Name: Rejestrowanie konformacji chromosomów w różnych skalach długości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Poznaj protokół Hi-C 3.0 do analizy interakcji chromatyny z użyciem formaldehydu i DSG. Ta metoda umożliwia wykrywanie struktury chromosomów z niskim tłem i wysoką rozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Denisowi Lafontaine'owi za opracowanie protokołu i Sergeyowi Venevowi za pomoc bioinformatyczną. Praca ta została wsparta grantem z National Institutes of Health Common Fund 4D Nucleome Program dla J.D. (U54-DK107980, UM1-HG011536). J.D. jest badaczem w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa.
Ten artykuł podlega polityce HHMI dotyczącej otwartego dostępu do publikacji. Szefowie laboratoriów HHMI wcześniej udzielali niewyłącznej licencji CC BY 4.0 dla publiczności i licencji podlegającej sublicencjonowaniu dla HHMI w swoich artykułach badawczych. Zgodnie z tymi licencjami, zaakceptowany przez autora manuskrypt tego artykułu może być bezpłatnie udostępniony na licencji CC BY 4.0 natychmiast po publikacji.

<ol><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li>
<li>Simonis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+organization+of+active+and+inactive+chromatin+domains+uncovered+by+chromosome+conformation+capture-on-chip+%284C%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C).</a> Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).</li>
<li>Dostie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Conformation+Capture+Carbon+Copy+%285C%29%3A+a+massively+parallel+solution+for+mapping+interactions+between+genomic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements.</a> Genome Research. 16 (10), 1299-1309 (2006).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li>
<li>Stadhouders, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+chromosome+conformation+capture+sequencing+for+rapid+genome-scale+high-resolution+detection+of+long-range+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions.</a> Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).</li>
<li>Kalhor, R., Tjong, H., Jayathilaka, N., Alber, F., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+architectures+revealed+by+tethered+chromosome+conformation+capture+and+population-based+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome architectures revealed by tethered chromosome conformation capture and population-based modeling.</a> Nature Biotechnology. 30 (1), 90-98 (2012).</li>
<li>Hsieh, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+nucleosome+resolution+chromosome+folding+in+yeast+by+micro-C%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by micro-C.</a> Cell. 162 (1), 108-119 (2015).</li>
<li>Hsieh, T. -H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-C+XL%3A+assaying+chromosome+conformation+from+the+nucleosome+to+the+entire+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Micro-C XL: assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome.</a> Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).</li>
<li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+decade+of+3C+technologies%3A+detailed+insights+into+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li>
<li>Rodley, C. D., Bertels, F., Jones, B., O’Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+identification+of+yeast+chromosome+interactions+using+Genome+conformation+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Global identification of yeast chromosome interactions using Genome conformation capture.</a> Fungal Genetics and Biology. 46 (11), 879-886 (2009).</li>
<li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li>
<li>Alipour, E., Marko, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+domain+structures+by+DNA-loop-extruding+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Self-organization of domain structures by DNA-loop-extruding enzymes.</a> Nucleic Acids Research. 40 (22), 11202-11212 (2012).</li>
<li>Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hitchhiker%E2%80%99s+guide+to+Hi-C+analysis%3A+Practical+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The Hitchhiker’s guide to Hi-C analysis: Practical guidelines.</a> Methods. 72, 65-75 (2015).</li>
<li>Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C+2.0%3A+An+optimized+Hi-C+procedure+for+high-resolution+genome-wide+mapping+of+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation.</a> Methods. 123, 56-65 (2017).</li>
<li>Golloshi, R., Sanders, J. T., McCord, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iteratively+improving+Hi-C+experiments+one+step+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Iteratively improving Hi-C experiments one step at a time.</a> Methods. 142, 47-58 (2018).</li>
<li>Darrow, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+DXZ4+on+the+human+inactive+X+chromosome+alters+higher-order+genome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Deletion of DXZ4 on the human inactive X chromosome alters higher-order genome architecture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (31), 4504-4512 (2016).</li>
<li>Akgol Oksuz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+chromosome+conformation+capture+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays.</a> Nature Methods. 18 (9), 1046-1055 (2021).</li>
<li>Ghuryeid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+Hi-C+links+with+assembly+graphs+for+chromosome-scale+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrating Hi-C links with assembly graphs for chromosome-scale assembly.</a> PLoS Computational Biology. 15 (8), 1007273(2019).</li>
<li>Gu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-mapping+of+nuclear+compartments+using+ultra-deep+Hi-C+shows+that+active+promoter+and+enhancer+elements+localize+in+the+active+A+compartment+even+when+adjacent+sequences+do+not%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Fine-mapping of nuclear compartments using ultra-deep Hi-C shows that active promoter and enhancer elements localize in the active A compartment even when adjacent sequences do not.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Ramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+3D+genome+architecture+through+in+situ+DNase+Hi-C%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mapping 3D genome architecture through in situ DNase Hi-C.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2104-2121 (2016).</li>
<li>Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C+3.0%3A+Improved+Protocol+for+Genome-Wide+Chromosome+Conformation+Capture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hi-C 3.0: Improved Protocol for Genome-Wide Chromosome Conformation Capture.</a> Current Protocols. 1 (7), 198(2021).</li>
<li>Belton, J. -M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C%3A+A+comprehensive+technique+to+capture+the+conformation+of+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Hi-C: A comprehensive technique to capture the conformation of genomes.</a> Methods. 58 (3), 268-276 (2012).</li>
<li>Truch, J., Telenius, J., Higgs, D. R., Gibbons, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+tackle+challenging+ChIP-Seq%2C+with+long-range+cross-linking%2C+Using+ATRX+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">How to tackle challenging ChIP-Seq, with long-range cross-linking, Using ATRX as an example.</a> Methods in Molecular Biology. 1832, Clifton, N.J. 105-130 (2018).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">In situ chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Current Protocols. 1 (8), 174(2021).</li>
<li>Tjong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population-based+3D+genome+structure+analysis+reveals+driving+forces+in+spatial+genome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Population-based 3D genome structure analysis reveals driving forces in spatial genome organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1663-1672 (2016).</li>
<li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+dynamics+of+chromosomal+organization+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle dynamics of chromosomal organization at single-cell resolution.</a> Nature. 547 (7661), 61-67 (2017).</li>
<li>Ramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+multiplex+single-cell+Hi-C%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Massively multiplex single-cell Hi-C.</a> Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).</li>
<li>Meng, L., Wang, C., Shi, Y., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Si-C+is+a+method+for+inferring+super-resolution+intact+genome+structure+from+single-cell+Hi-C+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Si-C is a method for inferring super-resolution intact genome structure from single-cell Hi-C data.</a> Nature Communications. 12 (1), 4369(2021).</li>
<li>Tavares-Cadete, F., Norouzi, D., Dekker, B., Liu, Y., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-contact+3C+reveals+that+the+human+genome+during+interphase+is+largely+not+entangled%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Multi-contact 3C reveals that the human genome during interphase is largely not entangled.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1105-1114 (2020).</li>
