Name: Trójwymiarowe barwienie całej nerki za pomocą CUBIC (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 31 s
Description: Naucz się trójwymiarowego barwienia całej nerki metodą CUBIC, obejmującego utrwalanie, odbarwianie i immunofluorescencję. Technika ta umożliwia makroskopową wizualizację struktur nerkowych i odkrycia w patologii nerek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Część tej pracy została przeprowadzona dzięki współpracy z Prof. Hiroki R. Ueda (Uniwersytet Tokijski), Prof. Etsuo A. Susaki (Uniwersytet Juntendo), Prof. Tetsuhiro Tanaka (Uniwersytet Tohoku), Prof. Masafumi Fukagawa, Dr. Takehiko Wada i Dr. Hirotaka Komaba (Uniwersytet Tokai).

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu Tokijskiego. Wszystkie zabiegi na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health. Do niniejszego badania wykorzystano samce myszy C57BL / 6NJcl w wieku 8 tygodni. Myszy pozyskano ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów).
1. Przygotowanie zwierząt i fiksacja nerek
<ol>
	<li>Wykonaj utrwalenie perfuzji, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Znieczulić mysz poprzez inhalację izofluranu (3%, 2,0 l/min) i dootrzewnowe podanie chlorowodorku medetomidyny (0,3 mg/kg), winianu butorfanolu (5 mg/kg) i midazolamu (4 mg/kg) (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Przeprowadzić perfuzję zwierzęcia z 20 ml PBS (pH 7,4) i 30 ml 4% PFA w buforze fosforanowym (PB) przez lewą komorę serca12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj utrwalanie przez zanurzenie zaraz po fiksacji perfuzyjnej i pobraniu próbek nerki9.
	<ol>
		<li>Zanurz nerkę w 4% PFA w temperaturze 4 °C na dodatkowe 16 godzin, a następnie myj ją PBS przez 2 godziny (trzy razy)9 (Rysunek 1). 
		UWAGA: Formaldehyd i paraformaldehyd są toksycznymi substancjami drażniącymi. Z odczynnikami należy obchodzić się pod wyciągiem z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Odbarwianie i delipidacja
<ol>
	<li>Przygotuj CUBIC-L do odbarwiania i delipidacji składającego się z 10% wagowych Triton X-100 i 10% wagowych N-butylodietanoloaminy (patrz Tabela Materiałów), zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami4,8,9.</li>
	<li>Wykonaj odbarwianie i delipidację za pomocą CUBIC-L, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
	<ol>
		<li>Zanurz utrwaloną nerkę w 7 ml 50% (v/v) CUBIC-L (mieszanina wody i CUBIC-L 1:1) w probówce o okrągłym dnie 14 ml (patrz Tabela materiałów) z delikatnym potrząsaniem w temperaturze pokojowej przez 6 godzin (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2A). Następnie zanurzyć go w 7 ml CUBIC-L w 14 ml probówce z okrągłym dnem, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 °C przez 5 dni.</li>
		<li>Podczas tego procesu codziennie odświeżaj CUBIC-L. Po procesie odbarwiania i delipidacji płucz nerkę PBS w temperaturze pokojowej przez 2 godziny (trzy razy)9 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Użyj łyżki dozującej do przenoszenia próbki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Barwienie immunofluorescencyjne w całości
<ol>
	<li>Przygotuj do barwienia.
	<ol>
		<li>Przygotować bufor barwiący dla przeciwciał pierwszorzędowych, mieszając 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,5% kazeiny w PBS i 0,05% azydku sodu9.</li>
		<li>Przygotować bufor barwiący dla przeciwciał drugorzędowych, mieszając 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,1% kazeiny w PBS i 0,05% azydku sodu9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj barwienie przeciwciałami pierwszorzędowymi.
	<ol>
		<li>Wybarwić immunologicznie zdelipidowaną nerkę przeciwciałami pierwszorzędowymi (1:100 lub 1:200, patrz tabela materiałów) w buforze barwiącym w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając przez 7 dni. 
		UWAGA: Ilość buforu barwiącego potrzebna na jedną nerkę wynosi 500-600 μL (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
		<li>Płucz nerkę 0,5% (v/v) Triton X-100 w PBS (PBST) w temperaturze pokojowej przez 1 dzień9 (Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj barwienie przeciwciałami wtórnymi.
	<ol>
		<li>Wybarwić immunologicznie nerkę przeciwciałami drugorzędowymi (1:100 lub 1:200, patrz tabela materiałów) w buforze barwiącym w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając przez 7 dni. Myj nerkę PBST w temperaturze pokojowej przez 1 dzień9 (Rysunek 1).</li>
		<li>Po utrwaleniu9, zanurz nerkę w 1% formaldehydzie w PB (mieszanina 1:36 37% formaldehydu i PB) na 3 godziny i przemyj ją PBS w temperaturze pokojowej przez 6 godzin (Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Dopasowanie współczynnika załamania światła (RI)
<ol>
	<li>Przygotuj CUBIC-R+.
	<ol>
		<li>Przygotować CUBIC-R, mieszając 45% wag. 2,3-dimetylo-1-fenylo-5-pirazolonu/antypiryny i 30% wag. nikotynamidu (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Przygotuj CUBIC-R+ do dopasowania indeksu załamania światła (RI), dodając 0,5 v% N-butylodietanoloaminy do CUBIC-R zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami4,8,9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj dopasowywanie wystąpień zarezerwowanych.
	<ol>
		<li>Zanurz nerkę w 7 ml 50% (v/v) CUBIC-R+ (mieszanina wody i CUBIC-R+ w stosunku 1:1) w probówce o okrągłym dnie o pojemności 14 ml, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej przez 1 dzień. Następnie zanurz go w 7 ml CUBIC-R+ w 14 ml probówce z okrągłym dnem, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej przez 2 dni9 (Rysunek 1). 
		UWAGA: Chociaż nerka unosi się w 50% CUBIC-R+ na początku dopasowania RI, opada i staje się przezroczysta w CUBIC-R+ pod koniec procesu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Akwizycja i rekonstrukcja obrazu
<ol>
	<li>Zanurz nerkę dopasowaną do RI w mieszaninie oleju silikonowego (RI = 1,555) i oleju mineralnego (RI = 1,467) (55:45) podczas akwizycji obrazu (RI = 1,51)5 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Uzyskaj obrazy 3D całej nerki za pomocą specjalnie zbudowanego mikroskopu fluorescencyjnego 9 (patrz Tabela materiałów). Zbierz wszystkie nieprzetworzone dane obrazu w 16-bitowym formacie TIFF. Wizualizuj i przechwytuj obrazy renderowane w 3D za pomocą oprogramowania do analizy obrazowania (Imaris, patrz tabela materiałów).</li>
</ol>

