Rejestrowanie konformacji chromosomów w różnych skalach długości

Protokół ten dokładnie wykrywa cechy fałdowania chromosomów w wielu skalach długości przy niskim sygnale tła. Na przykład interakcje wzmacniaczy promotorów można analizować w kontekście przedziałów chromosomowych. Zastosowanie endonukleaz restrykcyjnych pozwala na obejście optymalizacji poziomu trawienia materiału wejściowego.

Do wychwytywania produktów ligacji nie jest wymagana selekcja przez izolację żelu. Najczęstszym problemem jest utrata komórek po utrwaleniu DSG i przechwyceniu wystarczającej ilości DNA do wytworzenia wysokiej jakości bibliotek. Na początek odessać pożywkę pipetą Pasteura sprzężoną z pułapką próżniową ze 150-milimetrowej płytki zawierającej 5 na 10 do szóstych komórek.

Umyj komórki dwukrotnie 10 mililitrami HBSS. Aby usieciować komórki, wlej 23,125 mililitrów 1% roztworu formaldehydu do 15-centymetrowej płytki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, delikatnie kołysząc płytką ręcznie co dwie minuty.

Następnie dodaj 1,25 mililitra 2,5-molowej glicyny i delikatnie zakręć płytką, aby wygasić reakcję sieciowania, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Kontynuuj inkubację na lodzie przez 15 minut, aby zatrzymać sieciowanie. Zeskrobać komórki z płytki za pomocą skrobaka do komórek lub gumowego policjanta i przenieść zawiesinę komórek do 50-mililitrowej stożkowej probówki z pipetą.

Odwirować zawiesinę o stężeniu 1 000 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant przez aspirację. Umyj granulkę raz 10 mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco lub DPBS. Następnie ponownie odwirować przed przystąpieniem do sieciowania DSG.

W celu sieciowania za pomocą DSG, ponownie zawieś granulowane ogniwa w 9,9 mililitra DPBS. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 300-milimolowego DSG. Wymieszaj probówkę przez odwrócenie i sieciuj komórki w temperaturze pokojowej przez 40 minut na rotatorze.

Po usieciowaniu dodaj 1,925 mililitra 2,5-molowej glicyny, odwróć do wymieszania i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 2,000 razy G przez 15 minut i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze 0,05% albuminy surowicy bydlęcej DPBS przed przeniesieniem go do probówki o pojemności 1,7 mililitra. Odwirować komórki w temperaturze 2 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant.

Zatrzaskowo zamroź osad w ciekłym azocie przed przystąpieniem do potwierdzenia wychwytywania chromosomów. Ponownie zawiesić usieciowaną podwielokrotność komórek w jednym mililitrze lodowatego buforu do lizy zawierającego 10 mikrolitrów koktajlu inhibitorów proteazy i przenieść do homogenizatora Dounce na 15 minut inkubacji na lodzie. Powoli przesuwaj tłuczek A w górę i w dół 30 razy, aby homogenizować komórki i inkubować przez jedną minutę, aby komórki ostygły przed kolejnymi 30 pociągnięciami.

Po ostatnim pociągnięciu przenieś lizat do 1,7-mililitrowej probówki. Odwirować zlizowaną zawiesinę w temperaturze 2 500 razy G przez pięć minut. Wyrzucić supernatant i przetrząsnąć lub przemieszać w wir w celu ponownego zawieszenia mokrego osadu.

Usuń jak najwięcej supernatantu, aby uzyskać substancję podobną do jogurtu z minimalnymi grudkami. Ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach lodowatego buforu restrykcyjnego przed odwirowaniem. Po drugim praniu ponownie zawiesić osad w 360 mikrolitrach buforu ograniczającego przez pipetowanie po dodaniu około 340 mikrolitrów do przeniesionej objętości osadu, w zależności od wielkości komórki.

