Name: Przygotowanie próbki do szybkiej analizy lipidów w mózgu Drosophila przy użyciu obrazowania metodą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Naucz się przygotowywania próbek lipidów z mózgu Drosophila melanogaster do obrazowania MALDI-MS. Ta metoda umożliwia wizualizację rozkładu lipidów in situ bez konieczności etykietowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy i Mayan Hein są wspierani przez Letni Program Badawczy CUNY Fundacji Sloana (CSURP). Jun Yin jest wspierany przez wewnętrzny program badawczy National Institutes of Health Project o numerze 1ZIANS003137. Wsparcie dla tego projektu zostało udzielone przez nagrodę PSC-CUNY dla Ye He i Rinata Abzalimova, ufundowaną wspólnie przez Kongres Profesjonalnego Personelu i The City University of New York.

1. Osadzanie głowicy muchy
UWAGA: Cała procedura trwa ~45-60 min.
<ol>
	<li>Przygotuj stopień związku o optymalnej temperaturze skrawania (związek OCT) z płaską powierzchnią.
	<ol>
		<li>Dodaj OCT do plastikowego kriomoldu (15 mm x 15 mm x 5 mm) do połowy głębokości kriomoldu i unikaj tworzenia się pęcherzyków. Pozostaw formę na płaskiej powierzchni na kilka minut, a następnie przenieś ją na suchy lód.</li>
		<li>Trzymaj kriomaler płasko na suchym lodzie i pozwól, aby OCT utworzył płaską i równą powierzchnię. Poczekaj, aż OCT całkowicie zestali się w formie. Zamrożone stopnie OCT należy natychmiast zużyć lub przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulenie dorosłych much za pomocą CO2 (tj. podkładki CO2 ).
	<ol>
		<li>Przygotuj szalkę Petriego zawierającą kawałek chusteczki laboratoryjnej. Użyj wody, aby zwilżyć część chusteczki, aby zmniejszyć elektryczność statyczną. Utrzymuj chusteczkę w połowie mokrą i w połowie suchą.</li>
		<li>Pod zakresem preparacyjnym 1 użyj kleszczy, aby przeciąć głowę muchy. Za każdym razem zbieraj 4-5 głów i umieszczaj je na suchym obszarze chusteczki laboratoryjnej. 
		UWAGA: Pobranie 4-5 głów zajmuje ~ 2 minuty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś etap OCT z suchego lodu do zakresu preparacji.
	<ol>
		<li>Przenieś stopień OCT z suchego lodu do mikroskopu 2, natychmiast przenieś głowice do stopnia OCT i szybko je ułóż , co zajmuje ~ 30 s, aby uniknąć stopienia OCT. Pozostaw ~ 1 mm pustej przestrzeni wokół każdego mózgu muchy, aby zapewnić odpowiednie podparcie od OCT i 4-5 mm pustej przestrzeni od krawędzi bloku, aby zapewnić odpowiednią przestrzeń do obsługi sekcji. Jeśli trąba jest zbyt długa, zdejmij końcówkę; Jeśli nie jest zbyt długi, zachowaj go w stanie nienaruszonym. Umieść stopień OCT z powrotem na suchym lodzie i pozostaw go na ~ 3 minuty, aby upewnić się, że stopień OCT pozostaje zamrożony i stały.</li>
		<li>Kiedy etap OCT znajdzie się z powrotem na suchym lodzie i czeka na zestalenie, zbierz kolejną rundę głów. Powtórzyć kroki 1.2 i 1.3, aby przenieść dodatkowe próbki na pozostałą przestrzeń na stoliku. 
		UWAGA: Dla każdego genotypu zwykle przygotowuje się osiem głów, a w jednym etapie OCT w tym laboratorium stosuje się cztery genotypy.</li>
		<li>Użyj dwóch mikroskopów preparacyjnych, obok siebie, aby uniknąć zmiany ostrości i wydłużenia czasu potrzebnego na przeniesienie i ułożenie głowic na stoliku OCT oraz zmniejszyć ryzyko stopienia się stopnia OCT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wyrównaniu wszystkich głowic muchowych pozostaw stopień OCT na suchym lodzie przez kolejne 5-10 minut.</li>
	<li>Zdejmij stolik OCT z suchego lodu, połóż go na płaskiej powierzchni (ławce), a następnie szybko dodaj dużą ilość związku OCT, aby pokryć wszystkie próbki i wypełnić całą krioformę, co zajmuje ~3 s.</li>
	<li>Natychmiast przenieś kriomaler z powrotem do suchego lodu i zamroź cały blok OCT zawierający osadzone tkanki. Pozostaw stopień OCT na suchym lodzie przez kolejne 5-10 minut. Oznacz próbki na marginesie krioformy.</li>
	<li>Zamrożone próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą gotowe do podziału.</li>
</ol>
2. Kriosekcja tkanki
UWAGA: Podczas obchodzenia się ze szkiełkami z tlenku indu i cyny (ITO), zawsze noś rękawice, aby uniknąć zanieczyszczenia tkanek. Zaleca się również noszenie maski, aby uniknąć oddychania bezpośrednio na zjeżdżalnię.
<ol>
	<li>Potwierdź stronę pokrytą ITO, testując przewodność szkiełek ITO za pomocą woltomierza ustawionego na rezystancję. Zaznacz stronę z pomiarem oporu jako stronę, do której ma przylegać tkanka. Oznacz go i zawsze umieszczaj chusteczkę laboratoryjną na dnie szkiełka, aby uniknąć zanieczyszczenia szkiełka.</li>
	<li>Pozwól tkankom zrównoważyć się w komorze kriostatu przez 30-45 minut.
	<ol>
		<li>Aby uniknąć stopienia OCT, należy wcześniej umieścić wszystkie niezbędne narzędzia, takie jak kleszcze i szczoteczka artystyczna z cienką końcówką, w komorze kriostatu, aby je wstępnie schłodzić.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyczyść kriostat, najlepiej 70% etanolem. Wytrzyj płytę rolki i stage i usuń zużyte ostrza. Użyj dodatkowych czystych chusteczek, aby upewnić się, że etanol odparował i że wszystkie powierzchnie są suche przed rozpoczęciem cięcia.</li>
	<li>Dostosuj temperaturę komory kriostatu i głowicy próbki w zależności od rodzaju tkanki (np. −14 °C dla wątroby, −20 °C dla mięśni i −25 °C dla skóry<klasa sup = "xref">10; −18 °C dla głów muchowych w tym protokole).</li>
	<li>Zamontuj chusteczkę na uchwycie próbki za pomocą OCT. Uważaj, aby użyć wystarczającej ilości OCT, aby zakryć podstawę bloku OCT i zamontuj blok tak płasko, jak to możliwe.</li>
	<li>Umieść czyste ostrze w stage i zablokuj je. W razie potrzeby ustaw głowicę próbki w kierunku stolika, aby uzyskać żądany kąt cięcia.
	<ol>
		<li>Umieść blok próbki w orientacji, w której wszystkie genotypy/grupy traktowane są ustawione pionowo do ostrza. 
		UWAGA: Zapewnia to stałą płaszczyznę cięcia i pozwala uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego z różnych grup. W przypadku cięcia innego bloku tkanki należy przełączyć się na nowe ostrze między próbkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij cięcie w grubych odcinkach (50-100 μm), aż zostanie znaleziony obszar zainteresowania (np. pożądany obszar mózgu).
