Wielostrumieniowy bioreaktor perfuzyjny zintegrowany z frakcjonowaniem wylotowym w celu dynamicznej hodowli komórek

Ta metoda pomaga zrozumieć, jak tempo wydzielania zmienia się w czasie i jak komórki reagują na zmieniające się w czasie sygnały stałe. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest ona tania, wymaga niewielkiego szkolenia, a konfiguracja systemu profusion może być dostosowana do nowatorskich eksperymentów. Rozpocząć od napełnienia jednej strzykawki roztworem tła i załadować ją do pierwszej pompy strzykawkowej.

Napełnić kolejną strzykawkę roztworem znacznikowym i załadować ją do drugiej pompy strzykawkowej. Podłączyć obie strzykawki do dwóch z trzech portów czterokierunkowego zaworu odcinającego za pomocą złączy typu luer. Zamknij kran do roztworu tła i wpompuj roztwór znacznikowy do zaworu odcinającego, aż wypłynie z otwartego portu.

Zatrzymać pompę i nie regulować dalej strzykawki. Upewnij się, że ruchoma belka pompy strzykawkowej jest dociśnięta do tłoków strzykawki, tak aby przepływ rozpoczął się natychmiast po uruchomieniu pompy. Zamknąć zawór odcinający do roztworu znacznikowego i pompować roztwór tła do zaworu odcinającego, aż wszystkie pozostałe roztwory znacznikowe zostaną wypłukane z otwartego portu.

Zatrzymać pompę i nie regulować dalej strzykawki. Skonfiguruj komponent systemu przepływu żądany do analizy RTD. Włóż końcówkę do dozownika końcówki do pipet i przepompuj roztwór tła przez element, aż zostanie całkowicie napełniony.

Ustawić pompę roztworu znacznikowego na żądane natężenie przepływu. Zamknąć zawór odcinający do roztworu tła i uruchomić przepływ roztworu znacznikowego. W tym samym czasie uruchom kolektor frakcji.

Kontynuuj przepływ roztworu znacznika przez krótki okres czasu, aby przybliżyć impuls wejściowy znacznika. W przypadku czujników RTD zalecany jest czas trwania impulsu wynoszący 10 minut przy natężeniu przepływu jednego mililitra na godzinę. Zatrzymać pompę roztworu znacznikowego pod koniec okresu impulsu roztworu znacznikowego.

Szybko zamknij zawór odcinający do roztworu znacznikowego i rozpocznij przepływ roztworu tła z tą samą szybkością przepływu. Pozwól, aby roztwór tła przepłynął i zbieraj frakcje, aż cały znacznik przejdzie przez system i dotrze do zebranych frakcji. W sterylnych warunkach włożyć korki z igłami do kultur na płytce studzienki z podciągniętymi igłami.

Po umieszczeniu korka opuść igły na żądaną wysokość w celu perfuzji, ponieważ wysokość igły wylotowej określa stabilny poziom płynu. Przykryj igły męskimi nasadkami typu luer i trzymaj całą studzienkę w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza do czasu użycia. Przygotuj dwie pożywki, które mają być użyte do perfuzji, oznaczając pożywkę, która zostanie dozowana jako pierwsza, jako jedno, a drugą pożywkę jako dwie.

Aby każda kultura miała być poddana perfuzji, napełnij jedną strzykawkę pożywką, aby wystarczyła na cały czas jej dysfuzji plus objętość wystarczającą do początkowego napełnienia systemu perfuzyjnego. Napełnić drugą strzykawkę pożywką numer dwa, aby wystarczyła na cały okres jej odstawienia. Podłączyć obie strzykawki do dwóch z trzech portów czterokierunkowego zaworu odcinającego.

Może być wymagany odcinek rurki do podłączenia strzykawek do zaworów odcinających. Przygotuj kurki, zamykając kran dla medium pierwszego i dozując medium drugie do kranu do momentu, aż zacznie kapać z otwartego portu. Następnie zamknij kran dla medium drugiego i wlej medium one do kranu do momentu, aż wszystkie pozostałe medium dwa zostaną wypłukane z otwartego portu.

Podłącz rurkę wylotową do otwartego portu kurka za pomocą złącza żeńskiego do zadziorowego luer. Włóż złącze luer męskie na zadzior na drugim końcu rurki. Dozować pożywkę jedną ze strzykawki, aż górna probówka zostanie napełniona pożywką i przystąpić do przygotowania rurki za strzykawką, jak pokazano wcześniej.

