Name: Wielostrumieniowy bioreaktor perfuzyjny zintegrowany z frakcjonowaniem wylotowym w celu dynamicznej hodowli komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj metodę budowy wielostrumieniowego bioreaktora perfuzyjnego do dynamicznej hodowli komórek i pomiaru kinetyki wydzielania. Niskokosztowy system umożliwia badanie odpowiedzi komórek na zmienne bodźce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało przeprowadzone dzięki wsparciu w ramach grantów nr R01EB012521, R01EB028782 i T32 GM008339 od National Institutes of Health.

<ol><li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent%2C+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li>
<li>Talaei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mathematical+model+of+the+dynamics+of+cytokine+expression+and+human+immune+cell+activation+in+response+to+the+pathogen+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153(2021).</li>
<li>Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-dependent+glucose+consumption+dynamics+in+3D+primary+human+liver+cultures+measured+by+a+sensitive+and+specific+glucose+sensor+with+nanoliter+input+volume%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume.</a> FASEB Journal. 35 (3), 21305(2021).</li>
<li>Muzzey, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+time-lapse+fluorescence+microscopy+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).</li>
<li>Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+method+to+assess+the+endogenous+activity+and+the+light-response+of+the+retinal+clock+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals.</a> Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).</li>
<li>Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outlook+on+microfluidics%3A+the+promise+and+the+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">An outlook on microfluidics: the promise and the challenge.</a> Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).</li>
<li>Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+measurement+of+circadian+clock+gene+expression+and+hormone+secretion+in+human+primary+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54673(2016).</li>
<li>Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-culture-based+secreted+bioluminescence+reporter+assay+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multichannel+perfusion+culture+bioluminescence+reporter+system+for+long-term+detection+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).</li>
<li>Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+circadian+oscillation+of+melatonin+release+in+pineal+cells+of+house+sparrow%2C+pigeon+and+Japanese+quail%2C+using+cell+perfusion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems.</a> Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).</li>
<li>Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+flow+cell+culture+system+for+precision+cell+stimulation+and+time-resolved+profiling+of+cell+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion.</a> Analytical Biochemistry. 625, 114213(2021).</li>
<li>Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaltzman%2C+WM+%22Drug+Delivery%3A+Engineering+Principles+for+Drug+Therapy%22">Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy</a>. , Oxford University Press. (2001).</li>
<li>Fogler, H. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFogler%2C+HS+%22Elements+of+Chemical+Reaction+Engineering.+4th+edn%22">Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn</a>. , Prentice Hall PTR. Boston. (2006).</li>
<li>Conesa, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConesa%2C+JA+%22Chemical+Reactor+Design%3A+Mathematical+Modeling+and+Applications%22">Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications</a>. , Wiley. (2019).</li>
<li>Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explicit+residence+time+distribution+of+a+generalised+cascade+of+continuous+stirred+tank+reactors+for+a+description+of+short+recirculation+time+%28bypassing%29%5BTitle%5D)+AND+%22Processes%22%5BJournal%5D)">Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing).</a> Processes. 7 (9), 615(2019).</li>
<li>Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+leukemic+T-cell+transcriptional+dynamics+in+vivo+with+a+blood-based+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay.</a> FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).</li>
<li>Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterising+bioreactor+mixing+with+residence+time+distribution+%28RTD%29+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests.</a> Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).</li>
<li>Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+dynamics+within+a+bioreactor+for+tissue+engineering+by+residence+time+distribution+analysis+combined+with+fluorescence+and+magnetic+resonance+imaging+to+investigate+forced+permeability+and+apparent+diffusion+coefficient+in+a+perfusion+cell+culture+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber.</a> Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).</li>
<li>Gaida, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+and+gas+residence+time+distribution+in+a+two-stage+bioreactor+with+cell+recycle%5BTitle%5D)+AND+%22HAL+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle.</a> HAL Open Science. , (2008).</li>
<li>Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wave+characterization+for+mammalian+cell+culture%3A+residence+time+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution.</a> New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).</li>
<li>Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freixó, A., Sánchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+residence+time+distribution+technique+to+the+study+of+the+hydrodynamic+behaviour+of+a+full-scale+wastewater+treatment+plant+plug-flow+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Technology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

W pracy opisano montaż i działanie systemu perfuzyjnej hodowli komórkowej z wieloma źródłami pożywki, co wykazano na konkretnym przykładzie, w którym mierzono dynamikę ekspresji genów sterowanych przez NF-κB w odpowiedzi na przejściowy impuls TNF-α. Zmierzono i zamodelowano RTD elementów systemu perfuzyjnego, a konwolucję sygnału wykorzystano do przewidywania zarówno ekspozycji komórek na impuls TNF-α, jak i rozkładu TNF-α w zebranych frakcjach środowiska ściekowego. Komórki wystawiono na działanie impulsu, a frakcje zbi...