	<ol>
		<li>Stale usuwaj dodatkowe elementy za pomocą wstępnie schłodzonego pędzla artystycznego, aby utrzymać scenę w czystości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmień grubość sekcji na 10-12 μm po osiągnięciu żądanego obszaru.
	<ol>
		<li>W razie potrzeby nieznacznie dostosuj temperaturę w komorze. Na przykład ustaw wyższą temperaturę, jeśli sekcja ma tendencję do łatwego łuszczenia się lub rozpadania. 
		UWAGA: Zalecana temperatura dla bloków OCT to -18 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie zbierz żądany odcinek i przyklej go do szkiełka ITO. Wykonaj tę operację w komorze kriostatu.
	<ol>
		<li>Weź szkiełko ITO o temperaturze pokojowej i umieść je nad sekcją, delikatnie i szybko zbliż się do sekcji, aby sekcja przylegała do szkiełka bez pozostawiania śladów na stoliku kriostatu. 
		UWAGA: OCT stopi się i przylgnie do szkiełka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść szkiełko na boku w stojaku lub chusteczce laboratoryjnej na zewnątrz kriostatu między zbiorami wielu sekcji.</li>
	<li>Jeśli pożądane jest porównanie różnych próbek z tej samej kohorty, umieść sekcje z wielu próbek na jednym szkiełku w celu jednoczesnej analizy i minimalnej zmienności. W razie potrzeby rozdziel na dwie prowadnice, ponieważ uchwyt tarczowy MALDI może pomieścić dwie prowadnice w jednym przebiegu.</li>
	<li>Przenieś szkiełka w skrzynce próżniowej do eksykatora ze środkiem osuszającym jako dolną warstwą. Suszyć szkiełka w próżni przez 30-60 min. 
	UWAGA: Alternatywnie, jeśli laboratorium nie jest wyposażone w eksykator próżniowy, szkiełka powinny być przechowywane w temperaturze -20 °C przez cały proces, aż do przechowywania w temperaturze -80 °C w ciągu 24 godzin lub wysyłki na suchym lodzie, aby uniknąć pogorszenia jakości lipidów lub metabolitów.</li>
	<li>Przejdź do osadzania matrycy. Jako matrycę należy użyć kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (DHB) w metanolu/wodzie (70/30, v/v).</li>
	<li>Jeśli szkiełka nie zostaną natychmiast uruchomione, należy je przechowywać w temperaturze -80 °C (do 1 miesiąca w przypadku wycinków mózgu muchy i 6 miesięcy w przypadku wycinków mózgu gryzoni) lub natychmiast wysłać próbkę do głównych zakładów MALDI z odpowiednim suchym lodem. Aby zapewnić optymalne przechowywanie i wysyłkę, umieść szkiełka w transporterze prowadnic i bezpiecznie uszczelnij otwór folią woskową. Uszczelnij torbą strunową, umieść ją w innej torbie z zamkiem błyskawicznym zawierającej środek osuszający i oznacz na zewnątrz. 
	UWAGA: Zapoznaj się z poprzednimi pracami, aby zapoznać się z następującymi krokami skanowania preparatów, osadzania matrycy i procedur obrazowania MALDI11.</li>
	<li>Osadzanie matrycy należy przeprowadzić za pomocą automatycznego rozpylacza matrycowego HTX M5 i roztworu DHB o stężeniu 40 mg/ml w metanolu/wodzie (70/30, v/v). Natryskiwać matrycę z niestandardowym natężeniem przepływu 0,12 ml/min i temperaturą dyszy 85 °C przez 10 przejść. Użyj gazu N2 o ciśnieniu 10 psi. 
	UWAGA: Jeśli ciśnienie gazu N2 w opryskiwaczu zostanie obniżone poniżej 5 psi, mechanizm zabezpieczający w opryskiwaczu natychmiast wyłączy grzałkę, aby uniknąć uszkodzenia opryskiwacza przy prędkości opryskiwania 1,300 mm/min, rozstawie ścieżek 2 mm, natężeniu przepływu 3 l/min i wysokości dyszy 40 mm.</li>
	<li>Użyj przyrządu MALDI do pomiaru czasu przelotu (TOF) MS (patrz tabela materiałów) w trybie jonów dodatnich, aby uzyskać widmo mas w zakresach mas od m/z 50-1,000.
	<ol>
		<li>Aby skalibrować przyrząd, należy nanieść 0,5 μl emulsji czerwonego fosforu w acetonitrylu na szkiełka ITO i wykorzystać jego widma do kalibracji przyrządu w zakresie masowym 50-1,000 m/z, stosując kwadratową krzywą kalibracyjną2.</li>
		<li>Ustaw średnicę plamki lasera na Średnią, ponieważ jest to modulowany profil wiązki dla szerokości rastrowej 40 μm, i zbierz dane obrazowania, sumując 500 strzałów z częstotliwością powtarzania lasera 1,000 Hz na pozycję matrycy.</li>
		<li>Użyj oprogramowania (patrz tabela materiałów) do nagrywania i przetwarzania danych spektralnych. Przeprowadź analizę danych obrazowania przy użyciu normalizacji średniej kwadratowej (RMS) w celu wygenerowania obrazów jonów przy szerokości przedziału ±0,10 Da. Dopasuj widma zarówno OCT, jak i tkanki mózgowej z tego samego eksperymentu za pomocą oprogramowania do oceny nakładających się pików i interferencji tłumienia jonów w OCT (rysunek uzupełniający S1). Po zakończeniu eksperymentu przetworzyć preparaty MALDI zawierające próbki tkanek za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E), jak opisano wcześniej11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+lipids+and+their+derivatives+in+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications.</a> Biomolecules & Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).</li>
<li>Augustin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+for+the+medium-chain+triglyceride+ketogenic+diet+in+neurological+and+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders.</a> Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).</li>
<li>Baldwin, K. T., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+astrocyte-induced+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).</li>
<li>Mauch, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cns+synaptogenesis+promoted+by+glia-derived+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol.</a> Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).</li>
<li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li>
<li>Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+using+lipopolysaccharide-stimulated+bone+marrow-derived+dendritic+cells+to+treat+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).</li>
