Name: Przewodnik po badaniu śródmięśniowego tworzenia się tłuszczu i jego komórkowego pochodzenia w mięśniach szkieletowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji i ilościowego oznaczania tłuszczu śródmięśniowego w tkance mięśniowej szkieletowej. Technika ta zachowuje morfologię adipocytów, umożliwiając badanie mechanizmów tworzenia się tłuszczu w chorobach mięśniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Kopinke za pomoc w zbieraniu danych i krytycznym czytaniu manuskryptu. Dziękujemy również członkom Instytutu Myologii Uniwersytetu Florydy za ich cenny wkład w prace nad manuskryptem. Prace były wspierane przez grant NIH 1R01AR079449. Rysunek 2 został stworzony za pomocą Biorender.

<ol><li>Milad, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+plasma+lipid+levels+exacerbate+muscle+pathology+in+the+mdx+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Increased plasma lipid levels exacerbate muscle pathology in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Skeletal Muscle. 7 (1), 19(2017).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+regional+body+fat+distribution%2C+and+the+metabolic+syndrome+in+older+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women.</a> Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+regional+adipose+tissue+distribution+and+both+type+2+diabetes+and+impaired+glucose+tolerance+in+elderly+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men and women.</a> Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+skeletal+muscle+strength%2C+mass%2C+and+quality+in+older+adults%3A+the+health%2C+aging+and+body+composition+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journals+of+Gerontology%2C+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The loss of skeletal muscle strength, mass, and quality in older adults: the health, aging and body composition study.</a> The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (10), 1059-1064 (2006).</li>
<li>Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thigh+adipose+tissue+distribution+is+associated+with+insulin+resistance+in+obesity+and+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).</li>
<li>Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+lipid+content+is+increased+in+obesity+and+decreased+by+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss.</a> Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).</li>
<li>Burakiewicz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+fat+replacement+of+muscle+by+quantitative+MRI+in+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Quantifying fat replacement of muscle by quantitative MRI in muscular dystrophy.</a> Journal of Neurology. 264 (10), 2053-2067 (2017).</li>
<li>Murphy, W. A., Totty, W. G., Carroll, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+of+normal+and+pathologic+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Roentgenology%22%5BJournal%5D)">MRI of normal and pathologic skeletal muscle.</a> American Journal of Roentgenology. 146 (3), 565-574 (1986).</li>
<li>Willcocks, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+prospective+longitudinal+study+of+magnetic+resonance+biomarkers+in+a+large+duchenne+muscular+dystrophy+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multicenter prospective longitudinal study of magnetic resonance biomarkers in a large duchenne muscular dystrophy cohort.</a> Annals of Neurology. 79 (4), 535-547 (2016).</li>
<li>Wokke, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+MRI+and+strength+measurements+in+the+assessment+of+muscle+quality+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Quantitative MRI and strength measurements in the assessment of muscle quality in Duchenne muscular dystrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (5), 409-416 (2014).</li>
<li>Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins%2C+potency%2C+and+heterogeneity+of+skeletal+muscle+fibro-adipogenic+progenitors-time+for+new+definitions%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions.</a> Skeletal Muscle. 11 (1), 16(2021).</li>
<li>El Agha, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+fibrotic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in fibrotic disease.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).</li>
<li>Joe, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li>
<li>Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+adipose+is+derived+from+a+non-Pax3+lineage+and+required+for+efficient+regeneration+of+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles.</a> Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).</li>
<li>Scott, R. W., Arostegui, M., Schweitzer, R., Rossi, F. M. V., Underhill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hic1+defines+quiescent+mesenchymal+progenitor+subpopulations+with+distinct+functions+and+fates+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hic1 defines quiescent mesenchymal progenitor subpopulations with distinct functions and fates in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Stem Cell. 25 (6), 797-813 (2019).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+adipogenesis+originate+from+a+common+mesenchymal+progenitor+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 21 3654-3664 (2011).</li>
<li>Hogarth, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroadipogenic+progenitors+are+responsible+for+muscle+loss+in+limb+girdle+muscular+dystrophy+2B%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Fibroadipogenic progenitors are responsible for muscle loss in limb girdle muscular dystrophy 2B.</a> Nature Communications. 10 (1), 2430(2019).</li>
<li>Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li>
<li>Stumm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odd+skipped-related+1+%28Osr1%29+identifies+muscle-interstitial+fibro-adipogenic+progenitors+%28FAPs%29+activated+by+acute+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Odd skipped-related 1 (Osr1) identifies muscle-interstitial fibro-adipogenic progenitors (FAPs) activated by acute injury.</a> Stem Cell Research. 32, 8-16 (2018).</li>
<li>Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+Hedgehog+signaling+restricts+injury-induced+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ciliary Hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis.</a> Cell. 170 (2), 340-351 (2017).</li>
<li>Huang, Y., Das, A. K., Yang, Q. Y., Zhu, M. J., Du, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zfp423+promotes+adipogenic+differentiation+of+bovine+stromal+vascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zfp423 promotes adipogenic differentiation of bovine stromal vascular cells.</a> PLoS One. 7 (10), 47496(2012).</li>
<li>Sun, Y. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFR%CE%B1+regulated+by+miR-34a+and+FoxO1+promotes+adipogenesis+in+porcine+intramuscular+preadipocytes+through+Erk+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">PDGFRα regulated by miR-34a and FoxO1 promotes adipogenesis in porcine intramuscular preadipocytes through Erk signaling pathway.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2424(2017).</li>
<li>Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation%2C+and+characterization+of+fibro-adipogenic+progenitors+%28FAPs%29+and+myogenic+progenitors+%28MPs%29+in+skeletal+muscle+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) in skeletal muscle in the rat.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e61750(2021).</li>
<li>Lukjanenko, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+disrupts+muscle+stem+cell+function+by+impairing+matricellular+WISP1+secretion+from+fibro-adipogenic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular WISP1 secretion from fibro-adipogenic progenitors.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446 (2019).</li>
<li>Santini, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+PDGFRalpha%28%2B%29+progenitor+cells+contribute+to+fibrosis+versus+healing+in+a+context-+and+spatiotemporally+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident PDGFRalpha(+) progenitor cells contribute to fibrosis versus healing in a context- and spatiotemporally dependent manner.</a> Cell Reports. 30 (2), 555-570 (2020).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+PDGFRalpha%2B+mesenchymal+progenitors+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of PDGFRalpha+ mesenchymal progenitors in human skeletal muscle.</a> Cell Death & Disease. 5, 1186(2014).</li>
<li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li>
<li>Soliman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+potential+of+Hic1-expressing+cardiac+stromal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogenic potential of Hic1-expressing cardiac stromal progenitors.</a> Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).</li>
