Przygotowanie próbki do szybkiej analizy lipidów w mózgu Drosophila przy użyciu obrazowania metodą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą
14 lipca 2022
Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych wskazówek dotyczących prawidłowego przygotowania próbki do analizy lipidów i metabolitów w małych tkankach, takich jak mózg Drosophila, przy użyciu wspomaganej matrycą laserowej desorpcji/jonizacji (MALDI) obrazowania spektrometrii mas
.Obrazowanie spektrometryczne Maldi MS jest uznanym i użytecznym narzędziem do identyfikacji i wizualizacji obfitości i dystrybucji lipidów, bez nadmiernej modyfikacji próbki. Główną zaletą obrazowania Maldi jest jego zdolność do wykrywania lipidów in situ bez znakowania i jednoczesnej analizy dużej populacji próbek. Praktyka czyni mistrza.
Upewnij się, że dobrze ćwiczysz przed przetworzeniem prawdziwych próbek eksperymentalnych. Zminimalizuj czas przygotowania próbki i unikaj zanieczyszczenia podczas całej procedury. Na początek dodaj optymalną temperaturę cięcia lub OCT do plastikowej formy kriogenicznej do połowy głębokości formy kriogenicznej, unikając tworzenia się pęcherzyków.
Pozostaw formę na płaskiej powierzchni na kilka minut, a następnie przenieś ją na suchy lód. Trzymaj kriomaler płasko na suchym lodzie i pozwól, aby OCT utworzył płaską i równą powierzchnię. Poczekaj, aż OCT całkowicie zestali się w formie.
Zamrożone etapy OCT należy natychmiast zużyć lub przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po znieczuleniu dorosłych much Za pomocą dwutlenku węgla przygotuj szalkę Petriego zawierającą kawałek chusteczki laboratoryjnej. Użyj wody, aby zwilżyć część chusteczki, aby zmniejszyć elektryczność statyczną.
Utrzymuj chusteczkę w połowie mokrą i w połowie suchą. Po przecięciu głowicy muchy pod lunetą sekcyjną, zbierz od czterech do pięciu głów i połóż je na suchym obszarze chusteczki laboratoryjnej. Weź etap OCT od suchego lodu do mikroskopu dwa.
Natychmiast przenieś głowice na etap OCT i szybko je ułożyj, co zajmuje około 30 do 60 sekund, aby uniknąć stopienia OCT. Pozostaw około jednego milimetra pustej przestrzeni wokół każdego mózgu muchy, aby zapewnić odpowiednie wsparcie ze strony OCT i od czterech do pięciu milimetrów pustej przestrzeni od krawędzi bloku, aby zapewnić odpowiednią przestrzeń do obsługi sekcji. Umieść stopień OCT z powrotem na suchym lodzie i pozostaw go na około trzy minuty, aby upewnić się, że stopień OCT pozostaje zamrożony i stały.
Po wyrównaniu wszystkich głowic muchowych pozostaw stopień OCT na suchym lodzie przez kolejne pięć do 10 minut. Przenieś stolik OCT z suchego lodu na płaską powierzchnię, a następnie szybko dodaj dużą ilość związku OCT, aby pokryć wszystkie próbki i wypełnić całą krioformę, co zajmuje około trzech sekund. Natychmiast przenieś kriomaler z powrotem do suchego lodu i zamroź cały blok OCT zawierający osadzone tkanki.
Pozostaw etap OCT na suchym lodzie przez kolejne pięć do 10 minut. Oznaczyć próbki na marginesie kriomoldu i przechowywać zamrożone próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu, gdy będą gotowe do podziału. Potwierdź stronę kodowaną ITO, testując przewodność szkiełek ITO za pomocą woltomierza ustawionego na rezystancję.
Zaznacz stronę z pomiarem oporu jako stronę, do której ma przylegać tkanka. Oznacz go i zawsze umieszczaj chusteczkę laboratoryjną na dnie szkiełka, aby uniknąć zanieczyszczenia szkiełka. Następnie pozwól tkankom zrównoważyć się w komorze kriostatu przez 30 do 45 minut.
Wyczyść kriostat, najlepiej 70% etanolem. Wytrzyj płytę rolki na scenie i wyjmij zużyte ostrza. Użyj dodatkowych czystych chusteczek, aby upewnić się, że etanol odparował i że wszystkie powierzchnie są suche przed rozpoczęciem cięcia.
Następnie dostosuj temperaturę głowicy próbki piasku w komorze kriostatu w zależności od rodzaju tkanki. Zamontuj tkankę na uchwycie próbki za pomocą OCT. Uważaj, aby użyć wystarczającej ilości OCT, aby zakryć podstawę bloku OCT i zamontuj blok tak płasko, jak to możliwe.
Umieść czyste ostrze na scenie i zablokuj je. W razie potrzeby ustaw głowicę próbki w kierunku stolika, aby uzyskać żądany kąt cięcia. Następnie rozpocznij cięcie w grubych sekcjach, aż zostanie znaleziony obszar zainteresowania.
