Trójwymiarowe barwienie całej nerki za pomocą CUBIC
18 lipca 2022
Obecny protokół opisuje metodę oczyszczania tkanek i barwienie immunofluorescencyjne w całości do trójwymiarowego (3D) obrazowania nerek. Technika ta może zaoferować makroskopowe perspektywy w patologii nerek, prowadząc do nowych odkryć biologicznych.
Protokół ten umożliwia wizualizację trójwymiarowych struktur w pełnej nerce, co może prowadzić do innowacyjnych odkryć w badaniach nad nerkami, zapewniając perspektywę makroskopową. Barwienie całych narządów jest trudne ze względu na trudności w penetracji przeciwciał. Protokół ten wykazał wysokiej jakości, całkowite zabarwienie nerek przez przeciwciała.
Aby rozpocząć, wykonaj utrwalanie przez zanurzenie natychmiast po utrwaleniu perfuzyjnym i pobraniu próbki nerki, zanurzając nerkę w 4% paraformaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 16 godzin. Wykonaj trzy płukania za pomocą PBS przez dwie godziny każde. Przeprowadź proces odbarwiania i odtłuszczania, zanurzając nieruchomą nerkę w siedmiu milimetrach 50% CUBIC-L w 14-mililitrowej probówce z okrągłym dnem, delikatnie potrząsając w temperaturze pokojowej.
Po sześciu godzinach zanurz nerkę w siedmiu mililitrach CUBIC-L w 14-milimetrowej probówce z okrągłym dnem, delikatnie potrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć dni. Odświeżaj CUBIC-L codziennie. Po zakończeniu odbarwiania i delipidacji użyj łyżki dozującej do obsługi próbki i umyj nerkę trzykrotnie PBS w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.
Immunostainować zdelipidowaną nerkę w pierwotnych przeciwciałach rozcieńczonych w barwiącym roztworze buforowym, delikatnie wstrząsając w wytrząsarce inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem dni. Następnie umyj nerkę 0,5% Triton X-100 w PBS, znanym również jako PBST, w temperaturze pokojowej przez jeden dzień. W przypadku barwienia przeciwciałami wtórnymi należy traktować nerkę przeciwciałami drugorzędowymi w buforze barwiącym, w ciemności, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem dni.
Napraw plamę za pomocą prania PBST w temperaturze pokojowej na jeden dzień. Po utrwaleniu zanurz nerkę w 1% formaldehydzie w PB na trzy godziny i myj ją PBS w temperaturze pokojowej przez sześć godzin. Wykonaj dopasowanie współczynnika załamania światła, zanurzając nerkę w siedmiu mililitrach 50% CUBIC-R+ w 14-mililitrowej probówce z okrągłym dnem z potrząsaniem na jeden dzień, a następnie poddając się leczeniu siedmioma mililitrami CUBIC-R+ z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej przez dwa dni.
Za pomocą metody barwienia immunologicznego nerwy współczulne i tętnice w całej nerce zostały uwidocznione w obrazowaniu 3D nerek. Ponadto uwidoczniono nieprawidłowe nerwy współczulne nerek po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym. Protokół ten ułatwił również wizualizację nerwów współczulnych w całej śledzionie.
W tym miejscu przedstawiono proces kwantyfikacji danych dla trójwymiarowego barwienia immunofluorescencyjnego. Ponadto z powodzeniem uwidoczniono przewody zbiorcze, odcinek S1 kanalików proksymalnych i kłębuszki nerkowe w całej nerce. Stłumiona omegalia kłębuszków nerkowych, wynikająca z podawania leków we wczesnych stadiach cukrzycowej choroby nerek, została również uwidoczniona w obrazowaniu 3D.
Protokół ten może oznaczać konkretną cząsteczkę w całej nerce. W ten sposób naukowcy mogą analizować zmiany struktury w naczyniach krwionośnych lub znajdować rzadkie zdarzenia w tkankach nerkowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół umożliwia wizualizację struktur trójwymiarowych w całym nerkach, zapewniając perspektywę makroskopową, która może prowadzić do innowacyjnych odkryć w badaniach nad nerkami. Metoda obejmuje klarowanie tkanki oraz immunofluorescencyjne barwienie całych preparatów w celu poprawy jakości obrazowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Patologia
Wstęp
- Barwienie całych organów jest trudne ze względu na problemy z penetracją przeciwciał.
- Wysoka jakość barwienia jest kluczowa dla dokładnego obrazowania 3D.
- Niniejszy protokół rozwiązuje typowe problemy w obrazowaniu nerek.
