Opracowanie modeli Drosophila melanogaster do obrazowania i optogenetycznej kontroli funkcji serca
25 sierpnia 2022
Obecny protokół opisuje wytwarzanie opsyn Drosophila melanogaster wykazujących ekspresję opsyn eNpHR2.0 lub ReaChR w sercu do obrazowania OCT i optogenetycznej stymulacji serca. Podano szczegółowe instrukcje dotyczące obrazowania OCT Drosophila i modulacji bicia serca, w tym symulacji możliwego do przywrócenia zatrzymania akcji serca, bradykardii i tachykardii u żywych zwierząt na różnych etapach rozwoju.
W protokole przedstawiono modele Drosophila, w których można scharakteryzować i kontrolować czynność serca za pomocą światła. Dzięki temu naukowcy mogą badać choroby serca u ludzi u Drosophila na nienaruszonych zwierzętach. Metoda ta pozwala niezawodnie osiągnąć nieinwazyjne obrazowanie OCT i optogenetyczną kontrolę funkcji serca Drosophila.
Ma wysoką wydajność i jakość. Stymulacja optogenetyczna może być potencjalnie alternatywą dla stymulacji elektrycznej jako terapii w leczeniu zaburzeń arytmii. Obrazowanie OCT i stymulację optogenetyczną można rozszerzyć na inne systemy modelowe, takie jak organoidy serca, danio pręgowany oraz embrionalne gardło i serce.
Na początek połącz pięć wskazówek GAL4 z podwójnie pulchną dziewiczą samicą TM6 i dwoma do trzech samców much z UAS Ops i Stocks na fiolkę. Następnego dnia przygotuj częściowo zdefiniowane jedzenie zgodnie z instrukcjami Bloomington Drosophila Stock Center, dodając 5,14 grama na 100 mililitrów sacharozy do pojemnika na gorącym talerzu. Następnie schłodzić do 60 stopni Celsjusza cały czas mieszając.
Następnie przygotuj wąskie fiolki muchowe, dodając 50 mikrolitrów 100-milimolowego roztworu etanolu all-trans retinal do każdej fiolki. Użyj pipety serologicznej, aby usunąć pięć mililitrów pokarmu dla much na jedną wąską muchę. Po wirowaniu z maksymalną prędkością przez 10 sekund, podłącz te fiolki i zawiń je w ciemną tkaninę, aby chronić je przed światłem.
Następnego dnia przenieś muchy równomiernie składające jaja do fiolek z etanolem all-trans zawierającym pokarm. Chronić stojaki z fiolkami przed światłem. Po 24 do 48 godzinach, w zależności od liczby złożonych jaj, wyrzuć rodziców, aby zapobiec przepełnieniu fiolki.
Następnie zbierz potomstwo inne niż tubby do obrazowania serca. Wybierz z fiolki larwę lub poczwarkę GAL4 w opcji UAS, połóż ją na chusteczce i delikatnie zetrzyj podłoże z powierzchni ciała za pomocą pędzla malarskiego. Przygotuj szkiełko mikroskopowe z małym kawałkiem taśmy dwustronnej pośrodku.
Następnie delikatnie umieść larwę lub poczwarkę na powierzchni taśmy grzbietową stroną do góry i prostopadle do dłuższego boku szkiełka za pomocą pędzla lub cienkiej pęsety. Delikatnie dociśnij, aby przymocować larwę lub poczwarkę do powierzchni taśmy. Teraz ustaw szkiełko na stoliku do obrazowania z larwą lub poczwarką skierowaną w dół i włącz optyczną tomografię koherentną lub źródło światła OCT za pomocą oprogramowania sterującego laserem.
Otwórz niestandardowe oprogramowanie sterujące OCT w domenie spektralnej. Następnie kliknij okno podglądu. Następnie ustaw parametry skanowania w oprogramowaniu OCT w domenie spektralnej.
Użyj mikromanipulatorów, aby kontrolować sample stage, aby ustawić ostrość serca muchy. Dostosuj pozycję ogniskowej, aby zminimalizować odbicie światła od powierzchni naskórka muchy. Rozważ również nałożenie oleju mineralnego na powierzchnię larwy lub poczwarki, aby zminimalizować odbicia.
