Name: Opracowanie modeli Drosophila melanogaster do obrazowania i optogenetycznej kontroli funkcji serca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Poznaj metodę nieinwazyjnego obrazowania OCT i optogenetycznej kontroli funkcji serca u Drosophila melanogaster. Technika ta umożliwia symulację arytmii i badań nad chorobami serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Andreyowi Komarovowi, Yuxuan Wangowi i Jiantao Zhu za pomoc w analizie danych oraz dziękują członkom laboratorium Zhou za ich cenne dyskusje. Prace w laboratorium dr Zhou były wspierane przez fundusz startowy z Uniwersytetu Waszyngtońskiego w St. Louis, granty National Institutes of Health (NIH) R01-EB025209 i R01-HL156265 oraz Clayco Foundation Innovative Research Award.

Dla niniejszego badania, transgeniczna linia eNpHR2.0 w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2, linia transgeniczna ReaChR w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO i specyficzny dla serca sterownik GAL4 zawierający fragment regulatorowy genu ręki w[1118]; Użyto P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] (ten zapas sterownika będzie oznaczony jako Hand-GAL4). y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 został użyty jako linia reporterska GFP. Wspomniane zapasy Drosophila zostały uzyskane z Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, patrz Tabela Materiałów) i utrzymywane w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 18 °C na standardowych podłożach z mąki kukurydzianej. Modele Drosophila opracowane w tym badaniu są dostępne na żądanie do wspólnej pracy.
1. Krzyżówki genetyczne Drosophila i przygotowanie pożywki
<ol>
	<li>Zmień równoważnik 3. chromosomu TM3 Sb[1] na TM6 Sb Tb, tworząc w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM6 Sb Tb (Hand-GAL4/TM6 Sb Tb). Patrz rysunek uzupełniający 1 dla schematu skrzyżowania. Zestaw krzyżówek w fiolkach ze zwykłą pożywką z mąki kukurydzianej. 
	UWAGA: Obecność markera gruźlicy pozwala użytkownikom odróżnić larwy i poczwarki zawierające transgen opsyny i sterownik GAL4 od zwierząt zawierających opsynę, ale bez driver25.</li>
	<li>Krzyżówki genetyczne należy przechowywać w inkubatorze o temperaturze 25 °C i wilgotności 70% na specjalnie opracowanych pożywkach zawierających all-trans retinaI (ATR) (patrz tabela materiałów) w ciemności przez 5 dni w przypadku pobierania larw i 6 dni w przypadku pobierania poczwarek.</li>
	<li>Połącz pięć dziewiczych samic Hand-GAL4 / TM6 Sb Tb i dwóch do trzech samców z zapasów UAS-opsin (eNpHR2.0 lub ReaChR) w jednej fiolce. Zobacz diagram krzyżowy dla opsyny eNpHR2.0 i ReaChR odpowiednio w Rysunek 2A i Rysunek 2B.</li>
	<li>Następnego dnia należy przygotować fiolki z pożywką zawierającą ATR.
	<ol>
		<li>Przygotuj Semi-Defined Food zgodnie z instrukcjami BDSC26. Zamiast sacharozy i glukozy dodaj tylko sacharozę (5,14 g/100 ml). Schłodzić do ~60 °C przy ciągłym mieszaniu.</li>
		<li>Przygotować wąskie fiolki i dodać 50 μl 100 mM roztworu etanolu ATR do każdej fiolki.</li>
		<li>Za pomocą pipety serologicznej wyrzucić pokarm na muchy do wąskich fiolek na muchy, 5 ml na fiolkę. Wir z maksymalną prędkością przez 10 s.</li>
		<li>Podłącz fiolki i zawiń je w ciemną tkaninę, aby chronić je przed światłem. Pozostaw fiolki do wyschnięcia na co najmniej 12 godzin (przez noc).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnego dnia przenieś muchy równomiernie składające jaja z Kroku 1.3. do fiolek z pokarmem zawierającym ATR (Krok 1.4.4.). Chronić stojaki z fiolkami przed światłem.</li>
	<li>Po 24-48 godzinach (w zależności od liczby złożonych jaj) wyrzuć rodziców, aby zapobiec przepełnieniu fiolki.</li>
	<li>Zbierz potomstwo inne niż gruźlica i użyj go do obrazowania serca. 
	UWAGA: Różnice fenotypowe w stadiach larwalnych i poczwarkowych są pokazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 2C. Podsumowanie i przybliżony harmonogram etapów przygotowania próbki są pokazane na Rysunek 3.</li>
</ol>
2. Optogenetyczna kontrola serca Drosophila
<ol>
	<li>Pobrać larwę/poczwarkę UAS-opsin/Hand-GAL4 z fiolki (Krok 1.7), nałożyć chusteczkę i delikatnie zetrzeć podłoże z powierzchni ciała za pomocą pędzla malarskiego.</li>
	<li>Przygotuj szkiełko mikroskopowe i umieść na środku mały kawałek taśmy dwustronnej.</li>
	<li>Za pomocą pędzla lub cienkiej pęsety delikatnie umieść larwę/poczwarkę na powierzchni taśmy grzbietową stroną do góry i prostopadle do dłuższego boku szkiełka. Delikatnie dociśnij, aby przymocować larwę/poczwarkę do powierzchni taśmy.</li>
	<li>Ustaw szkiełko na stoliku do obrazowania, larwa/poczwarka skierowana w dół.</li>
	<li>Włącz źródło światła OCT za pomocą oprogramowania sterującego laserem (patrz Tabela materiałów). Otwórz niestandardowe oprogramowanie sterujące SD-OCT, a następnie kliknij okno Podgląd.</li>
	<li>Ustaw parametry skanowania w oprogramowaniu SD-OCT. 
	UWAGA: Celem jest wyrównanie próbki w celu optymalnego obrazowania bijącego serca, tak aby wybór zakresu X i zakresu Y obejmował obszar serca. Na tym etapie zarówno liczba skanów A, jak i B-skanów wynosi 400. Zakres w kierunkach x i y wynosi ~490 μm i ~537 μm, co pokazuje odpowiednio dwa ortogonalne przekroje czynne serca (xz i yz).</li>
	<li>Użyj mikromanipulatorów, aby kontrolować sample stage, aby skupić się na sercu muchy. Dostosuj pozycję ogniskowej, aby zminimalizować odbicie światła od powierzchni naskórka muchy. Rozważ nałożenie oleju mineralnego na powierzchnię larwy/poczwarki, aby zminimalizować odbicia. 
	UWAGA: Olej może zwiększać ryzyko przemieszczania się zwierząt poprzez pogorszenie właściwości klejących taśmy.</li>
	<li>Upewnij się, że serce muchy może być w pełni widoczne w oknie obrazu bez żadnych zniekształceń, zablokowania przez tkankę oraz istotnych cieni i odbić; w przeciwnym razie wróć do kroku 2.7.</li>
	<li>Ustaw parametry skanowania dla akwizycji obrazu OCT w trybie M. 
	UWAGA: Liczba skanów A jest zmniejszona w porównaniu z krokiem 2.7. aby uzyskać większą liczbę klatek na sekundę, aby uchwycić dynamikę bicia serca muchy (kilka Hz). Liczba skanów B oznacza liczbę powtarzających się klatek dla obrazowania w trybie M, którą można dostosować w zależności od czasu nagrywania i dostępnej pamięci systemowej. W tym eksperymencie 128 skanów A może pozwolić na prędkość ~125 klatek / s, a 4,000 powtarzających się skanów B jest nagrywanych, co zapewnia ciągły zapis ~32 s.</li>
	<li>Uzyskaj pięć zestawów danych kontrolnych bez impulsów stymulacji światłem czerwonym, aby obliczyć tętno spoczynkowe (RHR).</li>
	<li>Zaprojektuj impuls świetlny do stymulacji stymulacji w niestandardowym oprogramowaniu sterującym OCT. W "Ustawieniach" dodaj zaprojektowane sekwencje impulsów świetlnych, aby kontrolować częstotliwość impulsów, szerokość impulsu, czas trwania stymulacji i czas oczekiwania zgodnie z różnymi protokołami stymulacji. 
	UWAGA: RHR jest mierzony na podstawie eksperymentu kontrolnego bez oświetlenia światłem i używany do obliczania częstotliwości, z jaką światło powinno pulsować w eksperymentach z tachypacingiem i bradypacingiem22.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie sterownika światła (patrz Tabela materiałów), aby wygenerować impulsy światła czerwonego. Wybierz tryb impulsowy w "Wybór trybu". Kliknij dwukrotnie rysunek ustawień "Profil impulsu" i wybierz tryb obserwującego. Utrzymuj intensywność OFF na 0 i ustaw procent intensywności ON po obliczeniu rzeczywistej gęstości mocy. 
	UWAGA: Impulsy świetlne stymulacji są wyzwalane sygnałem z oprogramowania sterującego OCT zgodnie z ustawieniami w kroku 2.12.</li>
	<li>Uzyskaj filmy w trybie M bijącego serca Drosophila ze stymulacją świetlną, klikając Acquire w oprogramowaniu sterującym OCT. Powtórz pomiary 5x.</li>
</ol>
3. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Otwórz specjalnie opracowane oprogramowanie do segmentacji serca muchy.</li>
	<li>Kliknij Wybierz plik, a następnie wybierz plik do analizy w wyświetlonym graficznym interfejsie użytkownika.</li>
	<li>Wprowadź pionowe i poziome granice obszaru serca w pikselach w górnych polach tekstowych. Kliknij Zmień rozmiar. Za pomocą suwaka na dole upewnij się, że cały obszar serca jest widoczny i że wypełnia całe pudełko dla całej kolekcji. Jeśli tak nie jest, powtórz ten proces i dostosuj granice.</li>
	<li>Kliknij Przewiduj, aby przewidzieć region serca. Program przejdzie teraz przez każdy wycinek w kolekcji i wybierze region serca, co zajmie około 3 minut.</li>
	<li>Kliknij na HR Plot po zakończeniu prognozy. Spowoduje to otwarcie nowego okna wyświetlającego wykres obszaru serca w czasie. Upewnij się, że wybrano właściwe obszary szczytu lub doliny. Wybierz Pulse, a następnie HR, aby wygenerować ostateczną figurę, a parametry funkcjonalne zostaną jednocześnie zapisane w .csv plikach.</li>
</ol>

