Czasowo-rozdzielczy pomiar dynamiki neuropeptydów in vivo za pomocą pojemnościowej immunosondy w sercu świni

Po raz pierwszy opracowano metodę pomiaru czasowo-rozdzielczego poziomów przekaźników peptydowych in vivo. Możemy mierzyć poziomy przekaźników peptydów w pojedynczych obiektach i dyskretnych lokalizacjach za pomocą analizy w czasie zbliżonym do rzeczywistego. Najpierw wytnij 25-centymetrowy drut platynowy pokryty perfluoroalkoksy.

Następnie za pomocą skalpela usuń około pięciu milimetrów powłoki perfluoroalkoksylowej z jednego końca, uważając, aby nie przeciąć drutu platynowego. Teraz włóż odizolowany koniec platynowego przewodu do pozłacanego, jednomilimetrowego styku złącza męskiego. Następnie za pomocą szczypiec z wąskimi końcówkami zaciśnij zęby kołka złącza wokół odizolowanego końca przewodu platynowego i przewód platynowy do pozłacanego styku złącza.

Następnie przygotuj roztwór dopaminy, dodając 50 miligramów chlorowodorku dopaminy do 50 mililitrów 10-milimolowego PBS o pH 6 i wymieszaj, mieszając. Po całkowitym rozpuszczeniu dopaminy umieść końcówkę drutu platynowego w naczyniu zawierającym świeżo przygotowany PBS uzupełniony dopaminą. Podłącz elektrodę krążkową chlorku srebra do kanału uziemiającego w stopniu głównym.

Następnie umieść krążek chlorku srebra w naczyniu zawierającym PBS uzupełniony dopaminą i drut platynowy. Przed kontynuowaniem podłącz bocznik przewodu do kanałów odniesienia stopnia głównego. Otwórz interaktywne oprogramowanie do akwizycji danych i ustaw protokół potencjału dowodzenia elektroosadzania piłokształtnego, ustawiając potencjał początkowy na minus 0,6 wolta, potencjał końcowy na 0,65 wolta, szybkość skanowania na 0,04 wolta na sekundę i czas trwania osadzania na 420 sekund.

Po zakończeniu osadzania polidopaminy usuń zmielony granulat chlorku srebra i końcówkę drutu platynowego z naczynia. Umieść końcówkę drutu w mikroprobówce zawierającej PBS o pH 7,4 na dwie do pięciu minut i upewnij się, że końcówka drutu nie styka się z bokami ani dnem mikrorurki. Następnie przygotuj roztwór przeciwciała, łącząc badane przeciwciało z PBS o pH 7,4 w stosunku 1:20 w naczyniu o odpowiedniej wielkości.

Następnie zanurz zdeponowaną polidopaminę końcówkę elektrody platynowej w roztworze przeciwciała na dwie godziny w temperaturze pokojowej, upewniając się, że końcówka z drutu platynowego jest zawieszona w roztworze i nie spoczywa na wewnętrznej powierzchni mikroprobówki. Umieść funkcjonalną końcówkę pojemnościowej immunosondy w komorze przepływowej, uważając, aby w żaden sposób nie naruszyć końcówki elektrody, ponieważ może to spowodować uszkodzenie końcówki sensorycznej sondy. Przed pierwszym testem eksperymentalnym wykonaj standardowy przebieg TBS, aby skonfigurować pojemnościową sondę immunologiczną, a dla protokołu napięcia ustaw dodatni potencjał kroku na 110 miliwoltów, ujemny potencjał krokowy na minus pięć miliwoltów, czas trwania kroku 20 milisekund, a czas akwizycji na 600 sekund.

Następnie utwórz interesujący nas roztwór peptydu, używając tego samego TBS, aby utrzymać skład superfusatu. Skonfiguruj system kolektora, w którym superfusat może być przełączany między TBS a TBS uzupełnionym peptydami. Użyj standardowych parametrów TBS i skonfiguruj protokół akwizycji danych wykrywania peptydów, ustawiając czas akwizycji na 360 sekund.

Przed osadzaniem polidopaminy należy przewlec odsłoniętą końcówkę elektrody z drutu platynowego przez igłę podskórną o rozmiarze 22, pozostawiając około dwóch milimetrów poza końcówką igły. Użyj kleszczyków i delikatnie zegnij końcówkę elektrody z drutu platynowego, aby utworzyć zadzior, który zwisa z końca igły podskórnej. Delikatnie wyjmij igłę z kolczastej końcówki, pozostawiając wystarczającą ilość drutu do umieszczenia w naczyniu bez kontaktu igły z płynem i kontynuuj osadzanie dopaminy, jak pokazano wcześniej.

Teraz przepłucz końcówkę sondy kolczastej PBS i umieść ją w roztworze przeciwciał. Następnie delikatnie wyjmij funkcjonalizowaną końcówkę z PBS. Przesuń igłę podskórną do kolczastej pojemnościowej sondy immunologicznej i delikatnie wszczep ją w obszarze zainteresowania przed podłączeniem złotego styku złącza do stopnia głównego.

Po wszczepieniu należy wyjąć igłę podskórną, pozostawiając elektrodę na miejscu. Dodatni krok w potencjale dowodzenia mierzy prąd wtrysku wymagany do zaciśnięcia napięcia sondy i umożliwia pomiar prądu pojemnościowego. Krok ujemnego potencjału dowodzenia usuwa związany peptyd z przeciwciała poprzez odpychanie elektrostatyczne.

Przebieg polecenia funkcji krokowej przedstawiał iteracyjne wykrywanie i kwantyfikację peptydu w czasie rozdzielczym. Dolna ścieżka reprezentowała potencjał dowodzenia i wynikający z niego prąd pod wpływem superfuzji sondy w TBS. Zrównoważona pojemnościowa immunosonda wykazała mniejszy początkowy rozpad i stabilną linię bazową przez sześć minut.

Przepływ neuropeptydu Y do komory przepływowej zwiększył prądy pojemnościowe w stosunku do linii podstawowej. Pojemnościowe prądy immunosondy mierzone za pomocą sondy funkcjonalizowanej przeciwciałem neuropeptydu Y wykazały sygnał zależny od stężenia, wrażliwy na neuropeptyd Y o niskiej zawartości pikomolu W celu kalibracji zmierzono krzywą wzorcową dla wszystkich badanych stężeń. Stymulacja obustronnego zwoju gwiaździstego wykazała podwyższony poziom neuropeptydu Y, gdy była współkreślona z prądami pojemnościowymi kontroli negatywnej.

Uwalnianie noradrenaliny mierzone pod stymulacją gwiaździstą wykazało synchroniczne uwalnianie z neuropeptydem Y, zgodne z wywołaną odpowiedzią współczulną. Opracowanie tych technik może dostarczyć śródoperacyjnych odczytów kluczowych modulatorów czynności serca, zapewniając w ten sposób potencjalne szybkie wskazówki terapeutyczne lub interwencyjne. Przedstawiona tutaj technika jest specyficzna dla układu sercowo-naczyniowego, jednak sama technika jest odpowiednia dla innych ustawień fizjologicznych, takich jak mocz, mięśnie szkieletowe, nerki, tkanka tłuszczowa i tak dalej.