Charakterystyka modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach za pomocą spektrometrii mas

Dzięki temu protokołowi wprowadziliśmy pierwszą metodę zdolną do jednoczesnego profilowania wielu modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach, otwierając nowe obszary badań obejmujące regulację potranskrypcyjną w poszczególnych komórkach. Wykorzystując zoptymalizowane warunki przygotowania próbki i tandemową spektrometrię mas chromatografii cieczowej, można wykryć i określić ilościowo ponad tuzin zmodyfikowanych nukleozydów w jednym neuronie w jednym eksperymencie. Poszczególne komórki różnią się od siebie pod względem funkcji, morfologii i profilu chemicznego.

Ważne jest, abyśmy byli w stanie zmierzyć pełną mozaikę chemiczną tych komórek, w tym ich profile RNA, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek, aby zrozumieć ich różnice, zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Stopień przygotowania zwojów nerwowych przed izolacją pojedynczego neuronu zależy od preferencji osoby wykonującej izolację. Spróbuj zarówno dłuższych, jak i krótszych terapii proteazą, aby zidentyfikować odpowiednie warunki.

Na początek umieść znieczuloną Aplysia californica brzuszną stroną do góry na tacy preparcyjnej. Zacznij go preparować za pomocą nożyczek chirurgicznych z jedną końcówką skierowaną w stronę zwierzęcia i ostrożnie wykonując podłużne cięcie przez stopę. Po przypięciu rostralnej, ogonowej i bocznej strony ciała zwierzęcia w celu odsłonięcia narządów wewnętrznych i zwojów ośrodkowego układu nerwowego w jamie ciała, należy odizolować główne zwoje ośrodkowego układu nerwowego od zwierzęcia poprzez chirurgiczne przecięcie nerwów i niektórych łączników pochodzących ze zwojów.

Zanurzyć zwoje w roztworze proteazy typu XIV o stężeniu 10 miligramów na mililitr od Streptomyces griseus i inkubować przez 30 minut do jednej godziny w temperaturze 34 stopni Celsjusza. Następnie sześciokrotnie przepłucz zwoje mózgu roztworem antybiotyku ze sztucznej wody morskiej. Następnie za pomocą polipropylenowej pipety transferowej, która została przycięta do otworu o średnicy pięciu milimetrów, przenieś wszystkie zwoje jaj do naczynia pokrytego polimerem silikonowym wypełnionego roztworem antybiotyku ze sztucznej wody morskiej.

Utrzymuj zwoje nerwowe zawsze zanurzone w sztucznej wodzie morskiej. Następnie, aby usunąć osłonki ganglionu, przypnij zwoje i użyj mikronożyczek i drobnych kleszczyków. Przy wystarczająco silnym leczeniu enzymatycznym użyj szklanych lub metalowych igieł do odsłaniania powłoki.

Wizualnie zidentyfikuj neurony, które Cię interesują. Używając połączonej szklanej kapilary lub ostrych igieł wolframowych, ostrożnie odizoluj zidentyfikowaną komórkę od zwoju objętościowego. Po pobraniu około jednego mikrolitra sztucznej wody morskiej do plastikowej mikropipety, przenieś izolowaną komórkę do probówki z próbką PCR zawierającej cztery mikrolitry 0,365 molowego octanu amonu.

W przypadku ślepych prób należy pobrać pięć mikrolitrów podwielokrotności roztworu antybiotyku ze sztucznej wody morskiej z naczynia zawierającego ganglion i wymieszać z buforem wytrawiającym. Poddać lizie izolowane neurony poprzez wielokrotne zasysanie i dozowanie mikropipety w 0,365 molowym octanie amonu. Niektóre komórki mogą nie pęknąć od razu.

Aby je zlizować, należy zastosować nacisk na średnicy komórki za pomocą połączonej szklanej kapilary. Następnie podgrzej próbkę w cyklu termicznym przed dodaniem do próbki 3,375 mikrolitra buforu do trawienia RNA. Wymieszać ten roztwór za pomocą mikropipety, kilkakrotnie pobierając i dozując roztwór.

