Przewodnik po badaniu śródmięśniowego tworzenia się tłuszczu i jego komórkowego pochodzenia w mięśniach szkieletowych

Jedną z istotnych barier w badaniu śródmięśniowej tkanki tłuszczowej, cechy charakterystycznej sarkopenii i chorób nerwowo-mięśniowych, jest skuteczne zachowanie i późniejsza wizualizacja adipocytów, zwłaszcza w zamrożonych skrawkach tkanek. Protokół zachowuje morfologię adipocytów i sekcje mięśni szkieletowych w celu solidnej, rygorystycznej i powtarzalnej wizualizacji i kwantyfikacji śródmięśniowej tkanki tłuszczowej. Nasz potok analiz zapewnia ramy do walidacji nowatorskich interwencji zapobiegających tworzeniu się tłuszczu w chorobach takich jak dystrofia mięśniowa Duchenne'a.

Na początek oczyść nogę, która ma być wstrzyknięta, świeżą chusteczką nasączoną alkoholem w celu dezynfekcji. Pobrać od 30 do 50 mikrolitrów 50% glicerolu do strzykawki insulinowej. Delikatnie rozczesz włosy na goleni, aby odsłonić położenie TA. Po zlokalizowaniu TA wbić igłę w TA dystalnie w pobliżu kostki.

Całkowicie włóż igłę do mięśnia i powoli wstrzyknij glicerol, stopniowo wycofując igłę, co pomaga uszkodzić większość mięśnia. Obficie spryskaj wszystkie obszary myszy, które mają zostać strzyżone, 70% etanolem, aby zapobiec przedostawaniu się włosów do sekcji i narzędzi. Użyj nożyczek, aby przeciąć skórę wokół górnej części nogi w pobliżu miednicy.

Delikatnie pociągnij skórę nogi od góry do kostki. Najpierw usuń zewnętrzną warstwę tkanki łącznej za pomocą pęsety z ostrą końcówką przed pobraniem TA. Wsuń pęsetę pod TA od dołu mięśnia, zaczynając od dystalnego ścięgna i delikatnie pociągnij w górę w kierunku kolana. Zatrzymaj się na końcu mięśnia.

Nie przekraczaj oporu odczuwalnego w dolnej części kolana. Jeśli przed dotarciem do dolnej części kolana występuje znaczny opór, zatrzymaj się i kontynuuj usuwanie resztek tkanki łącznej. Gdy TA zostanie częściowo podniesiona z nogi za pomocą pęsety, użyj tego samego ruchu skalpelem, aby przeciąć połączenie TA z dolną częścią kolana.

Wypatrosz ścięgno w kostce nożyczkami, aby całkowicie usunąć TA. Dotykaj tylko mięśnia przy ścięgnie, aby uniknąć uszkodzenia włókien. Przetnij jedną trzecią TA na końcu, naprzeciwko ścięgna. Umieść go w probówce mikrowirówki i zamroź błyskawicznie, wrzucając do ciekłego azotu.

Zanurz pozostałe dwie trzecie tkanki w znakowanej studzience z 4% PFA do histologii. Pamiętaj, aby śledzić, kiedy pierwsza i ostatnia tkanka została umieszczona w utrwalaczu. Umieść na nutatorze na dwie do dwóch i pół godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po utrwaleniu usuń PFA ze studzienek. Opłucz chusteczki zimnym jednym X PBS dwa do trzech razy, a następnie umyj dwa do trzech razy zimnym 1X PBS przez pięć minut na pranie. Usuń PBS z dołków i dodaj tyle 30% sacharozy do 1X PBS, aby tkanka mogła unosić się na wodzie.

Umieść na nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc. Włącz mikroskop i uruchom oprogramowanie do obrazowania. Zabezpiecz zjeżdżalnię na scenie.

Użyj dowolnego kanału, aby zidentyfikować obszar, który ma zostać zobrazowany. W oprogramowaniu do obrazowania dostosuj wzmocnienie i czas ekspozycji dla każdego kanału. Zrób zdjęcia całej tkanki w każdym kanale i połącz poszczególne płytki, aby utworzyć kompozyt o pełnym przekroju TA.

