Name: Fotodynamiczne podejście do badania funkcji pękania pęcherzyków wewnątrzkomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Poznaj technikę CALI do badania pękania pęcherzyków wewnątrzkomórkowych w żywych komórkach HeLa. Ta metoda pozwala precyzyjnie kontrolować uszkodzenia subkomórkowe i analizować aktywowane szlaki sygnałowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS za wsparcie badań. Główny obiekt jest finansowany przez Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213). Autorzy dziękują Common Equipment Core Facility Instytutu Nauk Biomedycznych (IBMS), Academia Sinica (AS) za pomoc w pozyskiwaniu obrazu.

1. Przygotowanie roztworu zapasowego AlPcS2a
<ol>
	<li>Rozpuścić 10 mg AlPcS2a w 400 µL 0,1 M NaOH. Aby zwiększyć rozpuszczalność, podgrzać roztwór do 50 °C i wymieszać na wortexie.</li>
	<li>Wymieszać roztwór z 4 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS). Następnie przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 µm w celu usunięcia nierozpuszczalnych osadów.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie roztworu za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Współczynnik ekstynkcji AlPcS2a przy 672 nm wynosi 4 x 104 cm-1 M-1. Rozcieńczyć roztwór AlPcS2a za pomocą PBS do uzyskania stężenia 1 mM. Przygotować aliquoty po 1 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Transfekcja
UWAGA: Gal3-GFP jest stosowane jako wskaźnik do obrazowania żywych komórek w celu wykrycia pękania lizosomów.
<ol>
	<li>Hodować kulturę komórek HeLa w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% płatkowej surowicy bydlęcej (FBS). Po przemyciu komórek roztworem PBS, poddać je trypsynizacji, a następnie resuspender w pożywce DMEM z dodatkiem 10% FBS. 
	UWAGA: Metoda ta jest możliwa do zastosowania w przypadku większości linii komórek przylegających, w tym linii HeLa i A549. W zasadzie, mimo braku testów na komórkach w zawiesinie, testy CALI można by przeprowadzić również z ich wykorzystaniem.</li>
	<li>Rozpuścić 300 ng plazmidu Gal3-GFP w 25 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy, a następnie dodać 0,6 µL odczynnika P3000. Delikatnie wymieszać. Rozpuścić 0,45 µL odczynnika Lipofectamine 3000 w 25 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy. Delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej. Połączyć rozcieńczone DNA oraz rozcieńczoną Lipofectamine 3000, a następnie inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wymieszać mieszaninę DNA-Lipofectamine, 3 x 105 zawiesionych komórek HeLa oraz 200 µL DMEM+10% FBS, a następnie wysiać komórki na centralnym szklanym obszarze szalki szklanej o średnicy 35 mm.</li>
</ol>
3. Barwienie AlPcS2a
<ol>
	<li>Aby umożliwić adhezję komórek, inkubuj je w temperaturze 37 °C w inkubatorze z zawartością 5% CO2 przez co najmniej 4 h.</li>
	<li>Rozcieńcz AlPcS2a w medium DMEM uzupełnionym o 10% FBS, aby przygotować roztwór AlPcS2a o stężeniu 1 µM. Podgrzej medium zawierające AlPcS2a w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Wymień medium hodowlane na medium zawierające AlPcS2a.</li>
	<li>Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z zawartością 5% CO2 przez noc (16-18 h).</li>
	<li>Następnego dnia przemyj komórki dwukrotnie PBS, aby usunąć pozakomórkowy AlPcS2a. Wymień medium na świeże, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez 4 h, aby pozostały barwnik wzdłuż szlaku endocytozy mógł zgromadzić się w lizosomach. 
	​UWAGA: Aby zabarwić endosomy, inkubuj komórki w 1 µM AlPcS2a w DMEM zawierającym 10% FBS przez 15 min w temperaturze 37 °C. Następnie przemyj komórki dwukrotnie PBS i inkubuj je w uprzednio ogrzanym medium przed obrazowaniem.</li>
</ol>
<img alt="Schemat dostarczania leku indukowanego podczerwienią; proces przejścia endosomu w lizosom w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63962/63962fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat przedstawiający selektwne uszkadzanie IV przy użyciu AlPcS2a. Rycina przedstawia schemat selektywnego uszkadzania IV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63962/63962fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, LysoTracker, AlPcS2a, nałożone obrazy komórek, analiza lokalizacji komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63962/63962fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Barwienie lizosomów za pomocą AlPcS2a. Lizosomy znakowane przez noc 1 µM AlPcS2a w komórkach HeLa wykazują pozytywne barwienie zielonym barwnikiem fluorescencyjnym o stężeniu 50 nM. Pasek skali: 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63962/63962fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
4. Obrazowanie próbki i oświetlenie
UWAGA: Można przeprowadzić uszkodzenie IV w obrębie regionu podkomórkowego pojedynczej komórki lub we wszystkich komórkach znakowanych AlPcS2a w naczyniu hodowlanym. Masowe naświetlanie całego naczynia hodowlanego umożliwia ilościowe badanie tego uszkodzenia, w tym badania biochemiczne.
<ol>
	<li>Manipuluj pojedynczymi komórkami poprzez uszkadzanie lizosomów w obrębie jednej komórki, zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Umieść naczynie hodowlane na stoliku mikroskopu konfokalnego. Do wzbudzenia GFP i AlPcS2a użyj odpowiednio laserów 488 nm i 561 nm.</li>
		<li>Zaznacz obszar zainteresowania (ROI) o wymiarach 5 x 5 µm2 na pęcherzykach znakowanych AlPcS2a, które mają zostać uszkodzone.</li>
