Name: Szybkie cięcie kości skroniowej człowieka w celu oceny patologii ucha środkowego związanej z COVID-19 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 42 s
Description: Poznaj szybką metodę cięcia kości skroniowej człowieka przy użyciu mikropiły z podwójnymi diamentowymi ostrzami. Technika skraca czas przetwarzania z 9-10 miesięcy do 10-14 dni, umożliwiając szybką analizę patologii ucha środkowej związanej z COVID-19.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Mohamedowi Leharowi za pomoc w tym projekcie. Prace te były częściowo wspierane przez National Institutes of Health (T32DC000027, NSA).

Ten protokół został opracowany za zgodą IRB (IRB00250002) i zgodnie z polityką instytucjonalną dotyczącą korzystania z tkanek ludzkich i materiału zakaźnego. Każdy dawca kości skroniowej wyraził pisemną zgodę przed śmiercią lub zgodę uzyskano pośmiertnie od rodziny dawcy. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, sprzętu i oprogramowania użytego w tym protokole.
1. Pobieranie kości skroniowych
<ol>
	<li>Uzyskaj zgodę lokalnej instytucjonalnej komisji rewizyjnej (IRB), dokonaj przeglądu polityki uczelni dotyczącej wykorzystania materiału ludzkiego i zakaźnego oraz uzyskaj zgodę na dawstwo tkanek przed zastosowaniem tego protokołu.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem pracy z tkankami pobranymi od dawców kości skroniowej zakażonych COVID-19 należy założyć odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE). Upewnij się, że środki ochrony osobistej składają się z respiratora N-95 i osłony twarzy (lub alternatywnie systemu oczyszczania powietrza pod nadciśnieniem), fartucha i dwóch par rękawiczek. Zapoznaj się z technikami prawidłowego zakładania i zdejmowania środków ochrony osobistej przed rozpoczęciem tego protokołu10.</li>
	<li>Skroniową tkankę kostną należy pobrać w ciągu 12-24 godzin od śmierci dawcy. Jeśli ciało nie jest przechowywane w lodówce, upewnij się, że zbiory nastąpią w ciągu 8 godzin od śmierci.
	<ol>
		<li>Pobranie kości skroniowych podczas autopsji przy użyciu metody czterech nacięć i bloku metodą osteotome7.
		<ol>
			<li>Po kraniotomii należy usunąć mózg i ostro podzielić nerwy czaszkowe do wewnętrznego kanału słuchowego.</li>
			<li>Wykonaj pierwsze nacięcie kostne z osteotomem równolegle i tylko przyśrodkowo do płaskonabłonkowej części kości skroniowej.</li>
			<li>Wykonaj drugie nacięcie kości równolegle do pierwszego na przyśrodkowej granicy kości skroniowej.</li>
			<li>Następnie wykonaj trzecie nacięcie 3-4 cm do przodu i równolegle do grzbietu skalistego.</li>
			<li>Wykonaj czwarte nacięcie mniej więcej równolegle do trzeciego, 2 cm za grzbietem skalistym. 
			UWAGA: Upewnij się, że wszystkie nacięcia przechodzą przez podstawę czaszki.</li>
			<li>Następnie usuń kość skroniową za pomocą ostrej sekcji, aby uwolnić przyczep tkanek miękkich wzdłuż dolnej krawędzi próbki. Jeśli balsamowanie ma być wykonane po pobraniu kości skroniowej, należy związać kikut tętnicy szyjnej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Utrwalanie tkanek, odwapnianie i sekcje
<ol>
	<li>Natychmiast umieść tkankę w 200-300 ml 10% buforowanej formaliny (formaldehydu), tak aby tkanka była całkowicie zanurzona. Pozostaw tkankę w formaldehydzie na minimum 72 godziny w temperaturze pokojowej, codziennie zmieniając roztwory. Chusteczkę należy przechowywać w hermetycznym pojemniku i wymieniać roztwór pod wyciągiem, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się wirusa. 
