Charakterystyka białka transbłonowego pojedynczego pęcherzyka zewnątrzkomórkowego za pomocą cytometrii nanoprzepływowej

Dogłębna charakterystyka pojazdów elektrycznych może być trudna, ponieważ wymaga wielu instrumentów do opisania poszczególnych parametrów. Pomiar tych kluczowych kryteriów za pomocą jednej techniki, takiej jak cytometria nanoprzepływowa, opisuje jednocześnie wiele subpopulacji EVs. Tak więc każdy EV jest mierzony indywidualnie, identyfikując cząstki o średnicy większej niż 14 nanometrów bez etykietowania przed określeniem ich fluorescencji.

Zapewnia to solidny zestaw danych, usuwając fałszywe alarmy. Cytometria nanoprzepływowa może być stosowana do EV z różnych źródeł, w tym wzbogaconych z osocza, płynu mózgowo-rdzeniowego i pożywki hodowlanej. Technika ta jest również wykorzystywana do analizy wirusów, nanocząstek lipidowych i nanomateriałów.

Ważne jest, aby zoptymalizować protokół etykietowania. Maksymalizuje to fluorescencję związaną z cząstką w porównaniu z resztkową fluorescencją pozostawioną w buforze. Aby rozpocząć, włącz instrument, załaduj Nano-Flow Profession i wybierz Start Up z menu rozwijanego Sjacket Flow, załaduj wodę do doku załadowczego i wybierz Boosting z menu rozwijanego Sheath Flow.

Rozcieńczyć kulki QC od 1 do 100 w wodzie destylowanej w probówce o pojemności 0,6 mikrolitra i umieścić je w doku załadowczym, aby wprowadzić próbkę do systemu. Następnie zwiększ próbkę przez 45 sekund, jak pokazano wcześniej, aby całkowicie zastąpić poprzednią próbkę, wodę lub roztwór czyszczący. Podczas zwiększania ustaw moc lasera na wstępnie ustawiony szablon dla koralików QC na 250 nanometrów FL QC standard.

Później, aby zmniejszyć ciśnienie w układzie, wybierz ciśnienie próbkowania z tego samego menu rozwijanego i ustaw ciśnienie automatycznego próbkowania na jeden kilogram paskala, aby utrzymać stałe ciśnienie. Następnie zainicjuj jednominutową analizę, wybierając opcję Czas do nagrania z kontrolek pozyskiwania. Dane zostaną wykreślone na wykresie punktowym przedstawiającym skalę logarytmiczną intensywności rozproszenia bocznego i wybraną intensywność fluorescencji.

Przed zapisaniem pliku należy wstawić nazwę pliku i rozcieńczenie próbki. Następnie wybierz rozładunek, aby wyjąć rurę z doku załadunkowego. Zastąp kulki QC 150 mikrolitrami roztworu czyszczącego i czyść przez ponad 30 sekund, wybierając opcję Boosting.

Używając probówki zawierającej 150 mikrolitrów wody, usuń nadmiar roztworu czyszczącego z końcówki kapilarnej, zanurzając końcówkę w wodzie. Następnie rozcieńczyć standardowe kulki od jednego do 100 w wodzie i załadować 100 mikrolitrów do doku załadunkowego. Teraz ustaw moc lasera na wstępnie ustawiony szablon, S16 EXO 68 na 155 nanometrów.

To ustawienie dotyczy zarówno wzorca rozmiaru, jak i próbek zawierających EV mniejsze niż 200 nanometrów. Wybierz pobieranie próbek i kontynuuj rejestrowanie próbki przez jedną minutę. Wykonaj trzeci pomiar z próbką wody lub PBS, aby utworzyć ślepą próbkę dewaluującą pomiar, identyfikując wyniki fałszywie dodatnie do usunięcia przez oprogramowanie.

Rozcieńczyć nieznakowane próbki EV w PBS do odpowiedniego zakresu stężeń cząstek od jednego razy 10 do ósmego do pięciu razy 10 do ósmych cząstek na mililitr do analizy nFCM. I załadować od 10 do 100 mikrolitrów rozcieńczonej próbki do doku załadowczego. Jeżeli stężenie cząstek nie jest znane, należy rozpocząć od rozcieńczenia próbki EV w stosunku 1 do 100.

Stężenie próbki można szybko przybliżyć na podstawie rozmiaru plamki lasera na kamerze CCD podczas wzmacniania lub na podstawie obserwacji śladu rozbłysku podczas próbkowania. Gdy załadowana próbka zostanie wzmocniona przez 45 sekund, nagrywaj przez jedną minutę i zapisz plik, jak pokazano wcześniej. Po nagraniu rozpocznij analizę tych danych, przełączając się z zakładki Akwizycja na zakładkę Analiza i otwierając zapisane pliki NFA.

Aby uzyskać dokładny pomiar próbki, należy użyć dwóch standardowych pomiarów wykonanych przed pomiarem próbki, aby ustawić wartości do porównania próbki, a także ślepej próby. Utwórz krzywą standardową rozmiaru do konwersji rozrzutu bocznego na średnicę, wybierając plik standardu rozmiaru i używając narzędzia do ustawiania progu. Próg, widoczny w śladzie serii zdarzenia, określa minimalne natężenie sygnału wymagane do uznania zdarzenia za znaczące.

