Name: Pomiar sztywności wątroby za pomocą mikroskopii sił atomowych sprzężonej z mikroskopią polaryzacyjną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj metodę pomiaru modułów sprężystości w obszarach bogatych w kolagen w tkankach wątroby za pomocą mikroskopii sił atomowych sprzężonej z mikroskopią polaryzacyjną. Technika ta umożliwia precyzyjną lokalizację włókien kolagenowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Agencję Grantową Republiki Czeskiej (18-02699S), Instytucjonalny Projekt Badawczy Czeskiej Akademii Nauk (RVO 68378050) oraz projekt MEYS CR NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, Instruct-CZ Centre of Instruct-ERIC konsorcjum UE, finansowane przez projekt infrastrukturalny MEYS CR LM2018127 i Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego – projekt "UP CIISB" (nr CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) wsparł finansowo pomiary w CF Nanobiotechnology, CEITEC MU. Dziękujemy również Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, Republika Czeska, wspierana przez MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) i RVO: 68378050-KAV-NPUI, za ich wsparcie w zakresie obrazowania mikroskopowego przedstawionego w niniejszym dokumencie.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiony protokół zapewnia krok po kroku powtarzalną metodę pomiaru AFM prawidłowej i zwłókniejącej tkanki wątroby myszy. Mikroskopia polaryzacyjna sprzężona zapewnia wysoką precyzję przestrzenną i umożliwia wizualizację włókien kolagenowych ze względu na ich dwójłomność. Ponadto przedstawiono szczegółowy opis analizy uzyskanych krzywych sił. Pomiar sztywności AFM można wykonać na poziomie komórkowym, co pozwala na monitorowanie miejscowych zmian właściwości mechanicznych tkanki wątroby spowodowanych rozwijającą się chorobą zwłóknieniową. Zwłóknienie wątroby nie jest jednorodnym procesem wpływającym na cały narząd. Wręcz przeciwnie, obszary bogatych w kolagen przegród zwłóknieniowych przeplatają się z obszarami o niskim lub zerowym poziomie złogów kolagenu. W związku z tym zmiany sztywności są specyficzne dla lokalnego mikrośrodowiska i wpływają na komórki tylko miejscowo stykające się z obszarami uszkodzonymi przez uraz. Ta mikroskala niejednorodności sztywności jest również widoczna w szczegółach map modułów AFM Younga, gdzie punkty o wysokiej sztywności graniczą z obszarami o prawie normalnej sztywności. Ta zmienność pokazuje, że nawet obszar tkanki bliznowatej kolagenu nie jest mechanicznie jednorodny i wymaga scharakteryzowania pomiaru AFM na poziomie komórkowym (ryc. 4).
Przedstawiony protokół pozwala na pomiar sztywności wątroby za pomocą AFM niezależnie od pobrania wątroby, ponieważ całe płaty wątroby osadzone w OCT mogą być przechowywane przez dłuższy czas w temperaturze -80 °C. Jednak po przecięciu tkanki zalecamy zmierzenie próbek w ciągu ~2 tygodni, ponieważ zaobserwowaliśmy stopniowe zmiękczanie skrawków tkanek przechowywanych przez dłuższy czas (ryc. 5).
AFM wyposażony w mikroskopię polaryzacyjną pozwala na precyzyjne zlokalizowanie obszaru zainteresowania w obrębie struktury zrazika wątroby. Ma jednak również pewne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę podczas interpretacji wyników. Uzyskane tutaj wartości sztywności zostały zmierzone w temperaturze pokojowej. Zakładamy, że wpływ temperatury na właściwości mechaniczne tkanek miękkich będzie niewielki; Może to być jednak jedna z przyczyn różnic między podawanymi in vivo wartościami właściwości mechanicznych tkanek wątroby a wartościami w niniejszym badaniu.
Ponadto protokół ten pozwala na analizę AFM tkanki wątroby przez okres do 3 godzin, co wymaga łagodnego unieruchomienia tkanki. Łagodne utrwalenie skrawków tkanki, a także cykl zamrażania-rozmrażania, najprawdopodobniej wpłyną na bezwzględne wartości modułu Younga. W związku z tym podane wartości modułów Younga mogą różnić się od wartości in vivo . Potrzebne są dalsze badania w celu optymalizacji protokołu pomiaru bezwzględnych wartości modułu Younga z odcinków wątroby, co można osiągnąć inną metodą utrwalania tkanki wątroby64.
Niemniej jednak zaobserwowaliśmy rosnącą sztywność obszarów bogatych w kolagen w wątrobie myszy leczonychCCl 4 przez 3 tygodnie w porównaniu z 6 tygodniami. Zmiany te odpowiadają progresji zwłóknienia podczas długotrwałego urazu (ryc. 4) i pokazują, że za pomocą przedstawionego protokołu można badać względne różnice między różnymi terapiami. Jest to zgodne z obserwacjami Calò i wsp., którzy wykazali, że łagodnie unieruchomione skrawki wątroby wykazują podobne różnice w wartościach sztywności między obszarami bogatymi w kolagen i pozbawionymi kolagenu, jak w świeżej tkance25.
