Name: Czasowo-rozdzielczy pomiar dynamiki neuropeptydów in vivo za pomocą pojemnościowej immunosondy w sercu świni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Poznaj metodę czasowo-rozdzielczego pomiaru poziomów peptydowych przekaźników in vivo za pomocą pojemnościowej immunosondy w sercu świni. Ta technika umożliwia analizę niemal w czasie rzeczywistym w pojedynczych osobnikach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Olu Ajijola (UCLA Cardiac Arrhythmia Center) za fachowe wsparcie dla eksperymentów in vivo. Prace te były wspierane przez NIH U01 EB025138 (JLA, CS).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Badań na Zwierzętach Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi określonymi przez National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8. edycja, 2011). Dorosłe samce świń rasy Yorkshire o wadze około 75 kg wykorzystano do badań in vivo10.
1. Produkcja i funkcjonalizacja pojemnościowej immunosondy
<ol>
	<li>Przeciąć drut platynowy pokryty perfluoroalkoksylem (PFA) o długości 25 cm (patrz Tabela materiałów) i usunąć około 5 mm powłoki PFA z jednego końca za pomocą skalpela, uważając, aby nie przeciąć drutu platynowego.</li>
	<li>Włóż odizolowany koniec przewodu platynowego do pozłacanego styku złącza męskiego 1 mm i zaciśnij zęby styku złącza wokół odizolowanego końca przewodu platynowego za pomocą szczypiec półokrągłych (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>przewód platynowy do pozłacanego styku złącza. Uważaj, aby nie użyć nadmiernej ilości lutu.</li>
	<li>Przygotować roztwór dopaminy, rozpuszczając 50 mg chlorowodorku dopaminy w 50 ml 10 mM soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 6,0) przez mieszanie.</li>
	<li>Gdy dopamina całkowicie się rozpuści, umieść końcówkę drutu platynowego w naczyniu zawierającym świeżo przygotowany PBS uzupełniony dopaminą. Podłącz złoty pin złącza do kanału headstage (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Podłącz elektrodę tarczową AgCl (elektrodę uziemiającą, patrz Tabela materiałów) do kanału uziemiającego w headstage. Umieścić krążek AgCl w naczyniu zawierającym PBS uzupełniony dopaminą i drut platynowy; Uważaj, aby zanurzyć tylko elektrodę tarczową, a nie drut lub lut. Przed kontynuowaniem podłącz bocznik przewodu do kanałów odniesienia stopnia czołowego.</li>
	<li>Otwórz interaktywne oprogramowanie do gromadzenia danych (patrz tabela materiałów). Przygotować protokół potencjału dowodzenia elektroosadzania piłokształtnego z następującymi parametrami: potencjał rozruchowy = −0,6 V; potencjał końcowy = +0,65 V; szybkość skanowania = 0,04 V∙s-1; czas osadzania = 420 s. Rozpocznij protokół osadzania polidopaminy, upewniając się, że wszystkie przewody są prawidłowo podłączone.</li>
	<li>Po zakończeniu osadzania polidopaminy należy wyjąć zmielony osad AgCl i końcówkę drutu platynowego z naczynia, uważając, aby nie naruszyć końcówki elektrody z drutu platynowego. Umieść końcówkę drutu w mikroprobówce zawierającej PBS (pH 7,4) na 2-5 minut, podczas przygotowywania roztworu przeciwciała; Upewnij się, że końcówka drutu nie styka się z bokami ani spodem mikrorurki. 
	UWAGA: Roztwór przeciwciała można przygotować podczas odkładania polidopaminy; jednak nie należy pomijać przenoszenia drutu platynowego z naczynia zawierającego dopaminę do mikroprobówki PBS po deponowaniu polidopaminy.</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciał. Połączyć badane przeciwciało z PBS (pH 7,4) w stosunku 1:20 w naczyniu o odpowiedniej wielkości (np. mikroprobówce). 
	UWAGA: Zastosowane tutaj przeciwciało monoklonalne anty-NPY (patrz tabela materiałów) podawano w dawce 1 mg/ml; Przykładowym preparatem przeciwciał byłoby tutaj 4 μL przeciwciała na 76 μL PBS.</li>
	<li>Zanurzyć osadzoną polidopaminą końcówkę elektrody platynowej w roztworze przeciwciała przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej, ponownie upewniając się, że końcówka z drutu platynowego jest zawieszona w roztworze i nie spoczywa na wewnętrznej powierzchni mikroprobówki. 
	UWAGA: Niedawne wdrożenie tej techniki faworyzuje użycie drutu platynowego elektrodowego bezpośrednio po tym kroku zamiast przechowywania na mokro lub na sucho do późniejszego wykorzystania.</li>
	<li>Po namoczeniu w roztworze przeciwciała krótko przepłucz nowo funkcjonalizowaną końcówkę pojemnościowej immunosondy (sondy CI) w PBS (pH 7,4). Sonda jest teraz gotowa do użycia.</li>