	UWAGA: Po upływie 72-godzinnego okresu utrwalania próbki nie muszą być już uważane za zakaźne.</li>
	<li>Użyj precyzyjnej mikropiły z podwójnymi ostrzami diamentowymi, aby pociąć każdą próbkę na trzy "grube" sekcje, aby umożliwić szybsze odwapnienie tkanek. Ustaw podwójne tarcze diamentowe na odległość 5 mm, tak aby środkowa część kości skroniowej miała grubość 5 mm. Upewnij się, że skrawki tkanki na obu końcach mają grubość 3-5 mm.</li>
	<li>Umieść grube skrawki w 200-300 ml 23% w/w roztworu odwapniającego z kwasem mrówkowym na 7-10 dni w temperaturze pokojowej, aż tkanka będzie wystarczająco miękka, aby można było ją zatopić w parafinie. Zmieniaj rozwiązania codziennie. Sprawdź, czy tkanki są odpowiednio odwapnione, dotykając próbki, która powinna być miękka. 
	UWAGA: Odwapnienie można również zweryfikować za pomocą promieniowania rentgenowskiego.</li>
	<li>Opłucz próbki pod bieżącą wodą z kranu przez 24 godziny, umieszczając je w dużej zlewce pod bieżącą wodą.</li>
	<li>Odwodnić tkankę w serii alkoholi o rosnącym stężeniu7. Zanurz tkankę w 100-200 ml 70% etanolu na 1,5 godziny, a następnie trzy przepłucz w 95% i 100% etanolu odpowiednio przez 1,5 godziny każde. Następnie umyj chusteczkę 3 x 1,5 h w ksylenie.</li>
	<li>Zanurz grube skrawki w parafinie, z czterema zabiegami po 45 minut każdy.</li>
	<li>Użyj kriotomu, aby wyciąć cienkie (10 μm) odcinki. Ustaw tkankę tak, aby tkanka została przecięta w płaszczyźnie osiowej. W razie potrzeby wytnij grubsze (20 μm) odcinki</li>.
</ol>
3. Immunohistochemia i obrazowanie
<ol>
	<li>Jeśli pożądane jest tradycyjne barwienie hematoksyliną i eozyną (nie opisane tutaj), wykonaj barwienie przed zamontowaniem sekcji na szkiełkach szkiełkowych7.</li>
	<li>Zamontuj sekcje na dodatnio naładowanych szkiełkach szkiełkowych.</li>
	<li>Piecz szkiełka na gorącej płycie w temperaturze 60 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Umieść szkiełka w uchwycie i zanurz je w komercyjnym roztworze do obróbki wstępnej zawierającym rozpuszczalnik organiczny (w tym przypadku dietanoloaminę) i etanol w celu odparafinowania, ponownego nawodnienia i zdemaskowania tkanki. 
	UWAGA: Ten krok jest niezbędny do osiągnięcia zadowalających wyników immunohistochemii dla tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie.</li>
	<li>Szkiełka podgrzewamy w szybkowarze pod wysokim ciśnieniem przez 20 min.</li>
	<li>Umieść szkiełka w nawilżonej komorze i zablokuj tkankę dostępnym w handlu roztworem blokującym.</li>
	<li>Zbadaj skrawki tkanki pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko enzymowi konwertującemu angiotensynę 2 (ACE2; 1:50), transbłonowej proteazie seryny 2 (TMPRSS2, 1:1,000) i proteazie furyny (1:250). 
	UWAGA: Przeciwciała ACE2, TMPRSS2 i furyny są stosowane, ponieważ uważa się, że białka te odgrywają rolę w zakaźności SARS-CoV-211,12, a ten protokół miał na celu zbadanie możliwych mechanizmów, za pomocą których SARS-CoV-2 może zainfekować ucho środkowe13.</li>
	<li>Leczyć drugorzędowym przeciwciałem anty-króliczym sprzężonym z HRP (ACE2, furyna; rozcieńczenie 1:100) lub przeciwciałem drugorzędowym anty-kozie (TMPRSS2, rozcieńczenie 1:100).</li>
	<li>Przeciwbarwić szkiełka 70% hematoksyliną w wodzie.</li>
	<li>Rejestruj obrazy pod mikroskopem świetlnym za pomocą zamontowanej kamery cyfrowej. Uzyskaj obrazy błony śluzowej ucha środkowego i trąbki Eustachiusza odpowiednio w powiększeniu 20x i 10x.</li>
</ol>