<li>Chung, M. I., Bujnis, M., Barkauskas, C. E., Kobayashi, Y., Hogan, B. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-mediated+BMP%2FSMAD+signaling+regulates+lung+alveolar+stem+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Niche-mediated BMP/SMAD signaling regulates lung alveolar stem cell proliferation and differentiation.</a> Development. 145 (9), Cambridge, England. (2018).</li>
<li>Hilgendorf, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omega-3+fatty+acids+activate+ciliary+FFAR4+to+control+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Omega-3 fatty acids activate ciliary FFAR4 to control adipogenesis.</a> Cell. 179 (6), 1289-1305 (2019).</li>
<li>Waisman, A., Norris, A. M., Elías Costa, M., Kopinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+and+unbiased+segmentation+and+quantification+of+myofibers+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automatic and unbiased segmentation and quantification of myofibers in skeletal muscle.</a> Scientific Reports. 11 (1), 11793(2021).</li>
<li>Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2%2B+CNS+glial+progenitors+remain+committed+to+the+oligodendrocyte+lineage+in+postnatal+life+and+following+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration.</a> Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).</li>
<li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4(2001).</li>
<li>Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+profiling+reveals+that+transient+adipogenic+activation+is+a+hallmark+of+mouse+models+of+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration.</a> PLoS One. 8 (8), 71084(2013).</li>
<li>Mahdy, M. A., Lei, H. Y., Wakamatsu, J., Hosaka, Y. Z., Nishimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+muscle+regeneration+following+cardiotoxin+and+glycerol+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Anatomy+%3D+Anatomischer+Anzeiger%3A+Official+Organ+of+the+Anatomische+Gesellscaft%22%5BJournal%5D)">Comparative study of muscle regeneration following cardiotoxin and glycerol injury.</a> Annals of Anatomy = Anatomischer Anzeiger: Official Organ of the Anatomische Gesellscaft. 202, 18-27 (2015).</li>
<li>Pisani, D. F., Bottema, C. D., Butori, C., Dani, C., Dechesne, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+skeletal+muscle+adiposity%3A+a+glycerol+treatment+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Mouse model of skeletal muscle adiposity: a glycerol treatment approach.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (3), 767-773 (2010).</li>
<li>Kawai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+glycerol+myopathy%3A+a+histological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Experimental glycerol myopathy: a histological study.</a> Acta Neuropathologica. 80 (2), 192-197 (1990).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Bmp3b+expression+maintains+skeletal+muscle+integrity+and+decreases+in+age-related+sarcopenia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Bmp3b expression maintains skeletal muscle integrity and decreases in age-related sarcopenia.</a> The Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139617(2021).</li>
<li>Biferali, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prdm16-mediated+H3K9+methylation+controls+fibro-adipogenic+progenitors+identity+during+skeletal+muscle+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Prdm16-mediated H3K9 methylation controls fibro-adipogenic progenitors identity during skeletal muscle repair.</a> Science Advances. 7 (23), 9371(2021).</li>
<li>Biltz, N. K., Meyer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+quantification+of+fatty+infiltration+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle.</a> Skeletal Muscle. 7 (1), (2017).</li>
<li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), Cambridge, England. (2021).</li>
<li>Gómez-Gaviro, M. V., Sanderson, D., Ripoll, J., Desco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+applications+of+tissue+clearing+and+three-dimensional+imaging+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Biomedical applications of tissue clearing and three-dimensional imaging in health and disease.</a> iScience. 23 (8), 101432(2020).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Protokół ten przedstawia obszerny i szczegółowy protokół, który pozwala na efektywną wizualizację i rygorystyczną kwantyfikację śródmięśniowej tkanki tłuszczowej. Dzięki podziale tego samego mięśnia na dwie części, z których jedna jest używana do immunofluorescencji, a druga do analizy RT-qPCR, protokół ten jest również bardzo wszechstronny. Można go również połączyć ze śledzeniem linii genetycznej FAP w celu zbadania ich konwersji do adipocytów w określonych warunkach i jest wysoce przystosowany do znakowania i obrazowania wielu dodatkowych typów komórek.
Najczęściej stosowanymi sposobami wizualizacji tłuszczu śródmięśniowego są skrawki parafiny, a następnie barwienie hematoksyliną i eozyną lub zamrożone skrawki barwione na barwniki lipofilowe, takie jak Oil Red O (ORO). Jednak podczas gdy tkanki przetwarzane parafiną zachowują najlepszą histologię, ten sam proces ekstrahuje również wszystkie lipidy, zapobiegając stosowaniu barwników lipofilowych. Chociaż metody barwienia lipofilowego będą działać zarówno na odcinkach tkanek utrwalonych, jak i nieutrwalonych PFA, kropelki lipidów są łatwo przemieszczane przez wywieranie nacisku na szkiełko nakrywkowe, zniekształcając w ten sposób przestrzenny rozkład tłuszczu śródmięśniowego. Aby obejść ten problem, w niedawnym badaniu opracowano rygorystyczny protokół wizualizacji adipocytów ORO+ przy użyciu podejścia całościowego. W tym celu autorzy zdecelularyzowali TA, aby uwidocznić przestrzenny rozkład śródmięśniowej tkanki tłuszczowej w całym TA41. Choć ta technika jest potężna, zapobiega również stosowaniu innych współbarwień do oznaczania dodatkowych struktur komórkowych. Przedstawione tutaj podejście do immunofluorescencji wierzchowca może być wykorzystane do współbarwienia adipocytów różnymi markerami, co pozwala na dokładne mapowanie środowiska komórkowego. Jednym z głównych wyzwań jest jednak przenikanie przeciwciał do tkanek. Im więcej włókien jest utrzymywanych razem, tym trudniej będzie przeciwciałom równomiernie przeniknąć i związać wszystkie dostępne antygeny. Dlatego ta metoda jest najbardziej skuteczna, gdy patrzy się na małe grupy włókien. Jednocześnie jest to również ograniczenie, ponieważ ogólna anatomiczna lokalizacja śródmięśniowej tkanki tłuszczowej jest tracona, gdy skupiamy się tylko na małych, złuszczonych wiązkach włókien. Jednak dzięki obecnemu rozwojowi nowatorskich metod oczyszczania tkanek oraz nowej technologii obrazowania, w przyszłości możliwa będzie większa penetracja i wizualizacja tkanek 42,43,44.
Podczas gdy wcześniejsze utrwalenie tkanki mięśniowej zachowuje morfologię adipocytów, stwarza również wyzwanie w ocenie wielkości włókien mięśniowych, która jest ważną miarą zdrowia mięśni. Rozmiar włókien mięśniowych określa się poprzez pomiar pola przekroju poprzecznego włókien mięśniowych. Wcześniej informowaliśmy, że wcześniejsze utrwalenie tkanki mięśniowej spowoduje, że większość dostępnych markerów do zarysowania włókien mięśniowych ulegnie awarii31. Aby pokonać tę przeszkodę, opracowaliśmy nowatorski potok segmentacji obrazu, który umożliwia pomiar rozmiaru włókien mięśniowych nawet w stałych odcinkach mięśni31. W ten sposób stworzyliśmy solidny i wydajny rurociąg przetwarzania tkanek, który w połączeniu z tym protokołem pokonuje większość wad spowodowanych wcześniejszym utrwaleniem tkanki mięśniowej.
Kolejną ważną zaletą tego podejścia jest wszechstronność. Dzieląc TA na dwie części, maksymalizuje się ilość informacji, które można uzyskać z jednego mięśnia. To nie tylko zmniejsza liczbę zwierząt, ale także dodaje dodatkową warstwę kontroli, potwierdzając histologię poprzez ekspresję genów i odwrotnie. Ponadto można badać wiele różnych genów poza genami adipogennymi. Wyizolowane RNA można również wykorzystać w eksperymencie RNAseq całych mięśni. Wreszcie, zamrożony kawałek mięśni może być również używany do pracy z białkami. Jednym z ograniczeń tego protokołu jest możliwość, że uraz nie będzie spójny na całej długości TA. Może to prowadzić do scenariusza, w którym dwie części mięśni różnią się pod względem ilości zawartego w nich tłuszczu śródmięśniowego, co może uzasadniać wykluczenie takiej próbki z dalszej analizy. W związku z tym zaleca się, aby nie polegać tylko na RT-qPCR w celu wyciągnięcia głównych wniosków na temat ilości tłuszczu śródmięśniowego, ale raczej jako danych uzupełniających do histologicznych ocen ilościowych.
Łącznie protokół ten nakreśla solidny, wydajny i rygorystyczny proces przetwarzania tkanek, który umożliwi wizualizację i kwantyfikację śródmięśniowej tkanki tłuszczowej, co jest pierwszym krokiem w opracowywaniu nowych opcji leczenia w celu zwalczania zwłóknienia tłuszczowego. Jednocześnie jest wszechstronny i może być dostosowany do wielu różnych typów komórek w mięśniach, a także adipocytów w innych tkankach.