</ol>
2. Eksperymentalne stanowisko do wykrywania i pomiaru peptydu in vitro
<ol>
	<li>Umieść funkcjonalną końcówkę sondy CI w komorze przepływowej, uważając, aby w żaden sposób nie naruszyć końcówki elektrody, ponieważ może to spowodować uszkodzenie końcówki sensorycznej sondy. 
	UWAGA: Komora przepływowa została utworzona poprzez wlanie elastomeru silikonowego (patrz Tabela Materiałów) do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm z wydłużonym, jajowatym wypełniaczem przestrzeni pośrodku naczynia. Po stwardnieniu jajowaty kształt jest usuwany z elastomeru. Komora jest następnie przepełniana solą fizjologiczną buforowaną Tris (TBS) i zapewnia natężenie przepływu 3 ml/min. Upewnij się, że dopływ i odpływ utrzymują poziom płynu w komorze w taki sposób, aby nie zaobserwowano pływowego działania superfusatu. Przepływ musi pozostać na miejscu tak długo, jak długo używana jest sonda CI.</li>
	<li>Przed pierwszym testem eksperymentalnym należy wykonać standardowy przebieg TBS w celu kondycjonowania sondy CI. Ustaw następujący protokół napięcia polecenia: dodatni potencjał krokowy = +100 mV; ujemny potencjał skokowy = −5 mV; czas trwania kroku = 20 ms; Czas nabycia = 600 s. 
	UWAGA: Ważne jest, aby umożliwić zrównoważenie sondy w początkowej fazie cyklicznego potencjału dowodzenia przed akwizycją danych.</li>
	<li>Stworzyć roztwór interesującego peptydu, używając tego samego TBS, aby utrzymać skład superfuzatu. Skonfiguruj system kolektora, w którym superfusat może być przełączany między TBS a TBS uzupełnionym peptydami bez wprowadzania pęcherzyków do systemu przewodów lub komory przepływowej. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano syntetyczny peptyd NPY ze świń (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Skonfiguruj protokół akwizycji danych wykrywających peptydy przy użyciu standardowych parametrów TBS (patrz krok 2.2.). 
	UWAGA: W tej implementacji czas trwania każdego testu eksperymentalnego wynosił 360 s (120 s TBS, 120 s TBS uzupełniony peptydem, 120 s TBS).</li>
</ol>
3. Adaptacja sondy CI do użytku in vivo
<ol>
	<li>Przed osadzaniem polidopaminy (krok 1.7) przewlecz odsłoniętą końcówkę elektrody z drutu platynowego przez igłę podskórną o gramaturze 22 G, pozostawiając około 2 mm poza końcówką igły. Za pomocą kleszczy delikatnie odchyl do tyłu końcówkę elektrody z drutu platynowego, tworząc "zadzior", który zwisa z końca igły podskórnej.
	<ol>
		<li>Delikatnie wyjmij igłę z kolczastej końcówki, pozostawiając wystarczającą ilość drutu, aby umieścić ją w naczyniu, tak aby igła nie stykała się z płynem. Wykonaj kroki 1.4.-1.11. 
		UWAGA: W zależności od konfiguracji in vivo może być konieczne przycięcie drutu platynowego o długości większej niż 25 cm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed podłączeniem sondy CI do głowicystage upewnij się, że cała instalacja elektryczna jest prawidłowo uziemiona. Niezastosowanie się do tego może spowodować niepożądane zakłócenia elektryczne podczas nagrań eksperymentalnych.</li>
	<li>Znieczulenie zwierząt należy postępować zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem10.</li>
	<li>Wykonaj operację, aby odsłonić obszar zainteresowania. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu wykonano sternotomię środkową w celu odsłonięcia serca. Zobacz Kluge et al.10, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat chirurgii zwierząt.</li>
	<li>Delikatnie wyjmij funkcjonalną końcówkę z płukanki PBS (krok 1.11.), skieruj igłę hidodermiczną do kolczastej sondy CI i delikatnie wszczep ją w obszarze zainteresowania przed podłączeniem złotego styku złącza do głowicy. Po wszczepieniu należy wyjąć igłę podskórną, pozostawiając elektrodę na miejscu. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu sondę umieszczono w środkowej bocznej ścianie mięśnia sercowego lewej komory10.</li>
	<li>Po upewnieniu się, że konfiguracja elektryczna jest prawidłowa, należy postępować zgodnie ze standardowymi i eksperymentalnymi protokołami testowymi (krok 2.2. i krok 2.4.).</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentów należy poddać zwierzę eutanazji zgodnie z technikami zatwierdzonymi przez instytucję. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu zwierzęta są poddawane eutanazji w głębokim znieczuleniu poprzez indukcję migotania komór10.</li>
</ol>