<ol><li>Velez-Fort, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stimulus+selectivity+and+connectivity+of+layer+six+principal+cells+reveals+cortical+microcircuits+underlying+visual+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing.</a> Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Landscape+for+Tissue+Clearing+Based+on+Hydrophilic+Reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents.</a> Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).</li>
<li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution%3A+toward+organism-level+systems+biology+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li>
<li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li>
<li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+three-dimensional+analysis+%28CUBIC-kidney%29+visualizes+abnormal+renal+sympathetic+nerves+after+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury.</a> Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).</li>
<li>Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+interactions+and+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune interactions and kidney disease.</a> Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).</li>
<li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oral+hypoxia-inducible+factor+prolyl+hydroxylase+inhibitor+enarodustat+counteracts+alterations+in+renal+energy+metabolism+in+the+early+stages+of+diabetic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease.</a> Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+sympathetic+signaling+in+macrophages+blocks+systemic+inflammation+and+protects+against+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+evaluation+of+total+glomerular+number+and+capillary+tuft+size+in+nephritic+kidneys+using+lightsheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812 (2020).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obecny protokół pozwolił na obrazowanie 3D całej nerki różnych struktur, takich jak nerwy współczulne, przewody zbiorcze, tętnice, kanaliki proksymalne i kłębuszki nerkowe 9,10,11. Ta metoda barwienia umożliwiła obserwację makroskopową i doprowadziła do nowych odkryć biologicznych, poprzez wizualizację zmian w nerkach współczulnych po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym 9,10<sup class="xref...