Infiltracja zdrowej tkanki mięśniowej przez włóknienie tłuszczowe jest charakterystyczną cechą dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD) i innych chorób nerwowo-mięśniowych, a także sarkopenii, otyłości i cukrzycy1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Chociaż zwiększona infiltracja tłuszczowa w tych schorzeniach jest silnie powiązana ze spadkiem funkcji mięśni, nasza wiedza na temat przyczyn i mechanizmów powstawania tłuszczu wewnątrzmięśniowego jest wciąż ograniczona. FAPs stanowią multipotentną populację mezenchymalnych komórek stropowych obecną w większości narządów dorosłych, w tym w mięśniach szkieletowych11,12. Jednak wraz z wiekiem oraz w przebiegu chorób przewlekłych komórki FAPs wytwarzają włóknistą tkankę bliznowatą i różnicują się w adipocyty, które lokalizują się pomiędzy poszczególnymi włóknami mięśniowymi i tworzą tłuszcz wewnątrzmięśniowy13,14,15,16,17,18,19,20.
Aby rozpocząć walkę z tworzeniem się tłuszczu wewnątrzmięśniowego, należy zdefiniować mechanizmy, dzięki którym FAP przekształcają się w adypocyty. PDGFRα jest „złotym standardem” markerów stosowanych w tej dziedzinie do identyfikacji FAP w mięśniach wielu gatunków13,16,17,18,20,21,22,23,24,25,26,27. W rezultacie opracowano kilka mysich linii Cre indukowalnych tamoksyfenem, znajdujących się pod kontrolą promotora Pdgfrα, co umożliwia genetyczną manipulację FAP in vivo z wykorzystaniem systemu Cre-LoxP27,28,29. Na przykład, poprzez połączenie tej indukowalnej linii Cre z reporterem genetycznym, można przeprowadzić śledzenie linii FAP – strategię, którą z sukcesem zastosowaliśmy do mapowania losów FAP w mięśniach i białej tkance tłuszczowej20,30. Poza śledzeniem linii, linie Cre te stanowią cenne narzędzia do badania konwersji FAP w tkankę tłuszczową.
Główną przeszkodą w zdefiniowaniu mechanizmu konwersji adipogennej FAP w tłuszcz wewnątrzmięśniowy jest możliwość rygorystycznego i powtarzalnego określenia ilości tłuszczu wewnątrzmięśniowego, który utworzył się w różnych warunkach. Kluczem jest zrównoważenie zachowania tkanki mięśniowej i tłuszczowej oraz dopasowanie tego do dostępnych metod barwienia w celu wizualizacji adipocytów. Na przykład mięśnie szkieletowe są często mrożone szokowo bez wcześniejszej fiksacji, co pozwala zachować włókna mięśniowe, ale zaburza morfologię adipocytów (Rysunek 1). Z kolei fiksacja z późniejszym zatopieniem w parafinie, mimo że zapewnia najlepszą histologię tkanki, w tym adipocytów, usuwa wszystkie lipidy, czyniąc tym samym większość barwników lipofilnych, takich jak powszechnie stosowany Oil Red O, bezużytecznymi.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig1v2.jpg" /> 
Rysunek 1: Reprezentatywne obrazy tkanki tłuszczowej wewnątrzmięśniowej w tkankach mięśniowych zamrożonych gwałtownie w porównaniu z utrwalonymi. (A) Schematyczny przegląd układu eksperymentalnego. Obrazy immunofluorescencyjne przedstawiające adipocyty (żółte), włókna mięśniowe (szare) i jądra (cyjan) w mięśniach TA (B) zamrożonych gwałtownie oraz (C) utrwalonych 21 dni po uszkodzeniu glicerolem. Paski skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Opisany tutaj protokół zachowuje morfologię włókien mięśniowych i adipocytów oraz umożliwia wizualizację i analizę wielu typów komórek. Podejście to opiera się na barwieniu immunofluorescencyjnym adipocytów w tkance mięśniowej utrwalonej w paraformaldehydzie (PFA), co pozwala na jednoczesne barwienie przy użyciu wielu przeciwciał. Można je również łatwo dostosować do przestrzennego obrazowania tłuszczu wewnątrzmięśniowego w nienaruszonej tkance przy użyciu obrazowania całych preparatów (whole-mount imaging), dostarczając tym samym informacji o mikrośrodowisku komórkowym tłuszczu w obrębie mięśnia. Ponadto protokół ten można połączyć z naszą niedawno opublikowaną metodą wyznaczania pola przekroju poprzecznego włókien mięśniowych w utrwalonych tkankach mięśniowych31, co jest istotnym pomiarem w ocenie stanu zdrowia mięśni. Przedstawiono tutaj również połączenie tego podejścia z genetycznym śledzeniem linii komórkowych (lineage tracing) w celu mapowania losów różnicowania się FAPs w adipocyty. Zatem opisany tutaj wszechstronny protokół umożliwia rygorystyczną i powtarzalną ocenę FAPs oraz ich różnicowania w tłuszcz wewnątrzmięśniowy w przekrojach tkankowych i nienaruszonych tkankach.
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig2v2.jpg" /> 
Rysunek 2: Schematyczny przegląd protokołu. Schematyczny przegląd obróbki tkanek, w której jedna trzecia TA zostaje usunięta, zamrożona w ciekłym azocie i homogenizowana w celu późniejszej izolacji RNA i analizy transkrypcji za pomocą RT-qPCR. Pozostałe dwie trzecie TA są utrwalane w PFA i poddawane obróbce w celu immunostainingu na skrawkach mrożonych lub całych włóknach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>16% PFA (opakowanie 12 butelek o pojemności 10 ml)</td><td>Elektronowa miskroskopia Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml probówki do mikrowirówek</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td>mikrowirówki do zamrażania/ubijania kulek</td></tr><tr><td>2-metylobutan (4 l)</td><td>Fisher Chemical</td><td>O3551-4</td><td>izopentan</td></tr><tr><td>Absolutny etanol (200 dowodów)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab fragment osła anty-mysz</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-007-003</td><td>blokowanie myszy na myszy</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 wtórne przeciwciało anty-kurczaka osła</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 drugorzędowe przeciwciało przeciw myszom</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 przeciwciało wtórne</td> <td>przeciwko królikowi osłaInvitrogen</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 przeciwciało wtórne przeciwko kozom osła</td><td>Invitrogen</td><td>A11057</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 przeciwciało wtórne przeciwko królikowi</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Przeciwciało falloidyny</td><td>Invitrogen</td><td>A12380</td><td>Rozpuszczone w 1,5 ml metanolu (~66 &mikro; Roztwór roboczy M)</td></tr><tr><td>BioLite 24-dołkowe Multidish</td><td>ThermoFisher Scientific 930186</td><td></td><td>24-dołkowa płytka do inkubacji tkanek PFA</td></tr><tr><td>Biometra TOne</td><td>analytikjena</td><td>8462070301</td><td>Termocykler</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GFP kurczaka</td><td>Aves</td><td>Labs GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform/alkohol izoamylowy 24:1(v/v) do biologii molekularnej, DNAzy, RNAzy i bez proteazy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC327155000</td><td></td></tr><tr><td>Olej kukurydziany</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>DAPI bejca</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>150 &micro; Roztwór roboczy M w dH2O</td></tr><tr><td>Serum osła (100 ml)</td><td>Milipore Sigma</td><td>5058837</td><td>do roztworu blokującego</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>pęseta z ostrymi końcówkami</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki proste 9 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>podłoże montażowe</td></tr><tr><td>Glicerol, 99,5%, do biologii molekularnej (500 ml)</td><td>Acros Organics</td><td>327255000</td><td></td></tr><tr><td>Koza przeciwciało anty-PDGFR&alfa</td><td>R& D</td><td>AF1062</td><td></td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji</td><td>VWR</td><td>230301V</td><td>do inkubacji tamoksyfenu</td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrofobowa bariera PAP Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>Hydrofobowy wstrzykiwacz</td><td>H-4000</td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa z mikrocienką igłą dożylną (28 G)</td><td></td>Strzykawka do insuliny 329461 <td></td><td>BD</td></tr><tr><td>z końcówką wsuwaną, 1 ml</td><td>BD</td><td>329654</td><td>Strzykawka insulinowa bez igły, do podawania doustnego </td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy cDNA iScript</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>78938441</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Leica DMi8 Mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>używany do szerokokątnego obrazowania IF i konfokalnego</td></tr><tr><td>Mikroszkiełka</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td>dodatnio naładowane preparaty mikroskopowe</td></tr><tr><td>mysie przeciwciało</td> <td>anty-MYODMysie</td> przeciwciało anty-PAX7 (supernatant) Invitrogen <td>MA1-41017</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>DSHB</td><td>AB 428528</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Premier+ Ostrza mikrotomu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop 2000 Spektrofotometr</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND2000</td><td>do pomiaru wydajności RNA</td></tr><tr>Mieszanka modelarska<td>Play-Doh</td><td>Hasbro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A25742</td><td>zielony barwnik PCR master mix</td></tr><tr><td>Puralube Maść weterynaryjna</td><td>Puralube</td><td>17033-211-38</td><td>weterynaryjna maść okulistyczna</td></tr><tr><td>QuantStudi 6 Flex Real-Time 384-well PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>4485694</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw perylipinie królika</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9349S</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka z czerwonym wirnikiem</td><td>Wytrząsarka Hoefer Scientific</td><td>PR70-115V</td><td>do barwienia IF</td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Slip-Rite Cover Glass</td><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>152460</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td>zawiera mini kolumny wirujące</td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes 1,5 ml, naturalne</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Sample Tubes RB (2 mL)</td><td>QIAGEN</td><td>990381</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Alfa Aesar</td><td>14314</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki ze stali nierdzewnej, 2,8 mm</td><td>Precellys</td><td>KT03961-1-101. Małe</td><td>koraliki</td>BK</tr><tr><td>Koraliki ze stali nierdzewnej, 5 mm</td><td>Koraliki średnie</td><td>QIAGEN</td><td>69989</td></tr><tr><td>Koraliki ze stali nierdzewnej, duże</td><td>koraliki</td><td>7 mm QIAGEN</td><td>69990</td></tr><tr><td>Skalpele jednorazowe ze stali nierdzewnej</td><td>Skalpel Miltex</td><td>327-4102</td><td></td></tr><tr><td>Rurka do karmienia ze stali nierdzewnej, 20 G x 38 mm, prosta</td><td>Instech Laboratories</td><td>Igła</td><td></td></tr> <tr><td>do pomiaru fal FTSS-20S-3Tamoxifen</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>T006000</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Plus O.C.T. Compound</td><td>Fisher HealthCare</td><td>4585</td> podłoże <td>do zatapiania</td></tr><tr><td>TissueLyser LT</td><td>QIAGEN</td><td>85600</td><td>ubijak do koralików</td></tr><tr><td>Adapter TissueLyser LT, 12-tubowy</td><td>QIAGEN</td><td>69980</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura</td><td>4566</td><td>formy do próbek</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Odczynnik</td> TRIzol Alfa <td>Aesar A16046</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tiocyjanian guanidu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596026</td></tr><tr><td>Tween20 (500 mL)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprowadnice VWR - Superfrost Plus</td><td>Słoiki</td> do barwienia VWR <td>48311703</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Coplin</td><td>Słoik Millipore Sigma</td><td>S6016</td><td>Coplin</td></tr></tbody></table>