Wiele istotnych procesów biologicznych zachodzi w hodowlach komórkowych i tkankowych w skali czasowej od minut do godzin1,2,3. Chociaż niektóre z tych zjawisk można obserwować i rejestrować w sposób zautomatyzowany, wykorzystując mikroskopię poklatkową4, bioluminescencję1 lub inne metody, eksperymenty obejmujące pobieranie próbek supernatantu hodowli do analizy chemicznej są często przeprowadzane ręcznie w statycznych hodowlach komórkowych. Pobieranie próbek manualnie ogranicza wykonalność niektórych badań ze względu na niedogodności związane z częstym pobieraniem próbek lub koniecznością robienia tego poza godzinami pracy. Dalsze niedoskonałości metod hodowli statycznych obejmują eksperymenty z kontrolowaną, przejściową ekspozycją na bodźce chemiczne. W hodowlach statycznych bodźce muszą być dodawane i usuwane ręcznie, a profile bodźców ograniczają się do zmian skokowych w czasie; ponadto wymiany pożywki powodują dodawanie i usuwanie innych składników medium, co może wpływać na komórki w sposób niekontrolowany5. Systemy fluidyczne mogą rozwiązać te problemy, jednak istniejące urządzenia stwarzają inne wyzwania. Urządzenia mikrofluidyczne wiążą się z wysokimi kosztami specjalistycznego sprzętu i szkolenia niezbędnego do ich produkcji i użytkowania, wymagają mikroanalitycznych metod przetwarzania próbek, a odzyskanie komórek z urządzeń po perfuzji jest utrudnione6. Stworzono niewiele systemów makrofluidycznych dla rodzajów eksperymentów opisanych w niniejszej pracy7,8,9,10, a są one zbudowane z wielu niestandardowych części wykonanych wewnętrznie i wymagają zastosowania wielu pomp lub kolektorów frakcji. Co więcej, autorom nie są znane żadne dostępne komercyjnie makrofluidyczne systemy perfuzyjne do hodowli komórkowych, poza bioreaktorami z mieszadłem do hodowli w zawiesinie, które są użyteczne w bioprodukcji, lecz nie są zaprojektowane do modelowania i badania fizjologii.
Autorzy opisali wcześniej projekt niskokosztowego systemu bioreaktora perfuzyjnego, składającego się niemal w całości z części dostępnych w handlu1. Podstawowa wersja systemu umożliwia utrzymanie wielu kultur w płytce wielodołkowej w inkubatorze CO2 i ich ciągłą perfuzję pożywką za pomocą pompy strzykawkowej, podczas gdy strumienie pożywki odpływowej z kultur są automatycznie frakcjonowane na próbki w czasie za pomocą kolektora frakcji z niestandardową modyfikacją. W ten sposób system ten umożliwia zautomatyzowane pobieranie próbek supernatantu pożywki hodowlanej oraz ciągłe dostarczanie substancji rozpuszczonych do kultur w czasie. System jest makrofluidyczny i modułowy, dzięki czemu można go łatwo modyfikować w celu dostosowania do potrzeb nowych projektów eksperymentalnych.
Ogólnym celem zaprezentowanej tutaj metody jest skonstruowanie, scharakteryzowanie i wykorzystanie perfuzyjnego systemu hodowli komórkowych, który umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, w których mierzone są szybkości sekrecji lub absorpcji substancji przez komórki w czasie i/lub w których komórki są eksponowane na precyzyjne, przejściowe sygnały rozpuszczonych substancji. Niniejszy artykuł wideo wyjaśnia, jak złożyć podstawowy układ, który pozwala na jednoczesną perfuzję do sześciu hodowli komórkowych przy użyciu jednej pompy strzykawkowej i zmodyfikowanego kolektora frakcji. Przedstawiono również dwa użyteczne warianty systemu podstawowego, wykorzystujące dodatkowe pompy i elementy, które umożliwiają przeprowadzanie eksperymentów polegających na wystawianiu komórek na przejściowe sygnały stężenia substancji, w tym krótkie impulsy oraz profile przypominające kinetykę farmakologiczną12, co pokazano na Rysunku 1.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig01.jpg" /> 
Rycina 1: Trzy warianty konstrukcji systemu perfuzyjnego. (Góra) Podstawowy system perfuzyjny. (Środek) System perfuzyjny z kurkiem do obsługi wielu źródeł pożywki. (Dół) System perfuzyjny z mieszadłowym zbiornikiem do symulacji dobrze wymieszanej objętości dystrybucji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig01large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
W wyniku dyspersji i dyfuzji wewnątrz przepływu sygnały substancji rozpuszczonej ulegają zniekształceniu lub „rozmyciu” podczas przemieszczania się przez układ przepływowy. Zniekształcenie to można określić ilościowo przy użyciu rozkładów czasu przebywania (RTD)13. Niniejszy artykuł wyjaśnia, jak przeprowadzać eksperymenty z użyciem znacznika na poszczególnych komponentach systemu perfuzji (Rycina 2) oraz dostarcza skrypty MATLAB do generowania RTD z pomiarowych danych. Szczegółowe wyjaśnienie tej analizy znajduje się w poprzedniej publikacji autorów1. Dodatkowe skrypty MATLAB dopasowują odpowiednie funkcje do RTD i wyodrębniają parametry fizyczne, a także wykonują splot sygnałów z wykorzystaniem RTD, aby przewidzieć, w jaki sposób wprowadzony przez użytkownika sygnał substancji rozpuszczonej będzie się rozprzestrzeniać i zniekształcać w systemie perfuzji14.
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Rozkłady czasu przebywania. RTD komponentów systemu przepływowego, takich jak ten odcinek rurki, mierzy się poprzez wprowadzenie impulsu znacznika do systemu i pomiar stopnia jego „rozmycia” w momencie przedostania się do zbieranych frakcji. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Ericksona i współpracowników1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig02large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>