<ol><li>Chow, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Biomarkers+for+the+prevention%2C+assessment%2C+and+management+of+heart+failure%3A+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).</li>
<li>Goldstein, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenal+responses+to+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Adrenal responses to stress.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (8), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Ullman, B., Hulting, J., Lundberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+plasma+neuropeptide-Y+in+coronary+care+unit+patients+with+and+without+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of plasma neuropeptide-Y in coronary care unit patients with and without acute myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 15 (4), 454-461 (1994).</li>
<li>Farrell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+modulates+catecholamine+release+into+interstitial+fluid+of+canine+myocardium+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II modulates catecholamine release into interstitial fluid of canine myocardium in vivo.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 281 (2), 813-822 (2001).</li>
<li>Ardell, J. L., Foreman, R. D., Armour, J. A., Shivkumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathectomy+and+spinal+cord+stimulation+attenuate+reflex-mediated+norepinephrine+release+during+ischemia+preventing+ventricular+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathectomy and spinal cord stimulation attenuate reflex-mediated norepinephrine release during ischemia preventing ventricular fibrillation.</a> JCI Insight. 4 (23), 131648(2019).</li>
<li>Franco-Cereceda, A., Lundberg, J. M., Dahlof, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+Y+and+sympathetic+control+of+heart+contractility+and+coronary+vascular+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide Y and sympathetic control of heart contractility and coronary vascular tone.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 124 (3), 361-369 (1985).</li>
<li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+neurocardiology%3A+development%2C+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li>
<li>Hoang, J. D., Salavatian, S., Yamaguchi, N., Swid, M. A., Vaseghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+activation+circumvents+high-dose+beta+blocker+therapy+in+part+through+release+of+neuropeptide+Y%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic activation circumvents high-dose beta blocker therapy in part through release of neuropeptide Y.</a> JCI Insight. 5 (11), 135519(2020).</li>
<li>Rigel, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neuropeptides+on+heart+rate+in+dogs%3A+comparison+of+VIP%2C+PHI%2C+NPY%2C+CGRP%2C+and+NT%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of neuropeptides on heart rate in dogs: comparison of VIP, PHI, NPY, CGRP, and NT.</a> American Journal of Physiology. 255, 311-317 (1988).</li>
<li>Kluge, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+cardiac+neuropeptide+dynamics+by+capacitive+immunoprobe+in+the+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of cardiac neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in the porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 320 (1), 66-76 (2021).</li>
<li>Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitive+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Electroanalysis%22%5BJournal%5D)">Capacitive biosensors.</a> Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).</li>
<li>Prodromidis, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedimetric+immunosensors-A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Electrochimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Impedimetric immunosensors-A review.</a> Electrochimica Acta. 55 (14), 4227-4233 (2010).</li>
<li>Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mussel-inspired+surface+chemistry+for+multifunctional+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings.</a> Science. 318 (5849), 426-430 (2007).</li>
<li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+catecholamines+from+individual+adrenal+medullary+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Secretion of catecholamines from individual adrenal medullary chromaffin cells.</a> Journal of Neurochemistry. 56 (6), 1855-1863 (1991).</li>
<li>Pihel, K., Schroeder, T. J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+selective+cyclic+voltammetric+measurements+of+epinephrine+and+norepinephrine+as+a+method+to+measure+secretion+from+single+bovine+adrenal+medullary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid and selective cyclic voltammetric measurements of epinephrine and norepinephrine as a method to measure secretion from single bovine adrenal medullary cells.</a> Analytical Chemistry. 66 (24), 4532-4537 (1994).</li>
<li>Jaffe, E. H., Marty, A., Schulte, A., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrasynaptic+vesicular+transmitter+release+from+the+somata+of+substantia+nigra+neurons+in+rat+midbrain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Extrasynaptic vesicular transmitter release from the somata of substantia nigra neurons in rat midbrain slices.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (10), 3548-3553 (1998).</li>
<li>Walsh, P. L., Petrovic, J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+splanchnic+nerve+and+chromaffin+cell+stimulation+in+mouse+adrenal+slices+with+fast-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Distinguishing splanchnic nerve and chromaffin cell stimulation in mouse adrenal slices with fast-scan cyclic voltammetry.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 49-57 (2011).</li>
<li>Wolfe, J. T., Wang, H., Perez-Reyes, E., Barrett, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+recombinant+Ca%28v%293.2%2C+T-type%2C+Ca%282%2B%29+channel+currents+by+CaMKIIgamma%28C%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stimulation of recombinant Ca(v)3.2, T-type, Ca(2+) channel currents by CaMKIIgamma(C).</a> The Journal of Physiology. 538, 343-355 (2002).</li>
<li>Chan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+in+vivo+detection+of+myocardial+norepinephrine+levels+in+the+beating+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fast in vivo detection of myocardial norepinephrine levels in the beating porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), 1091-1099 (2020).</li>
<li>Chow, R. H., von Rüden, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChow%2C+RH+%22Single-Channel+Recording%2C+Second+Edition%22">Single-Channel Recording, Second Edition</a>. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 245-275 (1995).</li>
<li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile%2C+high+efficiency+immobilization+of+lipase+enzyme+on+magnetic+iron+oxide+nanoparticles+via+a+biomimetic+coating%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Facile, high efficiency immobilization of lipase enzyme on magnetic iron oxide nanoparticles via a biomimetic coating.</a> BMC Biotechnology. 11, 63(2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktów interesów, finansowych lub innych.