Następnie ustaw parametry skanowania dla akwizycji obrazu OCT w trybie M i uzyskaj pięć zestawów danych kontrolnych bez impulsów stymulacji światłem czerwonym, aby obliczyć tętno spoczynkowe. Zaprojektuj impuls świetlny do stymulacji stymulacji w niestandardowym oprogramowaniu sterującym OCT. W tym celu kliknij zakładki ustawień i dodaj zaprojektowane sekwencje impulsów świetlnych, aby kontrolować częstotliwość impulsów, szerokość impulsu, czas trwania stymulacji i czas oczekiwania zgodnie z różnymi protokołami stymulacji.
Następnie otwórz oprogramowanie sterownika światła, aby wygenerować impulsy światła czerwonego. Wybierz tryb impulsowy w wyborze trybu. Kliknij dwukrotnie rysunek, aby ustawić profil impulsu i wybierz tryb popychacza.
Utrzymuj intensywność wyłączenia na poziomie zerowym i ustaw procent intensywności włączenia po obliczeniu rzeczywistej gęstości mocy. Uzyskaj filmy w trybie M bijącego serca Drosophila ze stymulacją świetlną, klikając Acquire w oprogramowaniu OCT Control. Nagrywaj błyski czerwonego światła wzdłuż serca muchy podczas akwizycji obrazu.
Należy pamiętać, że do kontrolowania funkcji serca muchy wymagane są różne ustawienia stymulacji w modelach z rodopsyną kanałową przesuniętą ku czerwieni i NPHR. Otwórz specjalnie opracowane oprogramowanie do segmentacji serca muchy i kliknij wybierz plik. Następnie wybierz plik do analizy w graficznym interfejsie użytkownika.
Wprowadź pionowe i poziome granice obszaru serca w pikselach w górnych polach tekstowych. Kliknij Zmień rozmiar. Za pomocą suwaka na dole upewnij się, że cały obszar serca jest widoczny i że wypełnia całe pudełko dla całej kolekcji.
Po kliknięciu zakładki przewidywania program przejdzie przez każdy wycinek w kolekcji i wybierze region serca w ciągu około trzech minut. Po zakończeniu przewidywania kliknij wykres HR, aby wyświetlić wykres obszaru serca w czasie w nowym oknie. Wybierz odpowiednie obszary szczytu lub doliny, wybierz zakładki pulsu, a następnie HR, aby wygenerować ostateczną liczbę.
Parametry funkcjonalne zostaną jednocześnie zapisane w plikach CSV. Specyficzność tkankową ręcznego sterownika GAL4 zweryfikowano poprzez obrazowanie ekspresji białek zielonej fluorescencji. Przedstawiono tutaj typowe obrazy OCT przekroju poprzecznego ciała larw i poczwarki.
Aby naśladować różne choroby serca, zaprojektowano cztery rodzaje impulsów świetlnych. Pojedynczy impuls trwający 10 sekund po pięciu sekundach oczekiwania powodował możliwe do przywrócenia zatrzymanie akcji serca. W przypadku stymulacji serca na częstotliwościach niższych niż tętno spoczynkowe zastosowano dwie sekwencje impulsów świetlnych o częstotliwościach stymulacji równych połowie tętna spoczynkowego i jednej czwartej tętna spoczynkowego trwających osiem sekund z czasem oczekiwania wynoszącym sześć sekund między nimi.
Wzorzec stymulacji w celu zwiększenia częstości akcji serca spowodowany aktywacją rodopsyny kanałowej przesuniętą ku czerwieni składał się z trzech sekwencji impulsów świetlnych. Zmniejszona częstotliwość skurczów serca po sygnałach świetlnych skutkowała wolniejszym tętnem, które naśladuje larwy i poczwarki. Seria trzech ciągów impulsów świetlnych o różnych częstotliwościach stymulacji została zastosowana na larwy i serca poczwarek, które wyraźnie wykazały przyspieszone tętno po impulsach świetlnych.
Niezbędne jest przygotowanie, wybór odpowiedniego potomstwa, montaż próbki i procedura obrazowania. Mamy nadzieję, że uda nam się przenieść technologię stymulacji optogenetycznej do większych modeli zwierzęcych, badać choroby serca ssaków i badać nowe podejścia terapeutyczne w leczeniu arytmii.
