Model bólu pleców myszy wywołany aktywatorem plazminogenu typu urokinazy
1 września 2023
Metody prostej, szybkiej indukcji modelu bólu pleców u myszy są tutaj dostępne za pomocą iniekcji aktywatora plazminogenu w moczu do wnętrza więzadła.
Protokół ten przedstawia nieinwazyjną metodę wywoływania przewlekłego bólu pleców u myszy przez okres do 10 tygodni, którą można wykonać szybko i niezawodnie przy minimalnym treningu. Najtrudniejszym aspektem tej techniki jest rozpoznanie, jak czuje się wstrzykiwanie więzadła w porównaniu z wstrzykiwaniem mięśni. Odczuwanie oporu przy kontakcie wskazuje na wstrzyknięcie więzadła.
Brak oporu oznacza, że igła może znajdować się w mięśniach lub jamie brzusznej. Aby rozpocząć, weź sterylną płaską powierzchnię, aby umieścić mysz. Następnie umieść stację odzyskiwania poduszki grzewczej obok stanowiska do operacji, aby natychmiast przenieść myszy po wstrzyknięciu.
Następnie przygotuj urokinazę i strzykawkę Hamiltona. Narysuj roztwór wcześniej, aby zminimalizować czas, jaki mysz spędza pod narkozą. Po znieczuleniu myszy dwoma palcami zlokalizuj odcinki kręgosłupa lędźwiowego w L2 i L3 poniżej klatki piersiowej i sprawdź miejsce wstrzyknięcia.
Umieścić końcówkę strzykawki Hamiltona obok kręgosłupa. Umieścić strzykawkę pod kątem około 45 stopni w więzadle bezpośrednio przylegającym do kości. Wprowadzić końcówkę igły delikatnie, ale stanowczo, do więzadła i wstrzykiwać powoli, aż wszystkie pięć mikrolitrów zostanie wstrzykniętych.
Delikatnie i powoli wyjmować igłę. Następnie umieść mysz w stacji odzysku ciepła, aż się obudzi i stanie się mobilna. Sprawdzaj myszy przez godzinę po zabiegu, aby upewnić się, że wszystkie normalne funkcje motoryczne są kontynuowane.
Po zabiegu należy codziennie przez tydzień sprawdzać wagę i miejsce wstrzyknięcia myszy, aby zapobiec infekcji lub powikłaniom. Przed badaniem przenieś każde zwierzę do osobnej przezroczystej kabiny na stole testowym z ekranem. Następnie stymuluj poduszkę stopy za pomocą filamentu Von Freya 3,61, który wywołuje cztery gramy siły.
Wycofanie stopy od trzech do pięciu bodźców jest uważane za pozytywną reakcję. Teraz przyłóż następny słabszy filament z serii, aż zwierzę przestanie reagować na stymulację mechaniczną. Używaj wyższego żarnika, aż zostanie wywołana reakcja, a następnie przełącz się z powrotem na niższy żarnik.
Korzystając z algorytmu dopasowania krzywej, oblicz mechaniczny próg wycofania, który jest minimalną siłą potrzebną do wywołania reakcji w 50% przypadków. Aby wykonać test Hargreavesa, umieść myszy w boksach na szklanej powierzchni ogrzewanej od dołu przez emiter podczerwieni. Zmierz czas od zastosowania bodźca światłem podczerwonym na tylnej łapie myszy do wycofania się jako opóźnienie stopy.
W teście zimnej płyty umieść myszy na aparacie z zimną płytą schłodzonym do minus dziewięciu stopni Celsjusza. Zapisz czas potrzebny myszy na podniesienie stopy po umieszczeniu na aparacie jako opóźnienie do wycofania stopy. Aby wykonać test lęku, umieść każde zwierzę w pudełku testowym preferencji miejsca z przejściem między dwiema komorami.
Jedna komora aparatu powinna być jasno oświetlona, podczas gdy druga strona powinna pozostać ciemna. Za pomocą komputera monitoruj czasy przebywania zwierzęcia w świetle i ciemności podczas 10-minutowego testu. Następnie umieść modelowe gryzonie lub naiwne zwierzęta w labiryncie zerowym lub użyj dwukomorowego testu preferencji jasnego lub ciemnego miejsca.