Niniejszy protokół opisuje produkcję i testowanie pojemnościowej sondy immunologicznej (sondy CI) zdolnej do wykrywania i pomiaru biomarkerów będących przedmiotem zainteresowania zarówno w warunkach in vitro , jak i in vivo . Detekcja odbywa się poprzez uwięzienie biomarkera na końcówce elektrody. Zdarzenie pułapki zmienia połączenie pojemnościowe między pojemnościową sondą immunologiczną z drutu platynowego a otaczającym środowiskiem płynu przewodzącego, mierzone jako zmiana prądu ładunku w odpowiedzi ...

Kilka metod chemicznych do wykrywania i ilościowego oznaczania biomarkerów jest rutynowo stosowanych zarówno w chemii białek, jak i w diagnostyce klinicznej, szczególnie w diagnozowaniu raka i ocenie postępu chorób sercowo-naczyniowych. Obecnie metody takie jak wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC), test immunoenzymatyczny (ELISA) i spektrometria mas polegają na pobieraniu próbek z przedziału naczyniowego1,2,3 poprzez pobieranie płynu luzem lub kompartment śródmiąższowy za pomocą mikrodializy. Mikrodializa wykorzystuje półprzepuszczalną rurkę membranową o znanej długości, którą umieszcza się w obszarze zainteresowania. Płyn zbierający jest przetłaczany przez rurkę przez kilka minut4 w celu pobrania próbki do analizy5, ograniczając w ten sposób rozdzielczość czasową. W ten sposób pobrane próbki zapewniają jedynie uśrednioną w czasie wartość lokalnego mikrośrodowiska i są ograniczone szybkością perfuzji i pobraniem wystarczającej objętości próbki. Ponadto metody te wymagają łączenia danych doświadczalnych i uśredniania sygnałów; W związku z tym mogą nie uwzględniać zmienności między przedmiotami. Co ważne, czas między pobraniem próbki a późniejszą analizą offline wyklucza natychmiastową interwencję kliniczną i terapię.
W niniejszym protokole opisano użycie pojemnościowego biosensora immunosondy (sondy CI) do czasowo rozdzielczego wykrywania elektrycznego określonych peptydów bioaktywnych. Neuropeptyd Y (NPY), uwalniany z pozazwojowych neuronów współczulnych, które unerwiają naczynia krwionośne, wsierdzie, kardiomiocyty i zwoje wewnątrzsercowe, jest głównym neuromodulującym przekaźnikiem peptydów w układzie sercowo-naczyniowym6,7,8,9. Przedstawiona tutaj metoda ma na celu pomiar NPY, a eksperymentalna wykonalność została zademonstrowana na modelu serca świni. Jednak podejście to ma zastosowanie do każdego bioaktywnego peptydu, dla którego dostępne jest selektywne przeciwciało10. Ta metoda opiera się na pojemnościowym połączeniu między sondą z drutu platynowego a płynem przewodzącym w funkcjonalizowanym tip11,12. W tym zastosowaniu interakcja była pośredniczona przez przeciwciało przeciwko docelowemu neuropeptydowi (NPY), które było związane z końcówką elektrody, łącząc się ze środowiskiem płynu przewodzącego. Funkcjonalizację tę osiągnięto poprzez elektroosadzanie reaktywnej polidopaminy na końcówce sondy z drutu platynowego10,13.
Gdy sonda funkcjonalizowana przeciwciałami jest umieszczona w obszarze zainteresowania in vivo, wywołane endogenne uwalnianie NPY prowadzi do wiązania się z przeciwciałami pułapkującymi na końcówce sondy, a płyn przewodzący na powierzchni elektrody jest wypierany przez białko NPY. Lokalne zmiany w środowisku elektrycznym powodują przemieszczenie płynu o wysokiej mobilności i wysokim dielektryku z nieruchomą, naładowaną statycznie cząsteczką. Zmienia to granicę faz elektroda-płyn, a tym samym jej pojemność, która jest mierzona jako zmiana prądu ładowania w odpowiedzi na potencjał dowodzenia funkcji krokowej. Ujemny potencjał "resetowania" jest wykorzystywany natychmiast po każdym indywidualnym cyklu pomiarowym, aby odeprzeć związany NPY od przeciwciała poprzez oddziaływanie elektrostatyczne, usuwając w ten sposób miejsca wiązania przeciwciał dla kolejnych rund pomiaru10. Pozwala to na efektywny pomiar NPY w sposób czasowo-rozdzielczy. Unikalna technika implantu ślimakowego pokonuje ograniczenia opisanych powyżej metod immunochemicznych opartych na mikrodializie w celu pomiaru dynamicznych poziomów biomarkerów z pojedynczego eksperymentu bez łączenia danych lub uśredniania sygnałów w kilku eksperymentach9, dostarczając dane w czasie zbliżonym do rzeczywistego. Co więcej, możliwość dostosowania tej metody do dowolnego biomarkera będącego przedmiotem zainteresowania, dla którego istnieje odpowiednie przeciwciało w skali czasowo rozdzielczej i zlokalizowanej, stanowi duży postęp techniczny w pomiarach immunochemicznych do oceny postępu choroby i kierowania interwencjami terapeutycznymi.
Oprogramowanie do akwizycji i analizy danych zostało napisane na zamówienie w IGOR Pro (w pełni interaktywne środowisko oprogramowania). System przetwornika analogowo-cyfrowego (A/D) emitował napięcie sterujące pod kontrolą komputera i pobierał dane z niestandardowego wzmacniacza. Wzmacniacz posiadał pewne unikalne cechy. Obejmowały one rezystor sprzężenia zwrotnego (przełączany) dla każdego z czterech kanałów akwizycji, co pozwalało na wybór obwodów cęgowych napięcia sprzężenia zwrotnego 1 MOhm lub 10 MOhm w celu zintegrowania zmienności elektrody. Zbudowano również jednostkę stopniową z pojedynczą głowicą i wzajemnym obwodem uziemiającym/referencyjnym dla wszystkich czterech kanałów akwizycji, aby umieścić urządzenie w pobliżu skrzyni w jednym module fizycznym. Do zebrania wszystkich raportowanych danych użyto ustawienia rezystora sprzężenia zwrotnego 1 MOhm.
Ustawienia filtra i wzmocnienia zostały przesłane telegraficznie ze wzmacniacza i zapisane w pliku danych. Dane były filtrowane z częstotliwością 1 kHz za pomocą 2-biegunowego analogowego filtra Bessela zdigitalizowanego z częstotliwością 10 kHz. Różnica potencjałów między sondą a otaczającym ją roztworem przewodzącym tworzy warstwę pojemnościową Helmholtza na końcówce sondy. Wiązanie liganda z przeciwciałem na końcówce sondy powoduje zmianę ładunku lokalnego, a tym samym zmianę pojemności Helmholtza. Ta zmiana w składowej pojemnościowej obwodu powoduje przesunięcie wielkości wstrzykiwanego ładunku wymaganego do doprowadzenia sondy do potencjału w protokole napięcia z funkcją krokową. W ten sposób wiązanie określonego liganda z funkcjonalizowaną sondą powoduje zmianę pomiaru pojemności elektrody jako zmianę szczytowego prądu pojemnościowego.