Stale usuwaj dodatkowe elementy za pomocą wstępnie schłodzonego pędzla artystycznego, aby utrzymać scenę w czystości. W razie potrzeby nieznacznie dostosuj temperaturę komory i zmień grubość sekcji na 10 do 12 mikrometrów po osiągnięciu żądanego obszaru. Ostrożnie zbierz żądaną sekcję.
Weź szkiełko ITO o temperaturze pokojowej i umieść je nad sekcją. Delikatnie podejdź do sekcji i przyklej ją do szkiełka, nie pozostawiając śladów na stoliku kriostatu. Umieść szkiełko na boku w stojaku lub chusteczce laboratoryjnej na zewnątrz kriostatu między zbiorami wielu sekcji.
Jeśli pożądane jest porównanie różnych próbek z tej samej kohorty, umieść sekcje z wielu próbek na jednym szkiełku, aby można je było analizować jednocześnie w celu zminimalizowania różnic. W razie potrzeby rozdziel na dwie prowadnice, ponieważ uchwyt na tarczę Maldi może pomieścić dwie prowadnice w jednym biegu. Przenieś szkiełka w pojemniku próżniowym do osuszacza z osuszaczem jako dolną warstwą.
Prowadź szkiełka w próżni przez 30 do 60 minut, a następnie przystąp do osadzania matrycy. Użyj dwóch pięciu kwasów dihydroksybenzoesowych lub DHB w wodzie metanolowej jako matrycy. Umieść szkiełka w transporterze szkiełek i bezpiecznie uszczelnij otwór folią woskową.
Uszczelnij za pomocą torby na suwak. Umieść go w innej torbie strunowej zawierającej środek osuszający. Oznacz zewnętrzną stronę i wyślij próbkę do głównych zakładów Maldi z odpowiednim suchym okiem.
Do osadzania matrycy należy użyć 40 miligramów na mililitr DHB i metanolu jako matrycy i spryskać ją za pomocą automatycznego rozpylacza matrycowego HTX M5. Użyj azotu pod ciśnieniem 10 PSI. Użyj czasu lotu Maldi, instrumentu MS i trybu jonów dodatnich, aby uzyskać widmo masowe.
Skalibruj instrument, wykrywając 0.5 mikrolitra emulsji czerwonego fosforu w aceto Nitro na szkiełkach ITO. Użyj jego widm do kalibracji przyrządu w zakresie mas od 100 do 1000 MZ, stosując kwadratową krzywą kalibracyjną. Ustaw średnicę plamki lasera na średnią, ponieważ jest to modulowany profil wiązki dla szerokości rastrowej 40 mikrometrów i zbierz dane obrazowania, sumując 500 strzałów z częstotliwością powtarzania lasera 1000 Hz na pozycję matrycy.
Następnie zapisz dane spektralne. Wykonaj analizę danych obrazowania przy użyciu normalizacji średniej kwadratowej w celu wygenerowania obrazów jonów w paśmie plus minus 0,10 daltona. Dopasuj widma zarówno OCT, jak i tkanki mózgowej z tego samego eksperymentu, używając oprogramowania do oceny nakładających się pików w interferencji tłumienia jonów OCT.
Na koniec przetworzyć szkiełka MALDI zawierające próbki tkanek za pomocą hematoksyliny i eozyny lub barwienia H i E. Obrazy z analizy Maldi MS ujawniły ogólny spadek zawartości lipidów w mózgu zmutowanego LPR1 z nokautem. Reprezentatywne wycinki mózgu dorosłej muchy barwione H i E są pokazane tutaj.
Na tym obrazie zaznaczono również gatunki lipidów, ich odpowiednie wartości MZ oraz skale mapy cieplnej. Średnie krotność redukcji mutanta nokautującego LPR1 w porównaniu z kontrolami z co najmniej czterech kontrprób biologicznych są pokazane jako liczby obok strzałek. Widmo masowe wybranego ślepego regionu OCT w obszarze tkanki mózgowej zarówno od muchy kontrolnej, jak i zmutowanej przedstawiono w zakresie od MZ1 do 1000 i MZ520 do 900.
Interferencja OCT jest związana zarówno ze zjawiskiem tłumienia jonów, jak i nakładającymi się problemami z sygnałem. Aby zachować wierność danych lipidomicznych, kluczowe znaczenie ma odpowiednie przygotowanie próbki, preparacja i kriosekcja. Po przeprowadzeniu eksperymentu Maldi, tożsamość lipidów można zweryfikować za pomocą LCMS, znanego również jako chromatografia cieczowa, lipodomika oparta na spektrometrii mas.