- Perspektywa makroskopowa może prowadzić do nowych spostrzeżeń biologicznych.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnej metody obrazowania trójwymiarowego (3D) nerek.
- Poprawa wizualizacji struktur nerkowych.
- Ułatwienie innowacyjnych odkryć w patologii nerek.
Zastosowane Metody
- Fiksacja przez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4°C przez 16 godzin.
- Trzykrotne płukanie w PBS, po dwie godziny każdego płukania.
- Odbarwianie i odtłuszczanie przy użyciu 50% CUBIC-L.
- Delikatne wstrząsanie w temperaturze pokojowej podczas procesu odtłuszczania.
Główne wyniki
- Wykazano wysoką jakość barwienia całego preparatu nerek.
- Osiągnięto poprawioną penetrację przeciwciał.
- Zapewniono wyraźną wizualizację 3D struktur nerek.
- Umożliwiono uzyskanie perspektywy makroskopowej dla lepszego zrozumienia patologii nerek.
Wnioski
- Protokół ten skutecznie ulepsza techniki obrazowania nerek.
- Otwiera on nowe możliwości odkryć w badaniach nad nerkami.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu uzyskania dalszych informacji.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Trójwymiarowe barwienie całej nerki z wykorzystaniem metody CUBIC umożliwia kompleksową wizualizację mikrostruktur nerkowych, przełamując ograniczenia konwencjonalnej patologii. Możliwość ta wspiera wysokorozdzielcze mapowanie naczyń krwionośnych, kanalików, kłębuszków i nerwów współczulnych, dostarczając kluczowych informacji dla wczesnego odkrywania i mechanistycznej redukcji ryzyka w badaniach nad chorobami nerek. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w kluczowych punktach zwrotnych podczas rozwoju portfela badań przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie architektury nerek i sieci komórkowych z rozdzielczością na poziomie pojedynczych komórek.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez wizualizację zmian strukturalnych po urazie lub interwencji.
- Ułatwia walidację funkcjonalną celów terapeutycznych dzięki kompleksowemu mapowaniu nerwów współczulnych i kłębków nerkowych.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy ustalaniu priorytetów dla celów terapeutycznych w chorobach nerek.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane biologiczne systemy 3D do dalszych procesów obrazowania i kwantyfikacji.
- Standaryzuje barwienie całych organów w celu uzyskania powtarzalnych, ilościowych wyników w różnych badaniach.
- Umożliwia skalowalne obrazowanie rzadkich zdarzeń i zmian strukturalnych w tkance nerek.
- Wspiera wiarygodną ocenę wpływu związków na mikroanatomię nerek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki obrazowania 3D z istotnymi dla choroby biomarkerami, takimi jak glomerulomegalia.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną poprzez wizualizację efektów interwencji.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszych etapach badań z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o kompleksową analizę tkanek.
- Zapewnia predykcyjną redukcję ryzyka dla translacyjnych programów badań nad nerkami.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół trójwymiarowego barwienia całego kidney integruje się z continuum od odkrycia do badań przedklinicznych, wspierając testowanie hipotez, walidację celów oraz dopasowanie biomarkerów translacyjnych w badaniach nad nerkami.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez mapowanie struktur nerkowych oraz odpowiedzi na uszkodzenia.
- Przesiew: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne wyniki obrazowania 3D do ilościowego porównania warunków eksperymentalnych.
- Analityka: Umożliwia pomiar i kwantyfikację zmian strukturalnych, wspierając rzetelną analizę statystyczną.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki obrazowania z modelami chorób i wczesną identyfikacją biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę do wielokrotnego wykorzystania w obrazowaniu całych organów w badaniach nad nerkami i powiązanymi tkankami.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów nerkowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ustandaryzowane, skalowalne i powtarzalne przepływy pracy w obrazowaniu 3D.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie kompleksowej analizy tkanek.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój programów dotyczących chorób nerek.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest biegłość w zakresie przejaśniania tkanek, immunobarwienia oraz analizy obrazowania 3D.
- Wymagany jest dostęp do zaawansowanej aparatury obrazującej oraz narzędzi do analizy komputerowej.
- Niezbędna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Może być wymagana adaptacja metody dla różnych układów organów lub paneli przeciwciał.
- Penetracja przeciwciał oraz czas trwania barwienia stanowią praktyczne ograniczenia w przypadku obrazowania całych organów.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:37
Kidney Fixation, Decolorization, and De-Lipidation
1:45
Whole-Mount Immunofluorescent Staining and Refractive Index (RI) Matching
3:03
Results: Whole-Mount Immunofluorescent Staining for Three-Dimensional (3D) Kidney Imaging
4:00
Conclusion