<table><tbody><tr><td>18 Gauge 1 1/2- calowa jednorazowa igła sondy do użytku ze strzykawkami i automatami dozującymi</td><td>Grainger</td><td>5FVK2</td><td></td></tr><tr><td>293T Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.</td></tr><tr><td>96-dołkowe przezroczyste płyty dolne, Corning</td><td>VWR</td><td>89091-010</td><td>Płytki do pomiaru stężeń barwnika w eksperymentach RTD i GLuc w eksperymencie z reprezentatywnymi wynikami.</td></tr><tr><td>BD&nbsp; Jednorazowe strzykawki z końcówkami Luer-Lok, 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td></td></tr><tr><td>Kolekcjoner frakcji BioFrac&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>7410002</td><td>Kolektor frakcji, który może być używany dla pojedynczego strumienia lub modyfikowany przy użyciu naszej metody, aby umożliwić zbieranie z wielu strumieni.</td></tr><tr><td>Przezroczysty, odporny na promieniowanie UV akryl o wysokiej wytrzymałości 12 "x 12" x 1/8 "</td><td>McMaster-Carr</td><td>4615T93</td><td>Ten arkusz jest cięty za pomocą wycinarki laserowej zgodnie z plikiem DXF w materiałach uzupełniających w celu wytworzenia wielogłowicowego dozownika, który można podłączyć do kolektora frakcji BioFrac.</td></tr><tr>Natywny substrat <td>NanoLight Technology</td><td>303</td> <td>Coelenterazine</td><td>stosowany w teście bioluminescencji lucyferazy Gaussia w reprezentatywnych wynikach.</td></tr><tr><td>Płytki wielodołkowe Corning Costar z powłoką TC, rozmiar 48&nbsp; studzienki, płyta polistyrenowa, studzienki z płaskim dnem</td><td>Millipore Sigma CLS3548</td><td></td><td>Służy do wzrostu i perfuzji komórek 293T w reprezentatywnych wynikach.</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Płytki do hodowli komórkowych Costar z płaskim dnem, rozmiar 12 dołków</td><td>Fisher Scientific</td><td>720081</td><td>Może być zatkany i używany jako zbiornik z mieszadłem w celu uzyskania profili farmakokinetycznych w perfuzji. Może również zawierać komórki do perfuzji.</td></tr><tr><td>DMEM, wysoka zawartość glukozy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>Epilog Zing 24 Laserowe</td><td>systemy tnące</td><td>Epilog Zing 24</td><td>Wycinarka laserowa służąca do produkcji wielogłowicowego dozownika z arkusza akrylowego. Można użyć innych wycinarek laserowych.</td></tr><tr><td>Sterylne strzykawki Fisherbrand do jednorazowego użytku, Luer-Lock, 20 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-460</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne strzykawki Fisherbrand do jednorazowego użytku, Luer-Lock, 60 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-461</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Fisherbrand Premium: 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>Probówki do mikrowirówek do zbierania frakcji.</td></tr><tr><td>Marka rybacka&nbsp; Jednorazowe probówki ze szkła borokrzemianowego z okrągłym dnem i gładkim końcem</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-26</td><td>Szklane rurki do zbierania frakcji.</td></tr><tr><td>Marka rybacka&nbsp; Końcówki do pipet SureOne Micropoint, uniwersalne dopasowanie, bez filtra</td><td>Fisher Scientific</td><td>2707410</td><td>końcówki do pipet 300 ul, które najlepiej pasują do wielogłowicowego dozownika i rurki, pełniąc funkcję końcówek dozujących.