przewodnik po badaniu śródmięśniowego tworzenia się tłuszczu i jego komórkowego pochodzenia w mięśniach szkieletowych

A Guide to Examining Intramuscular Fat Formation and its Cellular Origin in Skeletal Muscle

Fibro-adipogenne komórki progenitorowe (FAP) to mezenchymalne komórki zrębowe, które odgrywają kluczową rolę podczas homeostazy i regeneracji mięśni szkieletowych. FAP budują i utrzymują macierz zewnątrzkomórkową, która działa jak molekularne rusztowanie z włókien mięśniowych. Ponadto FAP są niezbędne do regeneracji włókien mięśniowych, ponieważ wydzielają wiele korzystnych czynników wyczuwanych przez komórki macierzyste mięśni (MuSC). Jednak w stanach chorobowych FAP są komórkowym pochodzeniem śródmięśniowej tkanki tłuszczowej i zwłókniejącej tkanki bliznowatej. To zwłóknienie tłuszczowe jest cechą charakterystyczną sarkopenii i chorób nerwowo-mięśniowych, takich jak dystrofia mięśniowa Duchenne'a. Jedną z istotnych barier w ustaleniu, dlaczego i w jaki sposób FAP różnicują się w tłuszcz śródmięśniowy, jest skuteczne zachowanie i późniejsza wizualizacja adipocytów, zwłaszcza w zamrożonych skrawkach tkanek. Konwencjonalne metody przetwarzania tkanki mięśni szkieletowych, takie jak szybkie zamrażanie, nie zachowują prawidłowo morfologii poszczególnych adipocytów, uniemożliwiając w ten sposób dokładną wizualizację i kwantyfikację. Aby pokonać tę przeszkodę, opracowano rygorystyczny protokół, który zachowuje morfologię adipocytów w sekcjach mięśni szkieletowych, umożliwiając wizualizację, obrazowanie i kwantyfikację śródmięśniowej tkanki tłuszczowej. Protokół określa również, w jaki sposób przetwarzać część tkanki mięśniowej do RT-qPCR, umożliwiając użytkownikom potwierdzenie zaobserwowanych zmian w tworzeniu tłuszczu poprzez oglądanie różnic w ekspresji genów adipogennych. Dodatkowo można go dostosować do wizualizacji adipocytów poprzez immunofluorescencję całych próbek mięśniowych. Wreszcie, protokół ten określa, w jaki sposób przeprowadzić genetyczne śledzenie linii FAP eksprymujących Pdgfrα w celu zbadania adipogennej konwersji FAP. Protokół ten konsekwentnie zapewnia wysokiej rozdzielczości i morfologicznie dokładne obrazy immunofluorescencyjne adipocytów, wraz z potwierdzeniem za pomocą RT-qPCR, co pozwala na solidną, rygorystyczną i powtarzalną wizualizację i kwantyfikację śródmięśniowej tkanki tłuszczowej. Opisany tutaj proces analizy jest pierwszym krokiem do lepszego zrozumienia, w jaki sposób FAP różnicują się w tłuszcz śródmięśniowy i zapewnia ramy do walidacji nowatorskich interwencji zapobiegających tworzeniu się tłuszczu.