Oceń czas spędzony w zamkniętych i otwartych obszarach labiryntu za pomocą stopera. W teście depresji rozpryskującej sacharozę spryskaj 10 do 30% roztworu sacharozy na kod grzbietowy i oceń częstotliwość, czas trwania i opóźnienie pielęgnacji przez 10 minut. Aby przeprowadzić testy nowych obiektów, aklimatyzuj myszy pojedynczo w przezroczystej plastikowej klatce z otwartą górą przez godzinę.
Dodaj dwie identyczne miniaturowe figurki do przeciwległych rogów klatki na pięć minut. Zaaklimatyzuj zwierzęta w dniu testów przez godzinę i umieść dwie identyczne minifigurki w tych samych pozycjach klatki na pięć minut, zanim włożysz je z powrotem do klatki domowej. Następnie zastąp jedną z oryginalnych figurek wyraźnie innym nowym obiektem.
Po czterech godzinach umieść myszy z powrotem w klatce testowej i zapisz czas spędzony na eksploracji obiektów. Aby ocenić funkcje motoryczne, zbuduj tunel z rurki po ręczniku papierowym przeciętej wzdłuż na jednej krawędzi. Rozłóż tunel na czystym kartce papieru do drukarki.
Trzymaj myszy delikatnie, aż się uspokoją. Nałóż nietoksyczny atrament indyjski na łapy myszy, umieszczając je w dołku na atrament, podkładce do stemplowania lub za pomocą bawełnianego wacika. Wypuść myszy przy wejściu do tunelu.
Pozwól im przebiec przez tunel i złap ich na końcu. Oceniaj odciski łap na podstawie długości kroku, szerokości kroku i rozstawu palców. Testy nadwrażliwości mechanicznej i termicznej wykazały, że myszy z przewlekłym bólem pleców miały znacznie zwiększoną wrażliwość mechaniczną, na ciepło i zimno w porównaniu z naiwnymi kontrolami.
Analiza lęku wykazała, że całkowity czas spędzony w jasnej komorze jasnego i ciemnego pudełka oraz liczba wydarzeń związanych z odchowywaniem były znacznie niższe u myszy z przewlekłym bólem pleców, co wskazuje na niepokój. Podczas testu rozprysku sacharozy myszy z przewlekłym bólem pleców wykazywały krótszy czas pielęgnacji i mniejszą liczbę zabiegów pielęgnacyjnych. Jednak czas przed rozpoczęciem pielęgnacji został znacznie wydłużony.
Długość kroku między myszami z przewlekłym bólem pleców a myszami nieleczonymi była znacząco różna. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas wykonywania tej procedury, jest to, że celujesz w więzadła wokół kręgosłupa, a nie w mięśnie. Model przewlekłego bólu pleców stanowi wiarygodne narzędzie do oceny różnych nowatorskich badań, farmakologii i innych potencjalnych terapii.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje nieinwazyjną metodę indukowania chronicznego bólu pleców u myszy przez okres do 10 tygodni, którą można przeprowadzić szybko i niezawodnie przy minimalnym przeszkoleniu. Technika ta koncentruje się na rozpoznawaniu różnicy między wstrzykiwaniem w więzadło a wstrzykiwaniem w mięsień.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Modele zwierzęce
- Badania nad bólem
Wprowadzenie
- Przewlekły ból pleców stanowi istotny problem zdrowotny.
- Modele zwierzęce są niezbędne do badania mechanizmów bólowych.
- Do celów badawczych potrzebne są niezawodne metody indukowania bólu u myszy.
- Niniejszy protokół ma na celu dostarczenie badaczom prostego podejścia w tym zakresie.
Cel badania
- Opracowanie szybkiej metody wywoływania bólu pleców u myszy.
- Ułatwienie badań nad mechanizmami bólu przewlekłego.
- Zminimalizowanie zakresu szkoleń wymaganych dla badaczy.
Zastosowane metody
- Wstrzyknięcie wewnątrzwięzadłowe aktywatora plazminogenu z mocznika.
- Użycie sterylnej płaskiej powierzchni do umieszczenia myszy.