Odłóż 18 mikrolitrów lizatu do zbadania integralności chromatyny lub CI.To pozostałego lizatu, dodaj 38 mikrolitrów 1% dodecylosiarczanu sodu do probówki hi-C, aby uzyskać całkowitą objętość 380 mikrolitrów i dokładnie wymieszaj, pipetując bez wprowadzania pęcherzyków. Inkubować próbki w temperaturze 65 stopni Celsjusza bez wstrząsania przez 10 minut, aby otworzyć chromatynę. Następnie natychmiast umieść rurkę na lodzie.

Po przygotowaniu mieszaniny wytrawiającej za pomocą Triton X-100 dodaj 107 mikrolitrów tej mieszaniny do probówki hi-C, aby uzyskać łączną objętość 487 mikrolitrów i traw chromatynę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termomikserze z przerywanym wstrząsaniem. Następnego dnia przenieś próbki do 65 stopni Celsjusza na 20 minut, aby dezaktywować pozostałą aktywność endonukleazy. Po umieszczeniu próbki na lodzie odłóż na bok 10 mikrolitrów kontroli trawienia lub DC i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Usuń skropliny z pokrywki za pomocą pipety lub wirując. Następnie dodaj 58 mikrolitrów mieszanki wypełniającej biotynę, aby uzyskać całkowitą objętość 535 mikrolitrów. Delikatnie pipetować, nie tworząc pęcherzyków, a następnie inkubować w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez cztery godziny w termomikserze.

Po inkubacji dodać 665 mikrolitrów mieszanki ligacyjnej, co daje objętość próbki 1 200 mikrolitrów. Wymieszać próbkę pipetując i inkubować w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez cztery godziny w termomikserze. Następnie dodaj 50 mikrolitrów proteinazy-K w dwóch frakcjach do probówki z próbką hi-C i inkubuj przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza z przerywanym wstrząsaniem.

W celu oczyszczenia DNA dodaj 100% lodowaty etanol i odwiruj probówki w temperaturze 18 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Całkowicie usunąć supernatant ze strony niebędącej granulką i suszyć próbkę na powietrzu przez 10 minut lub do momentu, gdy granulki będą widocznie suche. Gdy granulki wyschną, rozpuść je w 450 mikrolitrach Tris low-EDTA, pipetując lub wirując.

Przenieś rozpuszczoną zawiesinę do 0,5-milimetrowej odśrodkowej jednostki filtrującej lub CFU, z granicą masy cząsteczkowej wynoszącą trzy kilodaltony. Odwirować jtk z maksymalną prędkością przez 10 minut i odrzucić przepływ. Po drugim praniu dodaj do kolumny 80 mikrolitrów Tris low-EDTA.

Przemień kolumnę w nową probówkę zbiorczą na dwie minuty wirowania z maksymalną prędkością. Na koniec załaduj próbki do 0,8% żelu agarozowego. Wyniki miareczkowania w żelu agarozowym PCR wykazały, że większość bibliotek wymaga od pięciu do ośmiu cykli końcowej amplifikacji PCR.

Trawienie komórkowe końcowej amplifikowanej biblioteki PCR, obserwowane przez mniejsze fragmenty na żelu agarozowym, potwierdza obecność prawidłowych połączeń ligacyjnych i służy jako kontrola jakości przed sekwencjonowaniem. Po sekwencjonowaniu zmapowane dane wykazały, że połączenie DpnII i DdeI znacznie zwiększa kontakty krótkiego zasięgu, podobnie jak dodanie DSG do konwencjonalnego sieciowania formaldehydu. Ulepszony sygnał można było również zaobserwować na długich i krótkich dystansach bezpośrednio z matryc interakcji 2D.

Sygnały przedziałowe są CRISPR na dużych odległościach, a kropki utworzone przez pętle chromatyny są bardziej widoczne na krótkich odległościach. Oprócz formaldehydu, sieciowanie za pomocą DSG zmniejsza losowe ligacje, poprawiając względne pokrycie w cis. Ważne jest, aby nie tracić komórek podczas i po usieciowaniu.

Granulki komórek mogą być luźne lub niewidoczne, a komórki mogą przyklejać się do końcówek pipet w niektórych.