Nerka składa się z różnych populacji komórek. Chociaż konwencjonalna patologia dostarcza nam wielu informacji na temat mikrośrodowiska nerek, obrazowanie trójwymiarowe (3D) jest potrzebne, aby dokładnie zrozumieć przesłuchy międzykomórkowe podczas progresji choroby nerek. W przeszłości konieczne było wykonanie ogromnej liczby seryjnych cięć i rekonstrukcji obrazu dla obrazowania 3D całego narządu1. Metoda ta wymagała jednak zbyt dużego wysiłku i wiązała się z problemami pod względem odtwarzalności.
Oczyszczanie optyczne jest dobrą strategią na pokonanie tej przeszkody2,3. Zmętnienie tkanek wynika głównie z rozpraszania i absorpcji światła, ponieważ każdy narząd składa się z różnych substancji, w tym wody, białka i lipidów. Tak więc podstawową strategią oczyszczania tkanek jest zastąpienie wody i lipidów w tkankach odczynnikami dopasowującymi współczynnik załamania światła (RI), które mają takie same właściwości optyczne jak białka4. Aby zaobserwować przezroczystą próbkę, przydatna jest mikroskopia fluorescencyjna z użyciem arkusza świetlnego5. Arkusze świetlne oświetlają przezroczystą próbkę z boku, a sygnały wzbudzenia są odbierane przez soczewkę obiektywu umieszczoną w pozycji pionowej6. Mikroskopia ta uzyskuje informacje o przekroju poprzecznym w jednym przemiataniu, co różni się od konfokalnej lub wielofotonowej mikroskopii fluorescencyjnej. Dzięki temu może szybko pozyskiwać obrazy z-stack przy niskim poziomie fotowybielania.
Clear, Unstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) to jedna z metod oczyszczania tkanek, która umożliwia obrazowanie całego narządu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego2,7,8. Barwienie immunofluorescencyjne CUBIC i całe mocowanie jest zoptymalizowane w niniejszym badaniu w celu wizualizacji struktur 3D nerek myszy9,10,11. Korzystając z tej metody barwienia całościowego, wizualizuje się zmiany w nerkowych nerkach współczulnych po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym9,10 i kłębuszkowe powiększenie we wczesnym stadium cukrzycowej choroby nerek11, a także naczynia krwionośne, kanaliki proksymalne i przewody zbiorcze w całej nerce9.

<table><tbody><tr><td>14 ml probówka PP o okrągłym dnie o wysokiej przejrzystości</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td>Oczyszczanie tkanek, barwienie, mycie</td></tr><tr><td>2,3-dimetylo-1-fenylo-5-pirazolon/antypiryna</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>D1876</td><td>CUBIC-R+</td></tr><tr><td>37%-roztwór formaldehydu</td><td>Nacalai Tesque</td><td>16223-55</td><td>Po utrwaleniu</td></tr><tr><td>4% roztwór buforowy fosforanu paraformaldehydu</td><td>Nacalai Tesque</td><td>09154-85</td><td>Fiksacja nerek</td></tr><tr><td>Alexa Mąka 555-sprzężone przeciwciało IgG przeciwko owcom</td><td>Invitrogen</td><td>A-21436</td><td>Przeciwciało drugorzędowe (1:100)</td></tr><tr><td>Mąka Alexa 647-sprzężone przeciwciało IgG przeciwko królikowi osłu</td><td>Invitrogen</td><td>A-31573</td><td>Przeciwciało drugorzędowe (1:200)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-akwaporyny 2 (AQP2)</td><td>Abcam</td><td>ab199975</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe (1:100)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-podocyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0372</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe (1:100)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-sodowo-glukozowo-glukozowe 2 (SGLT2)</td><td>Abcam</td><td>ab85626</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe (1:100)</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw hydroksylazie tyrozynowej (TH)</td><td>Abcam</td><td>ab113</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe (1:100)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-&alfa--aktynowe mięśni gładkich (&alfa;-SMA)</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe (1:200)</td></tr><tr><td>Kazeina blokująca w PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>37528</td><td>Bufor barwiący</td></tr><tr><td>Winian butorfanolu</td><td>Meiji</td><td>005526</td><td>Znieczulenie</td></tr><tr><td>C57BL/6NJcl</td><td>Nippon Bio-Supp.Center</td><td>Nie dotyczy</td><td>Szczep myszy</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazowania</td></tr><tr><td>Mikroskop makro-zoom</td><td>OLYMPUS</td><td>MVX10</td><td>Jednostka obserwacyjna specjalnie zbudowanego mikroskopu</td></tr><tr><td>Chlorowodorek medetomidyny</td><td>Kyoritsu-Seiyaku</td><td>008656</td><td>Środek znieczulający</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>SANDOZ</td><td>27803229</td><td>Znieczulający</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>Olejek immersyjny</td></tr><tr><td>N-butylodietanoloamina</td><td>Tokio Przemysł chemiczny</td><td>B0725</td><td>CUBIC-L, CUBIC-R+</td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Tokio Przemysł chemiczny</td><td>N0078</td><td>CUBIC-R +</td></tr> <tr><td>eter mono-p-izooktylofenylowy glikolu polietylenowego / Triton X-100</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12967-45</td><td>CUBIC-L, PBST</td></tr><tr><td>Olej silikonowy HIVAC-F4</td><td>Shin-Etsu Chemical</td><td>50449832</td><td>Olejek immersyjny</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Wako</td><td>195-11092</td><td>Bufor do barwienia</td></tr></tbody></table>

