noc w temperaturze 70 stopni Celsjusza. Po wyjęciu formy wzorcowej z piekarnika i pozostawieniu jej do ostygnięcia, oderwij utwardzone PDM od formy głównej i plastikowej ramy, nie uszkadzając formy głównej w PDM. Następnie, aby utrzymać powierzchnię wolną od kurzu, umieść przezroczystą taśmę na mikrokanalikach wytłoczonych w PDM.Następnie użyj zamontowanej gilotyny lub żyletki, aby pociąć PDM na płyty zgodnie z przeznaczeniem w projekcie. Podczas wycinania bocznego otworu płyty PDM używanej do urządzenia do interakcji bakteryjno-grzybiczej lub urządzenia BFI, upewnij się, że mikrokanały są całkowicie otwarte. Jednak w przypadku płyt PDM używanych do montażu urządzenia do interakcji grzyb-grzyb lub FFI, każdy róg powinien być przycięty tak, aby pasował do szalki Petriego ze szklanym dnem.Następnie za pomocą precyzyjnego noża wybij otwory wlotowe lub wylotowe zgodnie z konstrukcją urządzenia. Następnie zanurz płyty PDM w 0,5-molowym roztworze wodorotlenku sodu. Opłucz płyty w sterylnej podwójnie destylowanej wodzie przed przeniesieniem ich do 70% roztworu etanolu.Po usunięciu etanolu i ponownym przepłukaniu płyt podwójnie destylowaną sterylną wodą, zanurz płyty w sterylnej podwójnie destylowanej wodzie i sonikuj przez pięć minut, a następnie wyjmij płytę PDM z wody, wysusz je sprężonym przefiltrowanym powietrzem i umieść na sterylnej kwadratowej szalce Petriego. Następnie inkubuj szalkę Petriego z płytą PDM w piekarniku w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez godzinę. Gdy płyty ostygną w środowisku wolnym od kurzu, usuń kurz z ich powierzchni za pomocą taśmy i sprężonego przefiltrowanego powietrza.Aby aktywować powierzchnie płyt PDM i szalek Petriego ze szklanym dnem, które zostaną następnie połączone ze sobą, umieść je w myjce plazmowej tak, aby powierzchnie, które mają być aktywowane, były skierowane do góry. Po wyjęciu płyty PDM z szalek Petriego z myjki plazmowej, należy je delikatnie połączyć, umieszczając aktywowane powierzchnie w konforemnym kontakcie ze sobą. Połącz płytę PDM BFI i FFI z szalkami Petriego o średnicy odpowiednio 35 milimetrów i 55 milimetrów, w celu sprawdzenia udanego wiązania, spróbuj ściągnąć laboratorium PDM z szalki Petriego za pomocą pęsety.Dokładnie zwizualizuj urządzenie za pomocą oka lub za pomocą mikroskopii ogólnej, aby upewnić się, że nie zapadają się wloty inokulacji ani mikrokanały. W przypadku warunków nasyconych wodą lub bogatych w składniki odżywcze należy odpipetować 100 mikrolitrów żądanego roztworu, aby napełnić urządzenia BFI natychmiast po związaniu. W przypadku urządzeń FFI dodaj 30 mikrolitrów pożywki do każdego wlotu.Na koniec dodaj od 100 do 200 mikrolitrów sterylnej podwójnie destylowanej wody na szalkę Petriego, aby utrzymać wilgotność. Jednak w przypadku warunków nienasyconych wodą wystarczy dodać od 100 do 200 mikrolitrów sterylnej podwójnie destylowanej wody na szalkę Petriego, aby utrzymać wilgotność. W celu zaszczepienia grzybów, wewnątrz okapu z przepływem laminarnym, za pomocą wysterylizowanego świdra korkowego, usuń korek agarowy z kolonii na obrzeżach trzydniowej kultury, upewniając się, że rosnący czoło strzępki pozostaje nienaruszone.Następnie wprowadzić zatyczkę agarową do wlotu grzyba urządzenia BFI i/lub FFI grzybnią skierowaną do dołu z przodu strzępki skierowaną w stronę otworów mikrokanałów, aby zachęcić do infiltracji kanałów strzępkami. W przypadku urządzenia FFI wprowadzić kolejny korek agarowy z drugim gatunkiem grzyba do przeciwległego wlotu. Następnie uszczelnij szalkę Petriego przezroczystą folią i inkubuj w temperaturze od 25 do 28 stopni Celsjusza w ciemności do momentu obrazowania.W przypadku inokulacji bakteryjnej, po wyjęciu urządzenia BFI z inkubatora, należy pobrać pipetą 10 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej do wlotu bakteryjnego w sterylnym środowisku. Gdy szalka Petriego zostanie uszczelniona przezroczystą folią, przechowuj urządzenie w pozycji pionowej w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności, aż rozpocznie się obrazowanie. Korzystając z tego protokołu, można było z powodzeniem zwizualizować interakcję między grzybem Coprinopsis cinerea a bakterią Bacillus subtilis.Zaobserwowano, że w obecności bakterii tempo wzrostu grzyba zaczęło drastycznie spadać po około pięciu godzinach kolokulacji. Co więcej, strzępki grzybów związane z bakteriami miały cienki i przezroczysty wygląd. Mikroskopia fluorescencyjna w czasie wykazała również zapadanie się strzępek grzybów po pięciu godzinach kolokulacji z Bacillus subtilis.Jednak od sześciu godzin populacja bakterii również zaczęła się zmniejszać. Wizualizacja interakcji grzyb-grzyb wykazała, że Fusarium graminearum silnie hamowało wzrost Trichoderma rossicum, co było widoczne przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten ujawnił ponadto znaczące zmiany morfologiczne w grzybie Verticillium longisporum w obecności bakterii Pseudomonas synxantha i Pseudomonas fluorescens.Zastosowana w badaniu technika obrazowania dynamicznego o wysokiej rozdzielczości ujawniła również tworzenie się przegród w Fusarium graminearum w obecności grzyba Clonostachys rosea. Znakowanie fluorescencyjne umożliwiło dynamiczną kwantyfikację proliferacji strzępek Clonostachys rosea w urządzeniu FFI. Urządzenia te mogą być dostosowywane i modyfikowane przez użytkownika w celu uwzględnienia różnych gatunków będących przedmiotem zainteresowania i odpowiedzi na ich specyficzne pytania eksperymentalne dotyczące interakcji mikrobiologicznych grzybów.Zarówno urządzenia BFI, jak i FFI przesunęły granice nauki, ujawniając, w jaki sposób grzyby rozprzestrzeniają sygnały obronne i składniki odżywcze po ataku grzybów, wirusów, nicieni i umożliwiając badania nad rozprzestrzenianiem się bakterii.