<li>Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+lipid+analysis+towards+lipidomics%2C+a+new+challenge+for+the+analytical+chemistry+of+the+21st+century.+Part+I%3A+Modern+lipid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).</li>
<li>Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+lipids+analysis+towards+lipidomics%2C+a+new+challenge+for+the+analytical+chemistry+of+the+21st+century.+Part+II%3A+Analytical+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).</li>
<li>Yang, K., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics%3A+Techniques%2C+applications%2C+and+outcomes+related+to+biomedical+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).</li>
<li>Norris, J. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+tissue+specimens+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+imaging+mass+spectrometry+in+biological+and+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research.</a> Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).</li>
<li>Veerasammy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+for+metabolic+profiling+using+MALDI+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62008(2020).</li>
<li>Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+lipid+metabolism%3A+Multiple+pathways+driving+functional+outcomes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10(2018).</li>
<li>Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+and+their+trafficking%3A+An+integral+part+of+cellular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization.</a> Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).</li>
<li>Wang, H., Eckel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+lipoproteins+doing+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">What are lipoproteins doing in the brain.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).</li>
<li>Palm, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoproteins+in+Drosophila+melanogaster-Assembly%2C+function%2C+and+influence+on+tissue+lipid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition.</a> PLoS Genetics. 8 (7), 1002828(2012).</li>
<li>Parra-Peralbo, E., Culi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+lipophorin+receptors+mediate+the+uptake+of+neutral+lipids+in+oocytes+and+imaginal+disc+cells+by+an+endocytosis-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism.</a> PLoS Genetics. 7 (2), 1001297(2011).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-specific+lipoprotein+receptors+interact+with+astrocyte+derived+apolipoprotein+and+mediate+neuron-glia+lipid+shuttling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling.</a> Nature Communications. 12 (1), 2408(2021).</li>
<li>Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+analysis+of+lipid+species+in+Drosophila+during+overnutrition+by+UHPLC-MS%2FMS+and+MALDI-MSI%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI.</a> Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).</li>
<li>Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+chemical+imaging+of+a+single+brain+tissue+section+using+ToF-SIMS%2C+MALDI-ToF+and+immuno%2Fhistochemical+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining.</a> Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).</li>
<li>Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+structural+effects+of+oral+administration+of+methylphenidate+in+Drosophila+brain+by+secondary+ion+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).</li>
<li>Dienel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+and+imaging+mass+spectrometric+assays+of+labile+brain+metabolites%3A+Critical+importance+of+brain+harvest+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures.</a> Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).</li>
<li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+tissue+analysis+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry%3A+Practical+aspects+of+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation.</a> Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).</li>
<li>Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+imaging+of+Drosophila+brain+using+matrix+sublimation+versus+modification+with+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).</li>
<li>Niehoff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Drosophila+lipids+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).</li>
<li>Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+imaging+of+GABA+in+the+Drosophila+melanogaster+adult+head%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head.</a> Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).</li>
<li>Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+fly+malpighian+tubule+lipidome+by+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).</li>
<li>Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+mass+spectrometry+for+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advances in mass spectrometry for lipidomics.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).</li>
<li>Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics+for+studying+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Lipidomics for studying metabolism.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12 (11), 668-679 (2016).</li>
<li>Wang, M., Wang, C., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+internal+standards+for+accurate+quantification+of+complex+lipid+species+in+biological+extracts+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry-What%2C+how+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why.</a> Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Jak wykazano w badaniu dotyczącym zmian w składzie lipidów w mózgach zmutowanych i dzikich typu Drosophila, MALDI MSI może być cenną techniką obrazowania bez znaczników do analizy in situ wzorców dystrybucji molekularnej w narządach małych owadów. Rzeczywiście, ponieważ lipidy są rozmieszczone zarówno w tkance mózgowej, jak i ciałach tłuszczowych głów Drosophila, konwencjonalne podejścia lipidomiczne oparte na chromatografii cieczowej i spektrometrii mas (LC-MS) mogą wykrywać tylko połączone sy...