</td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; DPBS, proszek, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>21600010</td><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami.</td></tr><tr><td>Wytrząsarka do miana Labline 4625</td><td>Marshall Scientific</td><td>Labline 4625 Wytrząsarka</td><td>orbitalna służąca do utrzymywania mieszanych zbiorników w stanie mieszanym.</td></tr><tr><td>Złączka Masterflex, poliwęglanowa, czterokierunkowy kran odcinający, męska blokada Luer, niesterylna; 10/PK</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-30600-04</td><td>Służy do łączenia wielu strumieni wlotowych do eksperymentów RTD i eksperymentów z hodowlami komórkowymi.</td></tr><tr><td>Złączka Masterflex, Poliwęglan, Prosta, Żeńska Luer x Cap; 25/PK</td><td>Masterflex</td><td>UX-45501-28</td><td></td></tr><tr><td>Złączka Masterflex, Polipropylen, Prosta, Żeńska Adaptery Luer na Króciec do węża, 1/16"</td> <td>Cole-Parmer</td><td>EW-45508-00</td><td></td></tr><tr><td>Złączka Masterflex, Polipropylen, Prosta, Męska Luer Lock do adaptera króćca, 1/16" ID</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45518-00</td><td></td></tr><tr><td>Złączka Masterflex, polipropylenowa, prosta, męska przejściówka Luer Lock na wtyczkę; 25/PK</td><td>Masterflex</td><td>EW-30800-30</td><td></td></tr><tr><td>Rurka do pompy precyzyjnej Masterflex L/S, silikon utwardzany platyną, L/S 14; 25 stóp</td><td>Masterflex</td><td>EW-96410-14</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2019b</td><td>Wersja R2019b. Można również stosować nowsze wersje. Niektóre starsze wersje mogą działać.</td></tr><tr><td>NE-1600 Sześciokanałowa programowalna pompa strzykawkowa</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw stojaków F1</td><td>Bio-Rad</td><td>7410010</td><td>Stojaki do przechowywania rurek zbiorczych w kolektorze frakcji.</td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko TNF-alfa (eksprymowane HEK293),</td> cytokina CF <td>Bio-Techne</td><td>10291-TA-020</td><td>stosowana do stymulacji komórek 293T w reprezentatywnych wynikach.</td></tr><tr><td>Zatyczki Saint Gobain Solid, silikon pionowy, Rozmiar: 00, Dół 10.5mm</td><td>Saint Gobain</td><td>DX263015-50</td><td>Pasuje do płytek 48-dołkowych.</td></tr><tr><td>Zatyczki Saint Gobain Solid, silikon pionowy, Rozmiar: 4 Dół 21mm</td><td>Saint Gobain</td><td>DX263027-10</td><td>Pasuje do płytek 12-dołkowych.</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu, 10,0 N roztwór wodny APHA; 1 L</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>S-395-1LT</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie CAD SolidWorks</td><td>Dassault Systems</td><td>SolidWorks</td><td>służące do tworzenia pliku DXF dozownika wielogłowicowego.</td></tr><tr><td>Wielomodowy czytnik mikropłytek Varioskan LUX</td><td>Czytnik płytek</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>VL0000D0</td>.</tr><tr><td>Wkład bazowy Wilton Color Right Performance Color System, Blue</td><td>Michaels</td><td>10404779</td><td>Niebieski barwnik spożywczy zawierający Brilliant Blue FCF, używany jako znacznik w eksperymentach RTD. Widmo absorbancji osiąga szczyty przy 628 nm.</td></tr></tbody></table>

