Pomiar sztywności wątroby za pomocą mikroskopii sił atomowych sprzężonej z mikroskopią polaryzacyjną
20 lipca 2022
Przedstawiamy protokół do pomiaru modułów sprężystości obszarów bogatych w kolagen w prawidłowej i chorej wątrobie za pomocą mikroskopii sił atomowych. Jednoczesne zastosowanie mikroskopii polaryzacyjnej zapewnia wysoką precyzję przestrzenną do lokalizacji obszarów bogatych w kolagen w wycinkach wątroby.
Nasz protokół zapewnia rozróżnienie między obszarami bogatymi w kolagen i brakującymi kolagenem w sekcjach wątroby. Dzięki temu można go wykorzystać do bardziej szczegółowego badania procesów fibrogenezy. Główną zaletą tej techniki jest zastosowanie mikroskopii polaryzacyjnej do zlokalizowania obszarów bogatych w kolagen w odcinkach wątroby.
Nasze protokoły mogą zapewnić doskonały wgląd w rozwój zwłóknienia wątroby, a także mogą być stosowane w przypadku innych tkanek miękkich, takich jak płuca, po pewnych optymalizacjach. Na początek usuń zamrożone skrawki wątroby z minus 80 stopni Celsjusza i rozmrażaj je w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Utrwal skrawki lodowatym 4% paraformaldehydem w PBS przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie przemyj pięć razy PBS.
Po ostatnim płukaniu wytrzyj nadmiar PBS wokół sekcji wątroby za pomocą chusteczki i zaznacz granicę około dwóch na cztery centymetry wokół odcinka wątroby za pomocą hydrofobowego markera. Przykryj próbkę PBS, a następnie załaduj próbkę na stolik AFM i przykryj ją głowicą AFM. W oprogramowaniu do mikroskopii sił atomowych lub AFM przejdź do zakładki ustawień i zaznacz pole wyboru automatycznego zapisywania, aby automatycznie zapisywać wszystkie pliki.
Następnie określ nazwę pliku i katalog do zapisania plików pomiarowych, przechodząc do zakładki ustawień i klikając zapisywanie ustawień. Zbliżyć się do powierzchni tkanki za pomocą wspornika AFM, włączając laser i klikając podejścia. Po zakończeniu podejścia wsuń końcówkę wspornika, klikając raz wciągania, który cofa wspornik do górnego końca zakresu piezoelektrycznego.
W razie potrzeby ustaw detektor ponownie za pomocą pokręteł na głowicy AFM. Wyłącz laser. Końcówka znajduje się teraz w centrum celu.
Następnie nałóż pole optyczne mikroskopu na mapy pomiarowe AFM, klikając zakładkę akcesoria i wybierając bezpośrednią kalibrację optyczną nakładki. W następnym oknie kliknij dalej, aby zrobić serię zdjęć wspornika skanującego określony obszar. Kliknij ponownie przycisk Dalej, aby przejść do następnego okna.
Na pierwszym obrazie kliknij ręcznie środek końcówki wspornika, aby przedstawić pozycję końcówki w oprogramowaniu. Rozmiarem okręgu przedstawiającego położenie końcówki można manipulować, wskazując jego promień, aby zwiększyć dokładność. Kliknij przycisk Kalibruj, aby automatycznie wykryć pozycję końcówki wspornika na wszystkich obrazach.
Potwierdź dokładność wykrywania końcówek, przeglądając obrazy. Kliknij przycisk Dalej, a następnie zakończ, aby zakończyć nakładkę optyczną. Następnie przesuń scenę, aby umieścić obszar bogaty w kolagen wewnątrz zielonego pola, widocznego na karcie przeglądarki danych, używając spolaryzowanego obrazu.
Wybierz obszar bogaty w kolagen, definiując obszar pod zakładką siatki, a następnie tworząc prostokąt na karcie przeglądarki danych za pomocą długiego naciśnięcia lewego przycisku myszy wewnątrz określonego zielonego pola. Kliknij potwierdź nowy region skanowania, aby ustawić wybrany obszar jako obszar pomiaru. Ustaw parametry pętli sprzężenia zwrotnego.