Przegląd
Ten protokół opisuje wytwarzanie Drosophila melanogaster ekspresujących opsiny do obrazowania tomografią koherencyjną (OCT) i optogenetycznego stymulowania serca. Zapewnia szczegółowe metody modyfikacji czynności serca u żywych zwierząt, w tym symulowanie różnych stanów serca.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Optogenetyka
- Badania nad układem krążenia
Tło
- Modele Drosophila pozwalają na badanie czynności i chorób serca.
- Techniki optogenetyczne umożliwiają precyzyjną kontrolę aktywności serca.
- Tomografia koherencyjna zapewnia nieinwazyjne obrazowanie dynamiki serca.
- To podejście można rozszerzyć na inne systemy modelowe.
Cel badania
- Opracowanie metody nieinwazyjnego obrazowania i kontroli czynności serca u Drosophila.
- Symulowanie stanów serca takich jak bradykardia i tachykardia.
- Badanie optogenetycznego stymulowania jako potencjalnej terapii dla zaburzeń rytmu serca.
Stosowane metody
- Wytwarzanie Drosophila ekspresujących opsiny.
- Przygotowanie pokarmu zawierającego all-trans retinal dla larw.
- Tomografia koherencyjna (OCT) do obrazowania czynności serca.
- Projektowanie sekwencyjnych impulsów świetlnych do optogenetycznego stymulowania.
Główne wyniki
- Udane obrazowanie czynności serca Drosophila za pomocą OCT.
- Demonstracja optogenetycznej kontroli nad częstością tętna.
- Zdolność do symulowania różnych stanów serca poprzez stymulację świetlną.
- Możliwość zastosowania w większych modelach zwierzęcych.
Wnioski
- Ta metoda zapewnia niezawodne podejście do badania czynności serca u Drosophila.
- Optogenetyczne stymulowanie może służyć jako alternatywa dla tradycyjnych metod stymulacji.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć tę technologię na modele ssaków.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Non-invasive optogenetic control and imaging of cardiac function in Drosophila melanogaster enables high-throughput, genetically tractable modeling of cardiac phenotypes relevant to human disease. This platform supports early-stage mechanistic de-risking and target validation for cardiac drug discovery by providing quantitative, reproducible readouts in a whole-organism context. Integration of OCT imaging with optogenetic pacing advances predictive confidence and translational continuity from discovery biology to preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cardiac function and arrhythmia mechanisms in a genetically defined, in vivo system.
- Supports functional target validation by linking genetic perturbations to quantitative cardiac phenotypes.
- Facilitates mechanistic de-risking through precise, reversible modulation of heart activity.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, scalable platform for quantitative assessment of cardiac responses to genetic or pharmacological interventions.
- Delivers reproducible, high-content imaging and optogenetic stimulation outputs for assay standardization.
- Enables screening readiness for compounds affecting cardiac rhythm or contractility in a whole-organism context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns disease-relevant cardiac phenotypes in Drosophila with translational biomarker strategies.
- Supports continuity from early discovery through preclinical validation by modeling arrhythmia and bradycardia in vivo.
- Provides predictive de-risking for cardiac safety and efficacy prior to mammalian studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven cardiac studies, quantitative phenotyping, and assay development in a genetically tractable model. It is positioned for integration from target validation through lead identification and preclinical risk assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for cardiac targets using optogenetic and imaging readouts.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound or genetic screening in a whole-organism system.
- Analytics: Provides high-resolution, time-resolved measurements of heart function for robust statistical comparison.
- Translational Research: Enables alignment of Drosophila cardiac phenotypes with preclinical biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for cardiac research across multiple genetic backgrounds and interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac target validation.
- Operational Value: Standardizes non-invasive, high-throughput cardiac phenotyping and optogenetic control workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling early risk assessment of cardiac liabilities.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cardiac programs with quantitative, translational data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, optogenetics, and OCT imaging.
- Needs access to custom imaging and light stimulation instrumentation with integrated analysis software.
- Demands cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptation to other model systems (e.g., organoids, zebrafish) may require protocol optimization.
- Practical limitations include throughput constraints and the need for precise genetic control.