Zastosowaliśmy wspornik SD-qp-BioT-TL-10 (teoretyczna stała sprężystości ~0,09 N/m) zmodyfikowany kulistą końcówką o średnicy 5,7 μm w celu zminimalizowania mechanicznego uszkodzenia tkanki wątroby podczas pomiarów. Kulka o średnicy 5,7 μm umożliwiła wystarczające wgłębienie próbki, aby zbadać jej sztywność przy jednoczesnym zachowaniu jej integralności. Ścieg o mniejszej średnicy może być użyty, po kilku optymalizacjach, do uzyskania wyższej rozdzielczości w mapach sztywności, ale może prowadzić do dalszego przeszacowania wartości modułu Younga (więcej szczegółów można znaleźć w Crichton i wsp.65). Korzystając z określonego zestawu wspornika-stopki, byliśmy w stanie scharakteryzować sztywność próbki w szerokim zakresie, od kilkudziesięciu jednostek Pa do ~100 kPa.
Model Sneddona został wykorzystany do wyprowadzenia modułu Younga na podstawie krzywych sił, ponieważ umożliwia analizę głębokich wgłębień za pomocą sond koloidalnych62. Model Sneddona, w przeciwieństwie do modelu Hertza, nie cierpi z powodu ograniczenia, że promień kontaktu musi być znacznie mniejszy niż promień kuli. Zakłada się ponadto, że grubość próbki jest kilkakrotnie większa niż głębokość wgłębienia30,66. W niniejszym badaniu wgłębienie wynosiło ~2 μm przy wielkości kulki 5,7 μm i grubości próbki 30 μm w obszarach bogatych w kolagen; w związku z tym model Sneddona był odpowiedni. Inne modele63 biorąc pod uwagę siłę przylegania między końcówką a podłożem, mogą być stosowane do różnych typów tkanek.
Analiza w AtomicJ wprowadza poprawki na skończoną grubość próbek w celu zminimalizowania udziału substratu przy jednoczesnym wyprowadzeniu modułu Younga62,67. W analizie uzyskanych krzywych sił zastosowaliśmy pojedynczy współczynnik Poissona wynoszący 0,45, który był wcześniej zalecany dla narządów tkanek miękkich24. Przybliżenie to nie ma istotnego wpływu na obliczone wartości modułu Younga, gdyż zmiana wartości współczynnika Poissona z 0,4 na 0,5 powoduje jedynie 0,893-krotny spadek wartości modułu Younga obliczonych według równania Sneddona. Biorąc pod uwagę wielokrotne różnice w module Younga między różnymi czasami trwania zabiegówCCl 4, błędy wynikające z aproksymacji współczynnika Poissona są tylko marginalne.
Do obliczenia wartości sztywności użyliśmy krzywych wycofania, ponieważ interesowała nas sprężysta reakcja tkanki na obciążenie dostarczane przez wspornik, a nie reakcja plastyczna na wgłębienie68. Ze względu na lepkosprężystą reakcję tkanki miękkiej, dopasowanie krzywych wycofania może zawyżać moduł Younga, o czym należy pamiętać. Ponadto zaobserwowaliśmy, że analiza danych z krzywymi podejścia daje podobne trendy w wartościach sztywności między obszarami zwłóknienia i kontrolnymi, chociaż wartości bezwzględne są odpowiednio niższe (dane nie pokazane).
Optymalizując protokół, zidentyfikowaliśmy kilka kroków krytycznych dla odtwarzalności pomiarów. Po pierwsze, ważne jest, aby upewnić się, że koralik znajduje się mniej więcej pośrodku półprzezroczystej końcówki podczas mocowania do wspornika. Zapobiega to ewentualnemu niewyważeniu mechanicznemu podczas wgniatania. Po drugie, podczas wiązania wątroby z PFA konieczne jest ścisłe przestrzeganie limitów czasowych rozmrażania i utrwalania. Zmiana czasu tego etapu może poważnie wpłynąć na właściwości mechaniczne skrawków tkanek. Po trzecie, wspornik musi być wielokrotnie kalibrowany z ciągłym monitorowaniem i wprowadzaniem jednoczesnych wartości temperatury, aby uniknąć wystąpienia jakichkolwiek artefaktów w wartościach sztywności spowodowanych wahaniami temperatury. Wreszcie, pojedynczy wycinek wątroby nie powinien być mierzony dłużej niż 3 godziny od przygotowania, ponieważ nałożony PBS może parować przez dłuższy czas. Czytelnicy mogą zapoznać się z tabelą rozwiązywania problemów (Tabela 3) w celu rozwiązywania problemów napotkanych podczas pomiaru AFM, omówionej również szczegółowo w Norman et al.46.
Tabela 3: Przewodnik rozwiązywania problemów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table 3v2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Przedstawiony protokół pozwala na powtarzalne badanie tkanki wątroby za pomocą AFM. Ma ona potencjał, aby ujawnić informacje na temat rozwoju i ostatecznej regresji zwłóknieniowej choroby wątroby na poziomie mikroskopowym i może przyczynić się do opracowania terapii ukierunkowanych na zwłókniałe obszary blizn powstałe podczas progresji przewlekłej choroby wątroby.