Ustaw wzmocnienie I na 50 Hz i wzmocnienie P na 0,001. Następnie ustaw nastawę na jeden nano Newton. Wybierz względną wartość zadaną zgodnie z badanymi materiałami, właściwościami mechanicznymi i sztywnością wspornika.
Określ prostą linię bazową, aby prawidłowo dopasować krzywe siły. Następnie należy wybrać długość ruchu wspornika w osi Z zgodnie z topografią powierzchni próbki. Ustaw ruch Z na stały czas trwania.
Ustaw czas wydłużenia na jedną sekundę z opóźnieniami wysuwania i chowania na zero. Ustaw częstotliwość próbkowania na 5 000 herców. Zaznacz znacznik przed zamkniętą pętlą Z, aby automatycznie dostosować odległość między próbką a końcówką wspornika podczas pomiarów.
Następnie odłącz zmotoryzowany sterownik stage, odznaczając przycisk włączania. Włącz laser i zbliż się do próbki za pomocą wspornika. Kliknij przycisk Rozpocznij skanowanie, aby zebrać krzywe odległości siły.
Analizuj pozyskane dane za pomocą oprogramowania open source AtomicJ. Załaduj krzywe sił do programu, klikając ikonę krzywych sił procesowych i map. Następnie w asystencie przetwarzania dodaj mapy do analizy, klikając przycisk dodaj.
Po załadowaniu map kliknij Dalej. Określ ustawienia przetwarzania w następnym oknie. Aby automatycznie oszacować punkt styku między próbką a wspornikiem przy użyciu zestawu parametrów krzywej dopasowania, należy użyć automatycznego oszacowania punktu kontaktu.
Określić punkt styku między wspornikiem a próbką za pomocą klasycznej metody siatki skupionej. Wybierz metodę estymacji jako metodę niezależną od modelu, aby uzyskać najlepsze określenie punktu styku na podstawie jakości zmierzonych krzywych siły, które należy empirycznie określić podczas optymalizacji analizy danych. Dopasuj krzywą wcięcia siły przy użyciu modelu klasycznego jako klasyczną L dwa dla dopasowania modelu.
Ustaw dopasowanie modelu do krzywej wycofania. Ustaw współczynnik Poissona na 0,45, zgodnie z zaleceniami dla tkanek miękkich, takich jak wątroba. Ustaw dopasowanie krzywej, używając stopnia linii bazowej wynoszącego trzy i stopnia kontaktu wynoszącego jeden.
Zmień stopień dopasowania wielomianu na podstawie skali odchyleń krzywych od modelu. Wybierz model używany do dopasowania krzywych wycofania jako model Sneddona. Wypełnij promień kulistej końcówki do 2,9 mikrometra.
Załaduj stałą sprężystości i invOLS z plików danych, włączając wczytywanie, a następnie kliknij przycisk Zakończ. Po analizie danych przejdź przez krzywe siły. Wyklucz krzywe siły, w których wspornik zbliżał się nieprawidłowo do powierzchni sekcji wątroby.
Krzywe te charakteryzują się wysokim poziomem hałasu i nieprawidłowymi kształtami. Następnie dane można skopiować lub wyeksportować. W tym badaniu łagodnie utrwalone skrawki wątroby uzyskane od myszy kontrolnych i myszy z łagodnym i zaawansowanym zwłóknieniem wywołanym wstrzyknięciem czterochlorku węgla badano za pomocą AFM.
Obszary w pobliżu żył centralnych odpowiadające obszarom, w których zwykle tworzą się włókna kolagenowe u myszy z czterochlorkiem węgla, analizowano w wątrobach kontrolnych. Rozkład modułów Younga był powtarzalny w różnych regionach w wątrobie kontrolnej i obszarach bogatych w kolagen w obrębie jednego odcinka wątroby. U myszy leczonych czterochlorkiem węgla mapy sztywności odpowiadające okołocentralnym obszarom złogów kolagenu wykazały znacznie wyższe wartości modułów Younga w porównaniu z równoważnymi obszarami u myszy kontrolnych.
Ponadto nastąpił znaczny wzrost wartości modułów Younga przy dłuższym leczeniu. Oceniono również wpływ długotrwałego przechowywania skrawków wątroby na właściwości mechaniczne włókien kolagenowych. Pomiary AFM wykazały istotnie niższe wartości modułów Younga w obszarach bogatych w kolagen dla skrawków przechowywanych przez trzy miesiące, w porównaniu z tymi uzyskanymi w ciągu dwóch tygodni.
