Name: Charakterystyka modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach za pomocą spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Poznaj metodę profilowania modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach Aplysia californica za pomocą chromatografii cieczowej i spektrometrii mas. Ta technika umożliwia jednoczesne wykrycie ponad tuzina zmodyfikowanych nukleozydów w pojedynczej komórce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez National Institute on Drug Abuse w ramach Award No. P30DA018310 oraz National Human Genome Research Institute w ramach Award no. RM1HG010023. K.D.C. dziękuje za wsparcie ze strony stypendium podoktorskiego Instytutu Beckmana. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy agencji finansujących.

1. Przygotowanie materiałów i roztworów
<ol>
	<li>Przygotuj sztuczną wodę morską (ASW) o stężeniu 460 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 22 mM MgCl2, 26 mMMgSO4 i 10 mM HEPES w wodzie uzyskanej z rygorystycznego systemu oczyszczania. Doprowadzić pH do 7,8 za pomocą 1 M NaOH lub HCl. Zazwyczaj należy przygotować 1 l ASW i przechowywać w temperaturze 14 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Przygotować roztwór antybiotyku ASW z 10 000 j./ml penicyliny G, 10 μg/μl streptomycyny i 10 μg/μl gentamycyny i przechowywać w temperaturze -20 °C. Bezpośrednio przed eksperymentem rozmrozić i rozcieńczyć zamrożony roztwór podstawowy antybiotyków w stosunku 1:100 w 20-40 ml ASW. Końcowe stężenie antybiotyków w roboczym roztworze ASW wynosi 100 μg/ml penicyliny G, 100 μg/ml streptomycyny i 100 μg/ml gentamycyny.</li>
	<li>Przygotować bufor do trawienia RNA, łącząc 1 μl 10 μg/μl albuminy surowicy bydlęcej, 0,5 μl 0,5 μg/μl pentostatyny, 0,495 μl fosfatazy alkalicznej 2 U/μL, 1 μl fosfodiesterazy 0,1 U fosfodiesterazy I (w 10 mM MgCl2) i 0,38 μl endonukleazy z Serratia marcescens (25 U) na próbkę. W przypadku analizowania wielu próbek należy przygotować mieszankę wzorcową w oddzielnej probówce zawierającej objętość każdego odczynnika pomnożoną przez liczbę próbek do analizy, plus jeszcze jedną próbkę, aby uwzględnić przypadkową utratę odczynnika w wyniku etapów przenoszenia pipety.</li>
	<li>Przygotuj kilka ostrych igieł (szklanych lub metalowych) do ręcznej izolacji neuronów. Wykonaj metalowe igły we własnym zakresie poprzez elektrochemiczne trawienie drutu wolframowego, jak w30 lub kup je. Przygotować szklane igły z grubościennych lub standardowych kapilar ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1 mm) za pomocą ściągacza do mikropipet. W przypadku niniejszej metody należy zachować średnicę końcówki igły w zakresie 1-5 μm, przy długości szyjki 100-150 μm. 
	UWAGA: Wytwarzanie zarówno igieł metalowych, jak i szklanych można zoptymalizować w celu wytworzenia narzędzi, które odpowiadają indywidualnym potrzebom badacza i konkretnemu badanemu modelowi biologicznemu.</li>
</ol>
2. Izolacja pojedynczego neuronu
<ol>
	<li>Schłodzić roztwór 0,33 M MgCl2 do temperatury 14 °C. Za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml znieczulić A. californica (150-250 g) poprzez wstrzyknięcie roztworu MgCl2 do jamy ciała zwierzęcia. Najlepsze wyniki uzyskuje się przy stosunku objętości roztworu (ml) do masy ciała zwierzęcia (g) w stosunku 1:3. Odczekaj około 3 minut, aż zwierzę się zrelaksuje, upewniając się, że nie wykazuje skurczów ciała w odpowiedzi na stymulację dotykową.</li>
	<li>Umieść zwierzę stroną brzuszną (stroną ze stopą) do góry na tacy preparcyjnej. Wypreparuj zwierzę za pomocą nożyczek chirurgicznych z jedną końcówką skierowaną w stronę zwierzęcia, ostrożnie wykonując podłużne cięcie przez stopę.</li>
	<li>Przypnij rostralną, ogonową i boczną stronę ciała zwierzęcia, aby odsłonić narządy wewnętrzne i zwoje OUN znajdujące się w jamie ciała. Odizoluj główne zwoje OUN od zwierzęcia poprzez chirurgiczne przecięcie nerwów i niektórych łączników pochodzących ze zwojów.</li>
	<li>Zanurzyć zwoje nerwowe w roztworze proteazy typu XIV ze Streptomyces griseus (10 mg/ml w roztworze antybiotyków ASW) i inkubować w temperaturze 34 °C przez 30 minut lub 1 godzinę (w przypadku zwoju mózgowego). 
	UWAGA: Czas trwania inkubacji zależy od pory roku, wielkości i kondycji zwierzęcia, a także docelowych neuronów. Izolacja niektórych neuronów wymaga dłuższej inkubacji niż innych i powinna być określona doświadczalnie.</li>
	<li>Przepłukać zwoje jaj 6x roztworem antybiotyków ASW i przenieść wszystkie zwoje jaj do naczynia pokrytego polimerem silikonowym wypełnionego roztworem antybiotyków ASW za pomocą polipropylenowej pipety transferowej, która została przycięta do otworu ~5 mm. Traktować pipetę 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej w ASW, aby zminimalizować przywieranie zwojów do pipety (opcjonalnie). Zwoje jaj powinny być zanurzone w ASW przez cały czas. 
	UWAGA: Leczenie enzymatyczne zmniejsza stabilność mechaniczną neuronów i otaczającej tkanki łącznej, w wyniku czego błony neuronalne mogą zostać uszkodzone w wyniku wystawienia na działanie powietrza podczas przenoszenia zwojów.</li>
	<li>Przypnij zwoje nerwowe i użyj mikronożyczek i drobnych kleszczy, aby usunąć osłonki ganglionu. Przy wystarczająco silnym leczeniu enzymatycznym do usuwania osłon należy użyć szklanych lub metalowych igieł.</li>
	<li>Wizualnie zidentyfikuj neurony A. californica, które Cię interesują. W niniejszej pracy badano następujące komórki: R2 w zwoju brzusznym, LPl1 w zwoju opłucnej, komórki śródmózgowe (MCC) w zwoju mózgowym oraz komórki B2 w zwoju policzkowym. Wykonaj obrazy optyczne wszystkich preparatów nerwowych i zwojowych za pomocą skalibrowanego mikroskopu przy 20-krotnym powiększeniu całkowitym, aby określić rozmiary i objętości każdego typu komórek.</li>
	<li>Za pomocą wyciągniętej szklanej kapilary lub ostrych igieł wolframowych ostrożnie odizoluj zidentyfikowaną komórkę od dużego zwoju.</li>
	<li>Pobrać niewielką ilość (1 μl) ASW do plastikowej mikropipety, a następnie przenieść wyizolowaną komórkę do probówki z próbką do PCR zawierającej 4 μl 0,365 M octanu amonu (pH 9,2). W przypadku ślepej próby należy pobrać 5 μl podwielokrotności roztworu antybiotyków ASW z naczynia zawierającego ganglion i wymieszać z buforem wytrawiającym (opisanym poniżej).</li>
</ol>
3. Liza komórek i trawienie RNA dla SNRMA-MS
<ol>
	<li>Poddaj lizie izolowane neurony poprzez wielokrotne zasysanie i dozowanie za pomocą mikropipety (średnica wewnętrzna ~100 μm) w 0,365 M octanu amonu. Niektóre mniejsze komórki mogą nie pęknąć od razu; Aby je zlizować, należy przyłożyć nacisk do średnicy komórki za pomocą wyciągniętej szklanej kapilary.</li>
	<li>Za pomocą termocyklera podgrzać próbki z następującym programem temperatury: 95 °C przez 3 minuty, 10 °C przez 3 minuty, trzymać w temperaturze 10 °C. Wyjmij probówkę z termocyklerem.</li>
	<li>Dodać 3,375 μl buforu do trawienia RNA do każdej próbki i wymieszać roztwór za pomocą mikropipety, pobierając i dozując roztwór kilka razy. Użyj miniaturowej wirówki stołowej o sile 2700 x g przez 30 s, aby odwirować wszelkie kropelki cieczy przylegające do ścianek probówki do PCR.</li>
	<li>Inkubować próbki w termocyklerze w temperaturze 37 °C przez 3 godziny, a następnie utrzymywać je w temperaturze 10 °C (podgrzewana pokrywa ustawiona w pozycji ON). Natychmiast po schłodzeniu próbki do temperatury 10 °C przenieść 7 μl roztworu do fiolki z automatycznym podajnikiem próbek wyposażonej w wkładkę o pojemności 250 μl, uważając, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków w probówce automatycznego podajnika próbek.</li>
</ol>
4. Chromatografia cieczowa z tandemową spektrometrią mas
UWAGA: Analizuj trawienie pojedynczych neuronów i autentyczne zmodyfikowane wzorce nukleozydów za pomocą systemu LC-MS/MS wyposażonego w źródło jonizacji elektrorozpylania i sześcioportowy zawór przełączający.
<ol>
	<li>Aby przygotować układ LC do separacji kanonicznych i zmodyfikowanych nukleozydów, należy zrównoważyć kolumnę C18 (150 mm x 2,1 mm, wielkość cząstek 2,2 μm, średnica porów 120 A) z 99% ruchomą fazą A (5 mM octanu amonu, pH 5,6) i 1% fazą ruchomą B (60/40 faza ruchoma A/acetonitryl (ACN)) przy natężeniu przepływu 0,2 ml/min przez 12 minut w temperaturze 36 °C. Do przygotowania mobilności należy użyć rozpuszczalników klasy LC-MS Fazy.</li>
	<li>Podczas gdy LC równoważy się, skalibrować spektrometr masowy, wprowadzając 1 mM roztwór octanu sodu w 50/50 ACN/woda do spektrometru masowego za pomocą pompy strzykawkowej o natężeniu przepływu 5 μl/min. Po kalibracji ponownie podłącz przepływ LC do spektrometru mas.</li>
	<li>Zaprogramować następujące parametry gradientu liniowego: 1% B przez 0-5 min, 5% B po 9 min, 7% B po 11 min, 10% B po 13 min, 15% B po 32 min, 40% B po 38 min, 50% B po 43 min, 100% B po 50 min, 100% B po 60 min, 1% B po 61 min, i 12-minutowe przywrócenie równowagi przy 1% B przed następnym wstrzyknięciem.</li>
	<li>Uruchomić przyrząd MS w trybie dodatnim z następującymi parametrami: napięcie kapilarne ustawione na 4 500 V, temperatura suszenia 275 °C, gaz suszący N2 5 l/min i gaz nebulizujący 1 bar. Ustawić zawór przełączający na marnotrawstwo przez pierwsze 2 minuty analizy i na źródło przez pozostałą część cyklu.</li>
	<li>Zbieraj widma masowe w zakresie m/z 110-600. Wybierz jony do dysocjacji wywołanej zderzeniem przy 35-40 eV w czasie cyklu 3 s, korzystając z preferowanej listy mas skonstruowanej przy użyciu database2 i okna izolacji ± 0,5. Użyj aktywnego wykluczenia, aby wykluczyć jony z fragmentacji po trzech widmach.</li>
	<li>Ustaw dynamiczną akwizycję widm MS/MS dla jonów o intensywności powyżej i poniżej 50 000 zliczeń odpowiednio przy 4 Hz i 1 Hz oraz minimalny próg selekcji jonów na poziomie 1 990 zliczeń.</li>
	<li>Dla ilościowych SNRMA-MS należy skonstruować krzywe kalibracyjne przy użyciu obszarów pików wyekstrahowanego chromatogramu jonowego (EIC) uzyskanych dla zmodyfikowanych wzorców nukleozydów przy co najmniej pięciu stężeniach, aby umożliwić interpolację nieznanych stężeń endogennego analitu. 
	UWAGA: Neurony uzyskane od zwierząt o masie ciała 150-250 g zazwyczaj wymagają krzywych kalibracyjnych dla zmodyfikowanych nukleozydów w zakresie od 0,02 pmol do 2 pmol, ale wartości te mogą się różnić w zależności od czułości instrumentu.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Wygeneruj EIC dla zmodyfikowanych nukleozydów (m/z z wartości bazy danych2). Zweryfikuj tożsamość przypuszczalnie zmodyfikowanych nukleozydów, porównując ich widma MS2 i charakterystykę retencji LC z wartościami bazy danych2. Tabela 1 zawiera listę typowych modyfikacji RNA wykrytych w pojedynczych neuronach A. californica.</li>
	<li>Ręcznie całkuj piki odpowiadające zmodyfikowanym i kanonicznym nukleozydom i zapisuj te wartości w arkuszu kalkulacyjnym. Znormalizować obszar piku dla każdego zmodyfikowanego nukleozydu sumą obszarów pików dla kanonicznej cytydyny, urydyny i guanozyny wykrytych w próbce. 
	UWAGA: Adenozyna nie jest objęta normalizacją ze względu na jej rolę w OUN jako dynamicznego neuromodulatora31.</li>
	<li>Skonstruuj macierz danych składającą się z każdej próbki pojedynczego neuronu i odpowiadających jej znormalizowanych obszarów pików dla zmodyfikowanych nukleozydów, które wykazywały stosunek sygnału do szumu >10. Wykonaj analizę składowych głównych (PCA) i wyświetl pierwsze dwie składowe główne na wykresie punktacji. Skonstruować liniowe krzywe kalibracyjne z obszarów pików EIC uzyskanych z szeregowego rozcieńczania wzorców nukleozydów i obliczyć stężenia wykrytych analitów.</li>
</ol>