		<li>Naświetlaj impulsowo ROI laserem 633 nm o mocy 0,21 mW przez 70 powtórzeń. Monitoruj powstawanie punktów Gal3 jako wskaźnika permeabilizacji błony lizosomalnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uszkodź wszystkie znakowane komórki w naczyniu hodowlanym zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Umieść naczynie hodowlane na platformie. Naświetl naczynie kolimowanym światłem LED 660 nm (światło bliskiej podczerwieni jest idealne, biorąc pod uwagę widmo wzbudzenia AlPcS2a).</li>
		<li>Umieść naczynie hodowlane pod mikroskopem i monitoruj wskaźniki permeabilizacji błony, o których wspomniano w kroku 4.1.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń uszkodzenie IV za pomocą następujących wskaźników.
	<ol>
		<li>Zawartość endosomów lub lizosomów jest silnie glikozylowana i zostaje odsłonięta w cytozolu po pęknięciu IV. Szybko znakuj te struktury za pomocą cytozolowych galektyn wiążących glikany, w tym galektynę-1, galektynę-3, galektynę-8 i galektynę-916,20.</li>
		<li>Wielkość rany można określić poprzez uwalnianie barwnika nieprzenikającego przez błonę, zgodnie z opisem w21.</li>
		<li>Różnicą między endosomami a lizosomami jest wartość pH w ich świetle. Pęknięcie lizosomów zaburza pH światła, co można zmierzyć za pomocą barwnika czułego na pH, takiego jak FITC-dekstran3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, TagRFP-Gal3, AlPcS2a, schemat przed/po naświetlaniu, analiza komórkowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63962/63962fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. CALI pośredniczone przez AlPcS2a indukuje lokalną rekrutację TagRFP-galektyny-3 (Gal3) do lizosomów w obszarze naświetlania. Lizosomy w komórkach HeLa wykazujących ekspresję TagRFP-galektyny-3 barwiono przez noc za pomocą 1 µM AlPcS2a, po czym zastosowano naświetlanie skupionym światłem bliskiej podczerwieni (633 nm) w obrębie żółtego kwadratu. Sygnał AlPcS2a wewnątrz żółtego kwadratu uległ fotobleachingowi, co towarzyszyło formowaniu się punktowych struktur (puncta) TagRFP-galektyny-3. Pasek skali: 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63962/63962fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<ol><li>Cossart, P., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+viruses+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of viruses and bacteria.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (8), 016972(2014).</li>
<li>Daussy, C. F., Wodrich, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BRepair+me+if+you+can%26%2334%3B%3A+membrane+damage%2C+response%2C+and+control+from+the+viral+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">34;Repair me if you can&#34;: membrane damage, response, and control from the viral perspective.</a> Cells. 9 (9), 2042(2020).</li>
<li>Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+induction+of+autophagy-mediated+lysosome+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover.</a> Nature Communications. 4, 2111(2013).</li>
<li>Sharma, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+for+cancer+and+for+infections%3A+what+is+the+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Israel+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy for cancer and for infections: what is the difference.</a> Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 691-705 (2012).</li>
<li>Kübler, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Laser+Application%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy.</a> Medical Laser Application. 20 (1), 37-45 (2005).</li>
<li>De Rosa, F. S., Bentley, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+of+skin+cancers%3A+sensitizers%2C+clinical+studies+and+future+directives%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy of skin cancers: sensitizers, clinical studies and future directives.</a> Pharmaceutical Research. 17 (12), 1447-1455 (2000).</li>
<li>Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+photosensitizers+for+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">New photosensitizers for photodynamic therapy.</a> Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).</li>
<li>Lavie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photodynamic+pathway+to+apoptosis+and+necrosis+induced+by+dimethyl+tetrahydroxyhelianthrone+and+hypericin+in+leukaemic+cells%3A+possible+relevance+to+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A photodynamic pathway to apoptosis and necrosis induced by dimethyl tetrahydroxyhelianthrone and hypericin in leukaemic cells: possible relevance to photodynamic therapy.</a> British Journal of Cancer. 79 (3-4), 423-432 (1999).</li>
<li>Jay, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+destruction+of+protein+function+by+chromophore-assisted+laser+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Selective destruction of protein function by chromophore-assisted laser inactivation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 85 (15), 5454-5458 (1988).</li>
<li>Grate, D., Wilson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-mediated%2C+site-specific+inactivation+of+RNA+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Laser-mediated, site-specific inactivation of RNA transcripts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (11), 6131-6136 (1999).</li>
<li>Lin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+inhibition+of+synaptic+release+with+chromophore-assisted+light+inactivation+%28CALI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI).</a> Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).</li>