Wątroba jest ważnym organem do utrzymania homeostazy organizmów1,2. Przewlekłe choroby wątroby są przyczyną ~2 milionów zgonów rocznie na całym świecie3. Powstają one najczęściej jako infekcje wirusowe, zaburzenia autoimmunologiczne, zespoły metaboliczne lub choroby związane z nadużywaniem alkoholu i towarzyszy im postępujące zwłóknienie wątroby. Uszkodzenie wątroby wywołuje reakcję zapalną, która prowadzi do aktywacji komórek odkładających macierz zewnątrzkomórkową (ECM) w odpowiedzi gojenia się ran. Jednak w przypadku przewlekłego urazu, nadmiar ECM tworzy nierozwiązaną tkankę bliznowatą w wątrobie, prowadząc do rozwoju zwłóknienia wątroby, marskości wątroby, raka wątroby i ostatecznie do niewydolności wątroby4.
Uszkodzenie hepatocytów natychmiast powoduje zwiększoną sztywność wątroby5,6. Wpływa to bezpośrednio na funkcję hepatocytów, aktywuje komórki gwiaździste wątroby (HSC) i fibroblasty wrotne oraz powoduje ich transróżnicowanie do miofibroblastów odkładających kolagen7,8. Odkładanie się włóknistego ECM dodatkowo zwiększa sztywność wątroby, tworząc samowzmacniającą się pętlę sprzężenia zwrotnego usztywnienia wątroby i aktywacji komórek wytwarzających macierz.
Sztywność wątroby stała się więc ważnym parametrem w prognozowaniu chorób wątroby. Zmiana właściwości biomechanicznych tkanki może być wykryta wcześniej niż zwłóknienie może być zdiagnozowane za pomocą analizy histologicznej. Dlatego opracowano różne techniki pomiaru sztywności wątroby zarówno w zastosowaniach badawczych, jak i klinicznych. W warunkach klinicznych elastografia przejściowa (TE)9,10,11,12,13 i elastografia rezonansu magnetycznego (MRE)14,15,16,17,18 zostały wykorzystane do nieinwazyjnego diagnozowania wczesnych stadiów uszkodzenia wątroby poprzez badanie dużej sztywności wątroby19.
W TE, fale ultradźwiękowe o łagodnej amplitudzie i niskiej częstotliwości (50 Hz) są rozchodzone przez wątrobę, a ich prędkość jest mierzona, co jest następnie wykorzystywane do obliczenia modułu sprężystości tkanki13. Jednak ta technika nie jest przydatna dla pacjentów z wodobrzuszem, otyłością lub niższymi przestrzeniami międzyżebrowymi z powodu niewłaściwego przekazywania fal ultradźwiękowych przez tkanki otaczające wątrobę9.
MRE opiera się na metodzie obrazowania metodą rezonansu magnetycznego i wykorzystuje mechaniczne fale ścinające o częstotliwości 20-200 Hz do celowania w wątrobę. Specyficzna sekwencja obrazowania metodą rezonansu magnetycznego jest następnie wykorzystywana do śledzenia fal wewnątrz tkanki i obliczania sztywności tkanki16. Wartości sztywności zgłoszone zarówno za pomocą technik TE, jak i MRE dobrze korelują ze stopniem zwłóknienia wątroby uzyskanym z biopsji próbek ludzkiej wątroby uszeregowanych za pomocą histologicznych wyników METAVIR 20 (Tabela 1). TE i MRE zostały również przystosowane do pomiaru sztywności wątroby w modelach gryzoni do celów badawczych21,22,23. Ponieważ jednak obie metody wyprowadzają wartości sztywności na podstawie odpowiedzi tkanki na rozchodzące się fale ścinające, uzyskane wartości mogą nie odzwierciedlać bezwzględnej sztywności mechanicznej tkanki.
Dla bezpośredniej mechanicznej charakterystyki wątroby gryzoni, Barnes et al. opracowali test modelowo-żelowo-tkankowy (test MGT) polegający na osadzeniu tkanki wątroby w żelu poliakrylamidowym24. Żel ten jest ściskany przez pulsacyjną jednostajną siłę, na podstawie której można obliczyć moduł Younga. Test MGT wykazuje dobrą korelację z testem wgłębień dostosowanym zarówno do prawidłowej, jak i zwłóknienia wątroby24 (Tabela 1).
Tabela 1: Wartości sztywności wątroby na poziomie masowym. TE i MRE porównane z bezpośrednimi pomiarami mechanicznymi ex vivo modułów sprężystości wątroby przy użyciu testów wgłębień i MGT dla wątroby z różnych źródeł. Zależność między E i G jest określona przez E = 2G (1 + v), gdzie v jest stosunkiem Poissona próbki; F0 do F4 reprezentują wynik zwłóknienia w systemie punktacji METAVIR, gdzie F0 oznacza niskie zwłóknienie lub jego brak, a F4 marskość wątroby. Skróty: TE = elastografia przejściowa; MRE = elastografia rezonansu magnetycznego; MGT = model-żel-tkanka; E = moduł sprężystości (Younga); G = moduł ścinania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table 1v2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Jedną z głównych wad ogólnych pomiarów sztywności wątroby jest to, że nie zapewniają one rozdzielczości heterogeniczności sztywności wątroby na poziomie komórkowym. Podczas progresji zwłóknienia obszary bogate w kolagen wykazują większą sztywność w porównaniu z otaczającymi je miąższami25,26. Ten gradient sztywności lokalnie wpływa na komórki rezydentne i odgrywa ważną rolę w napędzaniu niejednorodności HSC27. W związku z tym zmiany w lokalnych właściwościach mechanicznych podczas rozwoju choroby wątroby muszą być scharakteryzowane na poziomie mikroskopowym, aby lepiej zrozumieć postęp zwłóknienia.
AFM pozwala na pomiar właściwości mechanicznych tkanek z wysoką rozdzielczością i wysoką czułością na siłę. AFM wykorzystuje końcówkę wspornika do wgniatania powierzchni próbki siłami tak niskimi, jak kilka pikonewtonów, wywołując deformację na poziomie mikroskopowym lub nanoskopowym w oparciu o geometrię i rozmiar zastosowanej końcówki. Reakcja siły próbki na przyłożone odkształcenie jest następnie mierzona jako ugięcie w klasie cantilever<sup="xref">28. Krzywe siła-przemieszczenie są zbierane na podstawie podejścia i cofania wspornika, który może być wyposażony w odpowiednie modele mechaniki kontaktowej w celu oceny lokalnej sztywności próbki29.
Oprócz pomiaru sztywności danego obszaru, AFM może również dostarczyć informacji topograficznych o konkretnych cechach próbki, takich jak struktura włókien kolagenowych30,31,32. Wiele badań opisało zastosowanie AFM do pomiaru sztywności różnych zdrowych i chorych tkanek, takich jak skin32,33, lung34,35, brain36, mammary37,38,39, chrząstka40, lub heart41,42,43,44 zarówno z próbek modelu pacjenta, jak i myszy. Co więcej, AFM został również wykorzystany in vitro do określenia sztywności komórek i zewnątrzkomórkowych rusztowań białkowych45,46,47.
Pomiar właściwości mechanicznych próbek biologicznych za pomocą AFM jest nietrywialny ze względu na ich miękkość i kruchość. W związku z tym różne badania ustandaryzowały różne warunki i ustawienia, które dają bardzo zmienne wartości modułów Younga (przejrzane przez Mckee et al.48). Podobnie jak w przypadku innych tkanek miękkich, wartości modułu Younga w wątrobie przy różnych stopniach zwłóknienia wątroby również wykazują dużą zmienność (Tabela 2). Różnice w wartościach modułu Younga wynikają z różnic w trybie pracy AFM, końcówce wspornika, metodzie przygotowania próbki, grubości próbki, głębokości i siłach wgłębienia, środowisku tkanki wątroby podczas pomiaru oraz metodzie analizy (tabela 2).
Tabela 2: Wartości sztywności wątroby na poziomie komórkowym. Wartości sztywności wątroby uzyskane za pomocą AFM opisują właściwości mechaniczne wątroby na poziomie komórkowym. Skróty: AFM = mikroskopia sił atomowych; E = moduł sprężystości (Younga); PFA = paraformaldehyd; PBS = sól fizjologiczna buforowana fosforanami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table 2v2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Ten artykuł opisuje protokół powtarzalnego pomiaru modułów Younga bogatych w kolagen obszarów zwłóknienia w tkance wątroby za pomocą AFM z precyzyjną lokalizacją zapewnioną przez użycie mikroskopii polaryzacyjnej. Podaliśmy czterochlorek węgla (CCl4) w celu wywołania odkładania się kolagenu w sposób odśrodkowy49 w modelu mysim, niezawodnie naśladując kluczowe aspekty zwłóknienia ludzkiej wątroby50. Spolaryzowane obrazy mikroskopowe umożliwiają wizualizację kolagenu w wątrobie ze względu na dwójłomność włókien kolagenowych51, co pozwala na dokładne ustawienie końcówki wspornika nad pożądanym obszarem zainteresowania w obrębie zrazika wątrobowego52.