microfluidic-tools-for-probing-fungal-microbial-interactions-at

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Urządzenia mikrofluidyczne mogą być wykorzystywane do wizualizacji złożonych procesów naturalnych w czasie rzeczywistym i w odpowiednich skalach fizycznych. Opracowaliśmy proste urządzenie mikrofluidyczne, które naśladuje kluczowe cechy naturalnych ośrodków porowatych, służące do badania wzrostu i transportu bakterii w podłożu gruntowym.

Okno na mikroświat: Proste systemy mikrofluidyczne do badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych

Przedstawiamy prostą metodę wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych zdolnych do stosowania podobnych warunków dynamicznych w odniesieniu do wielu odrębnych szczepów, bez konieczności korzystania z pomieszczeń typu clean room lub litografii miękkiej.

Urządzenie mikroprzepływowe do badania wielu odrębnych szczepów

Źródło: Miquel Guennoc, C. i inni. Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów włóknistych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje przygotowanie hodowli grzybów na poddanych leczeniu błon celofanowych, aby wspierać tworzenie kolonii i wzrost promieniowy. Następnie pokazuje uprawę i przygotowanie komórek bakteryjnych glebowych do testów interakcji. Na koniec ilustruje, jak komórki bakteryjne...

Ustanowienie współkultury grzybowo-bakteryjnej do tworzenia biofilmu

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Defensyny roślinne odgrywają ważną rolę w obronie roślin przed patogenami. Aby skutecznie wykorzystać te peptydy przeciwgrzybicze jako środki przeciwgrzybicze, zrozumienie ich sposobów działania (MOA) ma kluczowe znaczenie. W tym miejscu opisano metodę obrazowania żywych komórek w celu zbadania krytycznych aspektów MOA tych peptydów.

Obrazowanie żywych komórek grzybów w celu zbadania sposobów wnikania i lokalizacji subkomórkowej przeciwgrzybiczych defensyn roślinnych

Przedstawiamy metodę analizy mikroprzepływowej poszczególnych linii komórek bakteryjnych na przykładzie Bacillus subtilis. Metoda ta przezwycięża niedociągnięcia tradycyjnych metod analitycznych w mikrobiologii, umożliwiając obserwację setek generacji komórek w ściśle kontrolowanych i jednolitych warunkach wzrostu.

Jednokomórkowa analiza mikroprzepływowa Bacillus subtilis

Niezbędne barwniki fluorescencyjne są niezbędnymi narzędziami do analiz obrazowania żywych komórek w nowoczesnej biologii komórek grzybów. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie znanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo-/egzocytozy i morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych.

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych

Tutaj prezentujemy protokół do profilowania interakcji między gospodarzem a patogenem podczas infekcji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas. Protokół ten wykorzystuje kwantyfikację bez znaczników do pomiaru zmian w obfitości białek zarówno gospodarza (np. Makrofagi), jak i patogenu (np. Cryptococcus neoformans) w jednym eksperymencie.

Bezznacznikowy przepływ pracy proteomiki ilościowej dla interakcji gospodarz-patogen opartych na odkryciach

Prezentujemy protokół obrazowania na żywo bez znaczników, wykorzystujący techniki mikroskopii światła przechodzącego do przechwytywania obrazów, analizy i ilościowego określania kinetyki wzrostu nitkowatego grzyba A. nidulans zarówno w kulturach zanurzonych, jak i w podłożach stałych. Protokół ten może być stosowany w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną.

Analiza ilościowa tempa wzrostu Aspergillus nidulans przy użyciu mikroskopii na żywo i oprogramowania typu open source

Poznaj mikroprzepływowe narzędzia do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych z wysoką rozdzielczością obrazowania. Ta metoda umożliwia obserwację dynamicznych procesów w mikrobiomie glebowym i rozwój biokontroli.

Narzędzia mikroprzepływowe do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie komórkowym

Przeglądaj więcej filmów