Synteza nanożeli reagujących na bodźce przy użyciu wodnego jednoetapowego sieciowania i konanopolimeryzacji

Nasz protokół oferuje znaczący postęp w syntezie sub100-nanometrowych nanożeli obciążonych białkami w jednoetapowej technice sieciowania i kopolimeryzacji w łagodnych warunkach reakcji wodnej. Główną zaletą tej techniki jest jej zdolność do syntezy nanożeli zawierających białka w łagodnych warunkach, unikając ostrych rozpuszczalników organicznych i wysokich temperatur, zachowując w ten sposób integralność ładunku biologicznego. Zacznij od umycia szklanych naczyń przefiltrowaną wodą dejonizowaną.

Aby wysuszyć szkło, przymocuj bezpieczną dyszę do wylotu sprężonego powietrza znajdującego się z boku okapu wyciągowego. Mocno trzymać fiolkę, umieścić dyszę w środku i aktywować sprężone powietrze, aby wyemitować kontrolowany strumień. Następnie napełnij 10-mililitrową szklaną fiolkę wodą dejonizowaną i zamknij ją gumową przegrodą.

Aby odtlenić wodę, napełnij balon gazowym azotem i przymocuj igłę do balonu. Umieść go na przegrodzie i przebij gumową przegrodę, aby umożliwić przepływ azotu. Należy również przymocować igłę wyjściową do kolby, aby utrzymać stały przepływ azotu.

Następnie rozpuść BSA lub BSA oznaczone Cy7 w odtlenionej wodzie dejonizowanej. Następnie dodaj ten roztwór do czystej 10-mililitrowej szklanej fiolki. Dodać roztwór AETC do kolby i uszczelnić ją inną gumową przegrodą.

Rozpuść akryloamid i odtlenioną wodę dejonizowaną i dodaj ten roztwór do mieszaniny fiolki. Następnie rozpuść środek sieciujący dwusiarczkowy w wodzie dejonizowanej i dodaj go do mieszaniny w fiolce. Przepłukiwać mieszaninę azotem gazowym przez 20 minut.

Następnie rozpuść SDS w odtlenionej wodzie dejonizowanej. Za pomocą strzykawki z przepłukiwanym azotem wprowadzić go do mieszaniny. Następnie dodać TEMED do mieszaniny reakcyjnej.

Pozwól mieszaninie odtlenić się przez trzy minuty pod ciągłym przepływem azotu gazowego. Rozpuść nadsiarczan amonu w jednym mililitrze odtlenionej wody dejonizowanej i wprowadź go do mieszaniny reakcyjnej. Następnie zamknąć kolbę w atmosferze azotu i mieszać mieszaninę przez trzy godziny i 30 minut w temperaturze pokojowej.

Aby zakończyć reakcję, usunąć uszczelkę z kolby. Reakcja kończy się, gdy mieszanina stanie się klarowna i bezbarwna. Aby oczyścić nanożele, dodaj mieszaninę reakcyjną do 15-mililitrowej odśrodkowej jednostki filtrującej.

Napełnij urządzenie wodą dejonizowaną i odwiruj, aby usunąć niereaktywne chemikalia lub niezamknięty ładunek. Dodaj dwa mililitry wody dejonizowanej do jednostki odśrodkowej, aby rozcieńczyć próbkę nanożelu. Próbkę końcową należy przechowywać w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza, aby zapobiec degradacji kapsułkowanego białka.

Weź kuwetę lub jednorazową składaną komórkę kapilarną do analizy. Wyczyść go wodą dejonizowaną z filtrem, a następnie przedmuchnij sprężonym powietrzem, aby usunąć wszelkie duże cząsteczki kurzu. Następnie napełnij kuwetę 50 do 100 mikrolitrami próbki, rozcieńczając ją 750 do 1 000 mikrolitrów przefiltrowanej wody dejonizowanej.

Aby włożyć kuwetę do instrumentu DLS, otwórz pokrywę komory na próbki i przytrzymaj kuwetę za górne krawędzie, aby uniknąć pozostawiania odcisków palców na okienkach optycznych. Umieść kuwetę odpowiednio wyrównaną ze ścieżką optyczną instrumentu. Następnie zamknij komorę na próbkę, aby zablokować światło otoczenia.

Rozpocznij pomiar wielkości cząstek za pomocą odpowiedniego oprogramowania w maszynie DLS. Po pomiarze wybierz wyniki istotne dla próbki, w tym średnią Z, średnią PI, szybkość zliczania na minutę, potencjał zeta i powiązaną grafikę. Upewnij się, że funkcja korelacji wyświetla gładką krzywą sigmoidalną wskazującą na jednolitą próbkę.

Po zakończeniu analizy ostrożnie wyjmij kuwetę z instrumentu DLS. Zaobserwowano stopniowy spadek intensywności piku związanego z białkiem BSA, co sugeruje enkapsulację białka w strukturze nanożelu. Charakterystyka fizyko-chemiczna nanożeli obciążonych BSA znakowanymi Cy7 wykazała pojedynczy zdefiniowany pik na głębokości od 50 do 100 nanometrów.

Jednak puste nanożele wykazywały niespójne i większe rozmiary. Do 86% zamkniętych w kapsułkach BSA oznaczonych Cy7 zostało wydanych w ciągu 48 godzin. Z drugiej strony, eksperymenty kontrolne bez dodatku glutationu doprowadziły do uwolnienia tylko 15% białka.

Analiza w podczerwieni z transformacją Fouriera wykazała, że BSA wyizolowane podczas syntezy nanożelu i inkubacji po glutationie zachowało swoją strukturę, na co wskazuje pik na odwrocie 1 662 centymetrów reprezentujący nienaruszone zwoje beta. Jednak BSA z nanożeli przechowywanych przez 30 dni wykazało szczyt na 1 613 centymetrów odwróconych, co wskazuje na międzycząsteczkowe struktury arkuszy beta i agregację białek. Dichroizm kołowy wykazywał niezmienione widma, podobne do natywnego BSA, co wskazuje na zachowaną strukturę alfa helisy.

Jednak niewielkie aberracje w charakterystycznych pikach dla BSA wyizolowanych po 30 dniach sugerowały pewną agregację. Utrzymanie ciągłego przepływu azotu ma kluczowe znaczenie dla zapobieżenia hamowaniu polimeryzacji wolnych rodników przez tlen. Dodatkowo, elementy systemu inicjującego wymagają szybkiego dodania w celu pomyślnej syntezy.

Po tej procedurze rozkład, morfologię i kinetykę uwalniania ładunku w rozmiarze nanożelu można dalej scharakteryzować poprzez ocenę odpowiedzi DLS, TEM i redoks poprzez inkubację z fizjologicznym środkiem redukującym glutationem.