Wytwarzanie i charakterystyka nanomatrycy janus base warstwa po warstwie w celu wspomagania regeneracji chrząstki
6 lipca 2022
Ten protokół opisuje kolejno składanie rusztowania nano-matrycy podstawy Janusa (JBNm) warstwa po warstwie poprzez dodawanie nanorurek o zasadzie Janusa (JBNts), matriliny-3 i transformującego czynnika wzrostu beta-1 (TGF-β1). JBNm został wyprodukowany i scharakteryzowany; Dodatkowo wykazywał doskonałą bioaktywność, wspierając funkcje komórek, takie jak adhezja, proliferacja i różnicowanie.
Ten protokół pokazuje, w jaki sposób złożyliśmy i scharakteryzowaliśmy warstwę po warstwie JBNm na poziomie molekularnym. JBNm otacza TGF-B1 i zapobiega jego uwalnianiu w otaczających tkankach, promując w ten sposób zlokalizowaną chondrogenezę. Formowanie JBNm jest ustandaryzowane, co pozwala na formowanie różnych JBNm do przyszłych zastosowań.
Unikalna struktura warstwa po warstwie pozwala na enkapsulację czynnika wzrostu, tworząc stałe, zlokalizowane uwalnianie, co pozwala uniknąć hipertrofii i podtrzymuje wzrost. JBNm zapewnia homeostatyczne mikrośrodowisko do regeneracji tkanki chrzęstnej w ograniczonym miejscu, ze względu na możliwość wstrzykiwania, która może być stosowana w różnych scenariuszach, takich jak złamania lub ubytki o nieregularnych kształtach. Na początek dodaj osiem mikrolitrów po jednym miligramie na mililitr TGF-B1, zawieszony w wodzie, do 32 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr Matrilin-3 zawieszonego w wodzie.
Odpipetować, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie tych białek. Dodaj 80 mikrolitrów po jednym miligramie na mililitr. Nanorurki janusowe lub JBNts zawieszone w wodzie do TGF-B1, roztworu Matrilin-3.
Kilkakrotnie pipetować, aby zapewnić prawidłowe mieszanie. W przypadku grupy JBNt dodaj pięć mikrolitrów po jednym miligramie na mililitr, JBNts do 50 mikrolitrów wody, aby uzyskać roztwór o stężeniu 90,9 mikrograma na mililitr. W przypadku grupy Matrilin-3 dodaj 40 mikrolitrów 10 mikrogramów na mililitr Matrilin-3 do 15 mikrolitrów wody, aby uzyskać roztwór o stężeniu 7,3 mikrograma na mililitr
.W przypadku grupy TGF-B1 dodaj 10 mikrolitrów po 10 mikrogramów na mililitr TGF-B1 do 45 mikrolitrów wody, aby uzyskać roztwór o stężeniu 1,8 mikrograma na mililitr. W przypadku grupy Janus Base Nano-Matrix lub JBNm dodaj 40 mikrolitrów po 10 mikrogramów na mililitr, Matrilin-3 do 10 mikrolitrów po 10 mikrogramów na mililitr TGF-B1. Mieszać, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie.
Następnie dodać do roztworu pięć mikrolitrów po jednym miligramie na mililitr JBNts, kilkakrotnie pipetując w celu wymieszania próbki. Za pomocą spektrofotometru zmierz widmo absorpcyjne każdej grupy. Oznacz TGF-B1 za pomocą zestawu do znakowania białek, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
Dodaj 20 mikrolitrów po 20 mikrogramów na mililitr, oznaczonych jako TGF-B1, do 25 mikrolitrów wody, aby uzyskać roztwór testowy o stężeniu 8,9 mikrograma na mililitr. Oznacz Matrilin-3 za pomocą oddzielnego zestawu do etykietowania. Dodaj 20 mikrolitrów 80 mikrogramów na mililitr oznaczonych Matrilin-3 do 25 mikrolitrów wody, aby uzyskać roztwór testowy 36 mikrogramów na mililitr
.Wymieszaj 20 mikrolitrów 80 mikrogramów na mililitr oznaczony Matrilin-3 z 20 mikrolitrami 20 mikrogramów na mililitr oznaczony TGF-B1 i pięcioma mikrolitrami wody, dając oznakowany związek TGF-B1, Matrilin-3. Odpipetuj mieszaninę kilka razy, aby wymieszać. Dodaj pięć mikrolitrów jednego miligrama na mililitr JBNts do 40 mikrolitrów wody, co daje roztwór 111 mikrogramów na mililitr
.Następnie dodaj pięć mikrolitrów jednego miligrama na mililitr JBNts do oznaczonego roztworu TGF-B1, Matrilin-3 i wielokrotnie pipetuj w celu wymieszania związku. Przenieść każdą grupę próbek do dołka na czarnej płytce 384-dołkowej. Załaduj płytkę do wielomodowego czytnika mikropłytek i wykonaj pomiary przy długościach fal wzbudzenia 488 i 555 nanometrów zgodnie z protokołami producenta.