Włóż złącze luer męskie do zadzioru do jednego końca rurki wylotowej i zakryj je żeńską nasadką luer. Ostrożnie przynieś wszystkie przygotowane rurki, strzykawki i płytkę studzienkową do inkubatora, który będzie używany do perfuzji. Umieścić pompę strzykawkową i kolektor frakcji w żądanych miejscach w pobliżu inkubatora.

Umieścić pompę strzykawkową na inkubatorze lub w jego pobliżu, a kolektor frakcji umieścić obok inkubatora w pobliżu portu. Załadować strzykawki do pompy. Zwiąż ze sobą zaślepione końce wszystkich rurek przed i za inkubatorem i wepchnij je z zewnątrz inkubatora do środka przez port.

Włóż otwarte końce probówek znajdujących się za nim do końcówek pipet dozujących wielogłowicowego dozownika kolektora frakcji. Wewnątrz inkubatora należy wciągnąć do inkubatora jak najwięcej luzu rurek wylotowych, aby zmaksymalizować długość przewodów, przez które przepływające medium może odbierać ciepło i dwutlenek węgla. Dla każdej zatkanej studzienki szybko odkręć igły oraz rurki przed i za tą studnią, a następnie przymocuj je razem ze złączami luer.

Po podłączeniu wszystkich części należy na krótko uruchomić pompę strzykawkową ze stosunkowo dużą prędkością, aby upewnić się, że wszystkie strumienie przepływają prawidłowo. W tym momencie, jeśli pożądane jest rozpoczęcie eksperymentu z rurkami wylotowymi pełnymi medium, kontynuuj pracę pompy, aż wszystkie zostaną napełnione, w przeciwnym razie zatrzymaj pompę. Ustaw natężenie przepływu pompy strzykawkowej dla pożywki i częstotliwość pobierania frakcji i uruchom obie maszyny jednocześnie, aby rozpocząć eksperyment.

Gdy konieczna jest wymiana źródła pożywki, należy szybko zatrzymać pompę strzykawkową w przypadku źródła medium. Przekręć kran zamykający na średni i uruchom pompę strzykawkową dla medium drugiego. W razie potrzeby później zmień źródło z powrotem na średnie.

Zbierz ułamki na żądany czas trwania eksperymentu. Stężenia znaczników we frakcjach z dwóch eksperymentów RTD zostały zmierzone i wprowadzone do RTD ze skryptu MATLAB w celu wytworzenia dwóch RTD. Pojedyncze rurki i wiele kawałków rurek połączonych szeregowo dobrze pasują do modelu dyspersji pojedynczej osiowej, a dodanie perfuzowanej płytki 48-dołkowej w linii spowodowało znikome odchylenie, umożliwiając dopasowanie zarówno metrowego RTD rury, jak i RTD całego systemu za pomocą funkcji dyspersji osiowej.

Przykład złego dopasowania modelu zademonstrowano przy użyciu modelu dyspersji osiowej dopasowanego do danych RTD rury o długości jednego metra i wykreślono go wraz z danymi. Początkowe przypuszczenia parametrów zostały zmienione, aby uzyskać dobre dopasowanie modelu, w którym tau było w przybliżeniu równe objętości systemu perfuzyjnego podzielonej przez jego objętościowe natężenie przepływu. 90-minutowy impuls TNF-alfa został zdefiniowany jako sygnał wejściowy do systemu i został połączony z jednometrowym RTD rurki w celu określenia sygnału TNF-alfa na wlocie płytki studziennej.

Sygnał wejściowy został również zbieżny z RTD całego układu w celu wyznaczenia sygnału TNF-alfa na wylocie systemu w zebranych frakcjach. Komórki HEK 293 zostały zmodyfikowane tak, aby wydzielały GLuc sterowane przez promotor zawierający element odpowiedzi NF-kappaB. Eksperyment ujawnił znaczny wzrost ekspresji i powolny spadek ekspresji GLuc napędzany przez NF-kappaB po ekspozycji na TNF-alfa.

Warianty systemu opisano w dołączonym artykule, w tym prostszą konfigurację do eksperymentów, które nie wymagają wprowadzania sygnałów i wystawiania komórek na działanie profili substancji rozpuszczonych Pharma-hu.