<li>Hsieh, C. W., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+mitophagy+with+photosensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Triggering mitophagy with photosensitizers.</a> Methods in Molecular Biology. 1880, 611-619 (2019).</li>
<li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+initiation+of+Parkin-mediated+mitophagy+within+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled initiation of Parkin-mediated mitophagy within single cells.</a> Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).</li>
<li>Molinari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vacuoles+induced+by+Helicobacter+pylori+toxin+contain+both+late+endosomal+and+lysosomal+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vacuoles induced by Helicobacter pylori toxin contain both late endosomal and lysosomal markers.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (40), 25339-25344 (1997).</li>
<li>Prince, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+a+lysosomal+pathway+regulating+neutrophil+apoptosis+by+a+major+bacterial+toxin%2C+pyocyanin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Subversion of a lysosomal pathway regulating neutrophil apoptosis by a major bacterial toxin, pyocyanin.</a> Journal of Immunology. 180 (5), 3502-3511 (2008).</li>
<li>Aits, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+lysosomal+membrane+permeabilization+by+lysosomal+galectin+puncta+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay.</a> Autophagy. 11 (8), 1408-1424 (2015).</li>
<li>Prasmickaite, L., Hogset, A., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+different+photosensitizers+for+use+in+photochemical+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of different photosensitizers for use in photochemical gene transfection.</a> Photochemistry and Photobiology. 73 (4), 388-395 (2001).</li>
<li>Berg, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+internalization%3A+a+novel+technology+for+delivery+of+macromolecules+into+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Photochemical internalization: a novel technology for delivery of macromolecules into cytosol.</a> Cancer Research. 59 (6), 1180-1183 (1999).</li>
<li>Moan, J., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photodegradation+of+porphyrins+in+cells+can+be+used+to+estimate+the+lifetime+of+singlet+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the lifetime of singlet oxygen.</a> Photochemistry and Photobiology. 53 (4), 549-553 (1991).</li>
<li>Thurston, T. L., Wandel, M. P., von Muhlinen, N., Foeglein, A., Randow, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin+8+targets+damaged+vesicles+for+autophagy+to+defend+cells+against+bacterial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Galectin 8 targets damaged vesicles for autophagy to defend cells against bacterial invasion.</a> Nature. 482 (7385), 414-418 (2012).</li>
<li>Repnik, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-leucyl-L-leucine+methyl+ester+does+not+release+cysteine+cathepsins+to+the+cytosol+but+inactivates+them+in+transiently+permeabilized+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">L-leucyl-L-leucine methyl ester does not release cysteine cathepsins to the cytosol but inactivates them in transiently permeabilized lysosomes.</a> Journal of Cell Science. 130 (18), 3124-3140 (2017).</li>
<li>Griffiths, G., Hoflack, B., Simons, K., Mellman, I., Kornfeld, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mannose+6-phosphate+receptor+and+the+biogenesis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mannose 6-phosphate receptor and the biogenesis of lysosomes.</a> Cell. 52 (3), 329-341 (1988).</li>
<li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3+Coordinates+a+cellular+system+for+lysosomal+repair+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Galectin-3 Coordinates a cellular system for lysosomal repair and removal.</a> Developmental Cell. 52 (1), 69-87 (2020).</li>
<li>Chu, Y. P., Hung, Y. H., Chang, H. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+to+monitor+lysophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Assays to monitor lysophagy.</a> Methods in Enzymology. 588, 231-244 (2017).</li>
<li>Nguyen, L., Madsen, S. J., Berg, K., Hirschberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+in+vitro+photochemical+internalization+protocol+for+3D+spheroid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">An improved in vitro photochemical internalization protocol for 3D spheroid cultures.</a> Lasers in Medical Science. 36 (8), 1567-1571 (2021).</li>
<li>Daugelaviciene, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-targeted+photodynamic+treatment+induces+primary+keratinocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology.+B%2C+Biology%22%5BJournal%5D)">Lysosome-targeted photodynamic treatment induces primary keratinocyte differentiation.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. B, Biology. 218, 112183(2021).</li>
<li>Hong, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+galectins+control+cellular+responses+commensurate+with+cell+surface+carbohydrate+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Intracellular galectins control cellular responses commensurate with cell surface carbohydrate composition.</a> Glycobiology. 30 (1), 49-57 (2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