Technika ta pozwala uzyskać molekularny wgląd w homeostazę lipidów w mózgu dzięki wykorzystaniu systemu modelu o dużej mocy i miękkim, który toruje drogę do zrozumienia zmian metabolicznych w mózgu związanych z chorobami człowieka.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół zawiera szczegółowe wytyczne dotyczące przygotowania próbek lipidów i metabolitów z niewielkich tkanek, takich jak mózg Drosophila, z wykorzystaniem obrazowania metodą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą macierzą (MALDI). Metoda ta umożliwia wizualizację rozkładu lipidów bez znaczącej modyfikacji próbki.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Analiza metabolomitów
- Rozkład lipidów
- Obrazowanie spektrometrią mas
Wstęp
- Obrazowanie metodą spektrometrii mas MALDI jest kluczowe dla detekcji lipidów in situ.
- Minimalizacja czasu przygotowania próbek jest niezbędna, aby uniknąć kontaminacji.
- Metodyka ta umożliwia jednoczesną analizę dużych populacji próbek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie próbek obejmuje optymalizację temperatury cięcia oraz zatapianie tkanek w związku OCT (optimal cutting temperature).
- W badaniu wykorzystano *Drosophila melanogaster* jako organizm modelowy.
- Technologia obrazowania MALDI umożliwia szczegółową ocenę zawartości lipidów.
Główne wyniki
- Pomyślne przygotowanie i sekcjonowanie tkanek mózgu Drosophila do obrazowania.
- Zapewnienie dokładnej wizualizacji i analizy lipidów dzięki prawidłowej obsłudze próbek.
- Zwalidowana metodologia zwiększa wiarygodność danych obrazowania spektrometrią mas.
Wnioski
- Niniejsze badanie ilustruje skuteczność obrazowania metodą spektrometrii mas MALDI w analizie lipidów w małych próbkach tkanek.
- Wnosi ono cenne techniki do prowadzonych badań biologicznych nad lipidami i metabolitami.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Szybkie przygotowanie próbek z minimalizacją zanieczyszczeń dla obrazowania spektrometrią mas MALDI (MSI) umożliwia wysokoprzepustową, przestrzennie rozdzielczą lipidomikę w małych układach tkankowych. Ten schemat postępowania wspiera zespoły zajmujące się wczesnym etapem odkryć, dążąc do zmapowania rozkładu lipidów oraz zmian metabolicznych w organizmach modelowych istotnych dla przebiegu chorób. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz redukcji ryzyka mechanistycznego dla portfeli badawczych w obszarze OUN i metabolizmu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia mapowanie przestrzenne gatunków lipidów w nienaruszonych mikrośrodowiskach tkankowych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wizualizację zmian w szlakach metabolicznych w modelach genetycznych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celu poprzez ilościowe porównania zawartości lipidów.
Przesiew i opracowywanie testu
- Przygotowuje standaryzowane przekroje tkanek dla powtarzalnych, bezznakowych analiz lipidomicznych.
- Redukuje zmienność wynikającą z manipulacji próbkami, wspierając opracowanie wiarygodnych testów.
- Umożliwia jednoczesną analizę wielu próbek w celu usprawnienia procesów przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki lipidomiki z fenotypami istotnymi dla danej choroby w organizmach modelowych.
- Zapewnia ciągłość od wyników etapu odkrywania do przedklinicznych badań nad biomarkerami.
- Wspiera dostosowanie postępów do poziomu ryzyka poprzez kwantyfikację zmian metabolicznych w obrębie różnych genotypów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół przygotowania próbek do MALDI MSI obejmuje etapy od wczesnego odkrywania po badania przedkliniczne, umożliwiając lipidomikę z rozdzielczością przestrzenną w modelach genetycznie zmodyfikowanych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących zaburzeń szlaków lipidowych in situ.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych danych lipidomicznych do analizy porównawczej.
- Analityka: Zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną oraz wyniki ilościowe do oceny statystycznej.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki uzyskane na organizmach modelowych z sygnaturami metabolicznymi istotnymi dla chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia skalowalny, zestandaryzowany schemat pracy dla różnych typów tkanek i badań.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie zaangażowania szlaków lipidowych oraz walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje obchodzenie się z próbkami i zmniejsza ryzyko kontaminacji w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie wiarygodnych decyzji go/no-go poprzez ilościowe określenie przestrzennych zmian lipidowych w odpowiednich modelach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów metabolicznych i CNS z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie sekcji tkanek, kriosekcjonowania oraz obsługi aparatury MALDI MSI.
- Konieczny jest dostęp do kriostatów, rozpylaczy matrycy oraz spektrometrów mas o wysokiej rozdzielczości.
- Niezbędna jest rygorystyczna standaryzacja międzyzespołowa w celu zminimalizowania zmienności próbek.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do innych małych systemów tkankowych poprzez optymalizację protokołu.
- Szybkość przygotowania próbek oraz kontrola zanieczyszczeń są krytyczne dla wierności danych.
