Określanie powinowactwa wiązania (K_D) przeciwciał znakowanych radioaktywnie do unieruchomionych antygenów

Metoda ta może określić powinowactwo wiązania znakowanego radioaktywnie przeciwciała do jego antygenu. Będzie również mierzył specyfikę wiązania. Główną zaletą tej prostej metody jest specyficzna charakterystyka powinowactwa wiązania tylko przeciwciała znakowanego radioaktywnie bez ingerencji ze strony niesprzężonego przeciwciała rodzicielskiego.

Technika ta ilościowo potwierdza zdolność znakowanego radioaktywnie przeciwciała do wiązania się z celem. Jest to ważne dla zastosowań w obrazowaniu jądrowym i terapii nuklearnej w różnych chorobach. Procedurę zademonstruje Erika Belitzky, adiunkt z mojego laboratorium.

Na początek przygotuj bufor immobilizacyjny, dodając 191 miligramów wodorowęglanu sodu i 23,9 miligramów węglanu sodu do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Następnie dodaj 40 mililitrów wody o mocy 18 megaomów i rozpuść przez wirowanie. Teraz dostosuj pH do 9,0, zanim zwiększysz całkowitą objętość do 50 mililitrów.

Następnie przygotuj 200 mililitrów buforu do mycia, dodając 200 mililitrów PBS i 100 mikrolitrów Tween 20 do 250-mililitrowej butelki. Przygotuj również 50 mililitrów buforu wiążącego, dodając 50 miligramów BSA i 25 mikrolitrów Tween 20 do 50 mililitrów PBS i wymieszaj przez wirowanie. Dodaj 1,5 grama BSA do 50 mililitrów PBS, aby przygotować bufor blokujący i delikatnie zmieszaj.

Rozcieńczyć antygen w buforze immobilizacyjnym. Następnie weź łamliwą, 96-dołkową płytkę z płaskim dnem i dodaj 100 mikrolitrów antygenu na dno każdej studzienki z 24 dołkami w układzie osiem na trzy. Przykryj płytkę taśmą uszczelniającą i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia umyj płytkę trzykrotnie buforem myjącym. Energicznie odwróć talerz w zlewie, aby pozbyć się płynu i postukaj talerzem o stos ręczników papierowych, aby usunąć nadmiar płynu. Następnie do studzienek zawierających antygen dodać 300 mikrolitrów buforu płuczącego na studzienkę za pomocą pipety wielokanałowej.

Dodaj 300 mikrolitrów buforu blokującego na studzienkę do obu studzienek pokrytych 24-antygenem i 24 pustych dołków 96-dołkowej płytki. Następnie inkubować płytkę przez godzinę w temperaturze otoczenia i trzykrotnie przemyć każdą studzienkę płytki 300 mikrolitrami buforu do mycia. Wykonać trzykrotne seryjne rozcieńczenia znakowanego radioizotopem przeciwciała w buforze wiążącym dla ośmiu rzędów oznaczonych na płytce jako od A do H.

Najpierw oblicz objętość podstawowego przeciwciała znakowanego radioaktywnie potrzebną do wytworzenia 1,2-mililitrowego roztworu o pierwszym stężeniu. Następnie dodać 800 mikrolitrów buforu wiążącego do probówek mikrowirówek oznaczonych od B do H i dodać wymaganą objętość buforu wiążącego do probówki mikrowirówki oznaczonej A. Dodaj obliczoną objętość podstawowego przeciwciała znakowanego radioaktywnie do probówki A i delikatnie odwirować. Następnie odwiruj za pomocą mini-mikrowirówki, aby zebrać cały płyn na dnie probówki.

Następnie dodaj 400 mikrolitrów płynu z dwóch A do probówki B. Po wirowaniu odwiruj go za pomocą mini-mikrowirówki. Podobnie, dodać roztwór z probówki B do probówki C, C do D, aż do probówki H. Dodać 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na studzienkę do trzech studzienek unieruchomionych antygenem i trzech studzienek zablokowanych tylko BSA. Teraz dodaj 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia do probówek do mikrowirówek oznaczonych wzorcem A do wzorca H i zachowaj te probówki jako znakowane radioaktywnie wzorce przeciwciał do oznaczenia w liczniku gamma.

Inkubuj płytkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie kołysząc. Oznaczyć probówki do mikrowirówek dla każdej studzienki, zgodnie z opisem w manuskrypcie. Odessać znakowane radioizotopowo przeciwciało z dołków 96-dołkowej płytki za pomocą aspiratora próżniowego.

Teraz za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 300 mikrolitrów buforu myjącego do każdej studzienki. Zassać bufor płuczący i powtórzyć mycie jeszcze cztery razy. Rozbij studzienki na odpowiednie probówki do mikrowirówek.

Policz radioaktywność w probówkach z antygenem oznaczonym jako H1, H2, H3, H3 do A1, A2, A3, a następnie tylko z BSA oznaczonym jako H4, H5, H6, do A4, A5, A6 za pomocą licznika gamma. Znakowany radioizotopowo amiwantamab wykazywał specyficzne wiązanie z białkami EGFR i cMET. Podobnie powinowactwo wiązania zostało również zachowane przez jednoramienne znakowane radioaktywnie fab związane z białkami EGFR i cMET.

Wykresy wiązania nasycenia wykazały, że gdy stężenia przeciwciał znakowanych radioaktywnie były zbyt niskie, nasycenie nie zostało osiągnięte, na co wskazuje krzywa liniowa. Stężenia przeciwciał znakowanych radioaktywnie, które były zbyt wysokie, prowadziły do saturacji bez wyraźnego wzrostu logarytmicznego, jak pokazuje plateau poziome. Zaobserwowano również silne niespecyficzne wiązanie ze względu na wysokie stężenia przeciwciał znakowanych radioaktywnie.

Procedura ta może wymagać wielu prób optymalizacji zakresu stężeń dla każdego specyficznego przeciwciała znakowanego radioaktywnie. Wykorzystaj dane z negatywnych wyników, aby pomóc w projektowaniu przyszłych eksperymentów. Gdy powinowactwo do wiązania jest znane, można je wykorzystać jako punkt odniesienia dla innych testów in vitro w ramach charakterystyki przeciwciała znakowanego radioaktywnie.