AlPcS2a wiąże się z błoną plazmatyczną, a następnie jest internalizowany przez endocytozę i ostatecznie gromadzi się w lizosomach. AlPcS2a może być zatem zlokalizowany w przedziałach subkomórkowych poprzez dostosowanie czasu inkubacji. Ograniczeniem tej metodologii jest to, że tylko subpopulacja kroplówek może być znakowana przez AlPcS2a poprzez endocytozę, ponieważ istnieje wiele innych błonowych źródeł IV, takich jak ER i aparat Golgiego. Ponadto selektywne znakowanie AlPcS2a...

Endosomy, rodzaj pęcherzyków wewnątrzkomórkowych (IV), powstają w wyniku endocytozy, a następnie dojrzewają do lizosomów. W tworzeniu kroplówek biorą udział różne wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe; dodatkowo różne bodźce wewnętrzne i zewnętrzne mogą uszkadzać kroplówki (np. patogeny mogą uciekać z ograniczonej błony podczas infekcji i wchodzić do cytoplazmy1). Zwykle towarzyszy temu pęknięcie pęcherzyków endocytotycznych2. W związku z tym techniki celowania i uszkadzania kroplówek mogą być stosowane w powiązanych badaniach3.
Terapia fotodynamiczna (PDT) to terapia zależna od światła, mająca na celu zwalczanie chorób poprzez zabijanie nowotworów lub patogenów4. W PDT docelowe komórki są znakowane nietoksycznymi chromoforami, zwanymi fotouczulaczami, które mogą być lokalnie aktywowane przez oświetlenie świetlne5,6. Fotouczulacze pochłaniają energię ze światła i przekształcają się w wzbudzony stan singletowy, prowadząc do długotrwałego wzbudzonego stanu trypletowego. Fotosensybilizatory stanu trypletowego mogą ulegać transferowi elektronów lub energii i tworzyć reaktywne formy tlenu (ROS) w obecności tlenu, a także mogą przestrzennie niszczyć znakowane komórki w obszarze oświetlenia7. Konsekwencje różnią się w zależności od mocy światła8. Kontrolując stężenie fotouczulaczy i intensywność oświetlenia świetlnego, docelowe biomolekuły mogą być selektywnie inaktywowane bez lizy komórek, określanej jako inaktywacja światła wspomagana chromoforem (CALI)9. Dzięki znaczącemu rozwojowi fotouczulaczy, które mogą selektywnie znakować różne cele subkomórkowe, CALI stał się cennym narzędziem do kontrolowania inaktywacji biomolekuł za pośrednictwem światła dla małych biomolekuł, takich jak nukleotydy i białka, a także organelli, takich jak mitochondria i endolizosomy3,10,11,12,13.
W porównaniu do CALI, metody chemiczne lub fizyczne są również używane do uszkadzania błon, takie jak toksyna bakteryjna14,15 i Leu-Leu-OMe16 leczenie uszkodzeń lizosomalnych. Jednak metody te wykazują masowe upośledzenie kroplówek w komórkach. W CAIN stosuje się wytrzymałe fotouczulacze (tj. Al(III) chlorek ftalocyjaniny, kwas disulfonowy (AlPcS2a)); AlPcS2a, celujący w lizosomy poprzez endocytozę, służy do rozbijania endosomów lub lizosomów w kontrolowanym regionie17. AlPcS2a to nieprzepuszczalny dla błony komórkowej chromofor na bazie ftalocyjaniny, który wiąże się z lipidem na błonie plazmatycznej i jest internalizowany przez endocytozę i ostatecznie gromadzi się w lizosomie przez szlak endocytarny18. Pochłania światło w zakresie widma bliskiej podczerwieni i generuje tlen singletowy, główny ROS generowany przez wzbudzony AlPcS2a18. Szybki rozpad tlenu singletowego ogranicza jego dyfuzję i odległość reakcji w maleńkim obszarze komórek (około 10-20 nm)19. Dostosowując czas trwania inkubacji AlPcS2a i oświetlenia światłem, dozwolona jest czasoprzestrzenna kontrola uszkodzeń IV w obszarze subkomórkowym. CALI staje się zatem potężnym narzędziem do badania konsekwencji uszkodzenia kroplówek oraz tworzenia i regulacji kroplówek.
W tym badaniu omówiono specyficzny protokół CALI wykorzystujący AlPcS2a jako fotosensybilizator. Protokół ten może być stosowany do różnych typów kroplówek, w tym endosomów i lizosomów, i stosowany do badania dalszych odpowiedzi po pęknięciu błony. Komórki HeLa wykazujące ekspresję galektyny-316,20 ujawnione po pęknięciu lizosomu są używane do zademonstrowania tego protokołu.