trójwymiarowe barwienie całej nerki za pomocą cubic

Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC

Chociaż konwencjonalna patologia dostarczyła wielu informacji na temat mikrostruktury nerek, trudno było poznać dokładną strukturę naczyń krwionośnych, kanalików proksymalnych, przewodów zbiorczych, kłębuszków nerkowych i nerwów współczulnych w nerkach z powodu braku trójwymiarowych (3D) informacji. Oczyszczanie optyczne jest dobrą strategią pokonania tej dużej przeszkody. Wiele komórek w całym narządzie można analizować w rozdzielczości pojedynczej komórki, łącząc oczyszczanie tkanek i technikę obrazowania 3D. Jednak metody znakowania komórek do obrazowania całego narządu pozostają słabo rozwinięte. W szczególności barwienie całych narządów jest trudne ze względu na trudności w penetracji przeciwciał. W niniejszym protokole opracowano barwienie nerek myszy w całości do obrazowania 3D za pomocą metody oczyszczania tkanek CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). Protokół umożliwił wizualizację odnerwienia współczulnego nerek po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym i powiększeniu kłębuszków nerkowych we wczesnym stadium cukrzycowej choroby nerek z kompleksowego punktu widzenia. W związku z tym technika ta może prowadzić do nowych odkryć w badaniach nad nerkami, zapewniając perspektywę makroskopową.

Stosując tę metodę barwienia, zwizualizowano nerwy współczulne [przeciwciało przeciwko tyrozynowej hydroksylazie (TH)] oraz tętnice [przeciwciało przeciwko $\alpha$-aktynie mięśni gładkich ($\alpha$SMA)] w całej nerce (Rysunek 4A,B oraz Wideo 1)9. Po urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym (IRI) zwizualizowano również nieprawidłowe nerwy współczulne nerek9,10 (...

Obecny protokół opisuje metodę oczyszczania tkanek i barwienie immunofluorescencyjne w całości do trójwymiarowego (3D) obrazowania nerek. Technika ta może zaoferować makroskopowe perspektywy w patologii nerek, prowadząc do nowych odkryć biologicznych.

Trójwymiarowe barwienie całej nerki za pomocą CUBIC

Although conventional pathology provided numerous information about kidney microstructure, it was difficult to know the precise structure of blood ...