<ol><li>Cantara, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+modification+database%2C+RNAMDB%3A+2011+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update.</a> Nucleic Acids Research. 39, suppl_1 195-201 (2011).</li>
<li>Boccaletto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MODOMICS%3A+a+database+of+RNA+modification+pathways.+2017+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update.</a> Nucleic Acids Research. 46, 303-307 (2017).</li>
<li>Kimura, S., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+degradosome+promotes+tRNA+quality+control+through+clearance+of+hypomodified+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The RNA degradosome promotes tRNA quality control through clearance of hypomodified tRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (4), 1394-1403 (2019).</li>
<li>Helm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+nucleotide+modification+and+alternative+folding+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional nucleotide modification and alternative folding of RNA.</a> Nucleic Acids Research. 34 (2), 721-733 (2006).</li>
<li>Rezgui, V. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA+tKUUU%2C+tQUUG%2C+and+tEUUC+wobble+position+modifications+fine-tune+protein+translation+by+promoting+ribosome+A-site+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">tRNA tKUUU, tQUUG, and tEUUC wobble position modifications fine-tune protein translation by promoting ribosome A-site binding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12289-12294 (2013).</li>
<li>Shanmugam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+methylation+of+tRNA-Asp+by+DNMT2+has+a+role+in+translation+of+proteins+containing+poly-Asp+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cytosine methylation of tRNA-Asp by DNMT2 has a role in translation of proteins containing poly-Asp sequences.</a> Cell Discovery. 1 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Jia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N+6-Methyladenosine+in+nuclear+RNA+is+a+major+substrate+of+the+obesity-associated+FTO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">N 6-Methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO.</a> Nature Chemical Biology. 7 (12), 885-887 (2011).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+mapping+reveals+reversible+and+dynamic+N+1+-methyladenosine+methylome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N 1 -methyladenosine methylome.</a> Nature Chemical Biology. 12 (5), 311-316 (2016).</li>
<li>Krogh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+2%E2%80%B2-O-Me+in+human+rRNA+reveals+a+subset+of+fractionally+modified+positions+and+provides+evidence+for+ribosome+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Profiling of 2′-O-Me in human rRNA reveals a subset of fractionally modified positions and provides evidence for ribosome heterogeneity.</a> Nucleic Acids Research. 44 (16), 7884-7895 (2016).</li>
<li>Babaian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+m1acp3%CE%A8+Ribosomal+RNA+Modification+Is+a+Major+Feature+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of m1acp3Ψ Ribosomal RNA Modification Is a Major Feature of Cancer.</a> Cell Reports. 31 (5), 107611(2020).</li>
<li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+RNA+m6A+methylation+represents+a+new+layer+of+control+in+the+gene+regulatory+network+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Region-specific RNA m6A methylation represents a new layer of control in the gene regulatory network in the mouse brain.</a> Open Biology. 7 (9), 170166(2017).</li>
<li>Wang, C. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METTL3-mediated+m6A+modification+is+required+for+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">METTL3-mediated m6A modification is required for cerebellar development.</a> PLOS Biology. 16 (6), 2004880(2018).</li>
<li>Engel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+m6A%2Fm-RNA+methylation+in+stress+response+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The role of m6A/m-RNA methylation in stress response regulation.</a> Neuron. 99 (2), 389-403 (2018).</li>
<li>Widagdo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+accumulation+of+N6-Methyladenosine+in+the+prefrontal+cortex+is+associated+with+memory+processes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent accumulation of N6-Methyladenosine in the prefrontal cortex is associated with memory processes in mice.</a> Journal of Neuroscience. 36 (25), 6771-6777 (2016).</li>
<li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li>
<li>Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+single-cell+proteomics+workflow+identifies+%3E1000+protein+groups+per+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive single-cell proteomics workflow identifies >1000 protein groups per mammalian cell.</a> Chemical Science. 12 (3), 1001-1006 (2021).</li>
<li>Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+metabolites+and+peptides+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Profiling metabolites and peptides in single cells.</a> Nature Methods. 8 (4), 20-29 (2011).</li>
<li>Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+differentiation+of+neuronal+phenotypes+by+single-cell+capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolic differentiation of neuronal phenotypes by single-cell capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (17), 6810-6817 (2011).</li>
<li>Lovatt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+in+vivo+analysis+%28TIVA%29+of+spatially+defined+single+cells+in+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue.</a> Nature Methods. 11 (2), 190-196 (2014).</li>
<li>Kærn, M., Elston, T. C., Blake, W. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochasticity+in+gene+expression%3A+from+theories+to+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Stochasticity in gene expression: from theories to phenotypes.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (6), 451-464 (2005).</li>
<li>Chan, C. T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+systems+approach+reveals+dynamic+control+of+tRNA+modifications+during+cellular+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A quantitative systems approach reveals dynamic control of tRNA modifications during cellular stress.</a> PLOS Genetics. 6 (12), 1001247(2010).</li>
<li>Sun, C., Jora, M., Solivio, B., Limbach, P. A., Addepalli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+ultraviolet+radiation+on+nucleoside+modifications+in+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The effects of ultraviolet radiation on nucleoside modifications in RNA.</a> ACS Chemical Biology. 13 (3), 567-572 (2018).</li>
<li>Heiss, M., Hagelskamp, F., Marchand, V., Motorin, Y., Kellner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+NAIL-MS+allows+insight+into+human+tRNA+and+rRNA+modification+dynamics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell culture NAIL-MS allows insight into human tRNA and rRNA modification dynamics in vivo.</a> Nature Communications. 12 (1), 389(2021).</li>
<li>Clark, K. D., Lee, C., Gillette, R., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neuronal+RNA+modifications+during+non-associative+learning+in+aplysia+reveals+key+roles+for+tRNAs+in+behavioral+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of neuronal RNA modifications during non-associative learning in aplysia reveals key roles for tRNAs in behavioral sensitization.</a> ACS Central Science. 7 (7), 1183-1190 (2021).</li>
<li>Basanta-Sanchez, M., Temple, S., Ansari, S. A., D'Amico, A., Agris, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attomole+quantification+and+global+profile+of+RNA+modifications%3A+Epitranscriptome+of+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Attomole quantification and global profile of RNA modifications: Epitranscriptome of human neural stem cells.</a> Nucleic Acids Research. 44 (3), 26(2016).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+DNA+and+RNA+methylation+in+circulating+tumor+cells+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of DNA and RNA methylation in circulating tumor cells by mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 88 (2), 1378-1384 (2016).</li>
<li>Sarin, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano+LC-MS+using+capillary+columns+enables+accurate+quantification+of+modified+ribonucleosides+at+low+femtomol+levels%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Nano LC-MS using capillary columns enables accurate quantification of modified ribonucleosides at low femtomol levels.</a> RNA. 24 (10), 1403-1417 (2018).</li>
<li>Clark, K. D., Philip, M. C., Tan, Y., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+liquid+microjunction+extraction+for+profiling+neuronal+RNA+modifications+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biphasic liquid microjunction extraction for profiling neuronal RNA modifications by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 92 (18), 12647-12655 (2020).</li>
<li>Clark, K. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+RNA+modification+analysis+by+mass+spectrometry%3A+Characterizing+RNA+modification+patterns+and+dynamics+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry: Characterizing RNA modification patterns and dynamics with single-cell resolution.</a> Analytical Chemistry. 93 (43), 14537-14544 (2021).</li>
<li>Guise, O. L., Ahner, J. W., Jung, M. -C., Goughnour, P. C., Yates, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+electrochemical+etching+of+tungsten+probe+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Reproducible electrochemical etching of tungsten probe tips.</a> Nano Letters. 2 (3), 191-193 (2002).</li>
<li>Peng, W., Wu, Z., Song, K., Zhang, S., Li, Y., Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+sleep+homeostasis+mediator+adenosine+by+basal+forebrain+glutamatergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons.</a> Science. 369 (6508), (2020).</li>
<li>Rayport, S. G., Ambron, R. T., Babiarz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+cholinergic+neurons+R2+and+LPl1+control+mucus+release+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Identified cholinergic neurons R2 and LPl1 control mucus release in Aplysia.</a> Journal of Neurophysiology. 49 (4), 864-876 (1983).</li>
<li>Rosen, S. C., Weiss, K. R., Goldstein, R. S., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+a+modulatory+neuron+in+feeding+and+satiation+in+Aplysia%3A+effects+of+lesioning+of+the+serotonergic+metacerebral+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of a modulatory neuron in feeding and satiation in Aplysia: effects of lesioning of the serotonergic metacerebral cells.</a> Journal of Neuroscience. 9 (5), 1562-1578 (1989).</li>
<li>Lloyd, P. E., Kupfermann, I., Weiss, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+peptidergic+neurons+regulate+gut+motility+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Central peptidergic neurons regulate gut motility in Aplysia.</a> Journal of Neurophysiology. 59 (5), 1613-1626 (1988).</li>
<li>Crain, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+enzymatic+hydrolysis+of+DNA+and+RNA+for+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation and enzymatic hydrolysis of DNA and RNA for mass spectrometry.</a> Methods in Enzymology. 193, 782-790 (1990).</li>
<li>Kadakkuzha, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+bidirectional+modulation+of+gene+expression+in+single+identified+R15+neuron+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Age-associated bidirectional modulation of gene expression in single identified R15 neuron of Aplysia.</a> BMC Genomics. 14 (1), 880(2013).</li>
<li>Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aplysia+ganglia+preparation+for+electrophysiological+and+molecular+analyses+of+single+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (83), e51075(2014).</li>
<li>Tardu, M., Jones, J. D., Kennedy, R. T., Lin, Q., Koutmou, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantification+of+modified+nucleosides+in+saccharomyces+cerevisiae+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and quantification of modified nucleosides in saccharomyces cerevisiae mRNAs.</a> ACS Chemical Biology. 14 (7), 1403-1409 (2019).</li>
<li>Heiss, M., Reichle, V. F., Kellner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+the+fate+of+tRNA+and+its+modifications+by+nucleic+acid+isotope+labeling+mass+spectrometry%3A+NAIL-MS%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Observing the fate of tRNA and its modifications by nucleic acid isotope labeling mass spectrometry: NAIL-MS.</a> RNA Biology. 14 (9), 1260-1268 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