<table><tbody><tr><td>Elektroda dyskowa AgCl</td><td>Warner Instruments (Holliston, MA)</td><td>64-1307</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne anty-NPY</td><td>Abcam, (Cambridge, MA)</td><td>ab112473</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowy wzmacniacz wielokanałowy / 1 Rezystor sprzężenia zwrotnego M&Omega; wielokanałowy stopień główny</td><td>NPI Electronic, (Tamm, Niemcy)</td><td>NA</td><td>Oparty na NPI VA-10M wzmacniacz wielokanałowy</td></tr><tr><td>Dopamina HCl</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>H8502-10G</td><td></td></tr><tr><td>Pozłacane złącze męskie pin</td><td>AMP-TE Connectivity (Amplimite)</td><td>6-66506-1</td><td></td></tr><tr><td>HEKA LIH 8 + 8 urządzenie analogowo-cyfrowe/cyfrowo-analogowe</td><td>HEKA Elektronik, (Holliston, MA)</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji danych Igor Pro, v. 7.08</td><td>WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)</td><td></td><td>Oprogramowanie sterujące potencjałem poleceń i akwizycją danych zostało napisane na zamówienie</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Standard Cyfrowa pompa perystaltyczna</td><td>Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drut platynowy powlekany PFA</td><td>A-M Systems, (Sequim, WA)</td><td>773000</td><td>0,005" średnica goła, 0,008" średnica powłoki</td></tr><tr><td>Elastomer silikonowy</td><td>World Precision Instruments (Sarasota, Floryda)</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>Syntetyczny peptyd NPY z trzody chlewnej</td><td>Bachem (Torrance, Kalifornia)</td><td></td><td></td>4011654</tr><tr><td>Syntetyczny świński peptyd NPY</td><td>Bachem (Torrance, Kalifornia)</td><td>4011654</td><td></td></tr></tbody></table>

czasowo-rozdzielczy pomiar dynamiki neuropeptydów in vivo za pomocą pojemnościowej immunosondy w sercu świni