<table><tbody><tr><td>Reodczynnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Al(III) Kwas disulfonowy chlorku ftalocyjaniny (AlPcS2a)</td><td>Frontier Scientific</td><td>P40632</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie</td><td>hodowlane ibidi</td><td>812128-200</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td><td>hodowlana DMEM uzupełniona 10% FBS i 100 U/ml penicyliny G i 100 mg/ml Streptomycyny</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A4736301</td><td></td></tr><tr><td>zestaw plazmidu Gal3-GFP</td><td>addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Green DND-26</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L7526</td><td>zielony barwnik fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Płyta wielościenna</td><td>perkinelmer</td><td>PK-6005550</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q15895</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific 31985070</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4</td></tr><tr><td><silna>Linia komórkowa</silna> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>Metody mają zastosowanie do większości dołączonych linii komórkowych. Warunki muszą być ustalane indywidualnie.</td></tr><tr><td>Udogodnienia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m Filtr</td><td>Merck</td><td>SLGV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Kolimowane światło LED&nbsp; (660 nm)</td><td>Thorlabs</td><td>M660L3-C1 i DC2100</td><td>Światło bliskie podczerwieni jest idealną bazą na widmie wzbudzenia AlPcS2a.</td></tr><tr><td>Mikroskopia konfokalna</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 780</td><td>Do długotrwałego obrazowania wymagany jest system inkubacji.</td></tr><tr><td>Spektrofotometry NanoDrop 2000/2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czerwone światło LED</td><td>Tholabs</td><td>M660L4-C1</td><td></td></tr></tbody></table>