SNRMA-MS wykorzystuje zoptymalizowane podejście do przygotowania próbek, co skutkuje niewielką, kompatybilną z MS objętością próbki, która może być dostarczona na platformę LC-MS. Wstępna enzymatyczna obróbka wstępna zwojów OUN decyduje zarówno o łatwości, z jaką można je wyjąć, jak i o trwałości pojedynczych neuronów podczas izolacji. Zwój mózgowy często wymaga przedłużonego leczenia enzymatycznego ze względu na stosunkowo grubą osłonkę w porównaniu ze zwojami policzkowymi, opłucnowymi i brzusznymi. Poszczególni badacze wykonujący izolacje pojedynczych neuronów mogą mieć różne preferencje co do tego, jak trwała powinna być osłonka przy użyciu mikronożyczek i cienkich kleszczy. Ważne jest jednak, aby zwoje nerwowe nie były nadmiernie trawione, ponieważ może to prowadzić do utraty ich integralności strukturalnej, utraty informacji o położeniu, które są krytyczne dla identyfikacji komórek docelowych i/lub lizy komórek. Po wyizolowaniu ze zwoju ważne jest, aby upewnić się, że minimalna objętość pożywki izolacyjnej jest zasysana podczas przenoszenia neuronu do probówki z próbką. Pożywka ASW zawiera wysokie stężenie soli, które mogą zakłócać działanie enzymów trawiennych podczas hydrolizy RNA, a także rozcieńczają próbkę.
Podczas etapu lizy mechanicznej często zdarza się, że duże neurony (o średnicy >250 μm) pękają po wielokrotnym przechodzeniu przez mikropipetę. Mniejsze neurony mogą wymagać dodatkowej uwagi, aby zapewnić lizę komórek, która zwykle polega na uciskaniu szklanej kapilary na komórkę. W takim przypadku możliwe jest, że częściowa objętość buforu próbki zostanie wciągnięta do kapilary z powodu sił kapilarnych. Objętość tę można dostarczyć z powrotem do probówki z próbką, wywierając nacisk na koniec szklanej kapilary, aby upewnić się, że żadna próbka nie zostanie utracona.
Najlepsze wyniki uzyskuje się, włączając etap ogrzewania przed dodaniem enzymów do trawienia RNA. Jest to prawdopodobne, ponieważ ogrzewanie w temperaturze 95 °C denaturuje drugorzędowe struktury RNA, które mogą utrudniać aktywność RNaz35 i zmniejszać ilość nukleozydów uwalnianych z biopolimerów RNA. Wcześniej przeprowadzono eksperymenty kontrolne z użyciem próbek wzbogaconych stabilną metioniną znakowaną izotopowo w celu zbadania, czy artefakty modyfikacji RNA wywołane ciepłem były przyczyną zwiększonych obszarów pików obserwowanych dla modyfikacji RNA w stosunku do protokołu SNRMA-MS bez ciepła29. Nie zaobserwowano takiego znakowania, co wskazuje, że lepsze sygnały modyfikacji RNA przy użyciu zoptymalizowanej metody SNRMA-MS wynikały z lepszego trawienia RNA.
Konwencjonalne metody izolowania całkowitego RNA z komórek obejmują ekstrakcję ciecz-ciecz (LLE) za pomocą chloroformu fenolowego, a następnie wytrącanie RNA, przemywanie i ponowne zawieszanie. Podejścia te okazały się przydatne w eksperymentach z reakcją łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją, w których ekspresja wybranych genów może być łatwo monitorowana w zidentyfikowanych neuronach A. californica 36,37. Jednak metody LLE nie są w stanie odzyskać wystarczającej ilości RNA do wykrycia zmodyfikowanych rybonukleozydów przez LC-MS, podczas gdy opisana tutaj metoda SNRMA-MS umożliwia wykrycie licznych modyfikacji RNA29. W celu oceny profili modyfikacji określonych typów RNA (np. rRNA, tRNA, mRNA) w próbkach tkanek / komórek objętościowych zastosowano ekstrakcję do fazy stałej wymiany anionowej24, wzbogacanie oparte na sondzie hybrydyzacyjnej38 i frakcjonowanie chromatograficzne39, ale podobne metody nie są jeszcze dostępne do oczyszczania RNA pojedynczej komórki. Opracowanie metod frakcjonowania RNA, które są w stanie wyizolować określone typy RNA z pojedynczych komórek, dostarczyłoby dodatkowych informacji na temat funkcji modyfikacji RNA.
SNRMA-MS ujawniła wcześniej niescharakteryzowaną heterogeniczność w krajobrazie modyfikacji RNA pojedynczych neuronów u A. californica i można sobie wyobrazić, że podobnie odmienne profile PTM istnieją w komórkach ssaków. Ponieważ komórki ssaków są stosunkowo małe w porównaniu z dużymi neuronami A. californica analizowanymi w tym protokole, konieczne są ulepszenia w obsłudze małych objętości próbek, aby ułatwić obniżenie granic wykrywalności. Chociaż obecnie SNRMA-MS jest ograniczony do objętości ~5 μl, oczekuje się, że znaczną poprawę można osiągnąć poprzez włączenie do przepływu pracy urządzeń do obsługi cieczy mikroprzepływowych. Co więcej, wdrożenie zautomatyzowanych lub półautomatycznych izolacji komórek zwiększyłoby przepustowość próbek i umożliwiłoby analizę modyfikacji RNA pojedynczych komórek w większych populacjach komórek. Dzięki połączeniu z nanoprzepływowymi separacjami LC27 możliwe będzie scharakteryzowanie znaczników epitranskryptomicznych w jeszcze mniejszych komórkach.