Czas mocowania wycinka wątroby w dużym stopniu decyduje o właściwościach mechanicznych wycinka wątroby. Zalecamy, aby ściśle przestrzegać interwałów czasowych określonych w protokole. Po pewnych optymalizacjach w protokole, podana metoda może być stosowana do dowolnych tkanek miękkich wykazujących znaczne odkładanie kolagenu, co jest wykrywalne za pomocą mikroskopii polaryzacyjnej.
Podana technika zapewnia naukowcom ujednolicony i wygodny protokół do badania mechanizmu działania wątroby u osób zdrowych i chorych.
Przegląd
Niniejsza praca prezentuje protokół pomiaru modułów sprężystości obszarów bogatych w kolagen w normalnych i bliznowaciejących tkankach wątroby z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych (AFM) połączonej z mikroskopią polaryzacyjną. Technika ta pozwala na wysoką przestrzenną precyzję w identyfikacji regionów bogatych w kolagen, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia bliznowacenia wątroby.
Kluczowe Elementy Badania
Obszar badawczy
- Bliznowacenie wątroby i jego charakterystyka
- Właściwości sprężyste tkanek
- Zastosowanie zaawansowanych technik obrazowania
Wprowadzenie
- Potrzeba ulepszonych metod różnicowania obszarów bogatych w kolagen od obszarów ubogich w kolagen w tkankach wątroby.
- Zrozumienie fibrogenesy jest kluczowe dla badań nad chorobami wątroby.
- Mikroskopia sił atomowych (AFM) zapewnia pomiary o wysokiej rozdzielczości w tkankach miękkich.
Wykorzystane Metody
- Mikroskopia sił atomowych (AFM) do pomiaru modułów sprężystości
- Obszary bogate w kolagen w tkankach wątroby jako system biologiczny
- Mikroskopia polaryzacyjna do lokalizacji kolagenu
Główne Wyniki
- Pomyślne zidentyfikowanie obszarów bogatych w kolagen w przekrojach wątroby
- Kwantyfikacja modułów Younga w różnych regionach wątroby
- Wgląd we właściwości mechaniczne związane z bliznowaceniem
Wnioski
- Protokół demonstruje niezawodne podejście do badania bliznowacenia wątroby.
- Ta metoda może potencjalnie zostać dostosowana do innych tkanek miękkich, przyczyniając się do szerszych badań biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of liver stiffness at the cellular level is critical for de-risking early-stage fibrosis targets and understanding disease progression mechanisms. Atomic force microscopy (AFM) coupled with polarization microscopy enables precise mapping of collagen-rich fibrotic regions, supporting predictive confidence in target validation and translational research. This capability strengthens portfolio decisions by providing reproducible, spatially resolved mechanical data relevant to fibrogenesis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of fibrogenesis by distinguishing collagen-rich from collagen-lacking regions.
- Supports biological de-risking through direct measurement of tissue mechanical properties linked to disease state.
- Provides reproducible quantitative data to inform target selection and triage in fibrosis research.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated tissue models for downstream compound screening.
- Delivers standardized, quantitative Young's modulus outputs for assay reproducibility.
- Enables high spatial precision in identifying regions of interest for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanical measurements with disease-relevant tissue changes for translational biomarker development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by mapping fibrosis progression.
- Provides predictive de-risking for therapeutic hypotheses targeting matrix remodeling.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, quantitative readouts, and cross-model standardization in fibrosis research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on matrix stiffening and its cellular effects in fibrogenesis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative stiffness measurements for assay development.
- Analytics: Generates spatially resolved Young's modulus data for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Links mechanical properties to disease progression for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for other soft tissues with collagen deposition, supporting broader R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in fibrosis target validation.
- Operational Value: Standardizes measurement of tissue mechanics with high reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in fibrosis programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of fibrosis and matrix-targeting assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and tissue preparation for reproducible results.
- Needs access to AFM instrumentation and polarization microscopy for spatial targeting.
- Demands strict adherence to fixation and storage protocols to ensure data integrity.
- Cross-team standardization is essential for reproducibility across studies and sites.
- Protocol adaptation may be needed for other soft tissues with distinct collagen architectures.