<ol><li>Nature Methods. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+the+Year+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Method of the Year 2010.</a> Nature Methods. 8, 1(2011).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics%3A+10+years+of+microbial+opsins+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).</li>
<li>Tsai, H. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phasic+firing+in+dopaminergic+neurons+is+sufficient+for+behavioral+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning.</a> Science. 324 (5930), 1080-1084 (2009).</li>
<li>Wykes, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+and+potassium+channel+gene+therapy+in+a+rodent+model+of+focal+neocortical+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optogenetic and potassium channel gene therapy in a rodent model of focal neocortical epilepsy.</a> Science Translational Medicine. 4 (161), (2012).</li>
<li>Entcheva, E., Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+optogenetics%3A+a+decade+of+enlightenment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac optogenetics: a decade of enlightenment.</a> Nature Reviews Cardiology. 18 (5), 349-367 (2021).</li>
<li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+heart+muscle+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).</li>
<li>Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y. R., Baier, H., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of cardiac function.</a> Science. 330 (6006), 971-974 (2010).</li>
<li>Nussinovitch, U., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+for+in+vivo+cardiac+pacing+and+resynchronization+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics for in vivo cardiac pacing and resynchronization therapies.</a> Nature Biotechnology. 33 (7), 750-754 (2015).</li>
<li>Nyns, E. C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+hybrid+bioelectronic+system+for+autogenous+restoration+of+sinus+rhythm+in+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">An automated hybrid bioelectronic system for autogenous restoration of sinus rhythm in atrial fibrillation.</a> Science Translational Medicine. 11 (481), (2019).</li>
<li>Bier, E., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+an+emerging+model+for+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Drosophila, an emerging model for cardiac disease.</a> Gene. 342 (1), 1-11 (2004).</li>
<li>Wolf, M. J., Amrein, H., Izatt, J. A., Choma, M. A., Reedy, M. C., Rockman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+the+identification+of+genes+causing+adult+human+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (5), 1394-1399 (2006).</li>
<li>Yu, L., Lee, T., Lin, N., Wolf, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affecting+rhomboid-3+function+causes+a+dilated+heart+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Affecting rhomboid-3 function causes a dilated heart in adult Drosophila.</a> PLOS Genetics. 6 (5), 1000969(2010).</li>
<li>Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+heart+function+in+larval+Drosophila+melanogaster+for+physiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (33), e1596(2009).</li>
<li>Zhu, Y. C., Yocom, E., Sifers, J., Uradu, H., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulatory+effects+on+Drosophila+larva+hearts%3A+Room+temperature%2C+acute+and+chronic+cold+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+B%2C+Biochemical%2C+Systemic%2C+and+Environmental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulatory effects on Drosophila larva hearts: Room temperature, acute and chronic cold stress.</a> Journal of Comparative Physiology. B, Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology. 186 (7), 829-841 (2016).</li>
<li>Zhu, Y. C., Uradu, H., Majeed, Z. R., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+Drosophila+heart+rate+at+different+temperatures+and+Ca2%2B+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of Drosophila heart rate at different temperatures and Ca2+ concentrations.</a> Physiological Reports. 4 (3), 12695(2016).</li>
<li>Malloy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+optogenetics+to+assess+neuroendocrine+modulation+of+heart+rate+in+Drosophila+melanogaster+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A%2C+Neuroethology%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Using optogenetics to assess neuroendocrine modulation of heart rate in Drosophila melanogaster larvae.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 203 (10), 791-806 (2017).</li>
<li>Men, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+preparation+and+longitudinal+imaging+of+heart+function+in+vivo+using+optical+coherence+microscopy+%28OCM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Drosophila preparation and longitudinal imaging of heart function in vivo using optical coherence microscopy (OCM).</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e55002(2016).</li>
<li>Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+adult+Drosophila+melanogaster+heart+with+real-time+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography.</a> Circulation. 114 (2), 35-36 (2006).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+expression+of+the+Alzheimer%27s+disease-associated+presenilin+gene+in+drosophila+heart+leads+to+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Alzheimer+Research%22%5BJournal%5D)">Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction.</a> Current Alzheimer Research. 8 (3), 313-322 (2011).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+the+Drosophila+ortholog+of+SOX5+in+heart+leads+to+cardiac+dysfunction+as+detected+by+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography.</a> Human Molecular Genetics. 22 (18), 3798-3806 (2013).</li>
<li>Men, J., Li, A., Jerwick, J., Li, Z., Tanzi, R. E., Zhou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+red-light+optogenetic+control+of+Drosophila+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Non-invasive red-light optogenetic control of Drosophila cardiac function.</a> Communications Biology. 3 (1), 1-10 (2020).</li>
<li>Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+pacing+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster.</a> Science Advances. 1 (9), 1500639(2015).</li>
<li>Stanley, C. E., Mauss, A. S., Borst, A., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+chloride+flux+on+Drosophila+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">The effects of chloride flux on Drosophila heart rate.</a> Methods and Protocols. 2 (3), 73(2019).</li>