Modyfikacje kanonicznych nukleozydów RNA są coraz częściej rozpoznawane ze względu na ich niezliczone role w regulacji translacji białek. Do tej pory zgłoszono ponad 150 unikalnych modyfikacji RNA, które różnią się złożonością, od metylacji, addycji heteroatomów, po koniugację z metabolitami komórkowymi1,2. Ten rozszerzony alfabet RNA, znany również jako epitranskryptom, jest generowany przez enzymatycznych pisarzy i jest odpowiedzialny za zmianę stabilności3, folding4 i wydajność translacji5,6 komórkowych RNA. Wybrane modyfikacje RNA mogą być również odwracane za pomocą gumek enzymatycznych7,8, podczas gdy inne są dołączane do RNA podstechiometrycznie9,10, renderując złożony krajobraz zmodyfikowanych i niezmodyfikowanych sekwencji RNA w systemach biologicznych.
Na znaczenie modyfikacji RNA w funkcji biologicznej wskazuje nierówny rozkład modyfikacji w różnych organach i tkankach, w tym w podregionach ośrodkowego układu nerwowego (OUN)11. Ta niejednorodność chemiczna została powiązana z rozwojem OUN 12, stress response13 i plastycznością zależną od aktywności14. Podregiony OUN obejmują ponadto heterogeniczne populacje komórek, w których poszczególne komórki wykazują odrębne profile chemiczne15,16,17,18. Nawet pojedyncze komórki tego samego typu mogą wykazywać unikalne transkryptomy, częściowo ze względu na mikrośrodowiska tkankowe19 i stochastyczną ekspresję genów20. Jednakże, podczas gdy charakterystyka transkryptomu pojedynczej komórki jest nieco rutynowa, nie ma analogicznych metod ustalania epitranskryptomów pojedynczych komórek dla wielu modyfikacji RNA. Potrzebne są nowe podejścia, które są w stanie profilować rozkład modyfikacji RNA w poszczególnych komórkach, do kompleksowej analizy heterogeniczności komórkowej i wpływu regulacyjnego modyfikacji potranskrypcyjnych (PTM) w OUN i innych układach biologicznych.
Jednoczesny pomiar licznych modyfikacji RNA w masowych komórkach/tkankach jest łatwo realizowany za pomocą technik chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS). Do analizy LC-MS/MS zmodyfikowanych rybonukleozydów, RNA jest ekstrahowany z komórek (zwykle 103-10 6 komórek), oczyszczany przez wytrącanie i ponowne zawieszanie, a następnie trawiony do nukleozydów. Mieszanina próbek składająca się z kanonicznych i zmodyfikowanych nukleozydów jest następnie wstrzykiwana do systemu LC-MS w celu separacji i wykrycia analitu, co prowadzi do określenia pełnego zestawu modyfikacji RNA w organizmie21,22,23. LC-MS/MS został niedawno wykorzystany do określenia 26 modyfikacji RNA w OUN modelu neurobiologicznego Aplysia californica (A. californica). Obfitość niektórych z tych znaków epitranskryptomicznych wykazywała dynamikę zależną od czasu i regionu, która korelowała ze zmianami behawioralnymi w animal24. Jednak ze względu na ograniczoną czułość metody możliwe było wykrycie modyfikacji RNA tylko w próbkach zbiorczych zawierających >103 komórek. Te większe próbki prawdopodobnie ukrywały unikalne i funkcjonalnie ważne profile modyfikacji RNA poszczególnych komórek ze średnimi populacyjnymi. Chociaż dokładna kontrola warunków przygotowania próbki poprawiła granice wykrywalności modyfikacji RNA w próbkach o małej objętości25,26,27,28, nadal istnieje zapotrzebowanie na metody analityczne, które mogą wykrywać i określać ilościowo wiele zmodyfikowanych rybonukleozydów w pojedynczych komórkach.
Ten protokół wprowadza analizę modyfikacji RNA pojedynczego neuronu za pomocą spektrometrii mas (SNRMA-MS), która pozwala na wykrycie ponad tuzina modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach z OUN A. californica29. Podejście to polega na chirurgicznej izolacji pojedynczych, zidentyfikowanych komórek z głównych zwojów OUN, a następnie zoptymalizowanym przebiegu przygotowania próbki, obejmującym mechaniczną lizę komórek, denaturację RNA i hydrolizę enzymatyczną w buforze zgodnym ze stwardnieniem rozsianym. Identyfikacja i kwantyfikacja nukleozydów modyfikowanych po transkrypcji jest następnie realizowana za pomocą LC-MS/MS. SNRMA-MS zaspokaja niezaspokojoną potrzebę w dziedzinie analizy modyfikacji RNA, ułatwiając pozyskiwanie potranskrypcyjnych profili modyfikacji RNA dla pojedynczych neuronów i ma potencjał do przyszłego zastosowania w innych typach komórek.