Protokół ten umożliwia wizualizację trójwymiarowych struktur w pełnej nerce, co może prowadzić do innowacyjnych odkryć w badaniach nad nerkami, zapewniając perspektywę makroskopową. Barwienie całych narządów jest trudne ze względu na trudności w penetracji przeciwciał. Protokół ten wykazał wysokiej jakości, całkowite zabarwienie nerek przez przeciwciała.Aby rozpocząć, wykonaj utrwalanie przez zanurzenie natychmiast po utrwaleniu perfuzyjnym i pobraniu próbki nerki, zanurzając nerkę w 4% paraformaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 16 godzin. Wykonaj trzy płukania za pomocą PBS przez dwie godziny każde. Przeprowadź proces odbarwiania i odtłuszczania, zanurzając nieruchomą nerkę w siedmiu milimetrach 50% CUBIC-L w 14-mililitrowej probówce z okrągłym dnem, delikatnie potrząsając w temperaturze pokojowej.Po sześciu godzinach zanurz nerkę w siedmiu mililitrach CUBIC-L w 14-milimetrowej probówce z okrągłym dnem, delikatnie potrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć dni. Odświeżaj CUBIC-L codziennie. Po zakończeniu odbarwiania i delipidacji użyj łyżki dozującej do obsługi próbki i umyj nerkę trzykrotnie PBS w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.Immunostainować zdelipidowaną nerkę w pierwotnych przeciwciałach rozcieńczonych w barwiącym roztworze buforowym, delikatnie wstrząsając w wytrząsarce inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem dni. Następnie umyj nerkę 0,5% Triton X-100 w PBS, znanym również jako PBST, w temperaturze pokojowej przez jeden dzień. W przypadku barwienia przeciwciałami wtórnymi należy traktować nerkę przeciwciałami drugorzędowymi w buforze barwiącym, w ciemności, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem dni.Napraw plamę za pomocą prania PBST w temperaturze pokojowej na jeden dzień. Po utrwaleniu zanurz nerkę w 1% formaldehydzie w PB na trzy godziny i myj ją PBS w temperaturze pokojowej przez sześć godzin. Wykonaj dopasowanie współczynnika załamania światła, zanurzając nerkę w siedmiu mililitrach 50% CUBIC-R+ w 14-mililitrowej probówce z okrągłym dnem z potrząsaniem na jeden dzień, a następnie poddając się leczeniu siedmioma mililitrami CUBIC-R+ z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej przez dwa dni.Za pomocą metody barwienia immunologicznego nerwy współczulne i tętnice w całej nerce zostały uwidocznione w obrazowaniu 3D nerek. Ponadto uwidoczniono nieprawidłowe nerwy współczulne nerek po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym. Protokół ten ułatwił również wizualizację nerwów współczulnych w całej śledzionie.W tym miejscu przedstawiono proces kwantyfikacji danych dla trójwymiarowego barwienia immunofluorescencyjnego. Ponadto z powodzeniem uwidoczniono przewody zbiorcze, odcinek S1 kanalików proksymalnych i kłębuszki nerkowe w całej nerce. Stłumiona omegalia kłębuszków nerkowych, wynikająca z podawania leków we wczesnych stadiach cukrzycowej choroby nerek, została również uwidoczniona w obrazowaniu 3D.Protokół ten może oznaczać konkretną cząsteczkę w całej nerce. W ten sposób naukowcy mogą analizować zmiany struktury w naczyniach krwionośnych lub znajdować rzadkie zdarzenia w tkankach nerkowych.

whole-kidney-three-dimensional-staining-with-cubic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film demonstruje test do barwienia mysich nerek metodą całościową przy użyciu metody oczyszczania tkanek zwanej CUBIC (clear, unstructed brain/body imaging cocktails and computational analysis) i barwienia immunofluorescencyjnego. Nerka jest poddawana oczyszczaniu tkanek, w którym nerka jest odlipidowana, odbarwiana i traktowana roztworem dopasowującym współczynnik załamania światła, aby tkanka była przezroczysta dla optymalnego obrazowania trójwymiarowego. Tkanka jest barwiona...

Technika barwienia całego narządu do trójwymiarowego obrazowania nerki

Inżynierskie konstrukty nerkowe dostarczają rozwiązania na niedobór narządów i szkodliwe skutki dializy. W tym miejscu opisujemy protokół mikropreparacji mysich nerek w celu izolacji segmentów korowo-rdzeniowych. Segmenty te są wszczepiane do konstruktów komórkowych wolnych od rusztowań, tworząc organoidy nerkowe.

Mikrodysekcja pierwotnych segmentów tkanki nerkowej i włączenie do niej nowatorskiej technologii konstrukcji bez rusztowań

Połączenie znakowania przeciwciałami, optycznego oczyszczania i zaawansowanej mikroskopii świetlnej pozwala na trójwymiarową analizę całych struktur lub organów. Opisano tutaj prostą metodę łączenia znakowania immunologicznego grubych plasterków nerki, oczyszczania optycznego za pomocą cynamonianu etylu oraz obrazowania konfokalnego, które umożliwia wizualizację i kwantyfikację trójwymiarowych struktur nerkowych.

Optyczne oczyszczanie i obrazowanie znakowanej immunologicznie tkanki nerki

Przedstawiono protokół do wizualizacji 3D mikroskopijnych struktur tkanek za pomocą metody barwienia specyficznego dla promieniowania rentgenowskiego, przeznaczonej do rentgenowskiej tomografii komputerowej.