<table><tbody><tr><td>Głowica AFM</td><td>Bruker</td><td>JPK nanowizard 3</td><td></td></tr><tr><td>Kamery</td><td>Andor</td><td>Zyla 5.5 USB (sCMOS, chłodzone wodą)</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Obrazowanieźródło&nbsp;</td><td>S/N:12310015</td><td></td></tr><tr><td>Cantilever</td><td>SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensory</td><td>S/N:73750F05</td><td></td></tr><tr><td>Cryotome</td><td>Leica&nbsp;</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Klej na bazie żywicy epoksydowej (długi czas pracy)</td> <td>Bison epoksydowe uniwersalne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kulki melaminowe; średnica, 5,7 um</td><td>Mikrocząstki, GmbH</td><td>MF-R-5.7</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>&nbsp; IX81</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofobowy&nbsp; marker do slajdów</td><td>SuperHT</td><td>PAP PEN</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td>JPK nanowizard&nbsp; v6.1.151</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Prowadnice AtomicJ v2.3.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost</td><td>Thermoscientific</td><td>nr ref. J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>System</td><td>Ubuntu 14.04.5 LTS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kontrola izolacji drgań jednostka</td><td>Stajnia stołowa</td><td>AVI-200-S</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar sztywności wątroby za pomocą mikroskopii sił atomowych sprzężonej z mikroskopią polaryzacyjną

Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

Usztywnienie macierzy zostało uznane za jeden z kluczowych czynników postępu zwłóknienia wątroby. Ma głęboki wpływ na różne aspekty zachowania komórek, takie jak funkcja komórki, różnicowanie i ruchliwość. Ponieważ jednak procesy te nie są jednorodne w całym narządzie, coraz ważniejsze staje się zrozumienie zmian we właściwościach mechanicznych tkanek na poziomie komórkowym.
Aby móc monitorować usztywnienie obszarów bogatych w kolagen w płatach wątroby, ten artykuł przedstawia protokół pomiaru modułów sprężystości tkanki wątrobowej z wysoką precyzją przestrzenną za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM). AFM jest czułą metodą, która może charakteryzować lokalne właściwości mechaniczne, obliczane jako moduł Younga (określany również jako moduł sprężystości). AFM w połączeniu z mikroskopią polaryzacyjną może być stosowany do specyficznego lokalizowania obszarów rozwoju zwłóknienia w oparciu o dwójłomność włókien kolagenowych w tkankach. Korzystając z przedstawionego protokołu, scharakteryzowaliśmy sztywność obszarów bogatych w kolagen ze zwłókniałych wątrob myszy i odpowiadających im obszarów w wątrobach myszy kontrolnych.
Wraz z rozwojem zwłóknienia zaobserwowano wyraźny wzrost sztywności obszarów kolagenowo-dodatnich. Przedstawiony protokół pozwala na wysoce powtarzalną metodę pomiaru AFM, dzięki zastosowaniu łagodnie utrwalonej tkanki wątroby, która może być wykorzystana do lepszego zrozumienia zainicjowanych przez chorobę zmian lokalnych właściwości mechanicznych tkanek i ich wpływu na los sąsiednich komórek.

