Narzędzia mikroprzepływowe do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie komórkowym

Za pomocą prezentowanych urządzeń mikroprzepływowych możemy badać dynamiczne oddziaływania pomiędzy grzybami a innymi drobnoustrojami z precyzyjną kontrolą przestrzenną i środowiskową, a także obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości na poziomie pojedynczej komórki. Co ważne, wzrost grzybów może być ograniczony i ukierunkowany w kanale mikroprzepływowym. Umożliwia uzyskanie wysokiej jakości zdjęć poklatkowych.

W związku z tym można badać złożoność interakcji grzyb-grzyb i grzyb-bakteria. Zrozumienie interakcji mikrobiologicznych grzybów jest niezbędnym krokiem w definiowaniu i ochronie mikrobiomu glebowego. Wiedza ta może zostać wykorzystana do opracowania nowych środków kontroli biologicznej w zrównoważonym rolnictwie.

Na początek przygotuj około 40 gramów poli(dimetylosiloksanu) lub PDM, dokładnie mieszając bazę i utwardzacz w stosunku 10 do 1 za pomocą szpatułki w czystym plastikowym kubku. Aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza, umieść kubek w komorze próżniowej na godzinę. Następnie, za pomocą przezroczystej taśmy, przymocuj formę wzorcową do plastikowego uchwytu i użyj sprężonego, przefiltrowanego powietrza, aby usunąć wszelkie cząsteczki kurzu, a następnie wylej PDM na środek formy głównej i pozwól jej się osadzić.

Aby zapobiec osadzaniu się cząsteczek kurzu na powierzchni PDM, luźno przykryj formę główną plastikową pokrywką, a następnie przenieś formę wzorcową do piekarnika i utwardź przez noc w temperaturze 70 stopni Celsjusza. Po wyjęciu formy wzorcowej z piekarnika i pozostawieniu jej do ostygnięcia, oderwij utwardzone PDM od formy głównej i plastikowej ramy, nie uszkadzając formy głównej w PDM. Następnie, aby utrzymać powierzchnię wolną od kurzu, umieść przezroczystą taśmę na mikrokanalikach wytłoczonych w PDM.

Następnie użyj zamontowanej gilotyny lub żyletki, aby pociąć PDM na płyty zgodnie z przeznaczeniem w projekcie. Podczas wycinania bocznego otworu płyty PDM używanej do urządzenia do interakcji bakteryjno-grzybiczej lub urządzenia BFI, upewnij się, że mikrokanały są całkowicie otwarte. Jednak w przypadku płyt PDM używanych do montażu urządzenia do interakcji grzyb-grzyb lub FFI, każdy róg powinien być przycięty tak, aby pasował do szalki Petriego ze szklanym dnem.

Następnie za pomocą precyzyjnego noża wybij otwory wlotowe lub wylotowe zgodnie z konstrukcją urządzenia. Następnie zanurz płyty PDM w 0,5-molowym roztworze wodorotlenku sodu. Opłucz płyty w sterylnej podwójnie destylowanej wodzie przed przeniesieniem ich do 70% roztworu etanolu.

Po usunięciu etanolu i ponownym przepłukaniu płyt podwójnie destylowaną sterylną wodą, zanurz płyty w sterylnej podwójnie destylowanej wodzie i sonikuj przez pięć minut, a następnie wyjmij płytę PDM z wody, wysusz je sprężonym przefiltrowanym powietrzem i umieść na sterylnej kwadratowej szalce Petriego. Następnie inkubuj szalkę Petriego z płytą PDM w piekarniku w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez godzinę. Gdy płyty ostygną w środowisku wolnym od kurzu, usuń kurz z ich powierzchni za pomocą taśmy i sprężonego przefiltrowanego powietrza.

Aby aktywować powierzchnie płyt PDM i szalek Petriego ze szklanym dnem, które zostaną następnie połączone ze sobą, umieść je w myjce plazmowej tak, aby powierzchnie, które mają być aktywowane, były skierowane do góry. Po wyjęciu płyty PDM z szalek Petriego z myjki plazmowej, należy je delikatnie połączyć, umieszczając aktywowane powierzchnie w konforemnym kontakcie ze sobą. Połącz płytę PDM BFI i FFI z szalkami Petriego o średnicy odpowiednio 35 milimetrów i 55 milimetrów, w celu sprawdzenia udanego wiązania, spróbuj ściągnąć laboratorium PDM z szalki Petriego za pomocą pęsety.