<table><tbody><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aplysia californica</td><td>National Resource for Aplysia (Miami, FL)</td><td></td><td>150&ndash; 250 g (dorosły)</td></tr><tr><td><mocny>Sprzęt stołowy</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz kapilarny do szkła</td> System oczyszczania wody <td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>Miniwirówka Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>do probówek PCR</td><td>LW Scientific</td><td>ZS-1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000C</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Techne</td><td>EW-93945-01</td><td></td></tr><tr><td>HPLC kolumna i materiały eksploatacyjne</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uznanie RSLC 120 C18</td> Fiolki z autosamplerem <td>Thermo Scientific</td><td>71399</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>C4011-13</td><td></td></tr><tr><td>LC i MS Oprzyrządowanie i oprogramowanie</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie DataAnalysis 4.4</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dionex Ultimate 3000 nanoLC</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Wyposażony w odgazowywacz online, automatyczny podajnik próbek i termostatowaną komorę kolumny</td></tr><tr><td>Impact HD UHR QqTOF spektrometr masowy</td><td>Bruker</td><td></td><td>Wyposażony w źródło</td></tr><tr><td>ESI RStudio</td><td>RStudio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia do mikrodysekcji </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki bardzo drobne vanny 3,5"</td><td>Roboz</td><td>RS-5640</td><td></td></tr><tr><td>Igły wolframowe</td><td>Roboz</td><td>RS-6065</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki/materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetano-sulfonowy (HEPES)Fisher</td> <td>Scientific</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td></td><td></td>LS004081</tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Honeywell</td><td>17836</td><td></td></tr><tr><td>Benzonaza (endonukleaza z S. marcescens)</td><td>EMD Millipore</td><td>70746-4</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Fisher Scientific</td><td>G1264</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208094</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina testowa nukleozydów</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47310-U</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7794</td><td></td></tr><tr><td>Pentostatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0508</td><td></td></tr><tr><td>Fosfodiesterazy I</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td></td><td></td>LS003926</tr><tr><td>Proteaza typu XIV od Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe kapilary szklane</td><td>AM Systems</td><td>626000</td><td>1 mm śr. śr., średnica wewnętrzna 0,5 mm, 4 w</td></tr><tr><td>siarczanie streptomycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka modyfikacji rna w pojedynczych neuronach za pomocą spektrometrii mas

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Modyfikacje potranskrypcyjne (PTM) RNA reprezentują niedostatecznie zbadany mechanizm zaangażowany w regulację translacji w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Najnowsze dowody powiązały specyficzne modyfikacje neuronalnego RNA z paradygmatami uczenia się i pamięci. Niestety, konwencjonalne metody wykrywania tych cech epitranskryptomicznych są w stanie scharakteryzować tylko bardzo obfite modyfikacje RNA w tkankach masowych, co wyklucza ocenę unikalnych profili PTM, które mogą istnieć dla poszczególnych neuronów w aktywowanych obwodach behawioralnych. W tym protokole opisano podejście - analiza modyfikacji RNA pojedynczego neuronu za pomocą spektrometrii mas (SNRMA-MS) - w celu jednoczesnego wykrywania i ilościowego oznaczania wielu zmodyfikowanych rybonukleozydów w pojedynczych neuronach. Podejście to zostało zweryfikowane przy użyciu pojedynczych neuronów morskiego Aplysia californica, rozpoczynając od izolacji chirurgicznej i leczenia enzymatycznego głównych zwojów OUN w celu odsłonięcia ciał komórek neuronów, a następnie ręcznej izolacji pojedynczego neuronu za pomocą ostrych igieł i mikropipety. Następnie przeprowadza się obróbkę mechaniczną i termiczną próbki w małej objętości buforu w celu uwolnienia RNA z pojedynczej komórki w celu późniejszego trawienia RNA. Zmodyfikowane nukleozydy są następnie identyfikowane i oznaczane ilościowo za pomocą zoptymalizowanej metody chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas. SNRMA-MS jest wykorzystywany do ustalania wzorców modyfikacji RNA dla pojedynczych, zidentyfikowanych neuronów z A. californica, które mają znane morfologie i funkcje. Przedstawiono przykłady jakościowych i ilościowych SNRMA-MS, które podkreślają niejednorodny rozkład modyfikacji RNA w poszczególnych neuronach w sieciach neuronowych.