W warunkach fizjologicznych widmo potencjału zeta Matrilin-3 było naładowane ujemnie ze względu na swój punkt izoelektryczny. Po dodaniu TGF-B1 do Matrilin-3 potencjał zeta związku TGF-B1 Matrilin-3 wzrósł do wartości bliskiej neutralnej. Potencjał zeta JBNm był najwyższy spośród trzech grup.
Widma absorpcyjne w zakresie widzialnym UV potwierdziły tworzenie się hierarchicznej struktury wewnętrznej JBNm warstwa po warstwie, pierścienie aromatyczne łańcuchów bocznych lizyny, a JBNty przyczyniły się do pików absorpcji, odpowiednio na 220 i 280 nanometrach. TEM wykorzystano do scharakteryzowania morfologii JBNts i JBNm. Po połączeniu z białkami zaobserwowano grube wiązki JBNm tworzące strukturę rusztowania.
Mikroskopia fluorescencyjna potwierdziła obecność struktury warstwa po warstwie i wykazała przekrój czynny JBNm. Po oznaczeniu na czerwono fluorescencyjny Matrilin-3 otoczył wiązki JBNt i utworzył zewnętrzną warstwę JBNm, podczas gdy zielona fluorescencyjna TGF-B1 utworzyła warstwę wewnętrzną. Transfer energii rezonansu fluorescencyjnego wykazał piki emisji na poziomie 520 nanometrów dla znakowanych grup TGF-B1 i 570 nanometrów dla grup Matrilin-3.
Zbadano wpływ JBNm na adhezję HMSC i proliferację komórek. JBNm wykazał, że HMSC grupują się razem ze sobą, podczas gdy mniej komórek przylegało do JBNt. Wyrównanie komórek i rozmiar komórek na JBNm wykazały, że JBNt odgrywają rolę w adhezji komórek, podczas gdy białka zwiększają powinowactwo do adhezji komórek.
Po pierwszym dniu hodowli komórkowej grupy JBNm i TGF-B1 wykazały znaczną proliferację komórek w porównaniu z innymi grupami. Gdy czas trwania struktury komórkowej wydłużył się do trzech i pięciu dni, grupy JBNm i TGF-B1 wykazały jeszcze większą proliferację komórek. Podczas znakowania fluorescencyjnego JBNm ważne jest, aby TGF-B1 i Matrilin-3 były indywidualnie znakowane i mieszane przed dodaniem JBNt, aby umożliwić prawidłowe tworzenie struktury warstwa po warstwie.
Dalsza ocena rusztowań może dostarczyć informacji na temat ich skuteczności w leczeniu terapeutycznym. Mówiąc dokładniej, wysokoprzepustowy test proliferacji może określić optymalną dawkę in vitro, a później in vivo. To nowatorskie rozwiązanie NanoMatriX pozwala naukowcom wykorzystać rusztowanie iniekcyjne na bazie nanomateriałów do regeneracji chrząstki.
To podejście naśladujące poli pozwala na zwiększenie androgenezy i przeciwdziałać proliferacji miejsca.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia montaż i charakterystykę rusztowania opartego na nanomatrycy Janus (JBNm) wykonanej metodą warstwa po warstwie. JBNm enkapsuluje TGF-β1, promując lokalną chondrogenezę i zapewniając homeostatyczne mikrośrodowisko dla regeneracji tkanki chrzęstnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biomateriały
- Inżynieria tkankowa
- Medycyna regeneracyjna
Wstęp
- Nanorurki na bazie Janus (JBNts) są wykorzystywane do montażu rusztowania.
- TGF-β1 ma kluczowe znaczenie dla promowania funkcji komórkowych.
- Struktura JBNm umożliwia kontrolowane uwalnianie czynników wzrostu.
- Zdolność JBNm do iniekcji umożliwia zastosowanie w ubytkach o nieregularnych kształtach.
Cel badania
- Stworzenie rusztowania wspierającego regenerację tkanki chrzestnej.
- Standaryzacja procesu tworzenia JBNm dla różnych zastosowań.
- Enkapsulacja czynników wzrostu w celu zapewnienia ich stopniowego uwalniania i uniknięcia hipertrofii.
Zastosowane metody
- Sekwencyjne dodawanie TGF-β1 oraz matryliny-3 w celu utworzenia JBNm.
- Charakterystyka rusztowania na poziomie molekularnym.
- Ocena bioaktywności w odniesieniu do adhezji i proliferacji komórek.