fotodynamiczne podejście do badania funkcji pękania pęcherzyków wewnątrzkomórkowych

A Photodynamic Approach to Study Function of Intracellular Vesicle Rupture

Pęcherzyki wewnątrzkomórkowe (IV) powstają poprzez endocytozę pęcherzyków do cytoplazmy. Tworzenie kroplówek bierze udział w aktywacji różnych szlaków sygnałowych poprzez przepuszczalność błon dożylnych oraz tworzenie endosomów i lizosomów. Metoda zwana inaktywacją laserową wspomaganą chromoforem (CALI) jest stosowana do badania tworzenia się kroplówek i materiałów kontrolujących regulację dożylną. CALI to oparta na obrazowaniu metodologia fotodynamiczna do badania szlaku sygnałowego indukowanego przez przepuszczalność błony. Metoda ta pozwala na czasoprzestrzenną manipulację wybranymi organellami w komórce. Metoda CALI została zastosowana do obserwacji i monitorowania określonych cząsteczek poprzez przenikanie endosomów i lizosomów. Wiadomo, że pęknięcie błony IV selektywnie rekrutuje białka wiążące glikany, takie jak galektyna-3. W tym przypadku protokół opisuje indukcję pęknięcia dożylnego przez AlPcS2a i zastosowanie galektyny-3 jako markera do znakowania uszkodzonych lizosomów, co jest przydatne w badaniu dalszych skutków pęknięcia błony dożylnej i ich dalszych skutków w różnych sytuacjach.

Pokazano schematyczny rysunek przedstawiający uszkodzenia IV wywołane przez AlPcS2a, w tym endosom i lizosom, (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
Dostępne na rynku markery mogą być używane do określania warunków barwienia AlPcS2a. Na przykład kolokalizacja AlPcS2a puncta i zielony barwnik fluorescencyjny 22 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).
Galektyna-3 znakowana fluoroforem może być stosowana jak...

Inaktywacja laserowa wspomagana chromeforem za pośrednictwemAlPcS 2a jest potężnym narzędziem do badania czasoprzestrzennych uszkodzeń pęcherzyków wewnątrzkomórkowych (IV) w żywych komórkach.

Fotodynamiczne podejście do badania funkcji pękania pęcherzyków wewnątrzkomórkowych

Intracellular vesicles (IVs) are formed through endocytosis of vesicles into cytoplasm. IV formation is involved in activating various signal pathways ...