Metoda SNRMA-MS obejmuje ręczną izolację zidentyfikowanych neuronów do małych objętości próbek w celu lizy, trawienia i analizy LC-MS/MS (Rycina 1A). Ten schemat postępowania pozwolił na rutynowe wykrycie ponad tuzina modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach OUN A. californica (Rycina 1B), co stanowi pokrycie niemal połowy znanego epitranskryptomu tego zwierzęcia24 w jednej komórce. Na przykład poddanie neuronu LPl1 (średnica ~500 µm) analizie SNRMA-MS doprowadziło do wykrycia 15 ± 1 modyfikacji RNA (n = 3). Zmodyfikowane nukleozydy zidentyfikowano jednoznacznie na podstawie trzech cech: właściwości retencji w LC, dokładnej masy oraz profilów fragmentacji MS2 w porównaniu z wartościami dostępnymi w bazie danych2. Tabela 1 przedstawia listę wszystkich modyfikacji RNA wykrytych w neuronie LPl1). Zastosowany w tych doświadczeniach wysokorozdzielczy spektrometr mas czasu przelotu z kwadrupolem umożliwił uzyskanie dokładności masy na poziomie 4 ppm oraz detekcję charakterystycznego jonu fragmentacyjnego MS2 o m/z 164 dla zmodyfikowanego nukleozydy N6,6-dimetyloadenozyny (m66A, Rycina 1B). W połączeniu z danymi z rozdziału LC, które są zgodne z wynikami zgłoszonymi do bazy danych (m66A eluje po N6-metyloadenozynie (m6A)), podejście SNRMA-MS wykazało prawidłową identyfikację zmodyfikowanych nukleozydów.
Platforma SNRMA-MS może być wykorzystana do ustalania profili modyfikacji RNA pojedynczych neuronów oraz badania ich związku z tkankami objętościowymi. Neurony R2 to duże (~500 µm średnicy) komórki cholinergiczne znajdujące się w zwoju jamy brzusznej. Metodę SNRMA-MS zastosowano do analizy modyfikacji RNA w neuronach R2, jak również w otaczającym je zwoju jamy brzusznej (Rycina 2A). Znormalizowane powierzchnie pików dla modyfikacji RNA w każdej próbce neuronu/zwoju (n = 7) posłużyły jako dane wejściowe dla PCA, wykazując, że neurony R2 wykazują odmienne profile modyfikacji RNA w porównaniu do zwojów, w których się znajdują (Rycina 2B). Świadczą o tym punkty danych dla neuronów R2 i zwojów jamy brzusznej, które zajmują różne obszary na wykresie wyników PCA. Dalsze potwierdzenie unikalnych wzorców zmodyfikowanych nukleozydów uzyskano z osobnej kohorty zwierząt (n = 7), w której przeprowadzono porównania parowe dla 13 modyfikacji RNA, powszechnie wykrywanych zarówno w pojedynczych neuronach, jak i w tkance objętościowej (Rycina 2C). Dwa zmodyfikowane nukleozydy, pseudourydyna (Ψ) i 2'-O-metyloguanozyna (Gm), występowały w znacznie większej liczbie w zwojach jamy brzusznej w porównaniu do neuronów R2. Przy analizie podzbioru modyfikacji RNA z zaznaczonymi parami neuron R2-zwój, we wszystkich zwojach jamy brzusznej stwierdzono wyższe poziomy Ψ i Gm, a we wszystkich z wyjątkiem jednego neuronach R2 stwierdzono wyższą zawartość 2'-O-metyloadenozyny (Am) niż w odpowiadającym im zwoju (Rycina 2D). Ogólnie wyniki SNRMA-MS wykazują po raz pierwszy, że profile modyfikacji RNA pojedynczych komórek mogą różnić się od profili komórek w próbkach objętościowych z tej samej tkanki.
Zastosowanie SNRMA-MS do badania zwierzęcia modelowego A. californica stwarza wyjątkową okazję do charakterystyki profili modyfikacji RNA w zidentyfikowanych, funkcjonalnie odrębnych neuronach. Modyfikacje RNA oceniano za pomocą SNRMA-MS w czterech zidentyfikowanych komórkach: R2 i LPl1 (homologiczne komórki cholergiczne uczestniczące w obronnym wydzielaniu śluzu)32, MCCs (serotonergiczne neurony modulacyjne uczestniczące w żerowaniu)33 oraz komórkach B2 (neurony peptidergiczne uczestniczące w motyliczności jelit)34. Analiza PCA sześciu modyfikacji RNA w tych zidentyfikowanych neuronach, wyizolowanych bezpośrednio po obróbce enzymatycznej lub hodowanych w preparacie zwoju przez 48 h, wykazała stabilność i dynamikę epitranskryptomów pojedynczych komórek. Modyfikacje RNA w komórkach o różnych funkcjach tworzyły unikalne klastry na wykresie wyników (score plot), podczas gdy homologiczne neurony R2/LPl1 grupowały się wspólnie (Rysunek 3A). Wykres ładunków (loading plot) pokazuje, że różnice wynikały głównie z obfitości izomerów pozycyjnych metyloadenozyny, w tym 2'-O-metyloadenozyny (Am) i N1-metyloadenozyny (m1A) (Rysunek 3B). W tej samej analizie przeprowadzono porównanie świeżo wyizolowanych komórek z komórkami hodowanymi in situ (tj. w ich odpowiednich zwojach) przez 48 h. Jak pokazano na wykresie PCA, komórki o różnych funkcjach pozostawały rozróżnialne pod względem profili modyfikacji RNA.
Ilościowa analiza SNRMA-MS może być wykorzystana do wyznaczania bezwzględnych ilości wybranych modyfikacji RNA, dla których dostępne są autentyczne wzorce. Wygenerowano zewnętrzne krzywe kalibracyjne dla m1A, Ψ, 2'-O-metylocytydyny (Cm), Am oraz m6A, a ilość każdego zmodyfikowanego nukleozydu w parach komórek MCC i R2/LPl1 określono poprzez interpolację (Rysunek 4A-E). Wewnątrzkomórkowe ilości m1A i Ψ w dwóch parach symetrycznych komórek MCC wydawały się być podobne, podczas gdy w trzech parach komórek R2/LPl1 zaobserwowano większe różnice w ilościach tych modyfikacji. Aby uwzględnić różnice wynikające z fizycznego rozmiaru badanych komórek, ilości modyfikacji RNA znormalizowano względem objętości komórek obliczonych z optycznego pomiaru ich średnic, co pozwoliło uzyskać wewnątrzkomórkowe stężenia zmodyfikowanych nukleozydów. Znaczące różnice w wewnątrzkomórkowych stężeniach Cm i Am zaobserwowano pomiędzy komórkami MCC a neuronami R2/LPl1. Ogólnie SNRMA-MS umożliwia zarówno jakościowe, jak i ilościowe profilowanie modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach.
<img alt="Metoda izolacji neuronów i trawienia enzymatycznego, przedstawiająca analizę LC-MS i wyniki chromatogramu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63940/63940fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat SNRMA-MS i detekcja wielu modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach za pomocą LC-MS/MS. (A) Fotografie odsłoniętego zrazu z ganglionu policzkowego i izolacji pojedynczego neuronu do probówki z próbką. Pasek skali = 200 µm, strzałki wskazują zidentyfikowaną komórkę B1. Przedstawiono również schemat procedury przygotowania próbek do analizy LC-MS/MS. (B) Nałożone na siebie EIC dla modyfikacji RNA w pojedynczym neuronie LPl1, z wstawką pokazującą widma MS1 i MS2 dla N6, N6-dimetyloadenozyny (m66A). Wartości m/z użyte do wygenerowania EIC dla zmodyfikowanych nukleozydów znajdują się w Tabeli 1. Rycina została zmodyfikowana na podstawie źródła29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63940/63940fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Badanie OUN Aplysia; analiza LC-MS; izolacja neuronów R2; modyfikacje RNA; schematy; wykresy danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63940/63940fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: SNRMA-MS rozróżnia profile modyfikacji RNA pojedynczych neuronów i tkanek zbiorczych. (A) Schemat OUN A. californica oraz przebieg analizy neuronów R2 i otaczającego je zwoju brzusznego. Zdjęcie przedstawia zwój brzuszny i neuron R2 (wstrzyknięto barwnik Fast Green w celu zwiększenia widoczności). (B) Względne powierzchnie pików 13 modyfikacji RNA posłużyły do wygenerowania wykresów wyników PCA (góra) oraz obciążeń (dół). (C) Porównania parowe modyfikacji RNA w zwoju brzusznym i neuronie R2. Słupki błędu reprezentują ±1 odchylenie standardowe (SD), *p &lt; 0,05, ***p &lt; 5 x 10−4, sparowany test t z korekcją Bonferroni−Holma. (D) Porównanie wybranych modyfikacji RNA z panelu C, w którym pary R2-zwój brzuszny dla każdego zwierzęcia przedstawiono za pomocą linii łączących. Rysunek zmodyfikowano na podstawie źródła29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63940/63940fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres analizy głównych składowych (PCA); PC1 vs. PC2; grupowanie danych; oznaczone kategorie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63940/63940fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Profilowanie modyfikacji RNA w zidentyfikowanych, różniących się funkcjonalnie neuronach z OUN A. californica. (A) Wykres wyników PCA dla komórek MCC oraz B2, R2 i LPl1, które zostały wyizolowane bezpośrednio lub po 48 h hodowli in situ (oznaczone jako cMCC, cB2, cR2, cLPl1), oraz (B) wykresy obciążenia dla sześciu modyfikacji RNA powszechnie wykrywanych w tych komórkach. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie źródła29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63940/63940fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie kultur komórkowych; A) komórki LMCC, RMCC; B) komórki R2, LPI1; C-D) wykresy pmol wewnątrzkomórkowych; E) stężenie modyfikacji RNA; analiza danych naukowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63940/63940fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Ilościowa analiza SNRMA-MS w neuronach A. californica. Ilościowa analiza SNRMA-MS dostarcza bezwzględnych ilości i stężeń wewnątrzkomórkowych dla kilku zmodyfikowanych nukleozydów w pojedynczych, zidentyfikowanych neuronach A. californica. Zdjęcia (A) lewego i prawego MCC (odpowiednio LMCC i RMCC) w zwoju mózgowym oraz (B) R2 w zwoju brzusznym i LPl1 w zwoju pleuralnym. Komórki zostały obwiedzione okręgiem w celu zwiększenia widoczności. Liniowe wykresy kalibracyjne dla (C) m1A i (D) Ψ (trójkąty) wykorzystane do interpolacji ilości zmodyfikowanych nukleozydów w pojedynczych komórkach (kolorowe kropki). Pary komórek od każdego zwierzęcia są oznaczone liczbami 1-3. (E) Stężenia wewnątrzkomórkowe pięciu zmodyfikowanych nukleozydów w parach komórek MCC oraz R2/LPl1. Grube linie łączą pary komórek. *p &lt; 0.05, **p &lt; 0.005, test t dla prób zależnych z korekcją Bonferroniego-Holma, n = 2 zwierzęta (łącznie cztery komórki) dla MCC oraz n = 3 zwierzęta (łącznie sześć komórek) dla R2/LPl1. Rycina została zmodyfikowana na podstawie źródła29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63940/63940fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Modyfikacje RNA</td>
			<td>Skrót</td>
			<td>Kolejność elucji (C18)</td>
			<td>m/z dla EIC</td>
			<td>m/z dla MS2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydrourydyna</td>
			<td>D</td>
			<td>1</td>
			<td>247.09</td>
			<td>115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pseudourydyna</td>
			<td>Y</td>
			<td>2</td>
			<td>245.08</td>
			<td>209/179/155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-metylocytydyna</td>
			<td>m3C</td>
			<td>3</td>
			<td>258.11</td>
			<td>126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1-metyloadenozyna</td>
			<td>m1A</td>
			<td>4</td>
			<td>282.12</td>
			<td>150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-metylocytydyna</td>
			<td>m5C</td>
			<td>5</td>
			<td>258.11</td>
			<td>126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N7-metyloguanozyna</td>
			<td>m7G</td>
			<td>6</td>
			<td>298.12</td>
			<td>166</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2'-O-metylo-cytydyna</td>
			<td>Cm</td>
			<td>7</td>
			<td>258.11</td>
			<td>112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inozyna</td>
			<td>I6A</td>
			<td>8</td>
			<td>269.09</td>
			<td>137</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2'-O-metyloguanozyna</td>
			<td>Gm</td>
			<td>9</td>
			<td>298.12</td>
			<td>152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2-metyloguanozyna</td>
			<td>m2G</td>
			<td>10</td>
			<td>298.12</td>
			<td>166</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2,N2,N7-trimetyloguanozyna</td>
			<td>m227G</td>
			<td>11</td>
			<td>326.15</td>
			<td>194</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2,N2-dimetyloguanozyna</td>
			<td>m22G</td>
			<td>12</td>
			<td>312.13</td>
			<td>180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2'-O-metyloadenozyna</td>
			<td>Am</td>
			<td>13</td>
			<td>282.12</td>
			<td>136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-metyloadenozyna</td>
			<td>m6A</td>
			<td>14</td>
			<td>282.12</td>
			<td>150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6,N6-dimetyloadenozyna</td>
			<td>m66A</td>
			<td>15</td>
			<td>296.14</td>
			<td>164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-izopentenyladenozyna</td>
			<td>i6A</td>
			<td>16</td>
			<td>336.17</td>
			<td>204/136/148</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Modyfikacje RNA wykryte w pojedynczych neuronach A. californica. Podano cechy służące do charakterystyki zmodyfikowanych nukleozydów, w tym kolejność retencji w LC, wartość m/z do generowania EIC oraz odpowiadające im fragmenty CID.