- Ocena wstrzykiwalności rusztowania pod kątem zastosowań praktycznych.
Główne wyniki
- JBNm wykazał doskonałą bioaktywność, wspomagając funkcje komórkowe.
- Osiągnięto lokalne uwalnianie TGF-β1, co nasiliło chondrogenezę.
- Rusztowanie utrzymywało środowisko homeostatyczne sprzyjające regeneracji tkanek.
- Standaryzowany proces tworzenia umożliwia wszechstronne zastosowania w inżynierii tkankowej.
Wnioski
- Rusztowanie JBNm budowane warstwa po warstwie jest skuteczne w regeneracji chrząstki.
- Enkapsulacja czynników wzrostu jest korzystna dla miejscowej naprawy tkanki.
- Metoda ta może zostać dostosowana do różnych scenariuszy klinicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Warstwowa nanomatryca bazowa Janus (JBNm) umożliwia precyzyjną lokalizację czynników wzrostu oraz długotrwałą kontrolę mikrośrodowiska, rozwiązując kluczowy problem w medycynie regeneracyjnej i inżynierii tkankowej. Platforma ta zapewnia pewność prognostyczną w wczesnych etapach przesiewania biomateriałów i zmniejsza ryzyko w procesie translacyjnym poprzez minimalizację efektów poza celem oraz hipertrofii. Jej zestandaryzowany montaż i możliwość wstrzykiwania sprawiają, że jest ona reużywalnym rozwiązaniem dla różnorodnych przedklinicznych modeli naprawy chrząstki.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie chondrogenezy indukowanej czynnikami wzrostu w kontrolowanych mikrośrodowiskach.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez izolację efektów TGF-β1 w obrębie ograniczonych rusztowań.
- Ułatwia funkcjonalną walidację oddziaływań biomateriał-białko w procesie regeneracji tkanek.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne rusztowanie do ilościowych analiz adhezji i proliferacji komórek.
- Umożliwia wysokoprzepustową ocenę składu rusztowania oraz enkapsulacji czynników wzrostu.
- Dostarcza spójnych, mierzalnych wyników do oceny porównawczej potencjalnych biomateriałów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla danej choroby, wspierając zlokalizowaną regenerację chrząstki in vitro oraz in vivo.
- Zapewnia ciągłość translacyjną dzięki wstrzykiwalnym, adaptacyjnym formom rusztowań przeznaczonym do ubytków o nieregularnym kształcie.
- Zmniejsza ryzyko hipertrofii oraz efektów pozatarczycowych, wspierając decyzje o dalszym rozwoju skorygowane o analizę ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Platforma JBNm integruje procesy od wczesnego etapu odkrywania po walidację przedkliniczną, umożliwiając testowanie hipotez, opracowywanie testów oraz badania translacyjne w ramach procedur regeneracji chrząstki.
- Biologia odkrywcza: Wspiera ocenę efektów czynników wzrostu w zaprojektowanych mikrośrodowiskach w oparciu o postawione hipotezy.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty adhezji i proliferacji komórek.
- Analityka: Umożliwia pomiary UV-Vis, fluorescencji oraz potencjału zeta w celu charakterystyki rusztowań.
- Badania translacyjne: Ułatwia zachowanie ciągłości przejścia od screeningu in vitro do modeli regeneracji chrząstki in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Standaryzowany montaż pozwala na adaptację w różnych programach dotyczących biomateriałów i inżynierii tkankowej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie regeneracji tkanek wspomaganej rusztowaniami oraz walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowanych, skalowalnych protokołów dla powtarzalnego wytwarzania i analizy rusztowań.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań poprzez minimalizację efektów pozacelowych czynników wzrostu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów na biomateriały w potokach medycyny regeneracyjnej z uwzględnieniem dostosowania do ryzyka.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie montażu biomateriałów, znakowania białek oraz technik charakteryzacji rusztowań.
- Wymaga dostępu do spektrofotometrii, mikroskopii fluorescencyjnej oraz infrastruktury TEM.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności przygotowania i analizy rusztowań.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych systemów modelowych, lecz może wymagać optymalizacji dla konkretnych tkanek docelowych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują precyzyjną kontrolę stosunku składników oraz wydajność znakowania.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Fabrication of the Janus Base Nano-Matrix (JBNm), Composed of Janus Base Nanotube (JBNt)/Matn1/Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1)
1:41
Observation of Specimens with Ultraviolet-Visible (UV-Vis) Spectroscopy
3:12
Absorption Spectra Measurement of Fluorescent-Labeled Proteins
5:08
Results: Layer-By-Layer Assembly of Janus Base Nano-Matrix Structure Scaffold for a Cartilage Tissue Construct
8:01
Conclusion