Wizualizacja immunofluorescencyjna tkanki tłuszczowej wewnątrzmięśniowej 
Zgodnie z powyższymi krokami i w odniesieniu do Rysunku 1A, pobrano przekroje tkanki mięśnia piszczelowego przedniego (TA) 21 dni po urazie glicerolem, które zostały albo zamrożone szokowo bezpośrednio po pobraniu w izopentanie chłodzonym w LN2, albo utrwalone w 4% PFA przez 2,5 h. Po wykonaniu kriotomii i barwieniu obu próbek, wykonano zdjęcia w połowie brzuszca, czyli w największym obszarze TA. Adipocyty PERILIPIN+ z nieutrwalonych mięśni TA (Rysunek 1B) wykazują znacznie zmienioną morfologię w porównaniu z przekrojami utrwalonymi (Rysunek 1C), co sprawia, że ich identyfikacja, wizualizacja i późniejsza kwantyfikacja są znacznie trudniejsze i potencjalnie niedokładne. Należy zauważyć, że pierwsze krople lipidowe PERILIPIN+ wykryto około 5 dni po urazie, a większość adipocytów uformowała się do 7. dnia. Do 21. dnia po urazie adipocyty były w pełni dojrzałe.
Ponieważ ilość tłuszczu na TA silnie koreluje z ciężkością wywołanego uszkodzenia, mięśnie TA muszą zostać znacząco uszkodzone, aby można było skutecznie obserwować i badać tworzenie tłuszczu wewnątrzmięśniowego. Ćwiczenie iniekcji z użyciem tuszu w preparatach pośmiertnych TA jest doskonałym sposobem na zwiększenie stopnia uszkodzenia. Skuteczne uszkodzenia zazwyczaj obejmują powyżej 50% mięśnia. Należy zauważyć, że uszkodzone obszary mięśnia reprezentują miejsca pozbawione włókien mięśniowych lub obszary zasiedlone przez włókna mięśniowe zawierające co najmniej jedno jądro położone centralnie, co jest znanym wyróżnikiem regenerującego się włókna mięśniowego.
Niniejszy protokół można łatwo dostosować do barwienia FAP oraz tłuszczu w 3D. W tym celu po utrwaleniu ostrożnie odseparowano liczne włókna mięśniowe z mięśnia TA, a następnie przeprowadzono immunofluorescencję całego preparatu (whole-mount). Kluczowe jest odpowiednie przymocowanie włókien do szkiełka przedmiotowego przy jednoczesnym unikaniu nadmiernej kompresji tkanki. Dzięki zastosowaniu formowalnych podkładek z gliny użytkownik może dostosować wymaganą grubość i przymocować szkiełko nakrywkowe do przedmiotu, co umożliwia nawet zastosowanie mikroskopu odwróconego (Rysunek 4A). Metoda ta została z sukcesem wykorzystana do znakowania FAP PDGFRα+, włókien mięśniowych Phalloidin+ oraz adipocytów wykazujących ekspresję PERILIPIN (Rysunek 4B, Supplemental Video 1 i Supplemental Video 2). Po uzyskaniu obrazów na wielu płaszczyznach z, obejmujących grubość do 150 µm, do stworzenia rekonstrukcji 3D wykorzystano moduł renderowania 3D w oprogramowaniu mikroskopu.
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig4v3.jpg" /> 
Rycina 4: Barwienie immunofluorescencyjne całego preparatu (whole-mount). (A) Widok z góry i z boku sposób montowania próbki i nakładania szkiełka nakrywnego do barwienia całego preparatu. (B) Reprezentatywne rekonstrukcje 3D komórek FAP (zielone; lewo) i adipocytów (czerwone; prawo) wraz z włóknami mięśniowymi (szare) i jądrami komórkowymi (niebieskie). Paski skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig4v3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Ilościowe oznaczanie tłuszczu wewnątrzmięśniowego 
Po wykonaniu zdjęć tłuszczu wewnątrzmięśniowego, funkcję Cell Counter w programie ImageJ/FIJI wykorzystano do ręcznego policzenia liczby adipocytów PERLIPIN+ (Rycina 5A). Następnie określono całkowitą powierzchnię przekroju mięśnia, a także powierzchnię uszkodzoną, zdefiniowaną przez obecność jąder położonych centralnie wewnątrz włókien mięśniowych. Aby skontrolować stopień nasilenia urazu, całkowitą liczbę adipocytów podzielono przez powierzchnię uszkodzoną, co pozwoliło uzyskać liczbę komórek tłuszczowych na 1 mm2 uszkodzonego mięśnia. Zazwyczaj mięśnie TA wykazujące &#60;30% uszkodzeń są wykluczane z analiz ilościowych. Należy zauważyć, że mimo iż adipocyty są rzadkie w przypadku braku urazu (od zera do ośmiu na powierzchnię przekroju), całkowita liczba adipocytów jest nadal normalizowana względem całkowitej powierzchni. Jak podkreślono na Rycynie 5B, uraz wywołany glicerolem powoduje powstanie ogromnych ilości tłuszczu wewnątrzmięśniowego w porównaniu do nieuszkodzonego mięśnia TA. Alternatywnie, ponieważ barwienie Perilipiny jest bardzo czyste i charakteryzuje się wysokim stosunkiem sygnału do szumu, można również zastosować funkcję Analyze Particle, aby określić całkowitą powierzchnię zajmowaną przez Perilipiny. Metoda ta nie pozwoli jednak na rozróżnienie między mniejszymi a mniejszą liczbą adipocytów. Wykonano zdjęcia i dokonano pomiarów ilościowych do trzech przekrojów z minimum czterech osobników, a następnie podano średnią liczbę komórek tłuszczowych obecnych u jednej myszy.
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig5v2.jpg" /> 