Lipidy biorą udział w szerokim zakresie procesów biologicznych i można je podzielić na pięć kategorii w zależności od ich różnorodności strukturalnej: kwasy tłuszczowe, triacyloglicerole (TAGs), fosfolipidy, lipidy steroli i sfingolipidy1. Podstawowe funkcje lipidów to dostarczanie źródeł energii dla procesów biologicznych (tj. TAG) i tworzenie błon komórkowych (tj. fosfolipidów i cholesterolu). Jednak dodatkowe role lipidów zostały zauważone w rozwoju i chorobach i były szeroko badane w dziedzinie biomedycyny. Na przykład raporty wykazały, że kwasy tłuszczowe o różnej długości mogą pełnić wyjątkowe role terapeutyczne. Krótkie łańcuchy kwasów tłuszczowych mogą być zaangażowane w mechanizmy obronne przed chorobami autoimmunologicznymi, średniej długości łańcuchy kwasów tłuszczowych wytwarzają metabolity, które mogą łagodzić napady, a długie łańcuchy kwasów tłuszczowych generują metabolity, które mogą być stosowane w leczeniu zaburzeń metabolicznych2. Wykazano, że w układzie nerwowym cholesterol i fosfolipidy pochodzące z gleju są niezbędne dla synaptogenezy3,4. Inne rodzaje lipidów okazały się obiecujące w zastosowaniach medycznych, w tym sfingolipidy wykorzystywane w systemach dostarczania leków i sacharyolipidy stosowane do wspierania układu odpornościowego5,6. Liczne role i potencjalne zastosowania terapeutyczne lipidów w dziedzinie biomedycyny sprawiły, że lipidomika – nauka zajmująca się szlakami i interakcjami lipidów komórkowych – stała się krytyczną i coraz ważniejszą dziedziną.
Lipidomika wykorzystuje chemię analityczną do badania lipidomu na dużą skalę. Główne metody eksperymentalne stosowane w lipidomice opierają się na spektrometrii mas (MS) w połączeniu z różnymi technikami chromatografii i ruchliwości jonów7,8. Zastosowanie SM w tej dziedzinie jest korzystne ze względu na jego wysoką specyficzność i czułość, szybkość akwizycji oraz unikalne możliwości (1) wykrywania lipidów i metabolitów lipidowych występujących nawet na niskich i przejściowych poziomach, (2) wykrywania setek różnych związków lipidowych w jednym eksperymencie, (3) identyfikowania nieznanych wcześniej lipidów oraz (4) rozróżniania izomerów lipidowych. Wśród osiągnięć w dziedzinie stwardnienia rozsianego, w tym jonizacji metodą elektrorozpylania desorpcji (DESI), MALDI i spektrometrii mas jonów wtórnych (SIMS), MALDI MSI stało się potężną techniką obrazowania, która uzupełnia konwencjonalne podejścia oparte na stwardnieniu rozsianym, dostarczając unikalnych informacji na temat przestrzennego rozkładu lipidów w przedziałach tkankowych9,10.
Typowy przepływ pracy w lipidomice składa się z przygotowania próbki, akwizycji danych za pomocą technologii spektrometrii mas i analizy danych11. Badania lipidów i metabolitów w próbkach doprowadziły do pojawienia się technik pozwalających zrozumieć fizjologiczne i patologiczne warunki procesów metabolicznych w organizmach. Chociaż zrozumienie interakcji biologicznych jest ważne, wrażliwość lipidów i metabolitów sprawia, że trudno jest je obrazować i zidentyfikować bez barwników lub innych modyfikacji. Zmiany w stężeniach lub dystrybucji metabolitów mogą prowadzić do zmian fenotypowych. Jednym z narzędzi wykorzystywanych do profilowania metabolomicznego jest MALDI MSI, bezznacznikowa technika obrazowania in situ, zdolna do jednoczesnego wykrywania setek cząsteczek. Obrazowanie MALDI pozwala na wizualizację metabolitów i lipidów w próbkach przy jednoczesnym zachowaniu ich integralności i rozkładu przestrzennego. Poprzednia technologia profilowania lipidów polegała na wykorzystaniu radioaktywnych substancji chemicznych do indywidualnego mapowania lipidów, podczas gdy obrazowanie MALDI rezygnuje z tego i pozwala na jednoczesne wykrywanie szeregu lipidów.
Metabolizm i homeostaza lipidów odgrywają ważne funkcje w fizjologii komórki, takie jak utrzymanie i rozwój układu nerwowego. Jednym z istotnych aspektów metabolizmu lipidów w układzie nerwowym jest transport lipidów między neuronami a komórkami glejowymi, w którym pośredniczą lipoproteiny nośnika molekularnego, w tym lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości (VLDL), lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL) i lipoproteiny o dużej gęstości (HDL)12. Lipoproteiny zawierają apolipoproteiny (Apo), takie jak ApoB i ApoD, które działają jako bloki strukturalne ładunku lipidowego i jako ligandy dla receptorów lipoproteinowych. Wzajemne oddziaływanie lipidów między neuronami a glejem obejmuje wielu graczy, takich jak ApoD, ApoE i ApoJ pochodzące z gleju oraz ich neuronalne receptory LDL (LDLR)13,14. U Drosophila apolipoforyna, należąca do rodziny ApoB, jest głównym nośnikiem lipidów w hemolimfie15. Apolipoforyna ma dwa blisko spokrewnione receptory lipoforyny (LpR), LpR1 i LpR2, które są homologami ssaków LDLR15,16. W poprzednich badaniach odkryto, że wydzielana przez astrocyty lipokalina Glial Lazarillo (GLaz), homolog Drosophila ludzkiego ApoD, i jej receptor neuronalny LpR1 współpracują w przenoszeniu lipidów między neuronami a glejem, regulując w ten sposób morfogenezę dendrytów17. Dlatego spekulowano, że utrata LpR1 spowoduje spadek ogólnej zawartości lipidów w mózgu Drosophila. MALDI MSI byłby odpowiednim narzędziem do profilowania zawartości lipidów w małych tkankach mózgów Drosophila z mutacją LpR1−/−, jak wykazano w tym badaniu.
Pomimo rosnącej popularności MALDI MSI, wysokie koszty i złożoność eksperymentalna często utrudniają jego implementację w indywidualnych laboratoriach. W związku z tym większość badań MALDI MSI jest przeprowadzana przy użyciu wspólnych obiektów podstawowych. Podobnie jak w przypadku innych zastosowań MALDI MSI, staranny proces przygotowania próbki do lipidomiki ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych wyników. Ponieważ jednak przygotowanie preparatu do próbek jest zwykle wykonywane w indywidualnych laboratoriach badawczych, istnieje możliwość różnic w pozyskiwaniu MALDI MSI. Aby temu zaradzić, niniejszy artykuł ma na celu przedstawienie szczegółowego protokołu przygotowania próbek małych próbek biologicznych przed pomiarem MALDI MSI przy użyciu analizy lipidowej dużej grupy dorosłych mózgów Drosophila w trybie jonów dodatnich jako przykładu11,17. Jednak niektóre klasy fosfolipidów i większość małych metabolitów są korzystnie wykrywane przez obrazowanie MALDI w trybie jonów ujemnych, co zostało opisane wcześniej11. Dlatego dzięki tym dwóm przykładowym badaniom mamy nadzieję dostarczyć szczegółowe protokoły przygotowania próbek o różnych kombinacjach: wolnostojąca duża tkanka kontra osadzona mała tkanka, montaż rozmrażowy kontra montaż na ciepłym suwaku oraz tryb jonów dodatnich i tryb jonów ujemnych.