<li>Vermeulen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-contact+4C%3A+long-molecule+sequencing+of+complex+proximity+ligation+products+to+uncover+local+cooperative+and+competitive+chromatin+topologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multi-contact 4C: long-molecule sequencing of complex proximity ligation products to uncover local cooperative and competitive chromatin topologies.</a> Nature Protocols. 15 (2), 364-397 (2020).</li>
<li>Oomen, M. E., Hedger, A. K., Watts, J. K., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+chromatin+interactions+between+and+along+sister+chromatids+with+SisterC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting chromatin interactions between and along sister chromatids with SisterC.</a> Nature Methods. 17 (10), 1002-1009 (2020).</li>
<li>Mitter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+of+sister+chromatids+in+the+replicated+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformation of sister chromatids in the replicated human genome.</a> Nature. 586 (7827), 139-144 (2020).</li>
<li>Krietenstein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+Details+of+Mammalian+Chromosome+Architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural Details of Mammalian Chromosome Architecture.</a> Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).</li>
<li>Hughes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+hundreds+of+cis-regulatory+landscapes+at+high+resolution+in+a+single%2C+high-throughput+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment.</a> Nature Genetics. 46 (2), 205-212 (2014).</li>
<li>Fullwood, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).</li>
<li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+long-range+chromatin+interactions+by+proximity+ligation-assisted+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq.</a> Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).</li>
<li>Mumbach, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiChIP%3A+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Krytyczne etapy obsługi komórek Chociaż możliwe jest użycie mniejszej liczby komórek wejściowych, protokół ten został zoptymalizowany dla ~5 × 106 komórek na linię sekwencjonowania (~400 mln odczytów), aby zapewnić odpowiednią złożoność po głębokim sekwencjonowaniu. Komórki najlepiej liczyć przed utrwaleniem. W przypadku generowania bibliotek ultragłębokich zazwyczaj mnożymy liczbę linii (i komórek), aż do osiągnięcia żądanej głębokości odczytu. W celu optymalnego utrwalenia, pożywkę zawierającą surowicę należy zastąpić PBS przed utrwaleniem FA, a roztwory utrwalające należy dodać natychmiast i bez gradientów stężeń15,22. W przypadku zbierania komórek skrobanie jest preferowane zamiast trypsynizacji, ponieważ przejście od bardziej płaskiego do kulistego kształtu po trypsynizacji może wpływać na konformację jądrową. Po dodaniu DSG luźne i grudkowate granulki komórkowe łatwo się gubią. Na tym etapie należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z komórkami i dodać do 0,05% BSA, aby zmniejszyć zbrylanie.
Modyfikacje metody Protokół ten został opracowany przy użyciu komórek ludzkich17. Jednak w oparciu o doświadczenie w wychwytywaniu konformacji chromosomów, protokół ten powinien działać w przypadku większości komórek eukariotycznych. W przypadku znacznie niższego wkładu (~1 × 106 komórek) zalecamy użycie połowy objętości do procedur wychwytywania lizy i konformacji [kroki 2.1-2.4]. Pozwoliłoby to również na przeprowadzenie izolacji DNA [krok 2.5] w wirówce stołowej z probówkami o pojemności 1,7 ml, co mogłoby poprawić granulowanie przy niskich stężeniach DNA. Kwantyfikacja DNA (krok 2.6.6) wskaże, jak należy postępować. W przypadku małych ilości wyizolowanego DNA (1-5 μg) sugerujemy pominięcie wyboru rozmiaru (krok 3.3) i przystąpienie do usuwania biotyny po zmniejszeniu objętości ze 130 μL do ~45 μL za pomocą CFU.
Protokół ten został opracowany specjalnie w celu zapewnienia wysokiej jakości danych po późniejszym sieciowaniu z FA i DSG oraz trawieniu z DpnII i DdeI. Jednak alternatywne strategie sieciowania, takie jak FA, a następnie EGS (bursztynian glikolu etylenowego)), który jest również stosowany w ChIP-seq23 i ChIA-PET24, mogą działać równie dobrze17. Podobnie do trawienia można stosować różne kombinacje enzymów, takie jak DpnII i HinfI18 lub MboI, MseI i NlaIII19 . Dostosowując kombinacje enzymów, należy pamiętać o stosowaniu biotynylowanych nukleotydów, które mogą wypełnić określone 5' zwisy i używać najbardziej optymalnych dla każdego koktajlu. DpnII jest dostarczany z własnym buforem, a producent enzymu zaleca określony bufor do trawienia DdeI. Jednak w przypadku podwójnego trawienia z DpnII i DdeI w tym protokole zalecany jest bufor restrykcyjny, ponieważ jest on oceniany na 100% aktywność dla obu enzymów.
Rozwiązywanie problemów z przechwytywaniem konformacji Trzy kluczowe etapy wychwytywania konformacji chromosomów: sieciowanie, trawienie i religacja zostały wykonane, zanim wyniki będzie można zwizualizować na żelu. Aby określić jakość każdego z tych trzech etapów i określić, gdzie mogły wystąpić problemy, pobiera się podwielokrotności przed (CI) i po trawieniu (DC) i umieszcza je w żelu wraz z ligowaną próbką Hi-C (ryc. 2). Żel ten służy do określenia jakości próbki Hi-C i tego, czy warto będzie kontynuować protokół. Bez CI i DC trudno jest wskazać potencjalne nieoptymalne kroki. Warto zauważyć, że nieoptymalne podwiązanie może być spowodowane problemem w samym podwiązaniu, wypełnieniu lub problemem z sieciowaniem. Aby rozwiązać problemy z sieciowaniem, pamiętaj, aby nie używać więcej niż 1 × 107 komórek na bibliotekę i zacznij od świeżych odczynników do sieciowania i czystych komórek (tj. przepłukanych PBS). W przypadku podwiązania upewnij się, że komórki i mieszanina ligacji są trzymane na lodzie. Dodać ligazę DNA T4 tuż przed 4 godzinną inkubacją w temperaturze 16 °C i dobrze wymieszać.
Rozwiązywanie problemów z przygotowywaniem biblioteki Jeśli potrzebnych jest więcej niż 10 cykli PCR lub po miareczkowaniu PCR na żelu nie widać produktu PCR (ryc. 4), istnieje kilka opcji zapisania próbki Hi-C. Wracając do miareczkowania PCR, pierwszą opcją jest ponowna próba PCR. Jeśli nadal nie ma wystarczającej ilości produktu, można spróbować kolejnej rundy ogona A i podwiązania adaptera (krok 3.6) po dwukrotnym umyciu kulek buforem 1x TLE. Po tym dodatkowym ogonie A i podwiązaniu adapterem można przejść do miareczkowania PCR jak poprzednio. Jeśli nadal nie ma produktu, ostatnią opcją jest ponowne rozpoznanie ułamka 0,8x z kroku 3.3 i kontynuowanie od tego miejsca.
Ograniczenia i zalety Hi-C3.0 Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że Hi-C jest metodą opartą na populacji, która rejestruje średnią częstotliwość interakcji między parami loci w populacji komórek. Niektóre analizy obliczeniowe mają na celu rozwikłanie kombinacji konformacji z populacji25, ale w zasadzie Hi-C jest ślepy na różnice między komórkami. Chociaż możliwe jest wykonanie pojedynczej komórki Hi-C26,27 i można dokonać wnioskowania obliczeniowego28, jednokomórkowa Hi-C nie nadaje się do uzyskiwania informacji 3C o ultrawysokiej rozdzielczości. Dodatkowym ograniczeniem Hi-C jest to, że wykrywa on tylko oddziaływania parami. Do wykrywania oddziaływań wielokontaktowych można użyć częstych obcinaczy w połączeniu z sekwencjonowaniem krótkiego odczytu (Illumina)16 lub wykonać wielokontaktowe 3C29 lub 4C30, używając sekwencjonowania długiego odczytu z platform PacBio lub Oxford Nanopore. Opracowano również pochodne Hi-C do specyficznego wykrywania kontaktów między chromatydami siostrzanymi i wzdłuż nich31,32.
Chociaż Hi-C19 i Micro-C33 mogą być używane do generowania map kontaktowych w rozdzielczościach subkilobazowych, oba wymagają dużej ilości odczytów sekwencjonowania, co może stać się kosztownym przedsięwzięciem. Aby uzyskać podobną, a nawet wyższą rozdzielczość bez ponoszenia kosztów, można zastosować wzbogacanie o określone regiony genomu (capture-C34) lub specyficzne interakcje białkowe (ChiA-PET35, PLAC-seq36, Hi-ChIP37). Zaletą i wadą tych aplikacji wzbogacających jest to, że próbkowana jest tylko ograniczona liczba interakcji. Przy takich wzbogaceniach zatraca się globalny aspekt Hi-C (i możliwość globalnej normalizacji).
Znaczenie i potencjalne zastosowania Hi-C3.0 Protokół ten został zaprojektowany, aby umożliwić uzyskanie wysokiej rozdzielczości, ultragłębokiego 3C, przy jednoczesnym wykrywaniu elementów składania na dużą skalę, takich jak TAD i komory17 (ilustracja 6). Protokół ten zaczyna się od 5 × 106 komórek na probówkę dla każdej biblioteki Hi-C, co powinno wystarczyć do sekwencjonowania jednej lub dwóch linii w komórce przepływowej, aby uzyskać do 1 miliarda odczytów sparowanych końców. Do ultragłębokiego sekwencjonowania należy przygotować wiele probówek po 5 × 106 komórek, w zależności od liczby zmapowanych odczytów i duplikatów PCR. Przy najwyższej rozdzielczości (<1 kb) interakcje pętlowe występują głównie między miejscami CTCF, ale można również wykryć interakcje promotor-wzmacniacz. Czytelnicy mogą zapoznać się z Akgol Oksuz et al.17 w celu uzyskania szczegółowego opisu analizy danych.

Metoda uchwytywania konformacji chromosomów (Chromosome conformation capture) jest stosowana od 2002 roku1. Fundamentalnie każdy wariant uchwytywania konformacji opiera się na utrwaleniu oddziaływań DNA-białko oraz białko-białko w celu zachowania trójwymiarowej organizacji chromatyny. Następnie przeprowadza się fragmentację DNA, zazwyczaj poprzez trawienie restrykcyjne, a na koniec religację bliskich końców DNA, aby przekształcić loci bliskie przestrzennie w unikalne kowalencyjne sekwencje DNA. W początkowych protokołach 3C wykorzystywano PCR do badania specyficznych oddziaływań typu „jeden-do-jednego”. Kolejne testy 4C umożliwiły wykrywanie oddziaływań typu „jeden-do-wszystkich”2, natomiast 5C wykrywało oddziaływania typu „wiele-do-wielu”3. Metoda uchwytywania konformacji chromosomów w pełni rozwinęła się po wprowadzeniu wysokoprzepustowego sekwencjonowania nowej generacji (NGS), co pozwoliło na wykrywanie genomowych oddziaływań typu „wszystkie-do-wszystkich” przy użyciu ogennomowej metody Hi-C4 oraz technik porównywalnych, takich jak 3C-seq5, TCC6 i Micro-C7,8 (zob. również przegląd Denkera i De Laata9).
W metodzie Hi-C do znakowania nawisów 5′ po trawieniu i przed ligacją stosuje się nukleotydy biotynilowane (Rycina 1). Pozwala to na wyselekcjonowanie prawidłowo strawionych i religowanych fragmentów za pomocą kulek pokrytych streptawidyną, co odróżnia tę metodę od GCC10. Istotną aktualizację protokołu Hi-C wprowadzili Rao i wsp.11, którzy przeprowadzili trawienie i religację w nienaruszonych jądrach komórkowych (tzn. in situ), aby zredukować liczbę fałszywych produktów ligacji. Ponadto zastąpienie trawienia enzymem HindIII trawieniem MboI (lub DpnII) zmniejszyło rozmiar fragmentów i zwiększyło potencjalną rozdzielczość Hi-C. Wzrost ten umożliwił wykrywanie struktur o stosunkowo niewielkiej skali oraz bardziej precyzyjną lokalizację genomową punktów kontaktu, takich jak pętle DNA między małymi elementami cis, np. pętle między miejscami wiązania CTCF powstające w wyniku ekstruzji pętli11,12. Ten potencjał wiąże się jednak z pewnymi kosztami. Po pierwsze, dwukrotny wzrost rozdzielczości wymaga czterokrotnego (22) zwiększenia liczby odczytów sekwencjonowania13. Po drugie, niewielkie rozmiary fragmentów zwiększają prawdopodobieństwo pomylenia niestrawionych fragmentów sąsiednich z fragmentami strawionymi i religowanymi14. Jak wspomniano, w Hi-C fragmenty strawione i religowane różnią się od fragmentów niestrawionych obecnością biotyny w miejscu ligacji. Niemniej jednak, wymagane jest prawidłowe usunięcie biotyny z nieligowanych końców, aby zapewnić wyizolowanie wyłącznie miejsc ligacji14,15.
Wraz ze spadkiem kosztów NGS, możliwe staje się badanie fałdowania chromosomów w większych szczegółach. Aby zmniejszyć rozmiar fragmentów DNA, a tym samym zwiększyć rozdzielczość, protokół Hi-C można dostosować poprzez zastosowanie częściej tnących enzymów restrykcyjnych16 lub kombinacji enzymów restrykcyjnych17,18,19. Alternatywnie, w metodach Micro-C można miareczkować MNase7,8, a w DNase Hi-C miareczkować DNase20, aby uzyskać optymalny stopień trawienia.
Niedawna systematyczna ocena podstaw metod 3C wykazała, że detekcja cech fałdowania chromosomów we wszystkich skalach długości uległa znacznej poprawie dzięki sekwencyjnemu sieciowaniu 1% FA, a następnie 3 mM DSG17. Ponadto Hi-C z trawieniem za pomocą HindIII okazało się najlepszą opcją do wykrywania wielkoskalowych cech fałdowania, takich jak przedziały (compartments), natomiast Micro-C było skuteczniejsze w wykrywaniu małkoskalowych cech fałdowania, takich jak pętle DNA. Wyniki te doprowadziły do opracowania jednolitej strategii o wysokiej rozdzielczości „Hi-C 3.0”, która wykorzystuje kombinację sieciujących czynników FA i DSG, a następnie podwójne trawienie endonukleazami DpnII i DdeI21. Hi-C 3.0 stanowi skuteczną strategię do ogólnego zastosowania, ponieważ precyzyjnie wykrywa cechy fałdowania we wszystkich skalach długości17. Poniżej szczegółowo opisano część eksperymentalną protokołu Hi-C 3.0 oraz przedstawiono typowe wyniki, jakich można się spodziewać po sekwencjonowaniu.
<img alt="Schemat metody uchwytywania konformacji chromatyny; etapy fiksacji, trawienia, ligacji i oczyszczania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Procedura Hi-C w sześciu krokach. Komórki są najpierw fiksowane za pomocą FA, a następnie DSG (1). Następnie po lizie następuje podwójne trawienie enzymami DdeI i DpnII (2). Biotyna jest wprowadzana poprzez wypełnianie nawisów, a proksymalne, stępione końce są ligowane (3) przed oczyszczaniem DNA (4). Biotyna jest usuwana z nieligowanych końców przed sonikacją i selekcją rozmiaru (5). Na koniec pull-down biotyny umożliwia ligację adapterów i amplifikację biblioteki metodą PCR (6). Skróty: FA = formaldehyd; DSG = glutaronian disukcynimidylu; B = biotyna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>1 kb Drabina</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500100</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne Agencourt AMPure XP, 60 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-0,5 (CFU)</td><td>EMD Milipore</td><td>UFC500396</td><td></td></tr><tr><td>bufor do wyżarzania (5x)</td><td>Zobacz przepis w materiałach</td><td></td> uzupełniających<td></td></tr><tr><td>ATP 10 mM</td><td>ThermoFisher</td><td>R0441</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-25i Ultrawirówka z chłodzeniem o dużej prędkości Beckman</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówka ultrawirówkowa Beckman Coulter 35 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>357002</td><td></td></tr><tr><td>Bufor wiążący (2x)</td><td>Zobacz przepis w materiałach</td><td></td><td></td>uzupełniających</tr><tr><td>biotyna-14-dATP 0,4 mM</td><td>Invitrogen</td><td>19524-016</td><td></td></tr><tr><td>BSA 10 mg/ml</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td>rozcieńczony od 20 mg/ml</td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>Falcon</td><td>353089</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki polipropylenowe 50 ml</td><td>Denville</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Rurka stożkowa 15 ml</td><td>Denville</td><td>C1017-P</td><td></td></tr><tr><td>Mikrorurka Covaris AFA z włóknem AFA Zatrzask 130 &MICRO; L</td><td>Covaris</td><td>520045/520077</td><td></td></tr><tr><td>Covaris Sonicator</td><td>Covaris</td><td>E220/E220evolution/M220</td><td></td></tr><tr><td>Kolba hodowlana 175 cm2</td><td>Falcon</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Płytki hodowlane 150 mm x 25 mm</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>dATP 1</td><td>mM Invitrogen</td><td>56172</td> dATP 10 mM Invitrogen 56172 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dCTP 10 mM</td><td>Invitrogen</td><td>56173</td><td></td></tr><tr><td>DdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0175L</td><td></td></tr><tr><td>dGTP 10 mM</td><td>Invitrogen</td><td>56174</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-5x10ML</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix 25 mM</td><td>Homogenizator Invitrogen</td><td>10297117</td><td></td></tr><tr><td>Dounce</td><td>DWK Life Sciences</td><td>8853010002/8853030002</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DPNII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0543M</td><td></td></tr><tr><td>DSG</td><td>ThermoScientific</td><td>20593</td><td></td></tr><tr><td>dTTP 10 mM</td><td>Invitrogen</td><td>56175</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>Fisher</td><td>A409-4</td><td>Rozcieńczony ze 100%</td></tr> <tr><td>bromku etydyny</td><td>Fisher</td><td>BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd (37%)</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik ładujący w żelu (6x)</td> <td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna w ultraczystej wodzie 2,5 M</td><td>Sigma</td><td>G8898-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Detergent Igepal CA-630</td><td>MP Biomedicals</td><td>198596</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Polimeraza DNA 5 U/&mikro; L</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Fragment Klenowa 3-->5' egzo-, 5 U/&mikro; L</td> Bufor ligacyjny <td>New England Biolabs</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>(10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa LoBind</td> z <td></td> ciekłym azotem <td></td> 1,7 ml Eppendorf 22431021 <td></td></tr><tr><td>Drabinka DNA o niskiej masie cząsteczkowej</td> New <td>England Biolabs</td><td>N3233L</td><td></td></tr><tr><td></td> Bufor do lizy Zobacz przepis w uzupełnieniu <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> materiały</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczny separator cząstek</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrofuge 1,7 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>MyOne Streptawidyna C1 kulki</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1 (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3.1 (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70013-032</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do PCR (paskowe) Biorad</td><td></td><td>TBS0201/ TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler do PCR</td><td>Biorad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Pfu Ultra II Bufor (10x)</td><td>Agilent</td><td></td><td>W zestawie z</td></tr><tr><td>polimerazą DNA Pfu Ultra PfuUltra II Fusion HS&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>600674</td><td></td></tr><tr><td>Rurka z blokadą fazową 15 ml</td><td>Qiagen</td><td>129065</td><td></td></tr><tr><td>Rurki z blokadą fazową 2 ml</td><td>Qiagen</td><td>129056</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: chloroform: alkohol izoamylowy</td><td>Invitrogen</td><td>15593-049</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>ThermoFisher</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K w wodzie ultraczystej 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>25530-031</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A, bez DNaz i proteaz 10 mg/ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Argos technologies</td><td>EW-04397-40 lub platforma</td><td></td>bujana</tr><tr><td>SDS 1%</td><td>Fisher</td><td>BP13111</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu pH = 5,2, 3 M</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell GT System Elektroforezy Poziomej</td><td>Biorad</td><td>1704401</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4 1 U/&mikro; L</td><td>Invitrogen</td><td>100004817</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA</td><td>T4 New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA T4 3 U/&mikro; L</td><td>Bufor ligacyjny New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>T4 (5x)</td> <td>Invitrogen</td><td>Y90001</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza polinukleotydowa T4 10 U/&mikro; L</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TBE</td><td>Zobacz przepis w materiałach</td><td></td><td></td>uzupełniających</tr><tr><td>Tris Low EDTA Buffer (TLE)</td><td>Zobacz przepis w materiałach</td><td></td><td></td>uzupełniających</tr><tr><td>Triton X-100 (10%)</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Adapter Truseq oligos</td><td>Zintegrowane DNA Technologie (IDT)</td><td>)https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry</td><td>250 nmol i oczyszczony HPLC</td></tr><tr><td>detergent Tween 20</td><td>Fisher</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do płukania Tween</td><td>Zobacz przepis w materiałach</td><td></td><td></td>uzupełniających</tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries</td> <td>(G560) SI-0236</td><td></td></tr></tbody></table>

rejestrowanie konformacji chromosomów w różnych skalach długości

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Przechwytywanie konformacji chromosomów (3C) służy do wykrywania trójwymiarowych oddziaływań chromatyny. Zazwyczaj chemiczne sieciowanie formaldehydem (FA) stosuje się do utrwalania oddziaływań chromatyny. Następnie trawienie chromatyny enzymem restrykcyjnym i późniejsza religacja końców fragmentów przekształca trójwymiarową (3D) bliskość w unikalne produkty ligacji. Wreszcie, po odwróceniu wiązań krzyżowych, usunięciu białka i izolacji DNA, DNA jest ścinane i przygotowywane do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Częstość ligacji zbliżeniowej par loci jest miarą częstości ich kolokalizacji w przestrzeni trójwymiarowej w populacji komórek.
Sekwencjonowana biblioteka Hi-C dostarcza informacji o częstości interakcji między wszystkimi parami loci dla całego genomu. Rozdzielczość i precyzja Hi-C opiera się na wydajnym sieciowaniu, które utrzymuje kontakty chromatyny oraz częstą i równomierną fragmentację chromatyny. W artykule opisano ulepszony protokół Hi-C in situ, Hi-C 3.0, który zwiększa efektywność sieciowania poprzez połączenie dwóch środków sieciujących (formaldehydu [FA] i glutaranu disuccinimidylu [DSG]), a następnie dokładniejsze trawienie przy użyciu dwóch enzymów restrykcyjnych (DpnII i DdeI). Hi-C 3.0 to pojedynczy protokół do dokładnej kwantyfikacji cech fałdowania genomu w mniejszych skalach, takich jak pętle i domeny kojarzenia topologicznego (TAD), a także cech w większych skalach obejmujących jądro, takich jak przedziały.

Ryciny w niniejszym manuskrypcie zostały wygenerowane z osobnego, powtórzonego eksperymentu, innego niż ten opublikowany wcześniej przez Lafontaine i współpracowników21. Po uzyskaniu danych z sekwencjonowania wysokoprzepustowego, do przetworzenia danych Hi-C wykorzystano Open Chromatin Collective (Open2C: https://github.com/open2c). Podobny rurociąg przetwarzania można znaleźć w portalu danych projektu 4D Nucleome (https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline). W skrócie, zaimplementowano rurociąg Nextflow distiller (https://github.com/open2c/distiller-nf), aby (1) dopasować sekwencje cząsteczek Hi-C do genomu referencyjnego, (2) sparsować pliki dopasowań .sam i utworzyć pliki z parami Hi-C, (3) odfiltrować duplikaty PCR oraz (4) zagregować pary w macierzach binowych interakcji Hi-C. Macierze te w formacie HDF5, nazywane coolerami, mogą być następnie (1) przeglądane na serwerze HiGlass (https://higlass.io/) oraz (2) analizowane przy użyciu szerokiego zestawu otwartych narzędzi obliczeniowych zawartych w kolekcji „cooltools” utrzymywanej przez Open Chromatin Collective (https://github.com/open2c/cooltools), w celu wyodrębnienia i ilościowego określenia cech fałdowania, takich jak przedziały (compartments), TADs i pętle.
Niektóre wskaźniki jakości bibliotek Hi-C3.0 można ocenić bezpośrednio po zmapowaniu par odczytów do genomu referencyjnego, korzystając z kilku prostych metryk/wskaźników. Po pierwsze, w przypadku komórek ludzkich zazwyczaj ok. 50% zsekwencjonowanych par odczytów można zmapować jednoznacznie. Ze względu na polimerową naturę chromosomów, większość tych zmapowanych odczytów (~60%-90%) reprezentuje oddziaływania w obrębie jednego chromosomu (cis), przy czym częstotliwość oddziaływań gwałtownie spada wraz ze wzrostem odległości genomicznej (spadek zależny od odległości). Spadek zależny od odległości najlepiej zobrazować na „wykresie skalowania” (scaling plot), który przedstawia prawdopodobieństwo kontaktu (na ramię chromosomu) jako funkcję odległości genomicznej. Stwierdzono, że zastosowanie różnych czynników sieciujących i enzymów może zmienić charakter spadku zależnego od odległości w zakresach długich i krótkich dystansów17. Dodanie sieciowania DSG zwiększa wykrywalność oddziaływań na krótkich dystansach w połączeniu z takimi enzymami jak Mnase oraz kombinacjami DpnII-DdeI, które generują mniejsze fragmenty (Rycina 6A).
Zależny od odległości spadek sygnału można również zaobserwować bezpośrednio na dwuwymiarowych macierzach oddziaływań: oddziaływania stają się rzadsze wraz ze zwiększaniem odległości od głównej przekątnej (Rysunek 6B). Ponadto cechy fałdowania genomu, takie jak przedziały (compartments), domeny TAD oraz pętle, można zidentyfikować na macierzach Hi-C i wykresach skalowania jako odchylenia od ogólnego średniego dla całego genomu spadku zależnego od odległości. Co istotne, sieciowanie za pomocą DSG w połączeniu z FA zmniejsza liczbę ligacji losowych, które ze względu na polimerową naturę chromosomów są nieograniczone i tym samym częściej występują między chromosomami (in trans) (Rysunek 6C). Ograniczenie ligacji losowych prowadzi do zwiększenia stosunku sygnału do szumu, szczególnie w przypadku oddziaływań międzychromosomalnych oraz bardzo długozasięgowych (&gt;10-50 Mb) w obrębie jednego chromosomu.
<img alt="Analiza danych Hi-C: Wykresy przedstawiające prawdopodobieństwo kontaktu, separację oraz mapy ciepła dla oddziaływań chromatyny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Reprezentatywne wyniki zmapowanych i przefiltrowanych bibliotek Hi-C. (A) Wykresy skalowania z prawdopodobieństwem kontaktu i jego pochodną dla różnych enzymów, uporządkowane według długości fragmentu (góra) oraz sieciowania za pomocą FA lub FA + DSG (dół). Trawienie przy użyciu MNAse (microC) lub DpnII-DdeI (Hi-C 3.0) znacząco zwiększa liczbę kontaktów krótkozasięgowych (góra), podobnie jak dodanie DSG do FA (dół). (B) Kolumny przedstawiają mapy ciepła Hi-C dla trawienia DpnII po samym sieciowaniu FA oraz trawienia DpnII lub DdeI po sieciowaniu FA+DSG. Białe strzałki wskazują zwiększającą się intensywność „punktów” po sieciowaniu DSG i trawieniu DdeI, co sugeruje lepszą detekcję pętli DNA. Wiersze przedstawiają różne fragmenty chromosomu 3 przy zwiększającej się rozdzielczości, zgodnie z panelem C: górny wiersz: cały chromosom 3 (0-198 295 559 Mb); środkowy wiersz: 186-196 Mb; dolny wiersz: 191,0-191,5 Mb. (C) Wykresy pokrycia dla regionów przedstawionych w części A. Czarne strzałki wskazują niższe pokrycie (% odczytów cis) dla sieciowania samym FA. Skróty: FA = formaldehyd; DSG = glutarate disuccinimidyl; chr = chromosom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Nie wszystkie zmapowane odczyty są użyteczne. Drugim wskaźnikiem jakości jest liczba duplikatów PCR. Jest wysoce nieprawdopodobne, aby identyczne odczyty wystąpiły przypadkowo po ligacji i sonikacji. Zatem takie odczyty prawdopodobnie są wynikiem amplifikacji PCR i muszą zostać odfiltrowane. Duplikaty często powstają, gdy do amplifikacji bibliotek o niskiej złożoności wymagana jest zbyt duża liczba cykli PCR. Zazwyczaj w przypadku Hi-C większość bibliotek wymaga jedynie 5-8 cykli końcowej amplifikacji PCR, co określa się poprzez PCR miareczkowy (patrz krok 3.9; Rycina 4). Niemniej jednak biblioteki o wystarczającej złożoności można uzyskać nawet po 14 cyklach amplifikacji PCR.
Kolejna kategoria duplikatów odczytów, tzw. duplikaty optyczne, może wynikać z procesu amplifikacji na platformach sekwencjonowania Illumina wykorzystujących wzorcowane ogniwa przepływowe (takich jak HiSeq4000). Duplikaty optyczne powstają albo w wyniku przeładowania ogniwa przepływowego, co powoduje, że (duże) klastry są rozpoznawane jako dwa oddzielne klastry, albo w wyniku lokalnej reklasteryzacji oryginalnej cząsteczki typu paired-end po pierwszej rundzie PCR. Ponieważ oba typy duplikatyw optycznych mają charakter lokalny, można je zidentyfikować i odróżnić od duplikatów PCR na podstawie ich położenia w ogniwie przepływowym. Podczas gdy biblioteki z zawartością &gt;15% duplikatów PCR wymagałyby regeneracji, biblioteki z duplikatami optycznymi mogą zostać ponownie załadowane po zoptymalizowaniu procesu ładowania.
Tabela uzupełniająca S1: Bufory i roztwory. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Hi-C 3.0 to ulepszony protokół Hi-C, który łączy sieciujące formaldehyd i glutaran disuccinimidylu z koktajlem enzymów restrykcyjnych DpnII i DdeI, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu i rozdzielczość wykrywania interakcji chromatyny.

Rejestrowanie konformacji chromosomów w różnych skalach długości

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

Protokół ten dokładnie wykrywa cechy fałdowania chromosomów w wielu skalach długości przy niskim sygnale tła. Na przykład interakcje wzmacniaczy promotorów można analizować w kontekście przedziałów chromosomowych. Zastosowanie endonukleaz restrykcyjnych pozwala na obejście optymalizacji poziomu trawienia materiału wejściowego.Do wychwytywania produktów ligacji nie jest wymagana selekcja przez izolację żelu. Najczęstszym problemem jest utrata komórek po utrwaleniu DSG i przechwyceniu wystarczającej ilości DNA do wytworzenia wysokiej jakości bibliotek. Na początek odessać pożywkę pipetą Pasteura sprzężoną z pułapką próżniową ze 150-milimetrowej płytki zawierającej 5 na 10 do szóstych komórek.Umyj komórki dwukrotnie 10 mililitrami HBSS. Aby usieciować komórki, wlej 23,125 mililitrów 1% roztworu formaldehydu do 15-centymetrowej płytki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, delikatnie kołysząc płytką ręcznie co dwie minuty.Następnie dodaj 1,25 mililitra 2,5-molowej glicyny i delikatnie zakręć płytką, aby wygasić reakcję sieciowania, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Kontynuuj inkubację na lodzie przez 15 minut, aby zatrzymać sieciowanie. Zeskrobać komórki z płytki za pomocą skrobaka do komórek lub gumowego policjanta i przenieść zawiesinę komórek do 50-mililitrowej stożkowej probówki z pipetą.Odwirować zawiesinę o stężeniu 1 000 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant przez aspirację. Umyj granulkę raz 10 mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco lub DPBS. Następnie ponownie odwirować przed przystąpieniem do sieciowania DSG.W celu sieciowania za pomocą DSG, ponownie zawieś granulowane ogniwa w 9,9 mililitra DPBS. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 300-milimolowego DSG. Wymieszaj probówkę przez odwrócenie i sieciuj komórki w temperaturze pokojowej przez 40 minut na rotatorze.Po usieciowaniu dodaj 1,925 mililitra 2,5-molowej glicyny, odwróć do wymieszania i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 2,000 razy G przez 15 minut i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze 0,05% albuminy surowicy bydlęcej DPBS przed przeniesieniem go do probówki o pojemności 1,7 mililitra. Odwirować komórki w temperaturze 2 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant.Zatrzaskowo zamroź osad w ciekłym azocie przed przystąpieniem do potwierdzenia wychwytywania chromosomów. Ponownie zawiesić usieciowaną podwielokrotność komórek w jednym mililitrze lodowatego buforu do lizy zawierającego 10 mikrolitrów koktajlu inhibitorów proteazy i przenieść do homogenizatora Dounce na 15 minut inkubacji na lodzie. Powoli przesuwaj tłuczek A w górę i w dół 30 razy, aby homogenizować komórki i inkubować przez jedną minutę, aby komórki ostygły przed kolejnymi 30 pociągnięciami.Po ostatnim pociągnięciu przenieś lizat do 1,7-mililitrowej probówki. Odwirować zlizowaną zawiesinę w temperaturze 2 500 razy G przez pięć minut. Wyrzucić supernatant i przetrząsnąć lub przemieszać w wir w celu ponownego zawieszenia mokrego osadu.Usuń jak najwięcej supernatantu, aby uzyskać substancję podobną do jogurtu z minimalnymi grudkami. Ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach lodowatego buforu restrykcyjnego przed odwirowaniem. Po drugim praniu ponownie zawiesić osad w 360 mikrolitrach buforu ograniczającego przez pipetowanie po dodaniu około 340 mikrolitrów do przeniesionej objętości osadu, w zależności od wielkości komórki.Odłóż 18 mikrolitrów lizatu do zbadania integralności chromatyny lub CI.To pozostałego lizatu, dodaj 38 mikrolitrów 1% dodecylosiarczanu sodu do probówki hi-C, aby uzyskać całkowitą objętość 380 mikrolitrów i dokładnie wymieszaj, pipetując bez wprowadzania pęcherzyków. Inkubować próbki w temperaturze 65 stopni Celsjusza bez wstrząsania przez 10 minut, aby otworzyć chromatynę. Następnie natychmiast umieść rurkę na lodzie.Po przygotowaniu mieszaniny wytrawiającej za pomocą Triton X-100 dodaj 107 mikrolitrów tej mieszaniny do probówki hi-C, aby uzyskać łączną objętość 487 mikrolitrów i traw chromatynę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termomikserze z przerywanym wstrząsaniem. Następnego dnia przenieś próbki do 65 stopni Celsjusza na 20 minut, aby dezaktywować pozostałą aktywność endonukleazy. Po umieszczeniu próbki na lodzie odłóż na bok 10 mikrolitrów kontroli trawienia lub DC i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Usuń skropliny z pokrywki za pomocą pipety lub wirując. Następnie dodaj 58 mikrolitrów mieszanki wypełniającej biotynę, aby uzyskać całkowitą objętość 535 mikrolitrów. Delikatnie pipetować, nie tworząc pęcherzyków, a następnie inkubować w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez cztery godziny w termomikserze.Po inkubacji dodać 665 mikrolitrów mieszanki ligacyjnej, co daje objętość próbki 1 200 mikrolitrów. Wymieszać próbkę pipetując i inkubować w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez cztery godziny w termomikserze. Następnie dodaj 50 mikrolitrów proteinazy-K w dwóch frakcjach do probówki z próbką hi-C i inkubuj przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza z przerywanym wstrząsaniem.W celu oczyszczenia DNA dodaj 100% lodowaty etanol i odwiruj probówki w temperaturze 18 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Całkowicie usunąć supernatant ze strony niebędącej granulką i suszyć próbkę na powietrzu przez 10 minut lub do momentu, gdy granulki będą widocznie suche. Gdy granulki wyschną, rozpuść je w 450 mikrolitrach Tris low-EDTA, pipetując lub wirując.Przenieś rozpuszczoną zawiesinę do 0,5-milimetrowej odśrodkowej jednostki filtrującej lub CFU, z granicą masy cząsteczkowej wynoszącą trzy kilodaltony. Odwirować jtk z maksymalną prędkością przez 10 minut i odrzucić przepływ. Po drugim praniu dodaj do kolumny 80 mikrolitrów Tris low-EDTA.Przemień kolumnę w nową probówkę zbiorczą na dwie minuty wirowania z maksymalną prędkością. Na koniec załaduj próbki do 0,8% żelu agarozowego. Wyniki miareczkowania w żelu agarozowym PCR wykazały, że większość bibliotek wymaga od pięciu do ośmiu cykli końcowej amplifikacji PCR.Trawienie komórkowe końcowej amplifikowanej biblioteki PCR, obserwowane przez mniejsze fragmenty na żelu agarozowym, potwierdza obecność prawidłowych połączeń ligacyjnych i służy jako kontrola jakości przed sekwencjonowaniem. Po sekwencjonowaniu zmapowane dane wykazały, że połączenie DpnII i DdeI znacznie zwiększa kontakty krótkiego zasięgu, podobnie jak dodanie DSG do konwencjonalnego sieciowania formaldehydu. Ulepszony sygnał można było również zaobserwować na długich i krótkich dystansach bezpośrednio z matryc interakcji 2D.Sygnały przedziałowe są CRISPR na dużych odległościach, a kropki utworzone przez pętle chromatyny są bardziej widoczne na krótkich odległościach. Oprócz formaldehydu, sieciowanie za pomocą DSG zmniejsza losowe ligacje, poprawiając względne pokrycie w cis. Ważne jest, aby nie tracić komórek podczas i po usieciowaniu.Granulki komórek mogą być luźne lub niewidoczne, a komórki mogą przyklejać się do końcówek pipet w niektórych.