Potranskrypcyjne modyfikacje RNA reprezentują niedostatecznie zbadaną warstwę regulacji translacji, która ostatnio została powiązana z plastycznością ośrodkowego układu nerwowego. W tym miejscu opisano przygotowanie próbki i podejście oparte na chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas w celu jednoczesnej charakterystyki licznych modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach.

Charakterystyka modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach za pomocą spektrometrii mas

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...

Dzięki temu protokołowi wprowadziliśmy pierwszą metodę zdolną do jednoczesnego profilowania wielu modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach, otwierając nowe obszary badań obejmujące regulację potranskrypcyjną w poszczególnych komórkach. Wykorzystując zoptymalizowane warunki przygotowania próbki i tandemową spektrometrię mas chromatografii cieczowej, można wykryć i określić ilościowo ponad tuzin zmodyfikowanych nukleozydów w jednym neuronie w jednym eksperymencie. Poszczególne komórki różnią się od siebie pod względem funkcji, morfologii i profilu chemicznego.Ważne jest, abyśmy byli w stanie zmierzyć pełną mozaikę chemiczną tych komórek, w tym ich profile RNA, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek, aby zrozumieć ich różnice, zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Stopień przygotowania zwojów nerwowych przed izolacją pojedynczego neuronu zależy od preferencji osoby wykonującej izolację. Spróbuj zarówno dłuższych, jak i krótszych terapii proteazą, aby zidentyfikować odpowiednie warunki.Na początek umieść znieczuloną Aplysia californica brzuszną stroną do góry na tacy preparcyjnej. Zacznij go preparować za pomocą nożyczek chirurgicznych z jedną końcówką skierowaną w stronę zwierzęcia i ostrożnie wykonując podłużne cięcie przez stopę. Po przypięciu rostralnej, ogonowej i bocznej strony ciała zwierzęcia w celu odsłonięcia narządów wewnętrznych i zwojów ośrodkowego układu nerwowego w jamie ciała, należy odizolować główne zwoje ośrodkowego układu nerwowego od zwierzęcia poprzez chirurgiczne przecięcie nerwów i niektórych łączników pochodzących ze zwojów.Zanurzyć zwoje w roztworze proteazy typu XIV o stężeniu 10 miligramów na mililitr od Streptomyces griseus i inkubować przez 30 minut do jednej godziny w temperaturze 34 stopni Celsjusza. Następnie sześciokrotnie przepłucz zwoje mózgu roztworem antybiotyku ze sztucznej wody morskiej. Następnie za pomocą polipropylenowej pipety transferowej, która została przycięta do otworu o średnicy pięciu milimetrów, przenieś wszystkie zwoje jaj do naczynia pokrytego polimerem silikonowym wypełnionego roztworem antybiotyku ze sztucznej wody morskiej.Utrzymuj zwoje nerwowe zawsze zanurzone w sztucznej wodzie morskiej. Następnie, aby usunąć osłonki ganglionu, przypnij zwoje i użyj mikronożyczek i drobnych kleszczyków. Przy wystarczająco silnym leczeniu enzymatycznym użyj szklanych lub metalowych igieł do odsłaniania powłoki.Wizualnie zidentyfikuj neurony, które Cię interesują. Używając połączonej szklanej kapilary lub ostrych igieł wolframowych, ostrożnie odizoluj zidentyfikowaną komórkę od zwoju objętościowego. Po pobraniu około jednego mikrolitra sztucznej wody morskiej do plastikowej mikropipety, przenieś izolowaną komórkę do probówki z próbką PCR zawierającej cztery mikrolitry 0,365 molowego octanu amonu.W przypadku ślepych prób należy pobrać pięć mikrolitrów podwielokrotności roztworu antybiotyku ze sztucznej wody morskiej z naczynia zawierającego ganglion i wymieszać z buforem wytrawiającym. Poddać lizie izolowane neurony poprzez wielokrotne zasysanie i dozowanie mikropipety w 0,365 molowym octanie amonu. Niektóre komórki mogą nie pęknąć od razu.Aby je zlizować, należy zastosować nacisk na średnicy komórki za pomocą połączonej szklanej kapilary. Następnie podgrzej próbkę w cyklu termicznym przed dodaniem do próbki 3,375 mikrolitra buforu do trawienia RNA. Wymieszać ten roztwór za pomocą mikropipety, kilkakrotnie pobierając i dozując roztwór.Odkręć wszelkie kropelki płynu przylegające do ścianek probówki do PCR za pomocą miniaturowej wirówki stołowej. Następnie inkubować próbki w cyklu termicznym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny, a następnie utrzymywać w temperaturze 10 stopni Celsjusza z podgrzewaną pokrywą ustawioną w pozycji On.Po ostygnięciu próbek natychmiast przenieś siedem mikrolitrów roztworu do fiolki automatycznego pobierania próbek wyposażonej w wkładkę o pojemności 250 mikrolitrów bez tworzenia się pęcherzyków w probówce automatycznego pobierania próbek. Aby przygotować system chromatografii cieczowej do oddzielenia kanonicznych i zmodyfikowanych nukleozydów, należy zrównoważyć kolumnę C18 przy użyciu 99% ruchomej fazy A i 1% ruchomej fazy B przy natężeniu przepływu 0,2 mililitra na minutę przez 12 minut w temperaturze 36 stopni Celsjusza.Uruchomić przyrząd do spektrometrii mas w trybie dodatnim z zaworem przełączającym ustawionym na marnotrawstwo przez pierwsze dwie minuty analizy i na źródło przez pozostałą część cyklu. Następnie zbierz widma masowe w zakresie m/z od 110 do 600. Wybierz jony do dysocjacji wywołanej zderzeniem przy 35 do 40 elektronowoltach w cyklu trzysekundowym, korzystając z preferowanej listy mas skonstruowanej na podstawie bazy danych i okna izolacji wynoszącego 0,5.Użyj aktywnego wykluczenia, aby wykluczyć jony z fragmentacji po trzech widmach. Ustaw dynamiczną akwizycję widm MS/MS dla jonów o intensywności powyżej i poniżej 50 000 zliczeń odpowiednio przy czterech hercach i jednym hercu. I minimalny próg selekcji jonów na poziomie 1 990 zliczeń.Do ilościowej analizy modyfikacji RNA pojedynczego neuronu za pomocą spektrometrii mas należy skonstruować krzywe kalibracyjne przy użyciu wyekstrahowanych obszarów pików chromatogramu jonowego uzyskanych dla zmodyfikowanych wzorców nukleozydów przy co najmniej pięciu stężeniach, aby umożliwić interpolację nieznanych stężeń endogennego analitu. Analiza modyfikacji RNA pojedynczego neuronu za pomocą spektrometrii mas polega na ręcznej izolacji zidentyfikowanych neuronów do małych objętości próbek w celu trawienia lizy i analizy LC-MS/MS. Analiza modyfikacji RNA pojedynczego neuronu za pomocą spektrometrii mas rutynowo wykryła ponad tuzin modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach z ośrodkowego układu nerwowego Aplysia californica, co stanowi pokrycie prawie połowy znanego epitranskryptomu tego zwierzęcia w pojedynczej komórce.Wyniki ujawniły po raz pierwszy, że profile modyfikacji RNA pojedynczych komórek mogą różnić się od profili komórek masowych w tej samej tkance. Dalsze wsparcie dla unikalnych zmodyfikowanych wzorców nukleozydów uzyskano od oddzielnej kohorty zwierząt, w której przeprowadzono porównania parami dla 13 modyfikacji RNA, powszechnie wykrywanych zarówno w pojedynczych neuronach, jak i w tkance masowej. Modyfikacje RNA w funkcjonalnie różnych komórkach utworzyły unikalne klastry na wykresie wyników, podczas gdy homologiczne neurony R2 / LPl1 grupowały się razem.Wykres obciążenia pokazuje, że różnice wynikały przede wszystkim z obfitości izomerów pozycyjnych metylodenozyny, w tym 2'O-metyloadenozyny i N1-metyladenozyny. Zewnętrzne krzywe kalibracyjne uzyskano dla N1-metyloadenozyny, pseudourydyny, 2'O-metyloguanozyny, 2'O-metyloadenozyny i N6-dimetyloadenozyny. Ilość każdego zmodyfikowanego nukleozydu w komórkach śródmózgowia i parach komórek R2 / LPl1 określono przez interpolację.Upewnij się, że minimalna objętość sztucznej wody morskiej jest przenoszona do probówki PCR wraz z pojedynczym izolowanym neuronem. Minimalizuje to rozcieńczenie próbki, co ostatecznie wpływa na wykrywanie analitu. Protokół ten może być wykorzystany do badania rozkładów modyfikacji RNA w strukturach subkomórkowych, takich jak aksony i dendryty, w celu lepszego zrozumienia mechanizmów translacji lokalnej zależnej od aktywności.