<table><tbody><tr><td>Kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy (DHB)</td><td>Milipore Sigma Aldrich</td><td>85707-1G-F</td><td></td></tr><tr><td>Andwin Scientific&nbsp; CRYOMOLD 15X15X5</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9464347</td><td></td></tr><tr><td>Andwin Scientific&nbsp; Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Pędzel artystyczny MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-111-2302</td><td></td></tr><tr><td>autoflex speed System MALDI-TOF MS</td><td>Bruker Daltonics Inc</td><td></td><td>Instrument MALDI-TOF MS BD</td></tr><tr><td>&NBSP; Strzykawka z końcówkami Luer-Lok</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Vacutainer Igły strzykawkowe ogólnego zastosowania</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-021-020</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Daltonics&nbsp; SZKIEŁKA SZKLANE MALDI IMAGNG</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0380464</td><td></td></tr><tr><td>Drierite, ze wskaźnikiem, 8 oczek, ACROS Organics</td><td></td><td>AC219095000</td><td></td></tr><tr><td>Skaner fotograficzny Epson Perfection V600</td><td>Amazon</td><td>Perfection V600</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; 5-miejscowy suwak pocztowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>HS15986</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Cyfrowy multimetr z automatycznym zakresem</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-241-1</td><td></td></tr><tr><td>FlexImaging v3.0</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazowania Bruker</td><td>Daltonics Inc</td><td></td> Bruker MS</tr><tr><td>Metanol klasy HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>MMX04751</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy HPLC</td><td>Opryskiwacz Fisher Scientific</td><td>W5-1</td><td></td></tr><tr><td>HTX M5</td><td>HTX Technologies, LLC</td><td></td><td>Automatyczna podgrzewana matryca opryskiwacz</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional&nbsp; Kimtech Science Kimwipes Delikatne wycieraczki Fisher</td><td>Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>MSC&nbsp; Torba do zamrażania</td><td>Ziploc Fisher Scientific</td><td>50-111-3769</td><td></td></tr><tr><td>SCiLS Lab (2015b)</td><td>SCiLS Lab</td><td></td><td>Zaawansowane oprogramowanie do analizy danych MALDI MSI</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; CryoStar NX50 Kriostat</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>95-713-0</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Nalgene Przezroczysty eksykator z poliwęglanu o klasycznym wzornictwie</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-642-7</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbki do szybkiej analizy lipidów w mózgu drosophila przy użyciu obrazowania metodą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