Rysunek 5: Ilościowe oznaczenie tłuszczu wewnątrzmięśniowego. (A) Reprezentatywny obraz pokazujący sposób zliczania adipocytów PERILIPIN+ (białe) przy użyciu funkcji Cell Counter w programie ImageJ. Pasek skali: 50 µm. (B) Ilościowe oznaczenie wszystkich adipocytów w mięśniu TA 21 dni po wstrzyknięciu glicerolu, znormalizowane do 1 mm2 obszaru uszkodzenia. Każda kropka reprezentuje średnią z jednej myszy. Słupki błędu przedstawiają SEM. **** = p &#60; 0.0001. (C) Warstwa RNA po homogenizacji i następującym po niej rozdziele faz za pomocą chloroformu, wykorzystywana do analizy RT-qPCR. (D) Krotność zmian w poziomach ekspresji Pparg i Cepbα, wczesnych genów adipogennych, oraz Plin1 i Adipoq, dwóch markerów dojrzałych adipocytów, w różnych punktach czasowych po uszkodzeniu glicerolem. Każda kropka reprezentuje średnią z jednej myszy. Słupki błędu przedstawiają SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig5v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Aby niezależnie potwierdzić ilość obecnej tkanki tłuszczowej wewnątrzmięśniowej, można oznaczyć poziomy ekspresji genów różnych markerów adipogennych. W tym celu RNA można wyizolować z części tego samego mięśnia TA użytego do immunofluorescencji (patrz kroki powyżej) w różnych punktach czasowych po urazie. Do homogenizacji tkanki zastosowano homogenizator kuleczkowy (bead beater) w połączeniu z tiocyjanianem guanidyny. Po dodaniu chloroformu i odwirowaniu ostrożnie wyekstrahowano górną warstwę zawierającą RNA, a do oczyszczania RNA użyto minikolumienek wirowych (Rysunek 5C). Metoda ta rutynowo pozwala uzyskać wysoką jakość i ilość RNA odpowiednią do wszystkich analiz następczych, takich jak RT-qPCR i RNAseq. W przypadku RT-qPCR określono względne poziomy ekspresji genów adipogennych w stosunku do genów housekeepingowych, a wszelkie zmiany względne oceniono metodą ΔΔCT38. Jak przedstawiono na Rysunku 5D, w porównaniu z nieuszkodzonym mięśniem TA, uraz glicerynowy indukuje ekspresję wczesnych markerów adipogennych, takich jak Pparg i Cebpα, już 3 dni po urazie. Markery dojrzałe, takie jak Adiponectin (Adipoq)&#160;i Perilipin (Plin1), mogą być wykrywalne już 5 dni po urazie glicerynowym.
Genetyczne śledzenie linii adipocytów 
Przedstawiony tutaj protokół barwienia adipocytów można łatwo dostosować w celu włączenia genetycznego śledzenia linii FAP, aby mapować i monitorować ich przekształcanie w adipocyty. Wykazaliśmy na przykład wcześniej, że rekombinację można było indukować via podaniem tamoksyfenu u myszy PdgfrαCreERT2; Rosa26EYFP&#160; na 2 tygodnie przed urazem, co skutecznie usunęło sekwencję stop floxed i trwale aktywowało ekspresję EYFP w FAP (Rysunek 6A). Osiągnęliśmy wysoką wydajność rekombinacji przy zastosowaniu zaprezentowanego tutaj schematu podawania tamoksyfenu, gdzie ~75% FAP PDGFRα+ wykazywało ekspresję EYFP20, co jest zgodne z wynikami raportowanymi przez inne laboratoria27,39,40. Dowodząc, że FAP są rzeczywiście komórkowym pochodzeniem tłuszczu wewnątrzmięśniowego, wykazaliśmy, że większość FAP przekształciła się w adipocyty EYFP+ wykazujące ekspresję PERILIPINY 7 dni po urazie glicerolem (Rysunek 6B).
<img alt="Rycina 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig6v3.jpg" /> 
Rycina 6: Śledzenie linii komórkowych FAP. (A) Schematyczny przegląd organizacji eksperymentalnej. (B) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne wykazujące skuteczną rekombinację i aktywację EYFP (żółty) w komórkach FAP PDGFRα+ (czerwony, groty strzałek) oraz adipocytach PERILIPIN+ (czerwony, gwiazdki). Paski skali: 25 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig6v3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wykrywanie wielu typów komórek 
Niniejszy protokół może być również wykorzystany do wizualizacji komponentu miogennego. Przy użyciu przeciwciał przeciwko PAX7 i MYOD1 można łatwo wykryć odpowiednio komórki macierzyste mięśni (MuSCs) oraz mioblasty 5 dni po uszkodzeniu glicerolem, nawet w przekroju tkanki mięśniowej utrwalonej w PFA (Rysunek 7). Zatem przedstawiony protokół jest wszechstronny i możliwy do dostosowania nie tylko do znakowania i obrazowania adipocytów oraz FAPs, ale także innych typów komórek linii miogennej.
<img alt="Rycina 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig7v2.jpg" /> 
Rycina 7: Barwienie immunofluorescencyjne komórek macierzystych mięśni i mioblastów. (A) Schematyczny przegląd układu eksperymentalnego. (B) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne pokazujące prawidłowe barwienie komórek macierzystych mięśni (MuSC) (żółty, lewo) przeciwciałem PAX7 oraz mioblastów (żółty, prawo) przeciwciałem MYOD1. LAMININA obrysowuje włókna mięśniowe (biały), a jądra komórkowe są w kolorze cyjanowym. Paski skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig7v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wideo dodatkowe 1: Rendering 3D FAPs. Rekonstrukcja trójwymiarowa włókien mięśniowych, FAPs oraz jąder komórkowych, odpowiednio barwionych na PHALLOIDIN (szary), PDGFRα (zielony) i DAPI (niebieski), 21 dni po urazie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/FAPs.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
Wideo uzupełniające 2: Rendering 3D tłuszczu wewnątrzmięśniowego. Rendering wolumetryczny pęczków włókien mięśniowych (szary, PHALLOIDIN) oraz tłuszczu wewnątrzmięśniowego (czerwony, PERILIPIN), który zastąpił włókno mięśniowe 21 dni po uszkodzeniu glicerolem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/FAT.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>

Zastąpienie zdrowej tkanki mięśniowej tłuszczem śródmięśniowym jest charakterystyczną cechą ludzkich chorób i schorzeń. Protokół ten określa, jak wizualizować, obrazować i określać ilościowo śródmięśniową tkankę tłuszczową, umożliwiając rygorystyczne badanie mechanizmów leżących u podstaw tworzenia się śródmięśniowej tkanki tłuszczowej.