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Możliwość pomiaru biomarkerów in vivo istotnych dla oceny postępu choroby jest bardzo interesująca dla społeczności naukowych i medycznych. Uzyskanie rozdzielczości wyników uzyskanych przy użyciu obecnych metod pomiaru niektórych biomarkerów może zająć kilka dni lub tygodni, ponieważ mogą one mieć ograniczoną rozdzielczość zarówno przestrzennie, jak i czasowo (np. mikrodializa płynu w komenbulencie śródmiąższowym analizowana za pomocą testu immunoenzymatycznego [ELISA], wysokosprawna chromatografia cieczowa [HPLC] lub spektrometria mas); W ten sposób ich wskazówki dotyczące szybkiej diagnozy i leczenia są zakłócone. W niniejszym badaniu przedstawiono unikalną technikę wykrywania i pomiaru przekaźników peptydowych in vivo za pomocą pojemnościowego bioczujnika immunosondy (sondy CI). Opisano protokół wytwarzania i charakterystykę in vitro tych sond. Przedstawiono pomiary uwalniania neuropeptydu Y (NPY) wywołanego stymulacją współczulną in vivo. Uwalnianie NPY jest skorelowane ze współczulnym uwalnianiem noradrenaliny dla porównania. Dane demonstrują podejście do szybkiego i lokalnego pomiaru neuropeptydów in vivo. Przyszłe zastosowania obejmują śródoperacyjną ocenę postępu choroby w czasie rzeczywistym oraz minimalnie inwazyjne wdrażanie tych sond za pomocą cewników.

Wytwarzanie i charakterystyka elektrod 
Wytworzono elastyczną pojemnościową immunosondę (sondy CI), a reprezentatywny obraz przedstawiono w Rycina 1APotencjał elektrody był ustawiany przez sterowany komputerowo układ clampowy (voltage clamp) (Rysunek 1B), a następnie elektrodę zanurzono w roztworze polidopaminy przygotowanym w PBS. Polidopaminę naniesiono elektrochemicznie na przewodzącą końcówkę elektrody13 do funkcjo...

Uznane metody immunochemiczne do pomiaru przekaźników peptydowych in vivo polegają na mikrodializie lub masowym pobieraniu płynów w celu uzyskania próbki do analizy offline. Cierpią one jednak z powodu ograniczeń czasoprzestrzennych. Niniejszy protokół opisuje wytwarzanie i zastosowanie pojemnościowego bioczujnika immunosondy, który pokonuje ograniczenia istniejących technik.

Czasowo-rozdzielczy pomiar dynamiki neuropeptydów in vivo za pomocą pojemnościowej immunosondy w sercu świni