characterizing-rna-modifications-single-neurons-using-mass

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opisana jest zmodyfikowana metoda northern blot do pomiaru modyfikacji N 6-metylodenozyny (m6A) w RNA. Obecna metoda może wykrywać modyfikacje w różnych RNA i kontrolach w ramach różnych projektów eksperymentalnych.

Metoda pomiaru modyfikacji RNA N 6-metyloadenozyny w komórkach i tkankach

Opisujemy protokół do identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących RNA w żywych komórkach za pomocą fotosieciowania za pośrednictwem UV i spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

Tutaj prezentujemy protokół zależnego od DNAzymu podziału RNA. Umożliwia to szybką i zależną od miejsca analizę 2'-O-metylacji RNA. Podejście to można wykorzystać do wstępnej lub głównej oceny aktywności snoRNA.

Zależna od DNAzymu analiza 2'-O-metylacji rRNA

Tutaj opisany jest test in vitro bez przeciwciał do bezpośredniej analizy aktywności metylotransferazy na syntetycznym lub transkrybowanym in vitro RNA.

Test bez przeciwciał do analizy aktywności metylotransferazy RNA

Test immunoprecypitacji metylowanego RNA jest metodą opartą na przeciwciałach, używaną do wzbogacania metylowanych fragmentów RNA. W połączeniu z głębokim sekwencjonowaniem prowadzi to do identyfikacji transkryptów przenoszących modyfikację m5C.

Test immunoprecypitacji metylowanego RNA do badania modyfikacji m5C u Arabidopsis

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół metody sekwencjonowania opartej na LC-MS, która może być używana jako bezpośrednia metoda sekwencjonowania krótkiego RNA (&lt;35 nt na przebieg) bez pośredniego cDNA, oraz jako ogólna metoda sekwencjonowania różnych modyfikacji nukleotydów w pojedynczym badaniu z precyzją pojedynczej zasady.

2D-HELS MS Seq: Ogólna metoda oparta na LC-MS do bezpośredniego i de novo sekwencjonowania mieszanin RNA z różnymi modyfikacjami nukleotydów

MALDI-TOF został użyty do scharakteryzowania fragmentów uzyskanych z reaktywności pomiędzy utlenionym RNA a egzorybonukleazą Xrn-1. Niniejszy protokół opisuje metodologię, która może być stosowana do innych procesów z udziałem RNA i/lub DNA.

Identyfikacja fragmentów RNA powstałych w wyniku degradacji enzymatycznej za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF

Ten protokół opisuje użycie mikroMS do sterowanej fluorescencją, jednokomórkowej spektrometrii mas MALDI-2, umożliwiając lepsze profilowanie molekularne pierwotnych komórek neuronalnych szczura.

Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą pod wpływem fluorescencji ze spektrometrią mas z indukowaną laserem spektrometrią mas z jonizacji poszczególnych komórek nerwowych szczura

Badanie to przedstawia solidną metodę izolacji mRNA aksonalnych za pomocą wkładek z błony porowatej, umożliwiając całkowite rozdzielenie neuronów od neurytów oraz oczyszczanie RNA. W połączeniu z RTddPCR podejście pozwala na absolutną ilościową ilościową ilościową transkrypcję o niskiej liczbie kopii, ułatwiając badania transportu mRNA i lokalnej translacji o wysokiej czułości, powtarzalności i szerokim zastosowaniu eksperymentalnym.

Izolacja i ilościowa ilościowość mRNA aksonalnych z użyciem wkładek z błony porowatej oraz RTddPCR

Przedstawiamy tutaj protokół półilościowej oceny globalnych poziomów M⁶A za pomocą punktowego blotu. Całkowite RNA jest ekstrahowane, denaturowane, naznaczane na nylonowej membranie, badane przeciwciałem przeciw m⁶A i wizualizowane za pomocą chemiluminescencji. Intensywność sygnału, zmierzona za pomocą analizy szarości ImageJ, odzwierciedla względną obfitość metylacji, zapewniając powtarzalny przepływ pracy w badaniach.

Test punktowy do wykrywania globalnych poziomów modyfikacji N 6-metyladenozyny RNA

Protokół ten oferuje szczegółowe podejście do oceny poziomów modyfikacji m6Aspecyficznego RNA za pomocą MeRIP-qPCR.

Test MeRIP-qPCR do wykrywaniapoziomówmodyfikacji specyficznego RNA w komórkach osteosarcoma

Poznaj metodę profilowania modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach Aplysia californica za pomocą chromatografii cieczowej i spektrometrii mas. Ta technika umożliwia jednoczesne wykrycie ponad tuzina zmodyfikowanych nukleozydów w pojedynczej komórce.

Charakterystyka modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach za pomocą spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów