Izolacja i identyfikacja komórek śródbłonka naczyń krwionośnych z różnych magazynów tłuszczu do dalszych zastosowań

Protokół ten pozwoli badaczowi na przeanalizowanie interesującej go tętnicy i wyizolowanie komórek naczyniowych w celu wykonania szerokiego zakresu testów funkcjonalnych. Badacz może badać różne łożyska naczyniowe i typy komórek, aby poszerzyć wiedzę na temat biologii komórek naczyniowych i mechanizmu dysfunkcji naczyń krwionośnych. Metoda ta jest najbardziej odpowiednia dla naukowców zajmujących się podstawową biologią komórek naczyniowych, a także dysfunkcją komórek naczyniowych w zwierzęcych modelach choroby.

Należy zwrócić szczególną uwagę na optymalizację protokołu trawienia, zwłaszcza tam, gdzie interesujące nas łożyska naczyniowe różnią się od przedstawionych tutaj. Na początek zabezpiecz mysz za pomocą szpilek do rozwarstwiania i spryskaj powierzchnię brzuszną 70% etanolem. Użyj kleszczy, aby podnieść skórę tuż nad genitaliami i wykonaj małe nacięcie o długości około dwóch milimetrów w skórze.

Włóż końcówkę nożyczek w miejsce nacięcia i wykonaj nacięcie linii środkowej o długości od czterech do pięciu centymetrów, zaczynając od początkowego nacięcia i rozcinając czaszkę do podstawy mostka. Wykonaj nacięcie o długości jednego centymetra rozciągające się bocznie od linii środkowej bezpośrednio poniżej kończyny przedniej. Wykonaj ukośne jednocentymetrowe nacięcie między tylną kończyną a genitaliami.

Wykonaj małe nacięcia wzdłuż nacięć skóry w linii środkowej, aby usunąć powiązaną tkankę łączną i odsłonić podskórny magazyn tłuszczu. Zidentyfikuj podskórną tkankę tłuszczową w kształcie litery C oraz tętnicę lub żyłę biegnącą prostopadle do jamy brzusznej. Zacznij od dołu kształtu litery C w pobliżu narządów płciowych i delikatnie chwyć tkankę tłuszczową, aby odsłonić tkankę łączną.

Wykonaj małe nacięcia w tkance łącznej, aby oddzielić tłuszcz od skóry i uniknąć naruszenia odsłoniętego układu krwionośnego. Kontynuuj preparowanie tkanki łącznej, aż podskórna tkanka tłuszczowa będzie mogła zostać usunięta w stanie nienaruszonym. Ostrożnie oddziel odsłoniętą tętnicę od otaczającej tkanki łącznej.

Wyizolowaną podskórną tkankę tłuszczową należy przechowywać w buforze HEPES na lodzie. Powtórzyć sekcję dla pozostałego tylnego podskórnego magazynu tłuszczu. Aby wyizolować krezkowy magazyn tłuszczowy, użyj kleszczy Graefe, aby podnieść cienką ścianę jamy otrzewnej powyżej pęcherza moczowego i wykonać małe nacięcie za pomocą prostych nożyczek.

Powoli podnieś ścianę jamy otrzewnej i włóż proste nożyczki do tęczówki w miejsce nacięcia. Wykonaj nacięcie od czterech do pięciu centymetrów od pęcherza moczowego do mostka. Następnie wykonaj dwa poziome nacięcia o długości jednego centymetra prostymi nożyczkami do tęczówki rozciągającymi się bocznie od linii środkowej do bezpośrednio nad kończyną tylną i poniżej kończyny przedniej.

Użyj kleszczy Graefe, aby odkleić mięśnie brzucha i odsłonić wnętrzności otrzewnej. Użyj pary kleszczy numer pięć, aby podnieść jelita z jamy trzewnej, aby odsłonić tkankę tłuszczową krezkową. Użyj zakrzywionych nożyczek i kleszczy numer pięć, aby oddzielić tłuszcz wzdłuż okrężnicy, zaczynając od jelita ślepego do miejsca, w którym okrężnica schodzi z pola widzenia.

Następnie należy oddzielić tkankę tłuszczową wzdłuż jelita cienkiego do trzustki. Usuń niewielką część trzustki, aby całkowicie odizolować tkankę tłuszczową krezkową. Przechowywać wyizolowaną tkankę tłuszczową krezkową w buforze HEPES na lodzie.

Aby wyizolować tętnice, najpierw przenieś tkankę tłuszczową do naczynia preparacyjnego zawierającego 10 mililitrów zimnego buforu HEPES. Pod mikroskopem stereoskopowym ustaw podskórną tkankę tłuszczową tak, aby odsłonić parę żył tętniczych. Ustaw trzewną tkankę tłuszczową tak, aby odsłonić kształt kalafiora i odpowiednią parę żył tętniczych.

Użyj kleszczyków numer 55, aby ostrożnie usunąć tkankę tłuszczową miąższową z tętnicy. Usuwaj małe kawałki tłuszczu na raz, nie uszkadzając interesującego Cię układu naczyniowego. Kontynuuj, aż tętnice zostaną całkowicie pozbawione miąższowej tkanki tłuszczowej.

Użyj kleszczy numer pięć, aby przenieść oczyszczone tętnice do nowej rurki ze świeżym buforem HEPES i trzymaj na lodzie, aż będą gotowe do trawienia. Najpierw dodaj po jednym miligramie dypazy i elastazy do dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Dodaj dwa mililitry roztworu dysocjacyjnego, odwiruj i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż do całkowitego rozpuszczenia.

Użyj kleszczyków numer pięć, aby przenieść oczyszczone tętnice do odpowiednich probówek z próbkami. Inkubować probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę z delikatnym mieszaniem przez odwrócenie co 10 do 15 minut. W międzyczasie dodaj jeden miligram kolagenazy typu jeden na próbkę do nowych probówek.

Po inkubacji pozwól tętnicom osiąść na dnie probówki i przenieś 500 mikrolitrów buforu od góry do probówek zawierających kolagenazę. Odwirować i zwrócić ten roztwór do odpowiednich probówek z próbkami. Próbki inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Upewnij się, że tętnice rozdzielą się na części po potrząśnięciu probówką z próbką. Za pomocą szklanej pipety energicznie rozcieraj strawioną tkankę od 10 do 15 razy, aby mechanicznie zdysocjować komórki. Przepuścić strawione próbki przez sitko do komórek o średnicy 70 mikronów lub sitko do rurki do cytometrii przepływowej w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.

Odwirować zawiesinę jednokomórkową i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze PBS z 5% BSA na 30 minut. Dodaj jeden mikrolitr barwnika żywotności komórek i inkubuj w ciemności przez 30 minut.

Odwirować zawiesinę komórkową i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach PBS z 1% BSA. Dodać przeciwciała pierwszorzędowe sprzężone z CD31 i CD45 i inkubować na kołysce w lodówce przez 15 minut. Umyj komórki, dodając jeden mililitr PBS z 1% BSA bezpośrednio do zawiesiny komórek.

Odwirować zawiesinę komórkową i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach 1% formaldehydu z 0,1% BSA. Przykryj probówki folią aluminiową i przechowuj w lodówce, aż będą gotowe do cytometrii przepływowej. Preparaty komórkowe uzyskane z trawionych podskórnych tętnic tłuszczowych wykorzystano do identyfikacji populacji komórek śródbłonka za pomocą cytometrii przepływowej.

Komórki CD31 dodatnie CD45 zidentyfikowano jako komórki śródbłonka. Barwienie żywotności komórek pozwoliło na identyfikację tylko tych żywotnych komórek, które przetrwały protokół izolacji i trawienia przed utrwaleniem. Aby zidentyfikować różnice w ekspresji białek błonowych i komórkach śródbłonka z odrębnego układu naczyniowego magazynu tłuszczu, izolowane komórki badano pod kątem translokazy kwasów tłuszczowych CD36.

CD36-dodatnie komórki śródbłonka zidentyfikowano w tkance tłuszczowej podskórnej i krezkowej. Kwantyfikacja ekspresji CD36 oraz komórek śródbłonka podskórnego i krezkowego wykazała, że zarówno odsetek komórek śródbłonka wykazujących ekspresję CD36, jak i intensywność ekspresji CD36 były większe w podskórnych komórkach śródbłonka. Bardzo ważne jest, aby dokładnie przeanalizować, zidentyfikować i oczyścić tętnice.

Co najważniejsze, protokół trawienia powinien zapewnić wystarczającą wydajność żywych komórek do dalszych zastosowań. Po tej procedurze wyizolowana populacja komórek może być wykorzystana do zastosowań, w tym między innymi do elektrofizjologii, profilowania molekularnego i generowania pierwotnej linii komórkowej do badań przesiewowych leków in vitro.