Endocytoza pęcherzyka do cytolazji powoduje powstawanie pęcherzyków wewnątrzkomórkowych. Permeabilizacja pęcherzyka aktywuje różne szlaki sygnałowe. Inaktywacja laserowa wspomagana chromoforem służy do badania konsekwencji pęknięcia pęcherzyków wewnątrzkomórkowych.Przestrzenną i czasową kontrolę subkomórkowego uszkodzenia pęcherzyków wewnątrzkomórkowych można osiągnąć poprzez dostosowanie warunków stania i oświetlenia świetlnego. Na początek utrzymuj hodowlę komórek HeLa w DMEM uzupełnioną 10% FBS. Po umyciu komórek PBS, trypsynizuj komórki.Następnie ponownie zawiesić komórki w DMEM uzupełnione 10% FBS. Rozcieńczyć 300 nanogramów plazmidu Gal3-GFP w 25 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy. Następnie dodaj 0,6 mikrolitra odczynnika P3000.I delikatnie wymieszaj, a następnie wiruj roztwór. Rozcieńczyć 0,45 mikrolitra odczynnika Lipofectamine 3000 w 25 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy i delikatnie wymieszać. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie wymieszać rozcieńczone DNA i rozcieńczoną Lipofectaminę 3000 i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po zmieszaniu mieszaniny lipofektaminy DNA, 300 000 zawieszonych komórek HeLa i 200 mikrolitrów DMEM z 10% FBS, zasiej komórki na centralnym obszarze szkła 35-milimetrowego szklanego naczynia guzikowego. Aby umożliwić przyczepienie komórek, inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze zasilanym 5% dwutlenkiem węgla przez co najmniej cztery godziny.Rozcieńczyć AlPcS2a w DMEM uzupełnionym 10% FBS, aby uzyskać jednomikromolowy roztwór AlPcS2a. Podgrzej pożywkę zawierającą AlPcS2a w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i zastąp pożywkę hodowlaną pożywką zawierającą AlPcS2a. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze zasilanym 5% dwutlenkiem węgla przez noc.Następnego dnia przemyj komórki dwukrotnie PBS w celu usunięcia zewnątrzkomórkowego AlPcS2a po zastąpieniu pożywki świeżą pożywką. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny, aby umożliwić gromadzenie się resztkowego barwnika wzdłuż szlaku endocytarnego w lizosomach. Aby manipulować pojedynczymi komórkami poprzez uszkadzanie lizosomów, umieść szalkę hodowlaną na stoliku mikroskopu konfokalnego.Użyj laserów 488 nm i 561 nm, aby uzyskać ekscytujące GFP i AlPcS2a. Zakreśl obszar zainteresowania o wymiarach pięć na pięć mikrometrów kwadratowych na pęcherzykach oznaczonych AlPcS2a, które są wybrane do uszkodzenia. Następnie oświetl impulsowo obszar zainteresowania laserem o długości 633 nm i mocy 0,21 miliwata, czyli 70 powtórzeń.Monitoruj tworzenie się Gal3 puncta jako wskaźnika przepuszczalności błony lizosomalnej. Barwienie lizosomalne AlPcS2a w komórkach HeLa przeprowadzono przy użyciu dostępnych na rynku markerów i pozytywnie wybarwiono zielonym barwnikiem fluorescencyjnym. Lizosomy w komórkach HeLa z ekspresją TagRFP-Galectin3 barwiono AlPcS2a.Wyniki wskazują, że inaktywacja laserowa wspomagana chromoforem na bazie AlPcS2a była w stanie kontrolować lokalne pęknięcie lizosomalne w obszarze zainteresowania, pozostawiając resztę lizosomów nienaruszoną. Ten krok jest ważny, ponieważ czas inkubacji określi stojące endosomy lub lizosomy. Na przykład ludzie mogą określić rozmiar na podstawie uwalniania barwnika nieprzepuszczalnego dla membrany.Można również stosować barwniki wrażliwe na pH, takie jak dekstran FITC, do różnicowania endosomów i lizosomów. Ta technika jest przydatna, rozpoczynając dalsze skutki pęknięcia błony pęcherzyków wewnątrzkomórkowych. W różnych sytuacjach występują również skutki następcze.