Profilowanie lipidowe, czyli lipidomika, jest dobrze znaną techniką używaną do badania całkowitej zawartości lipidów w komórce lub tkance. Informacje uzyskane z lipidomiki są cenne w badaniu szlaków zaangażowanych w rozwój, chorobę i metabolizm komórkowy. Wiele narzędzi i oprzyrządowania pomogło w realizacji projektów lipidomicznych, w szczególności różne kombinacje technik spektrometrii mas i chromatografii cieczowej. Obrazowanie metodą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI MSI) stało się ostatnio potężną techniką obrazowania, która uzupełnia konwencjonalne podejścia. Ta nowatorska technika dostarcza unikalnych informacji na temat przestrzennego rozmieszczenia lipidów w przedziałach tkankowych, co wcześniej było nieosiągalne bez zastosowania nadmiernych modyfikacji. Przygotowanie próbki w ramach podejścia MALDI MSI ma kluczowe znaczenie i dlatego jest głównym tematem tego artykułu. W artykule przedstawiono szybką analizę lipidową dużej liczby mózgów Drosophila osadzonych w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) w celu zapewnienia szczegółowego protokołu przygotowania małych tkanek do analizy lipidów lub analizy metabolitów i małych cząsteczek za pomocą MALDI MSI.

Postawiono hipotezę, że utrata neuronalnego receptora LpR1 dla wydzielanej przez astrocyty lipokalinowej białka Glial Lazarillo (GLaz), homologu ludzkiego ApoD u Drosophila, może prowadzić do zmniejszenia ogólnej zawartości lipidów w mózgu Drosophila. Aby to sprawdzić, wykorzystano technikę MALDI MSI do profilowania lipidów w mózgach mutantów LpR1−/− oraz w mózgach Drosophila typu dzikiego, co zostało szczegółowo opisane poniżej.
Eksperyment przep...

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych wskazówek dotyczących prawidłowego przygotowania próbki do analizy lipidów i metabolitów w małych tkankach, takich jak mózg Drosophila, przy użyciu wspomaganej matrycą laserowej desorpcji/jonizacji (MALDI) obrazowania spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do szybkiej analizy lipidów w mózgu Drosophila przy użyciu obrazowania metodą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Lipid profiling, or lipidomics, is a well-established technique used to study the entire lipid content of a cell or tissue. Information acquired ...