Dokładnie zwizualizuj urządzenie za pomocą oka lub za pomocą mikroskopii ogólnej, aby upewnić się, że nie zapadają się wloty inokulacji ani mikrokanały. W przypadku warunków nasyconych wodą lub bogatych w składniki odżywcze należy odpipetować 100 mikrolitrów żądanego roztworu, aby napełnić urządzenia BFI natychmiast po związaniu. W przypadku urządzeń FFI dodaj 30 mikrolitrów pożywki do każdego wlotu.

Na koniec dodaj od 100 do 200 mikrolitrów sterylnej podwójnie destylowanej wody na szalkę Petriego, aby utrzymać wilgotność. Jednak w przypadku warunków nienasyconych wodą wystarczy dodać od 100 do 200 mikrolitrów sterylnej podwójnie destylowanej wody na szalkę Petriego, aby utrzymać wilgotność. W celu zaszczepienia grzybów, wewnątrz okapu z przepływem laminarnym, za pomocą wysterylizowanego świdra korkowego, usuń korek agarowy z kolonii na obrzeżach trzydniowej kultury, upewniając się, że rosnący czoło strzępki pozostaje nienaruszone.

Następnie wprowadzić zatyczkę agarową do wlotu grzyba urządzenia BFI i/lub FFI grzybnią skierowaną do dołu z przodu strzępki skierowaną w stronę otworów mikrokanałów, aby zachęcić do infiltracji kanałów strzępkami. W przypadku urządzenia FFI wprowadzić kolejny korek agarowy z drugim gatunkiem grzyba do przeciwległego wlotu. Następnie uszczelnij szalkę Petriego przezroczystą folią i inkubuj w temperaturze od 25 do 28 stopni Celsjusza w ciemności do momentu obrazowania.

W przypadku inokulacji bakteryjnej, po wyjęciu urządzenia BFI z inkubatora, należy pobrać pipetą 10 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej do wlotu bakteryjnego w sterylnym środowisku. Gdy szalka Petriego zostanie uszczelniona przezroczystą folią, przechowuj urządzenie w pozycji pionowej w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności, aż rozpocznie się obrazowanie. Korzystając z tego protokołu, można było z powodzeniem zwizualizować interakcję między grzybem Coprinopsis cinerea a bakterią Bacillus subtilis.

Zaobserwowano, że w obecności bakterii tempo wzrostu grzyba zaczęło drastycznie spadać po około pięciu godzinach kolokulacji. Co więcej, strzępki grzybów związane z bakteriami miały cienki i przezroczysty wygląd. Mikroskopia fluorescencyjna w czasie wykazała również zapadanie się strzępek grzybów po pięciu godzinach kolokulacji z Bacillus subtilis.

Jednak od sześciu godzin populacja bakterii również zaczęła się zmniejszać. Wizualizacja interakcji grzyb-grzyb wykazała, że Fusarium graminearum silnie hamowało wzrost Trichoderma rossicum, co było widoczne przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten ujawnił ponadto znaczące zmiany morfologiczne w grzybie Verticillium longisporum w obecności bakterii Pseudomonas synxantha i Pseudomonas fluorescens.

Zastosowana w badaniu technika obrazowania dynamicznego o wysokiej rozdzielczości ujawniła również tworzenie się przegród w Fusarium graminearum w obecności grzyba Clonostachys rosea. Znakowanie fluorescencyjne umożliwiło dynamiczną kwantyfikację proliferacji strzępek Clonostachys rosea w urządzeniu FFI. Urządzenia te mogą być dostosowywane i modyfikowane przez użytkownika w celu uwzględnienia różnych gatunków będących przedmiotem zainteresowania i odpowiedzi na ich specyficzne pytania eksperymentalne dotyczące interakcji mikrobiologicznych grzybów.

Zarówno urządzenia BFI, jak i FFI przesunęły granice nauki, ujawniając, w jaki sposób grzyby rozprzestrzeniają sygnały obronne i składniki odżywcze po ataku grzybów, wirusów, nicieni i umożliwiając badania nad rozprzestrzenianiem się bakterii.