Przewodnik po badaniu śródmięśniowego tworzenia się tłuszczu i jego komórkowego pochodzenia w mięśniach szkieletowych

Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) are mesenchymal stromal cells that play a crucial role during skeletal muscle homeostasis and regeneration. FAPs build ...

Jedną z istotnych barier w badaniu śródmięśniowej tkanki tłuszczowej, cechy charakterystycznej sarkopenii i chorób nerwowo-mięśniowych, jest skuteczne zachowanie i późniejsza wizualizacja adipocytów, zwłaszcza w zamrożonych skrawkach tkanek. Protokół zachowuje morfologię adipocytów i sekcje mięśni szkieletowych w celu solidnej, rygorystycznej i powtarzalnej wizualizacji i kwantyfikacji śródmięśniowej tkanki tłuszczowej. Nasz potok analiz zapewnia ramy do walidacji nowatorskich interwencji zapobiegających tworzeniu się tłuszczu w chorobach takich jak dystrofia mięśniowa Duchenne'a.Na początek oczyść nogę, która ma być wstrzyknięta, świeżą chusteczką nasączoną alkoholem w celu dezynfekcji. Pobrać od 30 do 50 mikrolitrów 50% glicerolu do strzykawki insulinowej. Delikatnie rozczesz włosy na goleni, aby odsłonić położenie TA. Po zlokalizowaniu TA wbić igłę w TA dystalnie w pobliżu kostki.Całkowicie włóż igłę do mięśnia i powoli wstrzyknij glicerol, stopniowo wycofując igłę, co pomaga uszkodzić większość mięśnia. Obficie spryskaj wszystkie obszary myszy, które mają zostać strzyżone, 70% etanolem, aby zapobiec przedostawaniu się włosów do sekcji i narzędzi. Użyj nożyczek, aby przeciąć skórę wokół górnej części nogi w pobliżu miednicy.Delikatnie pociągnij skórę nogi od góry do kostki. Najpierw usuń zewnętrzną warstwę tkanki łącznej za pomocą pęsety z ostrą końcówką przed pobraniem TA. Wsuń pęsetę pod TA od dołu mięśnia, zaczynając od dystalnego ścięgna i delikatnie pociągnij w górę w kierunku kolana. Zatrzymaj się na końcu mięśnia.Nie przekraczaj oporu odczuwalnego w dolnej części kolana. Jeśli przed dotarciem do dolnej części kolana występuje znaczny opór, zatrzymaj się i kontynuuj usuwanie resztek tkanki łącznej. Gdy TA zostanie częściowo podniesiona z nogi za pomocą pęsety, użyj tego samego ruchu skalpelem, aby przeciąć połączenie TA z dolną częścią kolana.Wypatrosz ścięgno w kostce nożyczkami, aby całkowicie usunąć TA. Dotykaj tylko mięśnia przy ścięgnie, aby uniknąć uszkodzenia włókien. Przetnij jedną trzecią TA na końcu, naprzeciwko ścięgna. Umieść go w probówce mikrowirówki i zamroź błyskawicznie, wrzucając do ciekłego azotu.Zanurz pozostałe dwie trzecie tkanki w znakowanej studzience z 4% PFA do histologii. Pamiętaj, aby śledzić, kiedy pierwsza i ostatnia tkanka została umieszczona w utrwalaczu. Umieść na nutatorze na dwie do dwóch i pół godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po utrwaleniu usuń PFA ze studzienek. Opłucz chusteczki zimnym jednym X PBS dwa do trzech razy, a następnie umyj dwa do trzech razy zimnym 1X PBS przez pięć minut na pranie. Usuń PBS z dołków i dodaj tyle 30% sacharozy do 1X PBS, aby tkanka mogła unosić się na wodzie.Umieść na nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc. Włącz mikroskop i uruchom oprogramowanie do obrazowania. Zabezpiecz zjeżdżalnię na scenie.Użyj dowolnego kanału, aby zidentyfikować obszar, który ma zostać zobrazowany. W oprogramowaniu do obrazowania dostosuj wzmocnienie i czas ekspozycji dla każdego kanału. Zrób zdjęcia całej tkanki w każdym kanale i połącz poszczególne płytki, aby utworzyć kompozyt o pełnym przekroju TA.Przed rozpoczęciem podgrzej wodę wolną od RNaz do 45 stopni Celsjusza i przygotuj świeży 70% etanol. Dodać 1000 mikrolitrów tiocyjanianu guanidyny do każdej probówki zawierającej próbkę. Ważne jest, aby używane były rurki zatwierdzone przez Bead Bicker.Dodaj trzy średnie koraliki lub jeden duży i jeden mały koralik do każdej tuby. Homogenizuj tkankę z częstotliwością 50 Hz przez dwie do czterech minut za pomocą ubijaka do kulek. W zależności od rodzaju tkanki i wielkości próbki może to potrwać do 10 minut.Dodaj 200 mikrolitrów chloroformu. Potrząsać próbkami przez 15 sekund. Inkubować przez dwie do trzech minut w temperaturze pokojowej.Wirować przez 15 minut po 12 000 razy G. Odpipetować 350 mikrolitrów klarownego supernatantu i dodać do nowej probówki mikrowirówki zawierającej 350 mikrolitrów 70% etanolu. Należy uważać, aby nie zassać niższych warstw białka i/lub DNA. Przenieś do 700 mikrolitrów tej mieszaniny do mini kolumny wirowej umieszczonej w dwumililitrowej probówce zbiorczej.Kontynuuj izolację RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Elutę za pomocą 30 do 50 mikrolitrów wody wolnej od RNaz, w zależności od oczekiwanej wydajności. Trzymaj RNA na lodzie i zmierz wydajność za pomocą spektrofotometru.Utrzymuj RNA przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Użyj do jednego mikrograma RNA do syntezy cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Po zakończeniu biegu dodaj 80 mikrolitrów wody wolnej od RNaz.Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Używając formatu 384 dołków, dodaj jeden mikrolitr startera na dno każdej studzienki. Swobodnie schnące podkłady skutkują ściślejszymi replikami technicznymi.Pozostawić pod przykryciem, aż podkłady całkowicie wyparują. Przygotuj reakcje próbek z czterema do ośmiu powtórzeń technicznych. Po zakończeniu serii PCR znormalizuj surowe wartości progowe cyklu do poziomów genów porządkowych i określ zmiany fałdowania, obliczając delta-delta Ct. Perilipina i dodatnie adipocyty z nieutrwalonych TA znacznie zmieniły morfologię w porównaniu ze stałymi sekcjami, co sprawia, że ich identyfikacja, wizualizacja i późniejsza kwantyfikacja są znacznie trudniejsze i potencjalnie niedokładne.Natomiast wiązanie PFA zachowuje morfologię adipocytów, co pozwala na dokładne wykrycie tłuszczu śródmięśniowego. W porównaniu z nieuszkodzonym mięśniem TA, uszkodzenie glicerolu indukuje ekspresję wczesnych markerów adipogennych, takich jak PPAR gamma i CEBP alfa już trzy dni po urazie. Dojrzałe markery, takie jak adiponektyna i perylipidina, można wykryć już po pięciu dniach od uszkodzenia gliceryny.Korzystając ze śledzenia linii genetycznej, większość receptorów alfa FAP PDGF wyraża marker linii EYFP. Siedem dni po uszkodzeniu glicerolu, EYFP dodatnie FAP przekształciły się w EYFP dodatnie adipocyty wyrażające perylipinę, co pokazuje, że FAP są rzeczywiście komórkowym pochodzeniem tłuszczu śródmięśniowego. Protokół można również dostosować do wizualizacji komory miogennej.Stosując przeciwciała przeciwko PAX7 i MYOD1, odpowiednio markery komórek macierzystych mięśni i mioblastów można łatwo wykryć pięć dni po uszkodzeniu glicerolu, nawet w skrawkach tkanki mięśniowej z utrwalonymi PFA. Protokół ten można również dostosować do wizualizacji i ilościowego oznaczania adipocytów i innych dorosłych tkanek. Ponadto nasza technika konserwacji tkanek jest kompatybilna z różnorodnością różnych technik stojących.