Obrazowanie spektrometryczne Maldi MS jest uznanym i użytecznym narzędziem do identyfikacji i wizualizacji obfitości i dystrybucji lipidów, bez nadmiernej modyfikacji próbki. Główną zaletą obrazowania Maldi jest jego zdolność do wykrywania lipidów in situ bez znakowania i jednoczesnej analizy dużej populacji próbek. Praktyka czyni mistrza.Upewnij się, że dobrze ćwiczysz przed przetworzeniem prawdziwych próbek eksperymentalnych. Zminimalizuj czas przygotowania próbki i unikaj zanieczyszczenia podczas całej procedury. Na początek dodaj optymalną temperaturę cięcia lub OCT do plastikowej formy kriogenicznej do połowy głębokości formy kriogenicznej, unikając tworzenia się pęcherzyków.Pozostaw formę na płaskiej powierzchni na kilka minut, a następnie przenieś ją na suchy lód. Trzymaj kriomaler płasko na suchym lodzie i pozwól, aby OCT utworzył płaską i równą powierzchnię. Poczekaj, aż OCT całkowicie zestali się w formie.Zamrożone etapy OCT należy natychmiast zużyć lub przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po znieczuleniu dorosłych much Za pomocą dwutlenku węgla przygotuj szalkę Petriego zawierającą kawałek chusteczki laboratoryjnej. Użyj wody, aby zwilżyć część chusteczki, aby zmniejszyć elektryczność statyczną.Utrzymuj chusteczkę w połowie mokrą i w połowie suchą. Po przecięciu głowicy muchy pod lunetą sekcyjną, zbierz od czterech do pięciu głów i połóż je na suchym obszarze chusteczki laboratoryjnej. Weź etap OCT od suchego lodu do mikroskopu dwa.Natychmiast przenieś głowice na etap OCT i szybko je ułożyj, co zajmuje około 30 do 60 sekund, aby uniknąć stopienia OCT. Pozostaw około jednego milimetra pustej przestrzeni wokół każdego mózgu muchy, aby zapewnić odpowiednie wsparcie ze strony OCT i od czterech do pięciu milimetrów pustej przestrzeni od krawędzi bloku, aby zapewnić odpowiednią przestrzeń do obsługi sekcji. Umieść stopień OCT z powrotem na suchym lodzie i pozostaw go na około trzy minuty, aby upewnić się, że stopień OCT pozostaje zamrożony i stały.Po wyrównaniu wszystkich głowic muchowych pozostaw stopień OCT na suchym lodzie przez kolejne pięć do 10 minut. Przenieś stolik OCT z suchego lodu na płaską powierzchnię, a następnie szybko dodaj dużą ilość związku OCT, aby pokryć wszystkie próbki i wypełnić całą krioformę, co zajmuje około trzech sekund. Natychmiast przenieś kriomaler z powrotem do suchego lodu i zamroź cały blok OCT zawierający osadzone tkanki.Pozostaw etap OCT na suchym lodzie przez kolejne pięć do 10 minut. Oznaczyć próbki na marginesie kriomoldu i przechowywać zamrożone próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu, gdy będą gotowe do podziału. Potwierdź stronę kodowaną ITO, testując przewodność szkiełek ITO za pomocą woltomierza ustawionego na rezystancję.Zaznacz stronę z pomiarem oporu jako stronę, do której ma przylegać tkanka. Oznacz go i zawsze umieszczaj chusteczkę laboratoryjną na dnie szkiełka, aby uniknąć zanieczyszczenia szkiełka. Następnie pozwól tkankom zrównoważyć się w komorze kriostatu przez 30 do 45 minut.Wyczyść kriostat, najlepiej 70% etanolem. Wytrzyj płytę rolki na scenie i wyjmij zużyte ostrza. Użyj dodatkowych czystych chusteczek, aby upewnić się, że etanol odparował i że wszystkie powierzchnie są suche przed rozpoczęciem cięcia.Następnie dostosuj temperaturę głowicy próbki piasku w komorze kriostatu w zależności od rodzaju tkanki. Zamontuj tkankę na uchwycie próbki za pomocą OCT. Uważaj, aby użyć wystarczającej ilości OCT, aby zakryć podstawę bloku OCT i zamontuj blok tak płasko, jak to możliwe.Umieść czyste ostrze na scenie i zablokuj je. W razie potrzeby ustaw głowicę próbki w kierunku stolika, aby uzyskać żądany kąt cięcia. Następnie rozpocznij cięcie w grubych sekcjach, aż zostanie znaleziony obszar zainteresowania.Stale usuwaj dodatkowe elementy za pomocą wstępnie schłodzonego pędzla artystycznego, aby utrzymać scenę w czystości. W razie potrzeby nieznacznie dostosuj temperaturę komory i zmień grubość sekcji na 10 do 12 mikrometrów po osiągnięciu żądanego obszaru. Ostrożnie zbierz żądaną sekcję.Weź szkiełko ITO o temperaturze pokojowej i umieść je nad sekcją. Delikatnie podejdź do sekcji i przyklej ją do szkiełka, nie pozostawiając śladów na stoliku kriostatu. Umieść szkiełko na boku w stojaku lub chusteczce laboratoryjnej na zewnątrz kriostatu między zbiorami wielu sekcji.Jeśli pożądane jest porównanie różnych próbek z tej samej kohorty, umieść sekcje z wielu próbek na jednym szkiełku, aby można je było analizować jednocześnie w celu zminimalizowania różnic. W razie potrzeby rozdziel na dwie prowadnice, ponieważ uchwyt na tarczę Maldi może pomieścić dwie prowadnice w jednym biegu. Przenieś szkiełka w pojemniku próżniowym do osuszacza z osuszaczem jako dolną warstwą.Prowadź szkiełka w próżni przez 30 do 60 minut, a następnie przystąp do osadzania matrycy. Użyj dwóch pięciu kwasów dihydroksybenzoesowych lub DHB w wodzie metanolowej jako matrycy. Umieść szkiełka w transporterze szkiełek i bezpiecznie uszczelnij otwór folią woskową.Uszczelnij za pomocą torby na suwak. Umieść go w innej torbie strunowej zawierającej środek osuszający. Oznacz zewnętrzną stronę i wyślij próbkę do głównych zakładów Maldi z odpowiednim suchym okiem.Do osadzania matrycy należy użyć 40 miligramów na mililitr DHB i metanolu jako matrycy i spryskać ją za pomocą automatycznego rozpylacza matrycowego HTX M5. Użyj azotu pod ciśnieniem 10 PSI. Użyj czasu lotu Maldi, instrumentu MS i trybu jonów dodatnich, aby uzyskać widmo masowe.Skalibruj instrument, wykrywając 0.5 mikrolitra emulsji czerwonego fosforu w aceto Nitro na szkiełkach ITO. Użyj jego widm do kalibracji przyrządu w zakresie mas od 100 do 1000 MZ, stosując kwadratową krzywą kalibracyjną. Ustaw średnicę plamki lasera na średnią, ponieważ jest to modulowany profil wiązki dla szerokości rastrowej 40 mikrometrów i zbierz dane obrazowania, sumując 500 strzałów z częstotliwością powtarzania lasera 1000 Hz na pozycję matrycy.Następnie zapisz dane spektralne. Wykonaj analizę danych obrazowania przy użyciu normalizacji średniej kwadratowej w celu wygenerowania obrazów jonów w paśmie plus minus 0,10 daltona. Dopasuj widma zarówno OCT, jak i tkanki mózgowej z tego samego eksperymentu, używając oprogramowania do oceny nakładających się pików w interferencji tłumienia jonów OCT.Na koniec przetworzyć szkiełka MALDI zawierające próbki tkanek za pomocą hematoksyliny i eozyny lub barwienia H i E. Obrazy z analizy Maldi MS ujawniły ogólny spadek zawartości lipidów w mózgu zmutowanego LPR1 z nokautem. Reprezentatywne wycinki mózgu dorosłej muchy barwione H i E są pokazane tutaj.Na tym obrazie zaznaczono również gatunki lipidów, ich odpowiednie wartości MZ oraz skale mapy cieplnej. Średnie krotność redukcji mutanta nokautującego LPR1 w porównaniu z kontrolami z co najmniej czterech kontrprób biologicznych są pokazane jako liczby obok strzałek. Widmo masowe wybranego ślepego regionu OCT w obszarze tkanki mózgowej zarówno od muchy kontrolnej, jak i zmutowanej przedstawiono w zakresie od MZ1 do 1000 i MZ520 do 900.Interferencja OCT jest związana zarówno ze zjawiskiem tłumienia jonów, jak i nakładającymi się problemami z sygnałem. Aby zachować wierność danych lipidomicznych, kluczowe znaczenie ma odpowiednie przygotowanie próbki, preparacja i kriosekcja. Po przeprowadzeniu eksperymentu Maldi, tożsamość lipidów można zweryfikować za pomocą LCMS, znanego również jako chromatografia cieczowa, lipodomika oparta na spektrometrii mas.Technika ta pozwala uzyskać molekularny wgląd w homeostazę lipidów w mózgu dzięki wykorzystaniu systemu modelu o dużej mocy i miękkim, który toruje drogę do zrozumienia zmian metabolicznych w mózgu związanych z chorobami człowieka.