Lekko utrwalone, 30 µm grube przekroje wątroby pobrane od myszy kontrolnych oraz od myszy z łagodną lub zaawansowaną włóknicą (indukowaną wtryskiwaniem CCl4 odpowiednio przez 3 tygodnie lub 6 tygodni49) poddano badaniu za pomocą AFM zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Do pomiaru map sztywności wybrano włókna kolagenowe znajdujące się w pobliżu żył centralnych. W wątrobach kontrolnych przeanalizowano obszary położone blisko żył centralnych, które odpowiadają miejscom, w których u zwierząt traktowanych CCl4 zazwyczaj tworzą się włókna kolagenowe (Rycina 4A). Rozkład modułów Younga był powtarzalny w różnych wątrobach kontrolnych oraz w obszarach bogatych w kolagen w obrębie jednego przekroju wątroby (Rycina 4B: lewy wykres skrzypcowy).
U zwierząt traktowanych CCl4 mapy sztywności odpowiadające obszarom okołoprzyśrodkowym złogów kolagenu wykazały znacznie wyższe wartości modułów Younga w porównaniu do analogicznych obszarów u myszy kontrolnych (Rycyna 4B: medianowe wartości modułu Younga 1,9 kPa vs. 2,6 kPa dla grupy kontrolnej i myszy traktowanej CCl4 przez 3 tygodnie; p = 0,07; 1,9 kPa vs. 5,1 kPa dla grupy kontrolnej i myszy traktowanej CCl4 przez 6 tygodni; p = 0,02). Co więcej, odnotowano istotny wzrost wartości modułów Younga przy dłuższym czasie traktowania CCl4 (Rycina 4B; medianowe wartości modułu Younga 2,6 kPa vs. 5,1 kPa dla myszy traktowanej CCl4 przez 3 tygodnie vs. 6 tygodni; p = 0,04). Wskazuje to na stopniowe utwardzanie się złogów kolagenu wraz z postępem włóknienia oraz na to, że pomiary AFM odzwierciedlają proces fibrogenezy.
Aby ocenić wpływ przedłużonego przechowywania przekrojów wątroby zatopionych w OCT na właściwości mechaniczne włókien kolagenowych, zmierzono sztywność włókien kolagenowych w przekrojach myszy traktowanych CCl4, które były przechowywane na szkiełkach po cięciu w temperaturze −80 °C przez 2 tygodnie lub 3 miesiące (Rysunek 5). Pomiary AFM wykazały znacznie niższe wartości modułów Younga w obszarach bogatych w kolagen dla przekrojów przechowywanych przez 3 miesiące w porównaniu do wyników uzyskanych z przekrojów mierzonych w ciągu 2 tygodni od wykonania cięcia (Rysunek 5; medianowe wartości modułu Younga 4,7 kPa vs. 3,6 kPa dla przechowywania przez 2 tygodnie vs. 3 miesiące; p &lt; 0,001). Zatem istotne jest pomiar właściwości mechanicznych tkanki wątroby krótko po przygotowaniu przekrojów z płatów wątroby zatopionych w OCT.
<img alt="Analiza modułu Younga, histogramy i wykresy skrzypcowe wykazują zmiany sztywności po traktowaniu CCl4." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4Pomiary AFM wykazują progresywne sztywnienie obszarów bogatych w kolagen, co koreluje z przedłużonym działaniem CCl44 leczenie (A) Przekroje wątroby myszy kontrolnych oraz myszy traktowanych $\text{CCl}_4$4 przez 3 tygodnie lub 6 tygodni wykorzystano do pomiaru właściwości mechanicznych obszarów bogatych w kolagen. Obramowane obszary przekrojów wątroby przedstawione na obrazach z mikroskopii w świetle spolaryzowanym (po lewej) to obszary skanowania bogate w kolagen (lub odpowiadające im regiony w wątrobie kontrolnej) wybrane do pomiarów AFM (30 µm Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 100 µm, 10 pikseli x 36 pikseli). Po prawej stronie przedstawiono mapy modułu Younga z Graduate skalami kolorystycznymi odpowiadającymi tym zaznaczonym obszarom, wraz z histogramami wartości modułu Younga z tych map; wstawione wykresy rozrzutu przedstawiają wartości &gt;10 kPa dla każdego stanu. Usztywnienie wątroby jest widoczne jako stopniowe przesunięcie rozkładu histogramu w prawo oraz większa częstotliwość punktów na wstawce z wykresem rozrzutu. Pasek skali = 20 µm. (BWykresy skrzypcowe przedstawiają rozkład modułów sprężystości z trzech obszarów zmierzonych dla każdego stanu (po lewej) oraz podsumowane wartości modułów sprężystości ze wszystkich trzech map (po prawej). Wykresy skrzypcowe wskazują medianę (czerwona linia), 25th percentyl i 75. percentyl (linie czarne); kropki reprezentują wartości średnie poszczególnych map z obszarów 1-3. Przedstawione wartości p obliczono przy użyciu testu t Studenta t-test przeprowadzony na średnich. Skróty: AFM = mikroskopia sił atomowych; CCl4 tetrachlorek węgla <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe i histogramy zmian modułu Younga, 2 tygodnie vs. 3 miesiące przechowywania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Przedłużone przechowywanie przekrojów wątroby prowadzi do spadku sztywności obszarów bogatych w kolagen. Do pomiaru modułu Younga wykorzystano przekroje wątroby (przygotowane z myszy traktowanych CCl4 przez 2 tygodnie) przechowywane w −80 °C przez 2 tygodnie lub 3 miesiące. Obrazy z mikroskopii polaryzacyjnej (po lewej) z ramkami wskazującymi obszary bogate w kolagen użyte do pomiarów AFM (30 µm x 100 µm, 10 pikseli x 36 pikseli). Odpowiadające im mapy modułu Younga ze skalami kolorystycznymi (po prawej). Histogramy przedstawiają wartości modułu Younga zebrane z 4-6 obszarów w każdej próbce; dołączone wykresy rozproszeniowe pokazują wartości &gt;10 kPa dla każdego stanu. Pasek skali = 20 µm. Skróty: AFM = mikroskopia sił atomowych; CCl4 = tetrachlorek węgla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rycina uzupełniająca S1: Metoda modyfikacji wspornika za pomocą mikrokuleczki z żywicy melaminowej. (A) Schemat ilustruje mocowanie kulistej kuleczki do wierzchołka wspornika. W celu uzyskania opisu krok po kroku należy przejść do sekcji 2, część 1, Mocowanie kuleczki o średnicy 5,7 µm do wierzchołka wspornika AFM. (B) Obraz mikroskopowy kulistej kuleczki o średnicy 5,7 µm przymocowanej do wierzchołka wspornika, przedstawiony w widoku z góry (lewo) i widoku bocznym (prawo). Paski skali = 20 µm. Skróty: AFM = mikroskopia sił atomowych; RT = temperatura pokojowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%201.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek dodatkowy S2: Analiza danych w programie AtomicJ. (A) Sekwencja kroków niezbędnych do otwarcia map sztywności w programie AtomicJ. Pojedyncze lewe kliknięcie opcji process force curves and maps (x) otwiera processing assistant. Pliki można załadować do processing assistant, klikając add (y) i wybierając wymagane pliki. Kliknij next (z), aby przejść do następnego kroku. (B) Parametry dopasowania krzywych, odpowiedni model mechaniki kontaktu oraz ustawienia AFM zastosowane podczas pomiaru. Kroki 1-11 odnoszą się do odpowiadających im podpunktów szczegółowo opisanych w kroku 3 protokołu, sekcja 5, Analiza danych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary_fig_2.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca S3: Schemat analizowanych danych w programie AtomicJ. Podgląd analizowanych danych przedstawia mapy sztywności (okno w lewym górnym rogu), krzywe sił (okno w prawym górnym rogu) oraz surowe dane (dolne okno). Skrót: AFM = mikroskopia sił atomowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%203.pdf" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Przedstawiamy protokół do pomiaru modułów sprężystości obszarów bogatych w kolagen w prawidłowej i chorej wątrobie za pomocą mikroskopii sił atomowych. Jednoczesne zastosowanie mikroskopii polaryzacyjnej zapewnia wysoką precyzję przestrzenną do lokalizacji obszarów bogatych w kolagen w wycinkach wątroby.