Przed rozpoczęciem podgrzej wodę wolną od RNaz do 45 stopni Celsjusza i przygotuj świeży 70% etanol. Dodać 1000 mikrolitrów tiocyjanianu guanidyny do każdej probówki zawierającej próbkę. Ważne jest, aby używane były rurki zatwierdzone przez Bead Bicker.

Dodaj trzy średnie koraliki lub jeden duży i jeden mały koralik do każdej tuby. Homogenizuj tkankę z częstotliwością 50 Hz przez dwie do czterech minut za pomocą ubijaka do kulek. W zależności od rodzaju tkanki i wielkości próbki może to potrwać do 10 minut.

Dodaj 200 mikrolitrów chloroformu. Potrząsać próbkami przez 15 sekund. Inkubować przez dwie do trzech minut w temperaturze pokojowej.

Wirować przez 15 minut po 12 000 razy G. Odpipetować 350 mikrolitrów klarownego supernatantu i dodać do nowej probówki mikrowirówki zawierającej 350 mikrolitrów 70% etanolu. Należy uważać, aby nie zassać niższych warstw białka i/lub DNA. Przenieś do 700 mikrolitrów tej mieszaniny do mini kolumny wirowej umieszczonej w dwumililitrowej probówce zbiorczej.

Kontynuuj izolację RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Elutę za pomocą 30 do 50 mikrolitrów wody wolnej od RNaz, w zależności od oczekiwanej wydajności. Trzymaj RNA na lodzie i zmierz wydajność za pomocą spektrofotometru.

Utrzymuj RNA przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Użyj do jednego mikrograma RNA do syntezy cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Po zakończeniu biegu dodaj 80 mikrolitrów wody wolnej od RNaz.

Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Używając formatu 384 dołków, dodaj jeden mikrolitr startera na dno każdej studzienki. Swobodnie schnące podkłady skutkują ściślejszymi replikami technicznymi.

Pozostawić pod przykryciem, aż podkłady całkowicie wyparują. Przygotuj reakcje próbek z czterema do ośmiu powtórzeń technicznych. Po zakończeniu serii PCR znormalizuj surowe wartości progowe cyklu do poziomów genów porządkowych i określ zmiany fałdowania, obliczając delta-delta Ct. Perilipina i dodatnie adipocyty z nieutrwalonych TA znacznie zmieniły morfologię w porównaniu ze stałymi sekcjami, co sprawia, że ich identyfikacja, wizualizacja i późniejsza kwantyfikacja są znacznie trudniejsze i potencjalnie niedokładne.

Natomiast wiązanie PFA zachowuje morfologię adipocytów, co pozwala na dokładne wykrycie tłuszczu śródmięśniowego. W porównaniu z nieuszkodzonym mięśniem TA, uszkodzenie glicerolu indukuje ekspresję wczesnych markerów adipogennych, takich jak PPAR gamma i CEBP alfa już trzy dni po urazie. Dojrzałe markery, takie jak adiponektyna i perylipidina, można wykryć już po pięciu dniach od uszkodzenia gliceryny.

Korzystając ze śledzenia linii genetycznej, większość receptorów alfa FAP PDGF wyraża marker linii EYFP. Siedem dni po uszkodzeniu glicerolu, EYFP dodatnie FAP przekształciły się w EYFP dodatnie adipocyty wyrażające perylipinę, co pokazuje, że FAP są rzeczywiście komórkowym pochodzeniem tłuszczu śródmięśniowego. Protokół można również dostosować do wizualizacji komory miogennej.

Stosując przeciwciała przeciwko PAX7 i MYOD1, odpowiednio markery komórek macierzystych mięśni i mioblastów można łatwo wykryć pięć dni po uszkodzeniu glicerolu, nawet w skrawkach tkanki mięśniowej z utrwalonymi PFA. Protokół ten można również dostosować do wizualizacji i ilościowego oznaczania adipocytów i innych dorosłych tkanek. Ponadto nasza technika konserwacji tkanek jest kompatybilna z różnorodnością różnych technik stojących.