sample-preparation-for-rapid-lipid-analysis-drosophila-brain-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy nową ilościową metodę lipidomiki służącą do identyfikacji licznych gatunków lipidów w drożdżach z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją przez elektroryś spray w trybie skanowania przeglądowego (ESI/MS). Metoda ta przewyższa obecnie dostępne metody identyfikacji i oznaczania ilościowego lipidów pod względem zdolności do rozdzielania różnych form cząsteczkowych lipidów, czułości oraz szybkości analizy.

Ilościowa ocena lipidomu drożdży z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją elektrorsprayową

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy metodę izolacji pojedynczych lub wielu neuronów dopaminergicznych (da) Drosophila z larw trzeciego stadium za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM) w klasie przechwytywania podczerwienią (IR). RNA uzyskane z wyizolowanych neuronów może być łatwo wykorzystane w dalszych zastosowaniach, w tym w analizach qRT-PCR lub mikromacierzach.

Mikrodysekcja laserowa neuronów obwodowych Drosophila

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-on) został wcześniej zgłoszony jako matryca MALDI do obrazowania tkanek małych cząsteczek; protokoły użycia DT do obrazowania MALDI endogennych lipidów na powierzchni skrawków tkanek za pomocą dodatniego jonu MALDI-MS na ultrawysokiej rozdzielczości instrument kwadrupol-FTICR są dostępne tutaj.

Dithranol jako matryca do obrazowania desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą na spektrometrze mas z cyklotronem z transformacją Fouriera

Danio pręgowany staje się cennym modelem przetwarzania lipidów w diecie i chorób metabolicznych. Opisano protokoły żywienia larw bogatych w lipidy, obrazowanie na żywo fluorescencyjnych analogów lipidów w diecie oraz ilościowe oznaczanie spożycia pokarmu. Techniki te można zastosować do różnych technik badań przesiewowych, obrazowania i dociekań opartych na hipotezach.

Paradygmat żywienia wysokotłuszczowego dla larw danio pręgowanego: karmienie, obrazowanie na żywo i kwantyfikacja spożycia pokarmu

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Celem tego protokołu jest zapewnienie prostego i taniego podejścia do zbierania zarodków Drosophila na średnią skalę (0,5-1 g) i przygotowywania ekstraktów białkowych, które mogą być używane w dalszych zastosowaniach proteomicznych, takich jak spektrometria mas z oczyszczaniem powinowactwa (AP-MS).

Przygotowanie na średnią skalę ekstraktów z zarodków Drosophila do eksperymentów proteomicznych

Ten protokół opisuje, jak przygotować larwy Drosophila do analizy metabolomicznej opartej na GC-MS.

Przygotowanie próbek larw Drosophila do metabolomiki opartej na chromatografii gazowej i spektrometrii mas (GC-MS)

Integralność bariery krew-mózg jest kluczowa dla funkcjonowania układu nerwowego. U Drosophila melanogaster bariera krew-mózg jest tworzona przez komórki glejowe podczas późnej embriogenezy. Protokół ten opisuje metody oznaczania tworzenia i utrzymywania bariery krew-mózg w zarodkach D. melanogaster i larwach trzeciego stadium rozwojowego.

Test integralności bariery krew-mózg u Drosophila melanogaster

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych wskazówek dotyczących przygotowania próbki podczas planowania eksperymentów z użyciem MALDI MSI, aby zmaksymalizować wykrywanie metaboliczne i molekularne w próbkach biologicznych.

Przygotowanie próbki do profilowania metabolicznego przy użyciu obrazowania spektrometrii mas MALDI

Ten protokół opisuje użycie mikroMS do sterowanej fluorescencją, jednokomórkowej spektrometrii mas MALDI-2, umożliwiając lepsze profilowanie molekularne pierwotnych komórek neuronalnych szczura.

Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą pod wpływem fluorescencji ze spektrometrią mas z indukowaną laserem spektrometrią mas z jonizacji poszczególnych komórek nerwowych szczura

Naucz się przygotowywania próbek lipidów z mózgu Drosophila melanogaster do obrazowania MALDI-MS. Ta metoda umożliwia wizualizację rozkładu lipidów in situ bez konieczności etykietowania.

Przygotowanie próbki do szybkiej analizy lipidów w mózgu Drosophila przy użyciu obrazowania metodą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie próbki do szybkiej analizy lipidów w mózgu Drosophila przy użyciu obrazowania metodą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Przeglądaj więcej filmów