wielostrumieniowy bioreaktor perfuzyjny zintegrowany z frakcjonowaniem wylotowym w celu dynamicznej hodowli komórek

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Niektóre funkcje komórek i tkanek działają w dynamicznej skali czasu od minut do godzin, które są słabo rozpoznawane przez konwencjonalne systemy hodowli. W ramach tych prac opracowano tani system bioreaktora perfuzyjnego, który umożliwia ciągłą perfuzję pożywki hodowlanej do modułu hodowli komórkowej i frakcjonowanie w module końcowym w celu pomiaru dynamiki w tej skali. System jest zbudowany prawie w całości z dostępnych na rynku części i może być równoległy w celu jednoczesnego przeprowadzania niezależnych eksperymentów na konwencjonalnych wielodołkowych płytkach do hodowli komórkowych. W tym artykule wideo pokazano, jak zmontować konfigurację podstawową, która wymaga tylko jednej wielokanałowej pompy strzykawkowej i zmodyfikowanego kolektora frakcji do równoległego perfuzji do sześciu kultur. Przedstawiono również przydatne warianty konstrukcji modułowej, które pozwalają na kontrolowaną dynamikę stymulacji, takie jak impulsy substancji rozpuszczonej lub profile podobne do farmakokinetycznych. Co ważne, gdy sygnały substancji rozpuszczonej przechodzą przez system, są zniekształcone z powodu dyspersji substancji rozpuszczonej. Ponadto opisano metodę pomiaru rozkładów czasu przebywania (RTD) składników układu perfuzyjnego za pomocą znacznika przy użyciu MATLAB. Czujniki RTD są przydatne do obliczania, w jaki sposób sygnały substancji rozpuszczonej są zniekształcane przez przepływ w systemie wielokomorowym. System ten jest bardzo wytrzymały i powtarzalny, dzięki czemu badacze zajmujący się badaniami podstawowymi mogą go łatwo wdrożyć bez konieczności korzystania ze specjalistycznych zakładów produkcyjnych.

Do pomiaru dynamiki ekspresji genu reporterowego sterowanego przez czynnik jądrowy kappa-light-chain-enhancer aktywowanych limfocytów B (NF-&#954;B) czynnik transkrypcyjny w ludzkich komórkach embrionalnej nerki 293 (HEK293) w odpowiedzi na 1,5-godzinny impuls czynnika martwicy nowotworów alfa (TNF-&#945;). Komórki HEK293 zostały stabilnie transdukowane za pomocą wektorów lentiwirusowych z konstruktem genowym zawierającym lucyferazę Gaussia (GLuc), sterowaną przez promotor zwany NFKB zawierający NF-&#954;element odpowied...

Ten artykuł przedstawia metodę budowy i obsługi taniego, wielokanałowego systemu hodowli komórek perfuzyjnych do pomiaru dynamiki wydzielania i szybkości wchłaniania substancji rozpuszczonych w procesach komórkowych. System może również wystawiać komórki na działanie dynamicznych profili bodźców.

Wielostrumieniowy bioreaktor perfuzyjny zintegrowany z frakcjonowaniem wylotowym w celu dynamicznej hodowli komórek

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...