Obrazowanie 3D próbek tkanek miękkich przy użyciu metody barwienia specyficznego dla promieniowania rentgenowskiego i nanoskopowej tomografii komputerowej

Ta praca opisuje dwie metody badania rozwoju narządów, ulepszone ustawienie ksenotransplantacji na błonie kosmówkowo-omoczniowej (CAM) z ptasich embrionów, które pozwala na unaczynienie hodowanych narządów embrionalnych i organoidów oraz nowatorską metodę hodowli narządów w stałym kierunku z zmodyfikowanymi warunkami eksperymentalnymi, która pozwala na obrazowanie konfokalne w wysokiej rozdzielczości w trybie poklatkowym.

Optymalizacja organoidów nerkowych i hodowli organotypowych pod kątem unaczynienia, przedłużony rozwój i ulepszone obrazowanie mikroskopowe

Tutaj udostępniamy szczegółowe, solidne i uzupełniające protokoły do wykonywania barwienia i obrazowania w rozdzielczości subkomórkowej stałych trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych w zakresie od 100 μm do kilku milimetrów, umożliwiając w ten sposób wizualizację ich morfologii, składu typu komórki i interakcji.

Barwienie i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości trójwymiarowych modeli organoidów i sferoidów

Ta metoda demonstruje przepływ pracy druku 3D oparty na wokselach, który drukuje bezpośrednio z obrazów medycznych z dokładną wiernością przestrzenną i rozdzielczością przestrzenną/kontrastową. Umożliwia to precyzyjną, stopniowaną kontrolę rozkładu materiałów za pomocą morfologicznie złożonych, stopniowanych materiałów skorelowanych z gęstością promieniotwórczą bez utraty lub zmiany danych.

Anatomia drukowania wokselowego: projektowanie i wytwarzanie realistycznych, przedchirurgicznych modeli planistycznych za pomocą drukowania bitmapowego

Tutaj prezentujemy protokół z wykorzystaniem mikroskopii 2-fotonowej u szczurów z Monachium Wistar Fromter z powierzchniowymi kłębuszkami nerkowymi w celu ilościowego określenia wpływu przedłużonej niedrożności moczowodu na dynamikę i funkcję kłębuszków nerkowych.

Wykorzystanie mikroskopii 2-fotonowej do ilościowego określenia wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na procesy kłębuszkowe

To badanie przedstawia łatwy w użyciu, kompletny i prosty zestaw metod do oznaczania i analizowania kłębuszków nerkowych z mysich nerek oczyszczonych metodą CUBIC. Dane, takie jak liczba i objętość kłębuszków nerkowych, można łatwo i niezawodnie uzyskać za pomocą dekstranu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-Dextran, mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych (LSFM) lub popularnej mikroskopii konfokalnej i oprogramowania, takiego jak Imaris.

Wydajna i szybka metoda etykietowania i analizy kłębuszków mysich

Tutaj prezentujemy protokoły, które szczegółowo opisują instrukcje dotyczące wdrażania hodowli komórkowych 3D przy użyciu matryc kolagenowych i kolagenowo-agarozowych w systemie mikrofizjologicznym. Protokoły te wspierają kogenerację kanalików proksymalnych nerek i sferoidów raka nerkowokomórkowego, symulując warunki in vivo i umożliwiając zaawansowane badania interakcji komórek raka nerki.

Kohodowla mikroprzepływowa zdrowych nerek i nabłonka guza w celu modelowania progresji raka nerki

Ten artykuł opisuje protokół immunofluorescencji multipleksowej zoptymalizowany pod kątem charakterystyki trójwymiarowej architektury przerzutów otrzewnowych.

Trójwymiarowe obrazowanie tkanki nośnej guza przy użyciu iteracyjnego wybielania rozszerza podejście multipleksywalne

Naucz się trójwymiarowego barwienia całej nerki metodą CUBIC, obejmującego utrwalanie, odbarwianie i immunofluorescencję. Technika ta umożliwia makroskopową wizualizację struktur nerkowych i odkrycia w patologii nerek.

Trójwymiarowe barwienie całej nerki za pomocą CUBIC

Przeglądaj więcej filmów