a-guide-to-examining-intramuscular-fat-formation-its-cellular-origin

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Ze względu na drastyczny i negatywny związek między otyłością a innymi chorobami współistniejącymi, uzasadnione są badania nad rolą tłuszczu w chorobach i ogólnym zdrowiu. Przedstawiamy protokół izolacji i wycinania magazynów tłuszczowych pozwalający na badanie tkanki tłuszczowej metodami in situ i in vitro.

Lokalizacja, identyfikacja i wycięcie mysich magazynów tłuszczu

Adipocyty istnieją w oddzielnych magazynach i pełnią różne role w swoich unikalnych mikrośrodowiskach. W miarę odkrywania regionalnych różnic w charakterze i funkcji adipocytów, ustandaryzowana identyfikacja i izolacja magazynów ma kluczowe znaczenie dla postępu w tej dziedzinie. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół wycinki różnych magazynów tłuszczu myszy.

Identyfikacja i sekcja różnorodnych mysich magazynów tłuszczowych

Coraz więcej dowodów wskazuje, że nadmierna infiltracja lipidów wewnątrz mięśni szkieletowych prowadzi do lipotoksyczności i cukrzycy. Tutaj przedstawiamy kompletny protokół, w tym przetwarzanie tkanek, barwienie za pomocą Bodipy, akwizycję obrazu i analizę, w celu ilościowego określenia wielkości, gęstości i subkomórkowego rozkładu kropelek lipidów w sposób specyficzny dla rodzaju włókna.

Analiza zawartości kropelek lipidów w mięśniach szkieletowych pod kątem rodzaju włókien i subkomórek

Preadipocyty są izolowane z frakcji naczyniowej zrębu międzyłopatkowej brązowej tkanki tłuszczowej od nowonarodzonych myszy i różnicowane w komórki, które gromadzą kropelki lipidów, wyrażają markery molekularne i pokazują morfologię mitochondriów dojrzałych brązowych adipocytów. Komórki te są dalej analizowane za pomocą immunofluorescencji i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Różnicowanie i obrazowanie brązowych adipocytów z frakcji zrębowej naczyniowej tkanki tłuszczowej śródłopatkowej od nowonarodzonych myszy

Niniejsze badanie opisuje oparte na decelularyzacji metodologie wizualizacji i ilościowego określania wewnątrzmięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT) poprzez nienaruszoną objętość mięśni, a także ilościowe określanie metryk poszczególnych adipocytów składających się na IMAT.

Kwantyfikacja nacieku tkanki tłuszczowej mięśni szkieletowych na podstawie decelularyzacji

Zbadaliśmy tkankę mięśni szkieletowych u buhajów Bos indicus i mieszańców, aby wyjaśnić różnice w cechach jakości mięsa. Stwierdzono, że siła tnąca Warnera-Bratzlera (WBSF) waha się od 4,7 kg do 4,2 kg. Izoformy łańcuchów ciężkich miozyny ujawniły różnice między zwierzętami, a wskaźnik fragmentacji miofibryli dostarczył dalszych informacji na temat zmienności tkliwości (WBSF).

Badanie mięśnia Longissimus: odkrywanie jego korelacji z jakością mięsa u buhajów Bos indicus i mieszańców

Biologia międzymięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT) jest w dużej mierze niezbadana ze względu na ograniczoną dostępność tkanek ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji jąder i przygotowania biblioteki zamrożonego ludzkiego IMAT do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder w celu identyfikacji składu komórkowego tego unikalnego magazynu tłuszczu.

Izolacja jąder z ludzkiej międzymięśniowej tkanki tłuszczowej i sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder w dół

W tym badaniu opisujemy prostą metodę przeprowadzania analizy Evans Blue Dye (EBD) na larwach danio pręgowanego.  Technika ta jest potężnym narzędziem do charakteryzowania integralności mięśni szkieletowych i wyznaczania modeli dystrofii mięśniowej danio pręgowanego, a także jest cenną metodą opracowywania nowych metod terapeutycznych.

Analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa

Danio pręgowany to doskonały model do badania funkcji mięśni i chorób. Podczas wczesnej embriogenezy danio pręgowany rozpoczyna regularne skurcze mięśni, powodując rytmiczne zachowanie podczas pływania, które zmienia się, gdy mięsień jest zakłócony. W tym miejscu opisujemy reakcję wywołaną dotykiem i test lokomocji, aby zbadać wydajność pływania jako miarę funkcji mięśni.

Wykorzystanie reakcji wywołanej dotykiem i testów lokomocji do oceny wydajności i funkcji mięśni u danio pręgowanego

Poznaj metodę wizualizacji i ilościowego oznaczania tłuszczu śródmięśniowego w tkance mięśniowej szkieletowej. Technika ta zachowuje morfologię adipocytów, umożliwiając badanie mechanizmów tworzenia się tłuszczu w chorobach mięśniowych.

Przewodnik po badaniu śródmięśniowego tworzenia się tłuszczu i jego komórkowego pochodzenia w mięśniach szkieletowych

Przeglądaj więcej filmów