Ta metoda pomaga zrozumieć, jak tempo wydzielania zmienia się w czasie i jak komórki reagują na zmieniające się w czasie sygnały stałe. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest ona tania, wymaga niewielkiego szkolenia, a konfiguracja systemu profusion może być dostosowana do nowatorskich eksperymentów. Rozpocząć od napełnienia jednej strzykawki roztworem tła i załadować ją do pierwszej pompy strzykawkowej.Napełnić kolejną strzykawkę roztworem znacznikowym i załadować ją do drugiej pompy strzykawkowej. Podłączyć obie strzykawki do dwóch z trzech portów czterokierunkowego zaworu odcinającego za pomocą złączy typu luer. Zamknij kran do roztworu tła i wpompuj roztwór znacznikowy do zaworu odcinającego, aż wypłynie z otwartego portu.Zatrzymać pompę i nie regulować dalej strzykawki. Upewnij się, że ruchoma belka pompy strzykawkowej jest dociśnięta do tłoków strzykawki, tak aby przepływ rozpoczął się natychmiast po uruchomieniu pompy. Zamknąć zawór odcinający do roztworu znacznikowego i pompować roztwór tła do zaworu odcinającego, aż wszystkie pozostałe roztwory znacznikowe zostaną wypłukane z otwartego portu.Zatrzymać pompę i nie regulować dalej strzykawki. Skonfiguruj komponent systemu przepływu żądany do analizy RTD. Włóż końcówkę do dozownika końcówki do pipet i przepompuj roztwór tła przez element, aż zostanie całkowicie napełniony.Ustawić pompę roztworu znacznikowego na żądane natężenie przepływu. Zamknąć zawór odcinający do roztworu tła i uruchomić przepływ roztworu znacznikowego. W tym samym czasie uruchom kolektor frakcji.Kontynuuj przepływ roztworu znacznika przez krótki okres czasu, aby przybliżyć impuls wejściowy znacznika. W przypadku czujników RTD zalecany jest czas trwania impulsu wynoszący 10 minut przy natężeniu przepływu jednego mililitra na godzinę. Zatrzymać pompę roztworu znacznikowego pod koniec okresu impulsu roztworu znacznikowego.Szybko zamknij zawór odcinający do roztworu znacznikowego i rozpocznij przepływ roztworu tła z tą samą szybkością przepływu. Pozwól, aby roztwór tła przepłynął i zbieraj frakcje, aż cały znacznik przejdzie przez system i dotrze do zebranych frakcji. W sterylnych warunkach włożyć korki z igłami do kultur na płytce studzienki z podciągniętymi igłami.Po umieszczeniu korka opuść igły na żądaną wysokość w celu perfuzji, ponieważ wysokość igły wylotowej określa stabilny poziom płynu. Przykryj igły męskimi nasadkami typu luer i trzymaj całą studzienkę w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza do czasu użycia. Przygotuj dwie pożywki, które mają być użyte do perfuzji, oznaczając pożywkę, która zostanie dozowana jako pierwsza, jako jedno, a drugą pożywkę jako dwie.Aby każda kultura miała być poddana perfuzji, napełnij jedną strzykawkę pożywką, aby wystarczyła na cały czas jej dysfuzji plus objętość wystarczającą do początkowego napełnienia systemu perfuzyjnego. Napełnić drugą strzykawkę pożywką numer dwa, aby wystarczyła na cały okres jej odstawienia. Podłączyć obie strzykawki do dwóch z trzech portów czterokierunkowego zaworu odcinającego.Może być wymagany odcinek rurki do podłączenia strzykawek do zaworów odcinających. Przygotuj kurki, zamykając kran dla medium pierwszego i dozując medium drugie do kranu do momentu, aż zacznie kapać z otwartego portu. Następnie zamknij kran dla medium drugiego i wlej medium one do kranu do momentu, aż wszystkie pozostałe medium dwa zostaną wypłukane z otwartego portu.Podłącz rurkę wylotową do otwartego portu kurka za pomocą złącza żeńskiego do zadziorowego luer. Włóż złącze luer męskie na zadzior na drugim końcu rurki. Dozować pożywkę jedną ze strzykawki, aż górna probówka zostanie