a-photodynamic-approach-to-study-function-intracellular-vesicle

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Obrazowanie na żywo komórek narażonych na działanie barwnika lipofilowego FM1-43 pozwala na precyzyjne określenie kinetyki, za pomocą której toksyny tworzące pory są usuwane z błony plazmatycznej. Jest to czuły test, który można wykorzystać do oceny wymagań dotyczących Ca2+, sfingomielinazy i innych czynników dotyczących naprawy błony komórkowej.

Test obrazowania na żywo do oceny roliCa2+ i sfingomielinazy w naprawie ran toksyn tworzących pory

Proces leczenia uszkodzonych komórek polega na transporcie określonych białek i subkomórkowych przedziałów do miejsca uszkodzenia błony komórkowej. W tym protokole opisano testy do monitorowania tych procesów.

Obrazowanie uszkodzeń błon komórkowych i procesów subkomórkowych zaangażowanych w naprawę

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

Uwijanie błony komórkowej za pomocą lasera dwufotonowego jest powszechnie stosowaną metodą oceny zdolności do ponownego uszczelniania błony i może być stosowane do wielu typów komórek. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania in vitro na żywo ponownego uszczelniania błony w komórkach pacjenta z dysferlinopatią po dwufotonowej ablacji laserowej.

Test naprawy błony komórkowej przy użyciu dwufotonowego mikroskopu laserowego

Opisujemy metody charakterystyki pęknięcia błony plazmatycznej za pośrednictwem MLKL w nekroptozie, w tym konwencjonalne i konfokalne obrazowanie za pomocą mikroskopii żywych komórek, skaningową mikroskopię elektronową i wiązanie lipidów oparte na NMR.

Charakterystyka pęknięcia błony plazmatycznej za pośrednictwem MLKL w nekroptozie

Test wycieku fluorescencji to prosta metoda, która umożliwia badanie interakcji peptyd/błona, aby zrozumieć ich udział w kilku procesach biologicznych, a zwłaszcza zdolność peptydów penetrujących komórki do zakłócania dwuwarstwowych fosfolipidów podczas bezpośredniego procesu translokacji komórkowej.

Test przecieku fluorescencyjnego w celu zbadania destabilizacji błony przez peptyd penetrujący komórkę

Metoda nakłuwania termoplazmonicznego łączy mikroskopię konfokalną, pęsetę optyczną i nanocząstki złota do badania reakcji białek podczas naprawy błony plazmatycznej w komórkach i gigantycznych pęcherzykach jednopłytkowych. Technika ta umożliwia szybkie i miejscowe nakłucie błony, co pozwala na identyfikację kluczowych białek i ich ról funkcjonalnych w skomplikowanej maszynerii naprawy błony plazmatycznej.

Termoplazmoniczne podejście do badania naprawy błon plazmatycznych w żywych komórkach i błonach modelowych

Protokół ten opisuje metodę obrazowania żywymi komórkami do monitorowania przepuszczalności błony lizosomalnej podczas nekroptozy, wykorzystującą sondy fluorescencyjne wykrywające zmiany w integralności błony lizosomalnej i zakwaszeniu.

Obrazowanie żywymi komórkami permeabilizacji błony lizosomalnej podczas nekroptozy

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Poznaj technikę CALI do badania pękania pęcherzyków wewnątrzkomórkowych w żywych komórkach HeLa. Ta metoda pozwala precyzyjnie kontrolować uszkodzenia subkomórkowe i analizować aktywowane szlaki sygnałowe.

Fotodynamiczne podejście do badania funkcji pękania pęcherzyków wewnątrzkomórkowych

Przeglądaj więcej filmów