Pomiar sztywności wątroby za pomocą mikroskopii sił atomowych sprzężonej z mikroskopią polaryzacyjną

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

Nasz protokół zapewnia rozróżnienie między obszarami bogatymi w kolagen i brakującymi kolagenem w sekcjach wątroby. Dzięki temu można go wykorzystać do bardziej szczegółowego badania procesów fibrogenezy. Główną zaletą tej techniki jest zastosowanie mikroskopii polaryzacyjnej do zlokalizowania obszarów bogatych w kolagen w odcinkach wątroby.Nasze protokoły mogą zapewnić doskonały wgląd w rozwój zwłóknienia wątroby, a także mogą być stosowane w przypadku innych tkanek miękkich, takich jak płuca, po pewnych optymalizacjach. Na początek usuń zamrożone skrawki wątroby z minus 80 stopni Celsjusza i rozmrażaj je w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Utrwal skrawki lodowatym 4% paraformaldehydem w PBS przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie przemyj pięć razy PBS.Po ostatnim płukaniu wytrzyj nadmiar PBS wokół sekcji wątroby za pomocą chusteczki i zaznacz granicę około dwóch na cztery centymetry wokół odcinka wątroby za pomocą hydrofobowego markera. Przykryj próbkę PBS, a następnie załaduj próbkę na stolik AFM i przykryj ją głowicą AFM. W oprogramowaniu do mikroskopii sił atomowych lub AFM przejdź do zakładki ustawień i zaznacz pole wyboru automatycznego zapisywania, aby automatycznie zapisywać wszystkie pliki.Następnie określ nazwę pliku i katalog do zapisania plików pomiarowych, przechodząc do zakładki ustawień i klikając zapisywanie ustawień. Zbliżyć się do powierzchni tkanki za pomocą wspornika AFM, włączając laser i klikając podejścia. Po zakończeniu podejścia wsuń końcówkę wspornika, klikając raz wciągania, który cofa wspornik do górnego końca zakresu piezoelektrycznego.W razie potrzeby ustaw detektor ponownie za pomocą pokręteł na głowicy AFM. Wyłącz laser. Końcówka znajduje się teraz w centrum celu.Następnie nałóż pole optyczne mikroskopu na mapy pomiarowe AFM, klikając zakładkę akcesoria i wybierając bezpośrednią kalibrację optyczną nakładki. W następnym oknie kliknij dalej, aby zrobić serię zdjęć wspornika skanującego określony obszar. Kliknij ponownie przycisk Dalej, aby przejść do następnego okna.Na pierwszym obrazie kliknij ręcznie środek końcówki wspornika, aby przedstawić pozycję końcówki w oprogramowaniu. Rozmiarem okręgu przedstawiającego położenie końcówki można manipulować, wskazując jego promień, aby zwiększyć dokładność. Kliknij przycisk Kalibruj, aby automatycznie wykryć pozycję końcówki wspornika na wszystkich obrazach.Potwierdź dokładność wykrywania końcówek, przeglądając obrazy. Kliknij przycisk Dalej, a następnie zakończ, aby zakończyć nakładkę optyczną. Następnie przesuń scenę, aby umieścić obszar bogaty w kolagen wewnątrz zielonego pola, widocznego na karcie przeglądarki danych, używając spolaryzowanego obrazu.Wybierz obszar bogaty w kolagen, definiując obszar pod zakładką siatki, a następnie tworząc prostokąt na karcie przeglądarki danych za pomocą długiego naciśnięcia lewego przycisku myszy wewnątrz określonego zielonego pola. Kliknij potwierdź nowy region skanowania, aby ustawić wybrany obszar jako obszar pomiaru. Ustaw parametry pętli sprzężenia zwrotnego.Ustaw wzmocnienie I na 50 Hz i wzmocnienie P na 0,001. Następnie ustaw nastawę na jeden nano Newton. Wybierz względną wartość zadaną zgodnie z badanymi materiałami, właściwościami mechanicznymi i sztywnością wspornika.Określ prostą linię bazową, aby prawidłowo dopasować krzywe siły. Następnie należy wybrać długość ruchu wspornika w osi Z zgodnie z topografią powierzchni próbki. Ustaw ruch Z na stały czas trwania.Ustaw czas wydłużenia na jedną sekundę z opóźnieniami wysuwania i chowania na zero. Ustaw częstotliwość próbkowania na 5 000 herców. Zaznacz znacznik przed zamkniętą pętlą Z, aby automatycznie dostosować odległość między próbką a końcówką wspornika podczas pomiarów.Następnie odłącz zmotoryzowany sterownik stage, odznaczając przycisk włączania. Włącz laser i zbliż się do próbki za pomocą wspornika. Kliknij przycisk Rozpocznij skanowanie, aby zebrać krzywe odległości siły.Analizuj pozyskane dane za pomocą oprogramowania open source AtomicJ. Załaduj krzywe sił do programu, klikając ikonę krzywych sił procesowych i map. Następnie w asystencie przetwarzania dodaj mapy do analizy, klikając przycisk dodaj.Po załadowaniu map kliknij Dalej. Określ ustawienia przetwarzania w następnym oknie. Aby automatycznie oszacować punkt styku między próbką a wspornikiem przy użyciu zestawu parametrów krzywej dopasowania, należy użyć automatycznego oszacowania punktu kontaktu.Określić punkt styku między wspornikiem a próbką za pomocą klasycznej metody siatki skupionej. Wybierz metodę estymacji jako metodę niezależną od modelu, aby uzyskać najlepsze określenie punktu styku na podstawie jakości zmierzonych krzywych siły, które należy empirycznie określić podczas optymalizacji analizy danych. Dopasuj krzywą wcięcia siły przy użyciu modelu klasycznego jako klasyczną L dwa dla dopasowania modelu.Ustaw dopasowanie modelu do krzywej wycofania. Ustaw współczynnik Poissona na 0,45, zgodnie z zaleceniami dla tkanek miękkich, takich jak wątroba. Ustaw dopasowanie krzywej, używając stopnia linii bazowej wynoszącego trzy i stopnia kontaktu wynoszącego jeden.Zmień stopień dopasowania wielomianu na podstawie skali odchyleń krzywych od modelu. Wybierz model używany do dopasowania krzywych wycofania jako model Sneddona. Wypełnij promień kulistej końcówki do 2,9 mikrometra.Załaduj stałą sprężystości i invOLS z plików danych, włączając wczytywanie, a następnie kliknij przycisk Zakończ. Po analizie danych przejdź przez krzywe siły. Wyklucz krzywe siły, w których wspornik zbliżał się nieprawidłowo do powierzchni sekcji wątroby.Krzywe te charakteryzują się wysokim poziomem hałasu i nieprawidłowymi kształtami. Następnie dane można skopiować lub wyeksportować. W tym badaniu łagodnie utrwalone skrawki wątroby uzyskane od myszy kontrolnych i myszy z łagodnym i zaawansowanym zwłóknieniem wywołanym wstrzyknięciem czterochlorku węgla badano za pomocą AFM.Obszary w pobliżu żył centralnych odpowiadające obszarom, w których zwykle tworzą się włókna kolagenowe u myszy z czterochlorkiem węgla, analizowano w wątrobach kontrolnych. Rozkład modułów Younga był powtarzalny w różnych regionach w wątrobie kontrolnej i obszarach bogatych w kolagen w obrębie jednego odcinka wątroby. U myszy leczonych czterochlorkiem węgla mapy sztywności odpowiadające okołocentralnym obszarom złogów kolagenu wykazały znacznie wyższe wartości modułów Younga w porównaniu z równoważnymi obszarami u myszy kontrolnych.Ponadto nastąpił znaczny wzrost wartości modułów Younga przy dłuższym leczeniu. Oceniono również wpływ długotrwałego przechowywania skrawków wątroby na właściwości mechaniczne włókien kolagenowych. Pomiary AFM wykazały istotnie niższe wartości modułów Younga w obszarach bogatych w kolagen dla skrawków przechowywanych przez trzy miesiące, w porównaniu z tymi uzyskanymi w ciągu dwóch tygodni.Czas mocowania wycinka wątroby w dużym stopniu decyduje o właściwościach mechanicznych wycinka wątroby. Zalecamy, aby ściśle przestrzegać interwałów czasowych określonych w protokole. Po pewnych optymalizacjach w protokole, podana metoda może być stosowana do dowolnych tkanek miękkich wykazujących znaczne odkładanie kolagenu, co jest wykrywalne za pomocą mikroskopii polaryzacyjnej.Podana technika zapewnia naukowcom ujednolicony i wygodny protokół do badania mechanizmu działania wątroby u osób zdrowych i chorych.