Po ustawieniu progu sprawdź parametry wykresu kropkowego, SS-H lub SS-A na osi X i FITC-A na osi Y. Otwórz narzędzie Generowanie krzywej standardowej i wybierz S16 EXO od 68 do 155 nanometrów jako szablon rozmiaru. Kliknij przycisk Znajdź szczyty, aby zidentyfikować intensywność piku rozpraszania bocznego jako cząstki o średnicy 68, 91, 113 lub 155 nanometrów.

Przed zamknięciem okna należy sprawdzić, czy została wygenerowana krzywa rozrzutu boku do średnicy z wartością R bliską jedności. Ustaw normę stężenia. Wybierz zapisany plik, kliknij zlicz wzorzec i wprowadź stężenie cząstek wzorca.

Ustaw standardowe informacje. Wybierz przykładowy plik EV i ustaw próg. Wybierz pusty plik i kliknij ustaw pusty, aby zidentyfikować liczbę wyników fałszywie dodatnich do usunięcia z liczby próbek.

Po otwarciu narzędzia do generowania plików PDF sprawdź rozmiar, stężenie i rozcieńczenia próbki. Następnie pokaż stężenie próbki i rozkład wielkości cząstek. Po oznaczeniu próbek EV zgodnie z opisem w manuskrypcie, weź jeden mikrolitr oznakowanej próbki i rozcieńcz jeden do 50 w PBS w probówce o pojemności 0,6 mililitra.

Załadować próbkę do stanowiska załadowczego i stosować ciśnienie doładowania przez 45 sekund. Upewnij się również, że ustawienia lasera są prawidłowe i załadowane są odpowiednie soczewki. Teraz przełącz się na ciśnienie próbkowania i wybierz czas nagrywania.

Po jednominutowym akwizycji nazwij plik danych i zapisz. Rozładuj próbkę, zastąp ją roztworem czyszczącym i zwiększ roztwór czyszczący przez ponad 30 sekund przed załadowaniem następnej oznaczonej próbki, jak pokazano wcześniej. W przypadku generowania plików PDF należy zastosować te same standardy, co opisano powyżej.

Tylko ślepy pomiar zostanie ustawiony inaczej. Wybierz przykładowy plik i ustaw próg. Wybierz narzędzie do bramkowania i użyj lewego przycisku myszy, aby narysować linię oddzielającą populację fluorescencyjnie dodatnią.

Ustaw nazwy i kolory reprezentacji. Ustaw pusty plik i kliknij ustaw pusty, aby zidentyfikować liczbę wyników fałszywie dodatnich do usunięcia z każdej innej populacji. Otwórz narzędzie do generowania plików PDF i zidentyfikuj rozkład wielkości, stężenie i procent subpopulacji fluorescencyjnie dodatniej.

Na wykresie punktowym zmień oś Y, aby pokazać pomiary fluorescencji z kanału zielonego lub czerwonego. Ustaw puste miejsce i wygeneruj plik PDF, jak pokazano wcześniej. Na wykresie kropkowym ustaw oś X na FITC, a oś Y na APC.

Wykorzystaj narzędzie kwadrantowe, aby zidentyfikować populacje podwójnie fluorescencyjnie dodatnie. Ustaw nazwy i kolory tak, aby były reprezentatywne, a następnie otwórz plik PDF i wybierz subpopulacje fluorescencyjne. EV pochodzące z C2C12 wykazały około 50% prezentacji CD9, 30% CD63, a 70% populacji prezentowało co najmniej jeden z trzech markerów EV.

Profile wielkości dla pojedynczych subpopulacji EV znakowanych tetraspaniną wykazały większą medianę wielkości wynoszącą około 75 do 85 nanometrów i mniej niż 65 nanometrów EV w porównaniu z całkowitą populacją cząstek. EV pochodzące z SW620 wykazały około 40% prezentacji CD9, 7% CD63 i 42% cząstek jako posiadających co najmniej jeden z trzech markerów. EV pochodzące z SW620, znakowane tetraspaniną wykazywały bardziej normalny rozkład i większą średnicę mediany między 90 a 110 nanometrów z podobnymi rozkładami między poszczególnymi subpopulacjami tetraspaniny.

Znakowanie membranowe wielokrotnie wykazało 80% pozytywność EV pochodzących z C2C12 i SW620. Intensywność rozproszenia bocznego korelowała z intensywnością FITC na wykresach punktowych zarówno C2C12, jak i SW620. Dwudodatnie wartości procentowe są bardzo podobne do dodatnich wartości procentowych tetraspaniny.

A znakowanie CD63 wydaje się wykazywać najsłabszą korelację z etykietowaniem membranowym. Procentowe pomiary dodatniości były podobne między znakowaniem przeciwciał z dodatkowym znakowaniem błonowym i bez niego. Średnia intensywność fluorescencji dla fluorescencyjnych populacji EV pochodzących z C2C12 sugerowała niższą prezentację CD63 i CD81 w porównaniu z EV CD9, podczas gdy SW620 wykazał, że użycie wszystkich trzech przeciwciał zapewnia większy sygnał fluorescencyjny niż jakakolwiek pojedyncza etykieta przeciwciała W tym protokole powszechne markery EV zostały znakowane fluorescencyjnie, ale wiele celów przeciwciał można wybrać, aby pokazać pochodzenie EV, funkcję EV lub stan chorobowy.