napełniona pożywką i przystąpić do przygotowania rurki za strzykawką, jak pokazano wcześniej.Włóż złącze luer męskie do zadzioru do jednego końca rurki wylotowej i zakryj je żeńską nasadką luer. Ostrożnie przynieś wszystkie przygotowane rurki, strzykawki i płytkę studzienkową do inkubatora, który będzie używany do perfuzji. Umieścić pompę strzykawkową i kolektor frakcji w żądanych miejscach w pobliżu inkubatora.Umieścić pompę strzykawkową na inkubatorze lub w jego pobliżu, a kolektor frakcji umieścić obok inkubatora w pobliżu portu. Załadować strzykawki do pompy. Zwiąż ze sobą zaślepione końce wszystkich rurek przed i za inkubatorem i wepchnij je z zewnątrz inkubatora do środka przez port.Włóż otwarte końce probówek znajdujących się za nim do końcówek pipet dozujących wielogłowicowego dozownika kolektora frakcji. Wewnątrz inkubatora należy wciągnąć do inkubatora jak najwięcej luzu rurek wylotowych, aby zmaksymalizować długość przewodów, przez które przepływające medium może odbierać ciepło i dwutlenek węgla. Dla każdej zatkanej studzienki szybko odkręć igły oraz rurki przed i za tą studnią, a następnie przymocuj je razem ze złączami luer.Po podłączeniu wszystkich części należy na krótko uruchomić pompę strzykawkową ze stosunkowo dużą prędkością, aby upewnić się, że wszystkie strumienie przepływają prawidłowo. W tym momencie, jeśli pożądane jest rozpoczęcie eksperymentu z rurkami wylotowymi pełnymi medium, kontynuuj pracę pompy, aż wszystkie zostaną napełnione, w przeciwnym razie zatrzymaj pompę. Ustaw natężenie przepływu pompy strzykawkowej dla pożywki i częstotliwość pobierania frakcji i uruchom obie maszyny jednocześnie, aby rozpocząć eksperyment.Gdy konieczna jest wymiana źródła pożywki, należy szybko zatrzymać pompę strzykawkową w przypadku źródła medium. Przekręć kran zamykający na średni i uruchom pompę strzykawkową dla medium drugiego. W razie potrzeby później zmień źródło z powrotem na średnie.Zbierz ułamki na żądany czas trwania eksperymentu. Stężenia znaczników we frakcjach z dwóch eksperymentów RTD zostały zmierzone i wprowadzone do RTD ze skryptu MATLAB w celu wytworzenia dwóch RTD. Pojedyncze rurki i wiele kawałków rurek połączonych szeregowo dobrze pasują do modelu dyspersji pojedynczej osiowej, a dodanie perfuzowanej płytki 48-dołkowej w linii spowodowało znikome odchylenie, umożliwiając dopasowanie zarówno metrowego RTD rury, jak i RTD całego systemu za pomocą funkcji dyspersji osiowej.Przykład złego dopasowania modelu zademonstrowano przy użyciu modelu dyspersji osiowej dopasowanego do danych RTD rury o długości jednego metra i wykreślono go wraz z danymi. Początkowe przypuszczenia parametrów zostały zmienione, aby uzyskać dobre dopasowanie modelu, w którym tau było w przybliżeniu równe objętości systemu perfuzyjnego podzielonej przez jego objętościowe natężenie przepływu. 90-minutowy impuls TNF-alfa został zdefiniowany jako sygnał wejściowy do systemu i został połączony z jednometrowym RTD rurki w celu określenia sygnału TNF-alfa na wlocie płytki studziennej.Sygnał wejściowy został również zbieżny z RTD całego układu w celu wyznaczenia sygnału TNF-alfa na wylocie systemu w zebranych frakcjach. Komórki HEK 293 zostały zmodyfikowane tak, aby wydzielały GLuc sterowane przez promotor zawierający element odpowiedzi NF-kappaB. Eksperyment ujawnił znaczny wzrost ekspresji i powolny spadek ekspresji GLuc napędzany przez NF-kappaB po ekspozycji na TNF-alfa.Warianty systemu opisano w dołączonym artykule, w tym prostszą konfigurację do eksperymentów, które nie wymagają wprowadzania sygnałów i wystawiania komórek na działanie profili substancji rozpuszczonych Pharma-hu.