- Stacja regeneracyjna z podgrzewaną matą do opieki po wstrzyknięciu.
- Technika identyfikacji właściwego miejsca wstrzyknięcia poprzez odczuwalny opór.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na niezawodne indukowanie przewlekłego bólu pleców u myszy.
- Pomyślna implementacja wymaga minimalnego przeszkolenia.
- Technikę iniekcji można opanować poprzez praktykę.
- Wyniki można obserwować przez okres do 10 tygodni.
Wnioski
- Niniejszy protokół przedstawia prostą metodę indukcji bólu.
- Wspiera on prowadzone badania nad mechanizmami bólu chronicznego.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w różnych zastosowaniach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Uporczywy ból dolnego odcinka kręgosłupa pozostaje głównym wyzwaniem translacyjnym w terapii bólu, przy ograniczonej liczbie modeli przedklinicznych, które dokładnie odzwierciedlałyby przewlekłość oraz towarzyszące temu zaburzenia behawioralne. Model mysi indukowany aktywatorem plazminogenu typu urokinazy umożliwia szybką i powtarzalną indukcję długotrwałego bólu pleców, wspierając ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz walidację punktów uchwycenia dla nowych kandydatów na leki przeciwbólowe. Model ten rozwiązuje kluczowy problem w procesie odkrywania leków przeciwbólowych, zapewniając solidną platformę do ilościowej, wielofunkcyjnej oceny hipotez terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrycia i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów szlaków bólowych oraz funkcjonalną walidację celów terapeutycznych w kontekście istotnym dla przebiegu choroby.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez modelowanie uporczywego bólu i powiązanych z nim fenotypów behawioralnych.
- Zwiększa pewność predykcyjną w wyborze celu dzięki mierzalnym i powtarzalnym punktom końcowym.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany system in vivo do przesiewania związków przeciwbólowych w badaniach fenotypów bólu przewlekłego.
- Standaryzuje testy behawioralne w kierunku nadwrażliwości mechanicznej, termicznej i zimnowrażliwości, a także miary lękowe i depresyjne.
- Umożliwia uzyskanie powtarzalnych, ilościowych wyników do oceny związków i ponownego wykorzystania platformy testowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgodność z punktami końcowymi istotnymi dla przebiegu choroby, w tym z zaburzeniami chodu i współwystępującymi zaburzeniami afektywnymi, w celu opracowania translacyjnych biomarkerów.
- Wsparcie ciągłości procesu od wczesnego etapu odkrywania po walidację przedkliniczną poprzez modelowanie trwałych stanów bólowych.
- Zapewnienie kryteriów postępu dostosowanych do ryzyka dla kandydackich terapii ukierunkowanych na ból przewlekły.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten integruje się z kontinuum od odkrycia do fazy przedklinicznej, łącząc wczesne badania mechanistyczne i identyfikację związków wiodących z translacyjnie istotnymi wynikami behawioralnymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków mechanizmów bólu z wykorzystaniem mierzalnych punktów końcowych behawioralnych.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, powtarzalnych wyników do przesiewania związków i analiz porównawczych.
- Analityka: Zapewnia progi wycofania mechanicznego, pomiary latencji oraz oceny behawioralne do rzetelnej analizy statystycznej.
- Badania translacyjne: Modeluje klinicznie istotny ból i choroby współistniejące, wspierając dopasowanie biomarkerów i ciągłość przedkliniczną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zestandaryzowaną, skalowalną platformę do wielokrotnego zastosowania w programach badawczych nad bólem.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych w leczeniu bólu.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowaną, powtarzalną i skalowalną indukcję fenotypów bólu uporczywego.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczenie solidnych danych przedklinicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów na leki przeciwbólowe.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymagana jest biegłość w precyzyjnym wykonywaniu iniekcji in vivo oraz przeprowadzaniu testów behawioralnych.
- Wymagany jest dostęp do specjalistycznej aparatury do testów behawioralnych i sensorycznych.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów badawczych i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest adaptowalna dla różnych szczepów myszy, lecz może wymagać optymalizacji dla konkretnych tła genetycznych.
- Ograniczenia obejmują konieczność stosowania starannej techniki iniekcji w celu uniknięcia efektów poza celowych.