<ol><li>Nogueira, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+otorhinolaryngology%3A+Otology%2C+laryngology+and+rhinology%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Otorhinolaryngology%22%5BJournal%5D)">A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology.</a> Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).</li>
<li>Pappas, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otology+through+the+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology-Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Otology through the ages.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).</li>
<li>Schuknecht, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otopathology%3A+The+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Auris+Nasus+Larynx%22%5BJournal%5D)">Otopathology: The past, present, and future.</a> Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).</li>
<li>Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otopathology+in+the+United+States%3A+History%2C+current+situation%2C+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives.</a> Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).</li>
<li>Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+pathology+of+high-tone+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nervous+and+Mental+Disease%22%5BJournal%5D)">Observations on the pathology of high-tone deafness.</a> Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480(1934).</li>
<li>Andresen, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+presbycusis+from+the+first+temporal+bone+laboratory+within+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States.</a> Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).</li>
<li>Schuknecht, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchuknecht%2C+H+%22Pathology+of+the+Ear%22">Pathology of the Ear</a>. , Lea and Febiger. Philadelphia, PA. (1993).</li>
<li>Chole, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labs+in+crisis%3A+Protecting+the+science--and+art--of+otopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">Labs in crisis: Protecting the science--and art--of otopathology.</a> Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).</li>
<li>Nager, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNager%2C+GT+%22Pathology+of+the+Ear+and+Temporal+Bone%22">Pathology of the Ear and Temporal Bone</a>. , Williams and Wilkins. Baltimore, MD. (1993).</li>
<li>COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html">https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html</a> (2022).</li>
<li>Essalmani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+roles+of+Furin+and+TMPRSS2+in+SARS-CoV-2+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity.</a> Journal of Virology. 96 (8), 0012822(2022).</li>
<li>Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACE2%2C+TMPRSS2%2C+and+Furin+expression+in+the+nose+and+olfactory+bulb+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Rhinology%22%5BJournal%5D)">ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans.</a> Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).</li>
<li>Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+virus+isolated+from+the+mastoid+and+middle+ear%3A+Implications+for+COVID-19+precautions+during+ear+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Otolaryngology+-+Head+%26+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery.</a> JAMA Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).</li>
<li>Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+decalcification+of+human+temporal+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Microwave decalcification of human temporal bones.</a> Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).</li>
<li>Stephenson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+location+of+Na%2B%2C+K%2B-ATPase+%CE%B11+subunit+in+the+human+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear.</a> Hearing Research. 400, 108113(2021).</li>
<li>McCall, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extralabyrinthine+manifestations+of+DFNA9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Extralabyrinthine manifestations of DFNA9.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).</li>
<li>Wu, P. Z., O'Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+hearing+loss+is+dominated+by+damage+to+inner+ear+sensory+cells%2C+not+the+cellular+battery+that+powers+them%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).</li>
<li>Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+26+immunohistochemistry+in+temporal+bones+with+cochlear+otosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+%26+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis.</a> Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).</li>
<li>Lopez, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+techniques+for+the+human+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical techniques for the human inner ear.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Badania nad kością skroniową człowieka mają kluczowe znaczenie dla badania patologii ucha wewnętrznego i środkowego, ale pozostają przedsięwzięciem wymagającym dużej ilości czasu i zasobów. W artykule opisano technikę, która wykorzystuje mikropiłę diamentową do generowania grubych skrawków kości skroniowej, które można szybko odwapnić przed dalszym cięciem, dzięki czemu czas od pobrania tkanki do badania można skrócić z 9-10 miesięcy do 10-14 dni. Technika ta może zmniejszyć zasoby wymagane do przetwarzania kości skronio...

Badania kości skroniowej człowieka stanowią nieocenione źródło do badania patologii i patofizjologii ucha wewnętrznego i środkowego. Przed XIX wiekiem niewiele było wiadomo o chorobach otologicznych1,2,3. Aby lepiej zrozumieć chorobę otologiczną i "chirurgię słuchu ratującą z rąk znachorów", Joseph Toynbee (1815-1866) opracował metody badania przekrojów histologicznych ludzkiej kości skroniowej3. Praca ta była kontynuowana przez Adama Politzera (1835-1920) w Wiedniu i innych w całej Europie przez pozostałą część XIX wieku, który wykorzystał skrawki kości skroniowej do opisania histopatologii wielu powszechnych schorzeń dotykających ucho2,3,4.
Pierwsze laboratorium ludzkiej kości skroniowej w Stanach Zjednoczonych zostało otwarte w 1927 roku w Johns Hopkins Hospital, gdzie Stacy Guild (1890-1966) opracowała metody przekroju kości skroniowej5,6. Metody opracowane przez Gildię składały się z 9-10-miesięcznego procesu, który obejmował pośmiertne zbiory, utrwalanie, odwapnianie w kwasie azotowym, odwadnianie w etanolu, osadzanie celoidyny, cięcie, barwienie i montaż. Modyfikacje tej techniki zostały później wprowadzone przez Harolda Schuknechta (1917-1996)7; Podstawowe składowe tego procesu pozostają jednak zasadniczo niezmienione.
Znaczne zasoby niezbędne do utrzymania laboratorium kości skroniowej stanowiły wyzwanie dla badań nad kością skroniową i prawdopodobnie przyczyniły się do spadku jej popularności w ciągu ostatnich 30 lat4,8. Znaczna część zasobów laboratoryjnych kości skroniowej musi być poświęcona 9-10 miesięcznemu procesowi przygotowania kości skroniowej. Jednym z najbardziej czasochłonnych etapów przygotowań jest odwapnienie kości skroniowej, która jest najgęstszą kością w ludzkim ciele. Odwapnienie jest zwykle wykonywane w kwasie azotowym lub kwasie etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) i trwa od tygodni do miesięcy, wymagając częstej wymiany roztworów7,9. Co więcej, wrażliwe na czas badania ludzkiego ucha, takie jak te związane z pandemią COVID-19, mogą być utrudnione przez ten powolny proces przygotowania. W artykule opisano technikę szybkiego cięcia kości skroniowej, która wykorzystuje mikropiłę diamentową do generowania grubych sekcji, które pozwalają na szybkie odwapnienie i analizę tkanek w ciągu 10-14 dni od pobrania kości skroniowej.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało anty-ACE-2 (rozcieńczenie 1:50)</td> Przeciwciało antyfurynowe <td>Novus Biologicals</td><td>SN0754</td><td></td></tr><tr><td>(rozcieńczenie 1:250)</td> <td>Przeciwciało</td> anty-TMPRSS2 Abcam <td>EPR 14674</td><td></td></tr><tr><td>(rozcieńczenie 1:1 000)</td> <td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-20984</td><td></td></tr><tr><td>BX43 Ręczny mikroskop systemowy</td><td>Olympus Life Science Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybrydowa płytka CBN/diamentowa Blade</td><td>Pace Technologies</td><td>WB-007GP</td><td></td></tr><tr><td>Collin Mallet - 8</td>'<td>'Surgical Mart</td><td>SM1517</td><td></td></tr><tr><td>DS-Fi3 Kamera mikroskopowa</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podwójny endogenny blok enzymatyczny (komercyjne rozwiązanie blokujące)</td><td>Dako</td><td>S2003</td><td></td></tr><tr><td>Eaosin Stain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>548-24-3</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaliny, neutralny buforowany 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Formical-4 Decalcifier (roztwór odwapniający kwas mrówkowy)</td><td>StatLab</td><td>1214-1 GAL</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin Stain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9627</td><td></td></tr><tr><td>HRP-Conjugated Anti-Rabbit Drugorzędowe przeciwciało (rozcieńczenie 1:100)</td><td>Leica Biosystems</td><td>PV6119</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS HRP Zestaw do wykrywania igG przeciwko kozom, peroksydaza (1:100 rozcieńczenie)</td><td>Vector Laboratories</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>Lambotte Osteotome</td><td>Surgical Mart</td><td>SM1553</td><td></td></tr><tr><td>Metalograficzny PICO 155P Precyzyjna piła</td><td>Pace Technologie</td><td>PICO 155P</td><td></td></tr><tr><td>Microsaw NIS Elements Wersja oprogramowania 4.6</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3683</td><td>parafina</td></tr><tr><td>Dodatnio naładowane szkiełka mikroskopowe z białym matowym końcem</td><td>Walter Products</td><td>1140B15</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome</td><td>New Life Scientific Inc.</td><td>A78900104</td><td>kriotom</td></tr><tr><td>Triology Roztwór do obróbki wstępnej (komercyjny roztwór do obróbki wstępnej)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>920P-05</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>920P-05</td><td></td></tr></tbody></table>

szybkie cięcie kości skroniowej człowieka w celu oceny patologii ucha środkowego związanej z covid-19

High-Speed Human Temporal Bone Sectioning for the Assessment of COVID-19-Associated Middle Ear Pathology

Analiza histopatologiczna przekrojów kości skroniowej człowieka jest podstawową techniką do badania patologii ucha wewnętrznego i środkowego. Wycinki kości skroniowej są przygotowywane przez pośmiertne pobranie kości skroniowej, utrwalenie, odwapnienie, osadzenie i barwienie. Ze względu na gęstość kości skroniowej odwapnienie jest procesem czasochłonnym i wymagającym dużych zasobów; Kompletne przygotowanie tkanek może zająć średnio 9-10 miesięcy. Spowalnia to badania otopatologiczne i utrudnia badania, w których liczy się czas, takie jak te związane z pandemią COVID-19. W artykule opisano technikę szybkiego przygotowania i odwapnienia skroniowych odcinków kości w celu przyspieszenia przetwarzania tkanek.
Kości skroniowe zostały pobrane pośmiertnie przy użyciu standardowych technik i utrwalone w 10% formalinie. Precyzyjna mikropiła z podwójnymi diamentowymi ostrzami została użyta do pocięcia każdej sekcji na trzy grube sekcje. Grube skrawki kości skroniowej były następnie odkamieniane w roztworze odwapniającym przez 7-10 dni, a następnie zanurzone w parafinie, pocięte na cienkie (10 μm) odcinki za pomocą kriotomii i zamontowane na nienaładowanych szkiełkach. Próbki tkanek zostały następnie odparafinowane i ponownie uwodnione w celu barwienia przeciwciałami (ACE2, TMPRSS2, furyna) i zobrazowane. Technika ta skróciła czas od pobrania do analizy tkanek z 9-10 miesięcy do 10-14 dni. Szybkie cięcie kości skroniowej może przyspieszyć badania otopatologiczne i zmniejszyć zasoby niezbędne do przygotowania tkanek, a jednocześnie ułatwić badania, w których liczy się czas, takie jak te związane z COVID-19.

Barwienie hematoksyliną i eozyną błony śluzowej ucha środkowego oraz trąbki słuchowej wykazało zachowanie struktury błony śluzowej ucha środkowego oraz tkanki podśluzowej ucha środkowego po obróbce (Rycina 1). Obrazy immunohistochemiczne wykazały ekspresję białek ACE2, TMPRSS2 i furyny w obrębie błony śluzowej ucha środkowego oraz trąbki słuchowej (Rycina 1). Obecność tych białek w uchu środkowym wskazuje na możliwą drogę, poprzez którą SARS-CoV-2 może infekować...