multi-stream-perfusion-bioreactor-integrated-with-outlet

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy platformę opartą na chipie do trójwymiarowej hodowli komórek w mikrobioreaktorach. Jeden chip może pomieścić do 10 Mio. komórek, które mogą być hodowane w precyzyjnie określonych warunkach pod kątem przepływu cieczy, ciśnienia tlenu itp. w sterylnym, zamkniętym obiegu.

Trójwymiarowa hodowla komórek na chipie w przepływowych mikrobioreaktorach

Opisujemy metodę poddawania przylegających komórek naprężeniom ścinającym w przepływie laminarnym w sterylnym obwodzie przepływu ciągłego. Poprzez przezroczystą komorę można badać adhezję i morfologię komórek, a z obwodu można pobierać próbki do analizy metabolitów oraz zbierać komórki po ekspozycji na siły ścinające do dalszych eksperymentów lub hodowli.

Komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego w przepływie laminarnym

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Tutaj prezentujemy protokół kohodowli komórek pierwotnych, modeli tkanek i biopsji dziurkowania w mikroprzepływowym chipie wielonarządowym przez okres do 28 dni. Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka skóry, agregaty wątroby i biopsje skóry z powodzeniem połączono we wspólnym krążeniu pożywki.

Wielonarządowy chip - platforma mikroprzepływowa do długoterminowej kokultury wielotkankowej

Przedstawiono szczegółowy protokół jednoczesnego działania 48 równoległych kultur komórkowych w różnych warunkach w systemie mikrobioreaktora. Opisano proces hodowli komórek, zbiór i późniejszą analizę miana przeciwciał.

Zastosowanie wysokowydajnego zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktorów do produkcji modelowej IgG1 w komórkach CHO

Opisano proces wytwarzania wielowarstwowego, mikroprzepływowego urządzenia opartego na PDMS, które umożliwia przeprowadzanie reakcji transkrypcji i translacji in vitro (IVTT) przez dłuższy czas. Ponadto zapewniony jest kompleksowy przegląd sprzętu i oprogramowania wymaganego do automatyzacji i utrzymania tych reakcji przez dłuższy czas.

Wielowarstwowa platforma mikroprzepływowa do prowadzenia przedłużonej ekspresji genów bez komórek

Ten protokół demonstruje metody umożliwiające rozszerzoną hodowlę in vitro ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX). Jeden etap zwiększa ogólną żywotność wielokomórkowych kultur klastrowych w hydrożelach 3D, poprzez proste usuwanie niezdolnych do życia pojedynczych komórek. Drugi krok demonstruje najlepsze praktyki dotyczące hodowli PDX w perfuzjowanej platformie mikroprzepływowej.

Zwiększona żywotność kultur hydrożelowych ex vivo 3D ksenoprzeszczepów pobranych od pacjentów w perfuzjonej platformie mikroprzepływowej

Protokół opisuje chirurgiczne pobieranie i późniejszą decelularyzację unaczynionych płatów świńskich poprzez perfuzję detergentu z dodecylosiarczanu sodu przez unaczynienie płata w dostosowanym bioreaktorze perfuzyjnym.

Pobieranie i perfuzja-decelularyzacja unaczynionych płatów świń w niestandardowym bioreaktorze perfuzyjnym

Ten protokół przedstawia konfigurację i działanie nowo opracowanego, wydrukowanego w 3D bioreaktora do hodowli ex vivo naczyń krwionośnych w trakcie perfuzji. System został zaprojektowany tak, aby mógł być łatwo przyjęty przez innych użytkowników, praktyczny, niedrogi i możliwy do dostosowania do różnych zastosowań eksperymentalnych, takich jak podstawowa biologia i badania farmakologiczne.

Ex vivo Kultura perfuzyjna dużych naczyń krwionośnych w bioreaktorze wydrukowanym w 3D

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są niezwykle obiecujące dla zastosowań biomedycznych, ale obecne metody izolacji są czasochłonne i niepraktyczne do użytku klinicznego. W niniejszej pracy prezentujemy urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia bezpośrednią izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z dużych objętości płynów biologicznych w sposób ciągły przy minimalnych krokach.

Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F

Poznaj metodę budowy wielostrumieniowego bioreaktora perfuzyjnego do dynamicznej hodowli komórek i pomiaru kinetyki wydzielania. Niskokosztowy system umożliwia badanie odpowiedzi komórek na zmienne bodźce.

Wielostrumieniowy bioreaktor perfuzyjny zintegrowany z frakcjonowaniem wylotowym w celu dynamicznej hodowli komórek

Przeglądaj więcej filmów