measurement-liver-stiffness-using-atomic-force-microscopy-coupled

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływa na wiele zachowań komórek adherentnych. Sztywność macierzy zmienia się przestrzennie w obrębie tkanki i ulega modyfikacjom w różnych stanach chorobowych. W niniejszej pracy opracowujemy metody charakteryzacji zmienności przestrzennej sztywności w normalnej i zwłókniałej tkance płuc myszy z wykorzystaniem mikroindentacji za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Mikromechaniczna charakterystyka tkanki płucnej z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii siłowej

Ten artykuł demonstruje protokół charakteryzujący właściwości mechaniczne żywych komórek za pomocą mikrowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM).

Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Przedstawiamy szczegółowe protokoły izolacji aort od myszy i pomiaru ich modułu sprężystości za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Pomiar sztywności mysich aort ex vivo za pomocą mikroskopii sił atomowych

Ten protokół opisuje użycie ulepszonej techniki ultradźwiękowej do nieinwazyjnej obserwacji i ilościowego oznaczania zmian w tkance wątroby w modelach niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby u gryzoni.

Zastosowanie obrazowania ultrasonograficznego i elastografii fali poprzecznej w szczurzym modelu NAFLD/NASH

Ilościowe określenie powierzchni styku i siły wywieranej przez końcówkę sondy mikroskopu sił atomowych (AFM) na powierzchnię próbki umożliwia określenie właściwości mechanicznych w nanoskali. Omówiono najlepsze praktyki w zakresie wdrażania nanotwardości opartej na wspornikach AFM w powietrzu lub płynie na miękkich i twardych próbkach w celu pomiaru modułu sprężystości lub innych właściwości nanomechanicznych.

Mikroskopia sił atomowych Nanotwardość oparta na wspornikach: pomiary właściwości mechanicznych w nanoskali w powietrzu i płynie

Celem tego badania było opracowanie nowatorskiego trójwymiarowego cyfrowego modelu do wczesnej diagnozy zwłóknienia wątroby, który obejmuje sztywność każdego woksela w wątrobie pacjenta i dlatego może być wykorzystany do obliczenia proporcji dystrybucji wątroby pacjenta w różnych stadiach zwłóknienia.

Trójwymiarowy cyfrowy model do wczesnej diagnostyki zwłóknienia wątroby w oparciu o elastografię rezonansu magnetycznego

Niedawno zidentyfikowaliśmy usztywnienie naczyń włosowatych siatkówki jako nowy paradygmat dysfunkcji siatkówki związanej z cukrzycą. W protokole tym omówiono etapy izolacji naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej z kultur śródbłonka siatkówki, a następnie opisano technikę pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Izolacja naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej do pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych

Protokół ten oferuje kompleksowy pipeline obrazowania umożliwiający wizualizację i modelowanie morfologii komórek wątrobowych gwiaździstych w nienaruszonej tkance wątroby. Podejście to łączy znakowanie fluorescencyjne fibroblastów z wykorzystaniem genetyki myszy, przygotowanie tkanek in situ oparte na perfuzji wątroby oraz zmodyfikowaną metodę oczyszczania tkanek iDISCO, aby uzyskać optyczną przezroczystość.

Mapowanie morfologii komórek gwiaździstych wątroby wątroby w myszych modelach włóknienia wątroby

Celem niniejszej pracy jest przeszkolenie czytelnika w obsłudze zintegrowanego mikroskopu sił atomowych i obrazowania optycznego do stymulacji mechanicznej żywych komórek w hodowli. Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych

Wykorzystując system obrazowania z dwufotonową mikroskopią o rozdzielczości spektralnej, uzyskano mapy wydajności transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) na poziomie pikseli dla komórek ekspresujących receptory błonowe, w których przypuszcza się tworzenie kompleksów homo-oligomerycznych. Na podstawie map wydajności FRET możliwe jest oszacowanie informacji stechiometrycznych dotyczących badanego kompleksu oligomeru.

In vivo ilościowe oznaczanie oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G z wykorzystaniem spektroskopowo rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej

Poznaj metodę pomiaru modułów sprężystości w obszarach bogatych w kolagen w tkankach wątroby za pomocą mikroskopii sił atomowych sprzężonej z mikroskopią polaryzacyjną. Technika ta umożliwia precyzyjną lokalizację włókien kolagenowych.

Pomiar sztywności wątroby za pomocą mikroskopii sił atomowych sprzężonej z mikroskopią polaryzacyjną

Przeglądaj więcej filmów