<li>Lindsley, D. L., Zimm, G. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLindsley%2C+DL+%22The+Genome+of+Drosophila+melanogaster%22">The Genome of Drosophila melanogaster</a>. , Elsevier. (1992).</li>
<li>Bloomington Drosophila Stock Center. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/germanfood.html">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/germanfood.html</a> (2022).</li>
<li>Dong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FlyNet+2.0%3A+Drosophila+heart+3D+%282D+%2B+time%29+segmentation+in+optical+coherence+microscopy+images+using+a+convolutional+long+short-term+memory+neural+network%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">FlyNet 2.0: Drosophila heart 3D (2D + time) segmentation in optical coherence microscopy images using a convolutional long short-term memory neural network.</a> Biomedical Optics Express. 11 (3), 1568-1579 (2020).</li>
<li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetics.</a> Nature Methods. 8 (1), 26-29 (2011).</li>
<li>Backhaus, B., Sulkowski, E., Schlote, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-synthetic%2C+general-purpose+medium+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Information+Service%22%5BJournal%5D)">A semi-synthetic, general-purpose medium for Drosophila melanogaster.</a> Drosophila Information Service. 60, 210-212 (1984).</li>
<li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2019+update%3A+A+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 139 (10), 56(2019).</li>
<li>Wolf, M. J., Rockman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+genetic+screens%2C+and+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Drosophila, genetic screens, and cardiac function.</a> Circulation Research. 109 (7), 794-806 (2011).</li>
<li>Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+homology+between+Drosophila+melanogaster+and+vertebrate+cardiovascular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 411-420 (2011).</li>
<li>Ocorr, K., Vogler, G., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assess+Drosophila+heart+development%2C+function+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%5BSupplement+to+Methods+in+Enzymology%5D%22%5BJournal%5D)">Methods to assess Drosophila heart development, function and aging.</a> Methods [Supplement to Methods in Enzymology]. 68 (1), 265-272 (2014).</li>
<li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).</li>
<li>Rotstein, B., Paululat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+morphology+of+the+Drosophila+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">On the morphology of the Drosophila heart.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (2), 15(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W porównaniu z naszymi poprzednimi raportami, w których ekspresja opsyn była napędzana nie tylko w sercu, ale także w otaczających tkankach mięśniowych, w obecnej pracy wykorzystano sterownik specyficzny dla serca, Hand-GAL4. Ta nowa konfiguracja genetyczna Hand> opsyna stosowana do optogenetycznej regulacji serca dodatkowo potwierdza wcześniej zgłoszone wyniki i ustanawia lepszy model badań sercowo-naczyniowych Drosophila .
Przygotowanie podłoża ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia eksperymentów. Białka opsyny wymagają do działania liganda, all-trans retinalu (ATR)28. Muchy nie wytwarzają wystarczającej ilości ATR, więc ATR musi być uzupełniany do pożywki muchowej. W tym badaniu wcześniej zgłoszona żywność instant została zastąpiona pożywkami półzdefiniowanymi29. Nowa receptura pożywek zawierających ATR została wprowadzona w celu zapewnienia równomiernego rozprowadzania ATR. ATR nie rozpuszcza się w wodzie; gdy zapas ATR na bazie etanolu 100 mM jest dodawany do pożywki na bazie wody, jest on rozpraszany przez wirowanie fiolek zawierających ciepłe pożywki półzdefiniowane. Również wcześniej zgłaszane stężenie ATR zostało zmniejszone z 10 mM dla eNpHR2.0 i 3 mM dla ReaChR22 do 1 mM stężenia końcowego dla obu. Stężenie to jest wystarczające do zapewnienia prawidłowej funkcji eNpHR2.0 i ReaChR.
Istotnym elementem sukcesu eksperymentu jest ulepszone przetwarzanie danych za pomocą FlyNet 2.027. Laboratorium kontynuuje rozwój tego oprogramowania, aby poprawić zarówno wydajność obliczeniową, jak i dokładność algorytmu automatycznej segmentacji serca muchy. Maski przekrojowe wytwarzane przez to oprogramowanie służą do uzyskiwania danych fizjologicznych Drosophila , takich jak skrócenie frakcyjne i prędkość ściany serca. Takie podejście umożliwiło wydajną analizę danych przy minimalnym nadzorze człowieka, dzięki czemu charakterystyka funkcji serca w dużych zestawach danych obrazowania serca jest szybsza i bardziej wiarygodna.
Zawał mięśnia sercowego pozostaje główną przyczyną zgonów, a niedokrwienie mięśnia sercowego przyczynia się do dwóch trzecich wszystkich przypadków niewydolności serca, która szybko staje się jedną z głównych przyczyn śmiertelności i zachorowalności w Stanach Zjednoczonych30. Opracowywanie nowych środków terapeutycznych i wyrobów medycznych wymaga dogłębnej wiedzy na temat mechanizmów zaburzeń pracy serca na poziomie fizjologicznym i biochemicznym. Cele te można osiągnąć za pomocą organizmów modelowych. D. melanogaster stał się jednym z najbardziej niezawodnych i wydajnych modeli 31,32,33,34,35. W ramach tych prac stworzono symulowane modele zaburzeń serca Drosophila indukowanych przez nieinwazyjne podejście optogenetyczne. Rozwój nieinwazyjnych technologii optycznej stymulacji serca stanowi podstawę do opracowania alternatywy dla tradycyjnych elektrycznych urządzeń do stymulacji serca. Wykorzystanie OCT do obserwacji czynności serca w czasie rzeczywistym pozwala na dokładne scharakteryzowanie odpowiedniej fizjologii serca w modelach Drosophila w zaawansowanych badaniach, w tym badaniach przesiewowych kandydatów na leki. Obrazowanie OCT ma głębokość penetracji ~1 mm, co dobrze sprawdza się w badaniach serca Drosophila, ale ogranicza jego zastosowanie do charakteryzowania funkcji serca w większych modelach zwierzęcych. Co więcej, bezpośrednie przełożenie badań nad Drosophila na modele ssaków stanowi wyzwanie. Konieczne jest opracowanie nowych narzędzi optogenetycznych, aby poprawić czułość opsyn i przetłumaczyć je na różne systemy modelowe, w tym danio pręgowanego, myszy, szczury i organoidy ludzkiego serca, do badań sercowo-naczyniowych.