Ten artykuł opisuje technikę szybkiego cięcia kości skroniowej człowieka, która wykorzystuje mikropiłę z podwójnymi diamentowymi ostrzami do generowania cienkich plasterków do szybkiego odwapnienia i analizy immunohistochemii kości skroniowej.

Szybkie cięcie kości skroniowej człowieka w celu oceny patologii ucha środkowego związanej z COVID-19

Histopathologic analysis of human temporal bone sections is a fundamental technique for studying inner and middle ear pathology. Temporal bone sections ...

Protokół ten skraca czas obróbki kości skroniowej z 9 do 10 miesięcy do 10 do 14 dni. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na szybką ocenę otopatologii, co w naszym przypadku ma znaczenie dla oceny patologii ucha środkowego związanej z COVID-19. Technika ta może być szczególnie pomocna w przypadku wrażliwych na czas badań kości skroniowej.W przyszłości może być jeszcze bardziej zoptymalizowany do użytku w badaniach patologii ucha wewnętrznego. Rozpocznij żniwa podczas autopsji i ostro podziel nerwy czaszkowe do wewnętrznego kanału słuchowego. Wykonaj pierwsze nacięcie kostne z osteotomem równolegle i tylko przyśrodkowo do płaskonabłonkowej części kości skroniowej.Następnie wykonaj drugie nacięcie kostne równolegle do pierwszego na przyśrodkowej granicy kości skroniowej. Wykonaj trzecie nacięcie na wysokości trzech do czterech centymetrów przed i równolegle do grzbietu skalistego. Następnie wykonaj czwarte nacięcie mniej więcej równolegle do trzeciego na dwa centymetry za grzbietem skalnym.Użyj ostrej sekcji, aby uwolnić tkankę miękką przyczepioną wzdłuż dolnej krawędzi próbki i usunąć kość skroniową. Po zbiorach natychmiast zanurz tkankę w 200 do 300 mililitrach 10% buforowanej formaliny. Następnie ustaw precyzyjną mikropiłę z podwójnymi ostrzami diamentowymi na odległość pięciu milimetrów.W celu szybkiego odwapnienia tkanek należy pociąć każdą próbkę na trzy sekcje, tak aby środkowa część kości skroniowej miała grubość pięciu milimetrów, a te na obu końcach miały grubość od trzech do pięciu milimetrów. Umieść skrawki w 200 do 300 mililitrach 0,37-molowego EDTA na siedem do 10 dni w temperaturze pokojowej w celu zmiękczenia. Zabarwienie błony śluzowej ucha środkowego i trąbki Eustachiusza hematoksyliną i eozyną wykazało, że tkanka jest zachowana po przetworzeniu przy użyciu tego protokołu.Analizy immunohistochemiczne wykazały obecność ACE2, transbłonowej proteazy seryny i białek furyny w tych tkankach, co może stanowić źródło zakażenia SARS-CoV2 w nabłonku oddechowym ucha środkowego. Ważne jest, aby odpowiednio ustawić skroniową tkankę kostną w pile diamentowej. Alternatywne techniki, które można połączyć z tą metodą, obejmują immunohistochemię dla różnych białek, różnych barwników tkanek i transkryptomikę.Technika ta pozwoliła nam szybko ocenić obecność białek zaangażowanych w zakażenie SARS-CoV2 w uchu środkowym podczas pandemii COVID-19.

high-speed-human-temporal-bone-sectioning-for-assessment-covid-19

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano prostą procedurę krojenia narządu Cortiego za pomocą wibratomu, a następnie przeprowadzenia immunohistochemii i mikroskopii konfokalnej. Procedura ta pozwala na lepsze zachowanie drobnej cytoarchitektury narządu Cortiego u ssaków, a w konsekwencji umożliwia dokładną kwantyfikację typów komórek.

Krojenie w wibratomie w celu lepszego zachowania cytoarchitektury organu Cortiego ssaków

Istnieją różne metody wprowadzania czynników ototoksycznych do ślimaków modeli zwierzęcych. Przedstawiono protokół chirurgiczny dostarczania środków ototoksycznych do wnęki okrągłego okna. Procedura jest niezawodna, tworzy ukierunkowane zmiany wewnątrzślimakowe i pozwala uniknąć mechanicznych uszkodzeń mikroarchitektury. Możliwe jest badanie samonaprawy/regeneracji ślimaka.