Odkręć wszelkie kropelki płynu przylegające do ścianek probówki do PCR za pomocą miniaturowej wirówki stołowej. Następnie inkubować próbki w cyklu termicznym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny, a następnie utrzymywać w temperaturze 10 stopni Celsjusza z podgrzewaną pokrywą ustawioną w pozycji On.Po ostygnięciu próbek natychmiast przenieś siedem mikrolitrów roztworu do fiolki automatycznego pobierania próbek wyposażonej w wkładkę o pojemności 250 mikrolitrów bez tworzenia się pęcherzyków w probówce automatycznego pobierania próbek. Aby przygotować system chromatografii cieczowej do oddzielenia kanonicznych i zmodyfikowanych nukleozydów, należy zrównoważyć kolumnę C18 przy użyciu 99% ruchomej fazy A i 1% ruchomej fazy B przy natężeniu przepływu 0,2 mililitra na minutę przez 12 minut w temperaturze 36 stopni Celsjusza.

Uruchomić przyrząd do spektrometrii mas w trybie dodatnim z zaworem przełączającym ustawionym na marnotrawstwo przez pierwsze dwie minuty analizy i na źródło przez pozostałą część cyklu. Następnie zbierz widma masowe w zakresie m/z od 110 do 600. Wybierz jony do dysocjacji wywołanej zderzeniem przy 35 do 40 elektronowoltach w cyklu trzysekundowym, korzystając z preferowanej listy mas skonstruowanej na podstawie bazy danych i okna izolacji wynoszącego 0,5.

Użyj aktywnego wykluczenia, aby wykluczyć jony z fragmentacji po trzech widmach. Ustaw dynamiczną akwizycję widm MS/MS dla jonów o intensywności powyżej i poniżej 50 000 zliczeń odpowiednio przy czterech hercach i jednym hercu. I minimalny próg selekcji jonów na poziomie 1 990 zliczeń.

Do ilościowej analizy modyfikacji RNA pojedynczego neuronu za pomocą spektrometrii mas należy skonstruować krzywe kalibracyjne przy użyciu wyekstrahowanych obszarów pików chromatogramu jonowego uzyskanych dla zmodyfikowanych wzorców nukleozydów przy co najmniej pięciu stężeniach, aby umożliwić interpolację nieznanych stężeń endogennego analitu. Analiza modyfikacji RNA pojedynczego neuronu za pomocą spektrometrii mas polega na ręcznej izolacji zidentyfikowanych neuronów do małych objętości próbek w celu trawienia lizy i analizy LC-MS/MS. Analiza modyfikacji RNA pojedynczego neuronu za pomocą spektrometrii mas rutynowo wykryła ponad tuzin modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach z ośrodkowego układu nerwowego Aplysia californica, co stanowi pokrycie prawie połowy znanego epitranskryptomu tego zwierzęcia w pojedynczej komórce.

Wyniki ujawniły po raz pierwszy, że profile modyfikacji RNA pojedynczych komórek mogą różnić się od profili komórek masowych w tej samej tkance. Dalsze wsparcie dla unikalnych zmodyfikowanych wzorców nukleozydów uzyskano od oddzielnej kohorty zwierząt, w której przeprowadzono porównania parami dla 13 modyfikacji RNA, powszechnie wykrywanych zarówno w pojedynczych neuronach, jak i w tkance masowej. Modyfikacje RNA w funkcjonalnie różnych komórkach utworzyły unikalne klastry na wykresie wyników, podczas gdy homologiczne neurony R2 / LPl1 grupowały się razem.

Wykres obciążenia pokazuje, że różnice wynikały przede wszystkim z obfitości izomerów pozycyjnych metylodenozyny, w tym 2'O-metyloadenozyny i N1-metyladenozyny. Zewnętrzne krzywe kalibracyjne uzyskano dla N1-metyloadenozyny, pseudourydyny, 2'O-metyloguanozyny, 2'O-metyloadenozyny i N6-dimetyloadenozyny. Ilość każdego zmodyfikowanego nukleozydu w komórkach śródmózgowia i parach komórek R2 / LPl1 określono przez interpolację.

Upewnij się, że minimalna objętość sztucznej wody morskiej jest przenoszona do probówki PCR wraz z pojedynczym izolowanym neuronem. Minimalizuje to rozcieńczenie próbki, co ostatecznie wpływa na wykrywanie analitu. Protokół ten może być wykorzystany do badania rozkładów modyfikacji RNA w strukturach subkomórkowych, takich jak aksony i dendryty, w celu lepszego zrozumienia mechanizmów translacji lokalnej zależnej od aktywności.