Pod koniec 2010 roku czasopismo Nature Methods wybrało optogenetykę jako Metodę Roku1. Wykorzystanie narzędzi genetycznych (transgenicznych opsyn) regulowanych światłem do kontrolowania tkanek biologicznych będących przedmiotem zainteresowania z niespotykaną precyzją i szybkością otworzyło wrota do nowych zastosowań. Do tej pory większość osiągnięć należy do neurobiologii. Technologia ta została wprowadzona jako nowa metoda precyzyjnej kontroli pojedynczych neuronów2 i przyczyniła się do osiągnięć w dziedzinie funkcji poznawczych żywego organizmu3. Od samego początku neuronaukowcy wykazywali zdolność do modulowania zachowania całego organizmu. Ekspresja i aktywacja światłem opsyny ChR2 w neuronach dopaminergicznych myszy powodowały ich aktywację i były wystarczające do napędzania warunkowania behawioralnego4. Optogenetyczne hamowanie podzbioru neuronów zawierających halorodopsynę NpHR2.0 dostarczanych do ogniska padaczkowego mózgu gryzonia spowodowało osłabienie napadów elektroencefalograficznych5.
Zastosowania optogenetyczne w kardiologii rozwijają się w stałym tempie6. ChR2 ulegał pomyślnej ekspresji w hodowli komórkowej kardiomiocytów i u myszy; Stymulację serca przeprowadzono za pomocą błysków niebieskiego światła (wykonanych przy użyciu wszczepionego włókna żywym zwierzętom)7. U danio pręgowanego ChR2 wyrażono i wykorzystano do identyfikacji obszaru serca powodującego rozrusznik serca; Aktywacja NpHR indukowała zatrzymanie akcji serca8. Optogenetyczne spacje serca mają unikalny potencjał do opracowywania nowych terapii stymulacji i resynchronizacji9. Ostatnio donoszono również o próbach stworzenia systemu terminacji autogennej arytmii10.
Szeroko zakrojone badania i rozwój nowych metod leczenia wymagają zastosowania różnych systemów modelowych, od hodowli komórkowych po ssaki. Serce kręgowca jest bardzo złożonym narządem. Kardiomiocyty (CM) stanowią jedną trzecią wszystkich komórek serca; Inne komórki obejmują neurony, komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych i komórki niepobudliwe (tj. Komórki śródbłonka, fibroblasty i komórki odpornościowe). Badania nad hodowlą komórek CM ograniczają przełożenie uzyskanych wyników na zastosowania medyczne u ludzi. Manipulacje genetyczne organizmów modelowych ssaków są ograniczone i czasochłonne. Mniejsze modele bezkręgowców mają wiele zalet; Ich układ sercowo-naczyniowy przenosi wszystkie niezbędne elementy histologiczne. Drosophila melanogaster (muszka owocowa) to prosty i potężny system modeli genetycznych do badania roli genów związanych z chorobami człowieka, w tym chorobami serca11,12,13. Muszki owocowe, jako zwierzęta krótkowieczne, stanowią doskonałą okazję do modelowania zmian funkcji serca zależnych od wieku lub choroby, które można śledzić przez całe życie14,15,16,17. Rurka serca muszki owocowej znajduje się na grzbietowej stronie jej ciała w odległości 200 μm od powierzchni naskórka, dzięki czemu światło widzialne lub bliskiej podczerwieni dociera do rurki serca. Ta cecha anatomiczna umożliwia nieinwazyjną stymulację optyczną serca Drosophila przy użyciu istniejących narzędzi optogenetycznych.
Aby monitorować serce Drosophila, opracowano niestandardowy system obrazowania optycznej tomografii koherentnej (SD-OCT) w domenie spektralnej ze zintegrowanym modułem wzbudzenia LED światła czerwonego18. Zmiany morfologiczne i rytmiczne w stosunkowo prostym sercu muszki owocowej można łatwo przeanalizować za pomocą tej nieinwazyjnej technologii obrazowania biomedycznego12,19,20,21. Dzięki zwiększonej wydajności sekcji optycznej i rozdzielczości przestrzennej w skali mikronów, OCT został z powodzeniem wykorzystany do badania struktury i monitorowania funkcji serca Drosophila na różnych etapach rozwoju, w tym larwy w trzecim stadium rozwojowym i wczesnej pupa18. System ten umożliwia również jednoczesne monitorowanie i stymulację stanu serca Drosophila u nienaruszonego zwierzęcia. Schemat systemu OCT jest pokazany w Rysunek 1. System SD-OCT wykorzystuje diodę superluminescencyjną (SLD) jako źródło światła (środkowa długość fali: 850 nm ± 10 nm, FWHM: 165 nm, patrz Tabela materiałów). Korzystając z soczewki obiektywowej 10x, system obrazowania OCT może osiągnąć rozdzielczość osiową ~4,4 μm w powietrzu i ~3,3 μm w tkance oraz rozdzielczość boczną ~2,8 μm, wystarczającą do rozpoznania drobnych szczegółów struktur serca muchy18,22. Sygnały interferencyjne światła odbitego od ramienia referencyjnego i ramienia próbki są wykrywane za pomocą spektrometru z kamerą do skanowania liniowego o rozdzielczości 2048 pikseli (maksymalna częstotliwość linii: 80 kHz, patrz tabela materiałów). Zmierzona czułość systemu wynosi ~95,1 dB. Każdy skan OCT w trybie B generuje obraz przekroju poprzecznego w płaszczyźnie obrazu xz. Powtarzające się obrazy w trybie B są rejestrowane w tym samym miejscu, aby utworzyć obrazy w trybie M rejestrujące bijące serce przez ponad ~30 s18,22,23. Liczba klatek na sekundę dla obrazowania w trybie M wynosi ~125 klatek/s, co wystarcza do uchwycenia dynamiki bicia serca muszki owocowej.
Do optogenetycznej regulacji funkcji serca Drosophila, moduł oświetleniowy ze źródłem światła LED 617 nm jest zintegrowany z ramieniem próbki systemu SD-OCT. Światło stymulacyjne skupia się na plamce o średnicy ~2,2 mm na powierzchni próbki, w tej samej pozycji, co plamka ostrości obrazowania. Specjalnie napisane oprogramowanie służy do sterowania trybem oświetlenia (natężenie światła, szerokość impulsu i cykl pracy), regulacji częstotliwości stymulacji impulsów świetlnych oraz synchronizacji oświetlenia modułu LED i akwizycji obrazowania OCT w trybie M22.
Ostatnie publikacje opisywały system transgeniczny Drosophila składający się z czasowo regulowanych opsyn ChR2, ReaChR i eNpHR2.0 przy użyciu systemu genetycznego UAS/GAL4. Uzyskane wyniki wykazały zdolność do inicjowania zatrzymania akcji serca i bradykardii spowodowanych aktywacją eNpHR2.0 światłem czerwonym oraz stymulacji serca o wyższej częstotliwości spowodowanej aktywacją ChR2 światłem niebieskim. Podobne eksperymenty stymulacyjne przeprowadzono z inną rodopsyną kanałową, ReaChR, indukowaną przez oświetlenie światłem czerwonym22,23,24. Ekspresja opsyny we wszystkich opisanych eksperymentach była napędzana przez 24B-GAL4, gdzie ekspresję opsyny obserwowano w szerokim zakresie tkanek, w tym w kardiomiocytach i otaczających komórkach mięśniowych. W obecnym badaniu 24B-GAL4 został zastąpiony sterownikiem Hand-GAL4 w celu uzyskania specyficznej dla serca ekspresji opsyn eNpHR2.0 i ReaChR.
Ogólnie, przedstawione wyniki eksperymentalne pokazują możliwe do przywrócenia zatrzymanie akcji serca oraz indukowaną bradykardię i tachykardię choroby serca. Dostępny jest szczegółowy protokół z instrukcjami krok po kroku dotyczącymi tworzenia transgenicznych modeli Drosophila i prowadzenia jednoczesnego obrazowania OCT i eksperymentów z stymulacją optogenetyczną na żywych zwierzętach.

<table><tbody><tr><td>All-trans retinal</td><td>Cayman Chemicals</td><td>18449</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Gibco</td><td>02-10-2025</td><td></td></tr><tr><td>Moduł sterujący źródłem światła BioLED, 4-kanałowy</td><td>Migtex Systems</td><td>BLS-SA04-US</td><td>Część modułu stymulacji optogenetycznej</td></tr><tr><td>Szerokopasmowy moduł źródła światła</td><td>Superlum</td><td>cBLMD-T-850-HP</td><td>Część systemu obrazowania SD-OCT</td></tr><tr><td>Cobra-S Spektrometry 800 OCT</td><td>&nbsp; Wasatch Photonics</td><td>CS800-840/180-80-OC2K-U3</td><td>Część systemu obrazowania SD-OCT</td></tr><tr><td>Delikatne wycieraczki do zadań</td><td>Kimberly-Clark Profesjonalne</td><td>34155</td><td>tkanki</td></tr><tr><td>Drosophila agar</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>Butelki do hodowli Drosophila</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-131</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie FlyNet 2.0</td><td>Z-Lab</td><td></td><td>Niestandardowe oprogramowanie do segmentacji serca muchy i analizy funkcji serca opracowane w laboratorium Zhou</td></tr><tr><td>Źródła kolimatorów LED dużej mocy</td><td>Migtex Systems</td><td>BLS-LCS-0617-03-22</td><td>Część modułu stymulacji optogenetycznej</td></tr><tr><td>Nieaktywne suche drożdże</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-106</td><td></td></tr><tr><td>Preparaty mikroskopowe</td><td>AmScope</td><td>BS-72P</td><td></td></tr><tr><td>Wąskie zatyczki do hodowli Drosophila</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-200</td><td></td></tr><tr><td>Wąskie fiolki do hodowli Drosophila</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116SB</td><td></td></tr><tr><td>Trwała taśma</td><td>dwustronna Zatyczki Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>do butelek Drosophila</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-194</td><td></td></tr><tr><td>Kwas propionowy</td><td>Sigma</td><td>P1386-1L</td><td></td></tr><tr><td>SD-OCT Oprogramowanie sterujące</td><td>Z-Lab</td><td></td><td>Niestandardowe oprogramowanie do akwizycji obrazu i kontroli stymulacji opracowane w laboratorium Zhou</td></tr><tr><td>SD-OCT i optogenetyczny system obrazowania i stymulacji optogenetycznej</td><td>Z-Lab</td><td></td><td>Obrazowanie i optogenetyczne systemy stymulacji opracowane w laboratorium Zhou (~ 50 tys. USD BOM)</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Carolina</td><td>89-2871</td><td></td></tr><tr><td>w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td><td>stock # 41752</td><td>eNpHR2.0 linia transgeniczna</td></tr><tr><td>w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td><td>stock # 53748</td><td>Linia transgeniczna ReaChR</td></tr><tr><td>w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1]</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td><td>stock # 48396</td><td>Specyficzny dla serca sterownik GAL4 zawierający fragment regulatorowy genu ręki</td></tr><tr><td>y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td><td>stock #6658</td><td>Linia reporterska GFP</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Lab Scientific bioKEMIX</td><td>978-907-4243</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie modeli drosophila melanogaster do obrazowania i optogenetycznej kontroli funkcji serca

Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

Użycie Drosophila melanogaster (muszki owocowej) jako organizmu modelowego zapewniło znaczący postęp w wielu dziedzinach nauk biologicznych, od organizacji komórek i badań genomicznych po badania behawioralne. Ze względu na zgromadzoną wiedzę naukową, w ostatnich latach Drosophila została sprowadzona do dziedziny modelowania chorób człowieka, w tym chorób serca. W prezentowanej pracy opisano eksperymentalny system monitorowania i manipulowania funkcją serca w kontekście całego żywego organizmu przy użyciu światła czerwonego (617 nm) i bez procedur inwazyjnych. Kontrolę nad sercem uzyskano za pomocą narzędzi optogenetycznych. Optogenetyka łączy ekspresję światłoczułych transgenicznych opsyn i ich aktywację optyczną w celu regulacji interesującej tkanki biologicznej. W niniejszej pracy wykorzystano niestandardowy zintegrowany system obrazowania optycznej tomografii koherentnej (OCT) i stymulacji optogenetycznej do wizualizacji i modulacji funkcjonującego serca D. melanogaster w 3. stadium rozwoju larwy i wczesnej poczwarki. Podwójny system genetyczny UAS/GAL4 został wykorzystany do ekspresji halorodopsyny (eNpHR2.0) i przesuniętej ku czerwieni rodopsyny kanałowej (ReaChR), w szczególności w sercu muchy. Przedstawiono szczegółowe informacje na temat przygotowania D. melanogaster do obrazowania OCT na żywo i stymulacji optogenetycznej. Opracowane w laboratorium oprogramowanie integracyjne przetworzyło dane obrazowe w celu stworzenia prezentacji wizualnych i ilościowych charakterystyk funkcji serca Drosophila. Wyniki wskazują na możliwość zainicjowania zatrzymania krążenia i bradykardii spowodowanej aktywacją eNpHR2.0 oraz wykonania stymulacji serca po aktywacji ReaChR.

Obecny protokół opisuje wytwarzanie opsyn Drosophila melanogaster wykazujących ekspresję opsyn eNpHR2.0 lub ReaChR w sercu do obrazowania OCT i optogenetycznej stymulacji serca. Podano szczegółowe instrukcje dotyczące obrazowania OCT Drosophila i modulacji bicia serca, w tym symulacji możliwego do przywrócenia zatrzymania akcji serca, bradykardii i tachykardii u żywych zwierząt na różnych etapach rozwoju.

Opracowanie modeli Drosophila melanogaster do obrazowania i optogenetycznej kontroli funkcji serca

Using Drosophila melanogaster (fruit fly) as a model organism has ensured significant progress in many areas of biological science, from cellular ...

W protokole przedstawiono modele Drosophila, w których można scharakteryzować i kontrolować czynność serca za pomocą światła. Dzięki temu naukowcy mogą badać choroby serca u ludzi u Drosophila na nienaruszonych zwierzętach. Metoda ta pozwala niezawodnie osiągnąć nieinwazyjne obrazowanie OCT i optogenetyczną kontrolę funkcji serca Drosophila.Ma wysoką wydajność i jakość. Stymulacja optogenetyczna może być potencjalnie alternatywą dla stymulacji elektrycznej jako terapii w leczeniu zaburzeń arytmii. Obrazowanie OCT i stymulację optogenetyczną można rozszerzyć na inne systemy modelowe, takie jak organoidy serca, danio pręgowany oraz embrionalne gardło i serce.Na początek połącz pięć wskazówek GAL4 z podwójnie pulchną dziewiczą samicą TM6 i dwoma do trzech samców much z UAS Ops i Stocks na fiolkę. Następnego dnia przygotuj częściowo zdefiniowane jedzenie zgodnie z instrukcjami Bloomington Drosophila Stock Center, dodając 5,14 grama na 100 mililitrów sacharozy do pojemnika na gorącym talerzu. Następnie schłodzić do 60 stopni Celsjusza cały czas mieszając.Następnie przygotuj wąskie fiolki muchowe, dodając 50 mikrolitrów 100-milimolowego roztworu etanolu all-trans retinal do każdej fiolki. Użyj pipety serologicznej, aby usunąć pięć mililitrów pokarmu dla much na jedną wąską muchę. Po wirowaniu z maksymalną prędkością przez 10 sekund, podłącz te fiolki i zawiń je w ciemną tkaninę, aby chronić je przed światłem.Następnego dnia przenieś muchy równomiernie składające jaja do fiolek z etanolem all-trans zawierającym pokarm. Chronić stojaki z fiolkami przed światłem. Po 24 do 48 godzinach, w zależności od liczby złożonych jaj, wyrzuć rodziców, aby zapobiec przepełnieniu fiolki.Następnie zbierz potomstwo inne niż tubby do obrazowania serca. Wybierz z fiolki larwę lub poczwarkę GAL4 w opcji UAS, połóż ją na chusteczce i delikatnie zetrzyj podłoże z powierzchni ciała za pomocą pędzla malarskiego. Przygotuj szkiełko mikroskopowe z małym kawałkiem taśmy dwustronnej pośrodku.Następnie delikatnie umieść larwę lub poczwarkę na powierzchni taśmy grzbietową stroną do góry i prostopadle do dłuższego boku szkiełka za pomocą pędzla lub cienkiej pęsety. Delikatnie dociśnij, aby przymocować larwę lub poczwarkę do powierzchni taśmy. Teraz ustaw szkiełko na stoliku do obrazowania z larwą lub poczwarką skierowaną w dół i włącz optyczną tomografię koherentną lub źródło światła OCT za pomocą oprogramowania sterującego laserem.Otwórz niestandardowe oprogramowanie sterujące OCT w domenie spektralnej. Następnie kliknij okno podglądu. Następnie ustaw parametry skanowania w oprogramowaniu OCT w domenie spektralnej.Użyj mikromanipulatorów, aby kontrolować sample stage, aby ustawić ostrość serca muchy. Dostosuj pozycję ogniskowej, aby zminimalizować odbicie światła od powierzchni naskórka muchy. Rozważ również nałożenie oleju mineralnego na powierzchnię larwy lub poczwarki, aby zminimalizować odbicia.Następnie ustaw parametry skanowania dla akwizycji obrazu OCT w trybie M i uzyskaj pięć zestawów danych kontrolnych bez impulsów stymulacji światłem czerwonym, aby obliczyć tętno spoczynkowe. Zaprojektuj impuls świetlny do stymulacji stymulacji w niestandardowym oprogramowaniu sterującym OCT. W tym celu kliknij zakładki ustawień i dodaj zaprojektowane sekwencje impulsów świetlnych, aby kontrolować częstotliwość impulsów, szerokość impulsu, czas trwania stymulacji i czas oczekiwania zgodnie z różnymi protokołami stymulacji.Następnie otwórz oprogramowanie sterownika światła, aby wygenerować impulsy światła czerwonego. Wybierz tryb impulsowy w wyborze trybu. Kliknij dwukrotnie rysunek, aby ustawić profil impulsu i wybierz tryb popychacza.Utrzymuj intensywność wyłączenia na poziomie zerowym i ustaw procent intensywności włączenia po obliczeniu rzeczywistej gęstości mocy. Uzyskaj filmy w trybie M bijącego serca Drosophila ze stymulacją świetlną, klikając Acquire w oprogramowaniu OCT Control. Nagrywaj błyski czerwonego światła wzdłuż serca muchy podczas akwizycji obrazu.Należy pamiętać, że do kontrolowania funkcji serca muchy wymagane są różne ustawienia stymulacji w modelach z rodopsyną kanałową przesuniętą ku czerwieni i NPHR. Otwórz specjalnie opracowane oprogramowanie do segmentacji serca muchy i kliknij wybierz plik. Następnie wybierz plik do analizy w graficznym interfejsie użytkownika.Wprowadź pionowe i poziome granice obszaru serca w pikselach w górnych polach tekstowych. Kliknij Zmień rozmiar. Za pomocą suwaka na dole upewnij się, że cały obszar serca jest widoczny i że wypełnia całe pudełko dla całej kolekcji.Po kliknięciu zakładki przewidywania program przejdzie przez każdy wycinek w kolekcji i wybierze region serca w ciągu około trzech minut. Po zakończeniu przewidywania kliknij wykres HR, aby wyświetlić wykres obszaru serca w czasie w nowym oknie. Wybierz odpowiednie obszary szczytu lub doliny, wybierz zakładki pulsu, a następnie HR, aby wygenerować ostateczną liczbę.Parametry funkcjonalne zostaną jednocześnie zapisane w plikach CSV. Specyficzność tkankową ręcznego sterownika GAL4 zweryfikowano poprzez obrazowanie ekspresji białek zielonej fluorescencji. Przedstawiono tutaj typowe obrazy OCT przekroju poprzecznego ciała larw i poczwarki.Aby naśladować różne choroby serca, zaprojektowano cztery rodzaje impulsów świetlnych. Pojedynczy impuls trwający 10 sekund po pięciu sekundach oczekiwania powodował możliwe do przywrócenia zatrzymanie akcji serca. W przypadku stymulacji serca na częstotliwościach niższych niż tętno spoczynkowe zastosowano dwie sekwencje impulsów świetlnych o częstotliwościach stymulacji równych połowie tętna spoczynkowego i jednej czwartej tętna spoczynkowego trwających osiem sekund z czasem oczekiwania wynoszącym sześć sekund między nimi.Wzorzec stymulacji w celu zwiększenia częstości akcji serca spowodowany aktywacją rodopsyny kanałowej przesuniętą ku czerwieni składał się z trzech sekwencji impulsów świetlnych. Zmniejszona częstotliwość skurczów serca po sygnałach świetlnych skutkowała wolniejszym tętnem, które naśladuje larwy i poczwarki. Seria trzech ciągów impulsów świetlnych o różnych częstotliwościach stymulacji została zastosowana na larwy i serca poczwarek, które wyraźnie wykazały przyspieszone tętno po impulsach świetlnych.Niezbędne jest przygotowanie, wybór odpowiedniego potomstwa, montaż próbki i procedura obrazowania. Mamy nadzieję, że uda nam się przenieść technologię stymulacji optogenetycznej do większych modeli zwierzęcych, badać choroby serca ssaków i badać nowe podejścia terapeutyczne w leczeniu arytmii.

developing-drosophila-melanogaster-models-for-imaging-optogenetic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym opracowaniu opisujemy podstawowy protokół fluorescencyjnego znakowania różnych elementów cewek serca larw i osobników dorosłych Drosophila melanogaster. Próbki te są dobrze dostosowane do obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej. Technika ta umożliwia szczegółową analizę strukturalną cech serc tego potężnego organizmu modelowego.

Fluorescencyjne znakowanie struktur serca Drosophila

Przedstawiono technikę niezbędną do wizualizacji bijącego serca w larwalnym i dorosłym stadium rozwoju Drosophila. Każdy etap cyklu życiowego wymaga zastosowania odmiennej metodologii.

Wizualizacja bijącego serca u Drosophila

Przedstawiamy różne metody monitorowania funkcji serca u larw Drosophila w celu analizy kwestii dotyczących funkcji złączy szczelinowych, mutacji kanałów jonowych, modulacji aktywności rozrusznika oraz w badaniach farmakologicznych.

Monitorowanie funkcji serca u larw Drosophila melanogaster w badaniach fizjologicznych

Czynnikiem ograniczającym wykorzystanie oka dorosłych Drosophila w badaniach nad neurodegeneracją i biologią komórki jest trudność w obrazowaniu procesów wewnątrzkomórkowych. Opisujemy metodę preparowania pojedynczych ommatidiów w celu utworzenia właściwej pierwotnej hodowli komórek neuronalnych, która może być poddawana działaniu leków oraz zaawansowanemu obrazowaniu.

Disekcja i obrazowanie pojedynczego ommatidium Drosophila

Tutaj opisujemy protokół optogenetycznej manipulacji aktywnością motoneuronalną podczas monitorowania zmian w wydatkach motorycznych (skurczu mięśni) u częściowo nienaruszonych larw Drosophila za pomocą laserów w konwencjonalnym mikroskopie konfokalnym. Technika ta umożliwia naukowcom osiągnięcie lokalnych zaburzeń aktywności neuronalnej w kilku neuromerach, aby wyjaśnić dynamikę obwodów motorycznych.

Optogenetyczne zaburzenia aktywności neuronalnej za pomocą oświetlenia laserowego u częściowo nienaruszonych larw Drosophila w ruchu

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

Tutaj opisane są eksperymentalne protokoły przygotowania Drosophila na różnych etapach rozwoju i wykonywania podłużnego optycznego obrazowania uderzeń serca Drosophila za pomocą niestandardowego systemu optycznej mikroskopii koherentnej (OCM). Zmiany morfologiczne i dynamiczne serca można scharakteryzować ilościowo, analizując parametry strukturalne i funkcjonalne serca na podstawie obrazów OCM.

Drosophila Przygotowanie i obrazowanie podłużne funkcji serca in vivo przy użyciu optycznej mikroskopii koherentnej (OCM)

Przedstawiono protokół, który pozwala na wizualizację nienaruszonego Drosophila melanogaster na dowolnym etapie rozwoju za pomocą tomografii mikrokomputerowej.

Obrazowanie całego zwierzęcia Drosophila melanogaster za pomocą tomografii mikrokomputerowej

Ta praca opisuje metodę kontrolowania rytmu serca nienaruszonych mysich serc transgenicznych myszy z rodopsyną kanałową-2 (ChR2) za pomocą lokalnej fotostymulacji za pomocą mikro-LED i jednoczesnego optycznego mapowania potencjału błony nasierdziowej.

Zaawansowane zarządzanie rytmem serca poprzez zastosowanie optogenetycznej fotostymulacji wieloośrodkowej w mysich sercach

Protokół sekcji serca i obrazowania fluorescencyjnego Drosophila upraszcza badanie struktury i patologii serca. Podejście to obejmuje proste cięcie, barwienie i obrazowanie, z pominięciem wiedzy technicznej potrzebnej do tradycyjnej sekcji. Zwiększa to dostępność, dzięki czemu Drosophila jest modelem szerzej wykorzystywanym do badań związanych z sercem w szerszej społeczności naukowej.

Nowatorska i skuteczna metoda barwienia fluorescencyjnego serca Drosophila z kriosekcją

Ten artykuł przedstawia metody manipulacji optogenetycznej u Drosophila melanogaster, wykorzystując CsChrimson i GtACR2 do aktywacji i wyciszania określonych neuronów. Opisano cztery eksperymenty wykorzystujące optogenetykę do badania zachowań termotaktycznych i smakowych, dostarczając wglądu w podstawowe mechanizmy neuronalne rządzące tymi procesami.

Testy behawioralne do optogenetycznej manipulacji obwodami neuronalnymi u Drosophila melanogaster

Poznaj metodę nieinwazyjnego obrazowania OCT i optogenetycznej kontroli funkcji serca u Drosophila melanogaster. Technika ta umożliwia symulację arytmii i badań nad chorobami serca.

Opracowanie modeli Drosophila melanogaster do obrazowania i optogenetycznej kontroli funkcji serca

Przeglądaj więcej filmów