capturing-chromosome-conformation-across-length-scales

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Metoda Hi-C umożliwia bezstronną, genomową identyfikację oddziaływań chromatyny (1). Hi-C łączy ligację bliskościową z sekwencjonowaniem masowo równoległym. Wynikowe dane mogą być wykorzystane do badania architektury genomowej w wielu skalach: wstępne wyniki pozwoliły zidentyfikować takie cechy jak terytoria chromosomowe, segregacja chromatyny otwartej i zamkniętej oraz struktura chromatyny w skali megabazy.

Hi-C: Metoda badania trójwymiarowej architektury genomów.

Test ACT (associated chromosome trap) jest nową, nieobciążoną metodą identyfikacji dalekosiężnych oddziaływań DNA. Charakterystyka dalekosiężnych oddziaływań DNA pozwoli nam określić związek architektury jądra z ekspresją genów zarówno w fizjologii prawidłowej, jak i w stanach chorobowych.

Zintegrowana pułapka chromosomowa do identyfikacji długodystansowych oddziaływań DNA

Ta praca opisuje protokół generowania bibliotek Hi-C o wysokiej rozdzielczości in situ z ciasno zaszczepionych zarodków Drosophila melanogaster przed gastrulacją.

Generowanie bibliotek wychwytywania konformacji chromatyny w całym genomie z ciasno zainscenizowanych wczesnych zarodków Drosophila

Pętla chromatyny odgrywa znaczącą rolę w regulacji genów; jednak nie ma postępu technologicznego, który pozwalałby na selektywną i odwracalną modyfikację pętli chromatyny. W tym miejscu opisujemy potężny system reorganizacji pętli chromatyny za pomocą CRISPR-dCas9 (CLOuD9), który wykazano, że selektywnie i odwracalnie moduluje ekspresję genów w docelowych loci.

Reorganizacja struktury pętli chromatyny za pośrednictwem CRISPR

Identyfikacja fizycznych interakcji między genami a elementami regulatorowymi jest trudna, ale została ułatwiona dzięki metodom wychwytywania konformacji chromosomów. Ta modyfikacja protokołu 4C-seq łagodzi stronniczość PCR, minimalizując nadmierną amplifikację matryc PCR i maksymalizując mapowalność odczytów poprzez włączenie etapu trawienia enzymu ograniczającego dodawanie.

Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq)

Informujemy o zastosowaniu ilościowego wychwytywania konformacji chromosomów, a następnie sekwencjonowania wysokoprzepustowego w ciałach embrionalnych generowanych z embrionalnych komórek macierzystych. Technika ta pozwala na identyfikację i ilościowe określenie kontaktów między domniemanymi wzmacniaczami a regionami promotorowymi danego genu podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych.

Identyfikacja kontaktów wzmacniacz-promotor w ciałach embrionalnych poprzez ilościowe wychwytywanie konformacji chromosomów (4C)

Genom jest zorganizowany w przestrzeni jądrowej w różne struktury, które mogą być ujawnione za pomocą technologii przechwytywania konformacji chromosomów. Metoda Hi-C w jądrze zapewnia zbiór interakcji chromatyny w całym genomie w liniach komórkowych Drosophila, który generuje mapy kontaktów, które można badać w rozdzielczości megabazowej na poziomie fragmentu restrykcyjnego.

W jądrze Hi-C w komórkach Drosophila

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

Protokół mapowania trójwymiarowej organizacji genomu z rozdzielczością nukleosomów przy użyciu metody przechwytywania konformacji chromosomów w całym genomie Micro-C-XL jest przedstawiony tutaj.

Mapowanie interakcji genomu 3D ssaków za pomocą Micro-C-XL

Tutaj szczegółowo prezentujemy adaptację techniki przechwytywania konformacji chromosomów (3C) z naciskiem na zaangażowanie i naukę na studiach licencjackich.

Uzyskanie A z 3Cs: Przechwytywanie konformacji chromosomów dla studentów

Przedstawiamy trójkolorowy protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej chromatyny (SMLM), który umożliwia powtarzalne mapowanie euchromatyny, heterochromatyny i RNAP II do analizy przestrzennej. Protokół ten umożliwia efektywne wielokolorowe oznakowanie w gęstych środowiskach jądrowych, w tym na celach związanych z chromatyną, co pozwala na niezawodne jednoczesne wykrywanie.

Protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki wieloznaczny do badania chromatyny w gęstym środowisku jądrowym

Poznaj protokół Hi-C 3.0 do analizy interakcji chromatyny z użyciem formaldehydu i DSG. Ta metoda umożliwia wykrywanie struktury chromosomów z niskim tłem i wysoką rozdzielczością.

Rejestrowanie konformacji chromosomów w różnych skalach długości

Przeglądaj więcej filmów