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

Po raz pierwszy opracowano metodę pomiaru czasowo-rozdzielczego poziomów przekaźników peptydowych in vivo. Możemy mierzyć poziomy przekaźników peptydów w pojedynczych obiektach i dyskretnych lokalizacjach za pomocą analizy w czasie zbliżonym do rzeczywistego. Najpierw wytnij 25-centymetrowy drut platynowy pokryty perfluoroalkoksy.Następnie za pomocą skalpela usuń około pięciu milimetrów powłoki perfluoroalkoksylowej z jednego końca, uważając, aby nie przeciąć drutu platynowego. Teraz włóż odizolowany koniec platynowego przewodu do pozłacanego, jednomilimetrowego styku złącza męskiego. Następnie za pomocą szczypiec z wąskimi końcówkami zaciśnij zęby kołka złącza wokół odizolowanego końca przewodu platynowego i przewód platynowy do pozłacanego styku złącza.Następnie przygotuj roztwór dopaminy, dodając 50 miligramów chlorowodorku dopaminy do 50 mililitrów 10-milimolowego PBS o pH 6 i wymieszaj, mieszając. Po całkowitym rozpuszczeniu dopaminy umieść końcówkę drutu platynowego w naczyniu zawierającym świeżo przygotowany PBS uzupełniony dopaminą. Podłącz elektrodę krążkową chlorku srebra do kanału uziemiającego w stopniu głównym.Następnie umieść krążek chlorku srebra w naczyniu zawierającym PBS uzupełniony dopaminą i drut platynowy. Przed kontynuowaniem podłącz bocznik przewodu do kanałów odniesienia stopnia głównego. Otwórz interaktywne oprogramowanie do akwizycji danych i ustaw protokół potencjału dowodzenia elektroosadzania piłokształtnego, ustawiając potencjał początkowy na minus 0,6 wolta, potencjał końcowy na 0,65 wolta, szybkość skanowania na 0,04 wolta na sekundę i czas trwania osadzania na 420 sekund.Po zakończeniu osadzania polidopaminy usuń zmielony granulat chlorku srebra i końcówkę drutu platynowego z naczynia. Umieść końcówkę drutu w mikroprobówce zawierającej PBS o pH 7,4 na dwie do pięciu minut i upewnij się, że końcówka drutu nie styka się z bokami ani dnem mikrorurki. Następnie przygotuj roztwór przeciwciała, łącząc badane przeciwciało z PBS o pH 7,4 w stosunku 1:20 w naczyniu o odpowiedniej wielkości.Następnie zanurz zdeponowaną polidopaminę końcówkę elektrody platynowej w roztworze przeciwciała na dwie godziny w temperaturze pokojowej, upewniając się, że końcówka z drutu platynowego jest zawieszona w roztworze i nie spoczywa na wewnętrznej powierzchni mikroprobówki. Umieść funkcjonalną końcówkę pojemnościowej immunosondy w komorze przepływowej, uważając, aby w żaden sposób nie naruszyć końcówki elektrody, ponieważ może to spowodować uszkodzenie końcówki sensorycznej sondy. Przed pierwszym testem eksperymentalnym wykonaj standardowy przebieg TBS, aby skonfigurować pojemnościową sondę immunologiczną, a dla protokołu napięcia ustaw dodatni potencjał kroku na 110 miliwoltów, ujemny potencjał krokowy na minus pięć miliwoltów, czas trwania kroku 20 milisekund, a czas akwizycji na 600 sekund.Następnie utwórz interesujący nas roztwór peptydu, używając tego samego TBS, aby utrzymać skład superfusatu. Skonfiguruj system kolektora, w którym superfusat może być przełączany między TBS a TBS uzupełnionym peptydami. Użyj standardowych parametrów TBS i skonfiguruj protokół akwizycji danych wykrywania peptydów, ustawiając czas akwizycji na 360 sekund.Przed osadzaniem polidopaminy należy przewlec odsłoniętą końcówkę elektrody z drutu platynowego przez igłę podskórną o rozmiarze 22, pozostawiając około dwóch milimetrów poza końcówką igły. Użyj kleszczyków i delikatnie zegnij końcówkę elektrody z drutu platynowego, aby utworzyć zadzior, który zwisa z końca igły podskórnej. Delikatnie wyjmij igłę z kolczastej końcówki, pozostawiając wystarczającą ilość drutu do umieszczenia w naczyniu bez kontaktu igły z płynem i kontynuuj osadzanie dopaminy, jak pokazano wcześniej.Teraz przepłucz końcówkę sondy kolczastej PBS i umieść ją w roztworze przeciwciał. Następnie delikatnie wyjmij funkcjonalizowaną końcówkę z PBS. Przesuń igłę podskórną do kolczastej pojemnościowej sondy immunologicznej i delikatnie wszczep ją w obszarze zainteresowania przed podłączeniem złotego styku złącza do stopnia głównego.Po wszczepieniu należy wyjąć igłę podskórną, pozostawiając elektrodę na miejscu. Dodatni krok w potencjale dowodzenia mierzy prąd wtrysku wymagany do zaciśnięcia napięcia sondy i umożliwia pomiar prądu pojemnościowego. Krok ujemnego potencjału dowodzenia usuwa związany peptyd z przeciwciała poprzez odpychanie elektrostatyczne.Przebieg polecenia funkcji krokowej przedstawiał iteracyjne wykrywanie i kwantyfikację peptydu w czasie rozdzielczym. Dolna ścieżka reprezentowała potencjał dowodzenia i wynikający z niego prąd pod wpływem superfuzji sondy w TBS. Zrównoważona pojemnościowa immunosonda wykazała mniejszy początkowy rozpad i stabilną linię bazową przez sześć minut.Przepływ neuropeptydu Y do komory przepływowej zwiększył prądy pojemnościowe w stosunku do linii podstawowej. Pojemnościowe prądy immunosondy mierzone za pomocą sondy funkcjonalizowanej przeciwciałem neuropeptydu Y wykazały sygnał zależny od stężenia, wrażliwy na neuropeptyd Y o niskiej zawartości pikomolu W celu kalibracji zmierzono krzywą wzorcową dla wszystkich badanych stężeń. Stymulacja obustronnego zwoju gwiaździstego wykazała podwyższony poziom neuropeptydu Y, gdy była współkreślona z prądami pojemnościowymi kontroli negatywnej.Uwalnianie noradrenaliny mierzone pod stymulacją gwiaździstą wykazało synchroniczne uwalnianie z neuropeptydem Y, zgodne z wywołaną odpowiedzią współczulną. Opracowanie tych technik może dostarczyć śródoperacyjnych odczytów kluczowych modulatorów czynności serca, zapewniając w ten sposób potencjalne szybkie wskazówki terapeutyczne lub interwencyjne. Przedstawiona tutaj technika jest specyficzna dla układu sercowo-naczyniowego, jednak sama technika jest odpowiednia dla innych ustawień fizjologicznych, takich jak mocz, mięśnie szkieletowe, nerki, tkanka tłuszczowa i tak dalej.

time-resolved-vivo-measurement-neuropeptide-dynamics-capacitive

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film demonstruje metodę wykrywania i ilościowego oznaczania przekaźników peptydowych za pomocą pojemnościowego biosensora immunosondy. Funkcjonalizowana elektroda, pokryta przeciwciałami, oddziałuje z peptydami będącymi przedmiotem zainteresowania, prowadząc do zmiany sygnału, która umożliwia precyzyjny pomiar i wykrywanie peptydów.