Mysie podejście oparte na okrągłym oknie do dostarczania czynników ototoksycznych: szybka i niezawodna technika indukowania zwyrodnienia komórek ślimakowych

Przedstawiamy metodę izolowania dorosłego organu Cortiego jako trzech nienaruszonych zwojów ślimaka (wierzchołek, środek i podstawa). Demonstrujemy również procedurę barwienia immunologicznego za pomocą fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał. Razem techniki te pozwalają na badanie komórek rzęsatych, komórek podporowych i innych typów komórek znajdujących się w ślimaku.

Rozwarstwienie całej góry i immunofluorescencja ślimaka dorosłej myszy

Przedstawiamy protokół izolowania pęcherza słuchowego, torebki i kosteczek słuchowych od myszy po urodzeniu w celu przeprowadzenia całego wierzchowca i analizy histologicznej.

Rozwarstwienie pęcherza słuchowego u myszy po urodzeniu: izolacja kości ucha środkowego i analiza histologiczna

Celem tego artykułu jest opisanie metodologii wyłącznie endoskopowego wycinka ucha środkowego ze zwłok. Ponadto naszym celem jest dostarczenie kompleksowego przewodnika po endoskopowej anatomii ucha środkowego.

Odkrywanie anatomii ucha środkowego za pomocą transkanałowej endoskopowej chirurgii ucha: podręcznik preparacji

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie skutecznej metody decelularyzacji i odkamieniania ślimaków myszy w celu wykorzystania ich jako rusztowań do zastosowań inżynierii tkankowej.

Protokół decelularyzacji ślimaków myszy w inżynierii tkankowej ucha wewnętrznego

Aby zagwarantować skuteczną i wysokiej jakości analizę funkcjonalną rzęsek w celu diagnozy PCD, niezbędna jest precyzyjna i staranna metoda pobierania i przetwarzania nabłonka oddechowego. Aby kontynuować świadczenie usług diagnostycznych w kierunku PCD podczas pandemii COVID-19, protokół wideomikroskopii rzęskowej został zaktualizowany w celu uwzględnienia odpowiednich środków kontroli zakażeń.

Pobieranie próbek i przetwarzanie szczotkowania nosa za pomocą cyfrowej wideomikroskopii rzęskowej o dużej prędkości – adaptacja do pandemii COVID-19

Ten artykuł przedstawia niezawodną metodę ekstrakcji ludzkiego ślimaka z kości skroniowej zwłok poprzez wiercenie, podążając za wyraźnymi anatomicznymi punktami orientacyjnymi.

Ekstrakcja ślimaka z ludzkiej kości skroniowej: protokół zwłok

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji i hodowli pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od myszy. Początkowo narząd Cortiego został wypreparowany z noworodków (w wieku 3-5 dni) mysich ślimaków pod mikroskopem. Następnie komórki trawiono enzymatycznie do zawiesiny jednokomórkowej i identyfikowano za pomocą immunofluorescencji po kilku dniach w hodowli.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od nowonarodzonych myszy

Tutaj opisujemy technikę pobierania ludzkich narządów przedsionkowych w warunkach fizjologicznych podczas labiryntektomii i ich analizę za pomocą barwienia immunologicznego.

Pobieranie końcowych narządów przedsionkowych w warunkach fizjologicznych podczas labiryntektomii

Poznaj szybką metodę cięcia kości skroniowej człowieka przy użyciu mikropiły z podwójnymi diamentowymi ostrzami. Technika skraca czas przetwarzania z 9-10 miesięcy do 10-14 dni, umożliwiając szybką analizę patologii ucha środkowej związanej z COVID-19.

Szybkie cięcie kości skroniowej człowieka w celu oceny patologii ucha środkowego związanej z COVID-19

Przeglądaj więcej filmów