Wykrywanie i pomiar peptydów docelowych za pomocą pojemnościowego biosensora immunoprobe

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół i sprzęt niezbędny do podwójnego optycznego mapowania potencjału transbłonowego (Vm) i wolnej retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego (SR) Ca2+ w sercu królika z perfundacją Langendorffa. Metoda ta pozwala na bezpośrednią obserwację i kwantyfikację dynamiki Vm i SR Ca2+ w nienaruszonym sercu.

Mapowanie optyczne retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego Ca2+ i potencjału transbłonowego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa

W sercu, zdarzenia molekularne koordynują funkcję elektryczną i kurczliwą narządu. Zaprezentowany tu zestaw technik mikroskopii fluorescencyjnej pola lokalnego umożliwia rejestrację zmiennych komórkowych w nienaruszonych sercach. Identyfikacja mechanizmów definiujących czynność serca ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, jak serce działa w sytuacjach patologicznych.

Mikroskopia fluorescencyjna w polu lokalnym: obrazowanie sygnałów komórkowych w nienaruszonych sercach

Tutaj prezentujemy protokół modulacji wewnątrzsercowego autonomicznego układu nerwowego i oceny jego wpływu na podstawową elektrofizjologię, arytmogenezę i dynamikę cAMP przy użyciu układu Langendorffa ex vivo.

Wpływ neuronów wewnątrzsercowych na elektrofizjologię serca i arytmogenezę w układzie Langendorffa ex vivo

Ten artykuł zawiera zestaw protokołów do rozwoju ludzkich sieci indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CM) hodowanych na wielodołkowych płytkach MEA w celu odwracalnego elektroportowania błony komórkowej do pomiarów potencjału czynnościowego. Nagrania o wysokiej przepustowości są uzyskiwane z tych samych lokalizacji komórkowych wielokrotnie przez kilka dni.

Sieci kardiomiocytów pochodzące z ludzkich iPSC na wielodołkowych układach mikroelektrod do powtarzalnych zapisów potencjału czynnościowego

Celem tego badania było ustalenie metody badania dynamiki serca za pomocą translacyjnego modelu zwierzęcego. Opisane podejście eksperymentalne obejmuje optokardiografię podwójnej emisji w połączeniu z badaniem elektrofizjologicznym w celu oceny aktywności elektrycznej w izolowanym, nienaruszonym modelu serca świni.

Badania optokardiograficzne i elektrofizjologiczne serca perfundowanego ex vivo Langendorffem

Opisujemy protokoły oceny stopnia transdukcji przez peptydy penetrujące komórki, wykorzystując systemy obrazowania ex vivo, a następnie zatapianie parafiny, cięcie i konfokalną mikroskopię fluorescencyjną na przykładzie peptydu celującego w serce. W naszym protokole pojedyncze zwierzę może być wykorzystane do uzyskania obu rodzajów oceny obrazowej tych samych narządów, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt potrzebnych do badań o połowę.

Obrazowanie in vivo skuteczności transdukcji peptydu ukierunkowanego na serce

Ten protokół ma na celu opisanie nowej metodologii pomiaru wewnętrznej szybkości wypalania serca za pomocą rejestracji matrycy mikroelektrod całej tkanki węzła zatokowo-przedsionkowego w celu identyfikacji wad rozrusznika serca u myszy. W tej metodzie można również wprowadzić środki farmakologiczne, aby zbadać ich wpływ na wewnętrzne rozruszniki serca.

Rejestracja szybkości wypalania węzłów zatokowo-przedsionkowych za pomocą matrycy mikroelektrod w celu identyfikacji wewnętrznych wad rozrusznika serca u myszy

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) okazały się obiecującym modelem in vitro do badań przesiewowych kardiotoksyczności indukowanej lekami i modelowania chorób. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru kurczliwości i elektrofizjologii hiPSC-CM.

Techniczne zastosowania nagrań matrycy mikroelektrod i patch clamp na indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Protokół ten przedstawia zaawansowane metody wytwarzania materiałów i ex vivo badania serca szczurów do optycznego i elektrycznego dwukierunkowego biointerfejsu, umożliwiając precyzyjną stymulację serca, rejestrację i modelowanie zawału na potrzeby badań bioelektronicznych.

Dwukierunkowe interfejsy elektryczne i optoelektroniczne w zdrowych i niedokrwionych sercach szczurów ex vivo

Poznaj metodę czasowo-rozdzielczego pomiaru poziomów peptydowych przekaźników in vivo za pomocą pojemnościowej immunosondy w sercu świni. Ta technika umożliwia analizę niemal w czasie rzeczywistym w pojedynczych osobnikach.

Czasowo-rozdzielczy pomiar dynamiki neuropeptydów in vivo za pomocą pojemnościowej immunosondy w sercu świni

Przeglądaj więcej filmów