Name: Charakterystyka białka transbłonowego pojedynczego pęcherzyka zewnątrzkomórkowego za pomocą cytometrii nanoprzepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Poznaj metodę Nano-Flow Cytometry do analizy pojedynczych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) większych niż 14 nm. Technika ta umożliwia bezetykietowe pomiary fluorescencji, eliminując fałszywe wyniki i zapewniając dokładną charakterystykę subpopulacji białek transbłonowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować grupom Owena Daviesa i Nicka Peake'a za nieustanne dostarczanie materiałów i ekspertyzy.

1. Konfiguracja przyrządu nFCM i pomiary standardów nFCM
UWAGA: Trzy pomiary są wykonywane przed rozpoczęciem zbierania danych dla próbek, aby potwierdzić poprawność ustawienia instrumentu nFCM i zapewnić mocne porównanie między instrumentami. Są to wzorzec stężenia/kontrola jakości (QC), wzorzec rozmiaru i ślepa próba.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć kulki QC w stosunku 1:100 w wodzie destylowanej w odpowiedniej probówce o pojemności 0,6 μl i umieścić w doku załadowczym.</li>
	<li>Z menu rozwijanego Sample Flow (Przepływ próbki) wybierz opcję Boosting (Zwiększanie jakości), aby wprowadzić próbkę kontroli jakości do systemu na 45 sekund w celu całkowitego zastąpienia poprzedniej próbki/roztworu czyszczącego.
	<ol>
		<li>Podczas zwiększania należy ustawić moc lasera na wstępnie ustawiony szablon dla koralików QC "250 nm FL QC standard", np. 10/40 mW dla niebieskiego lasera, 20/50 mW dla czerwonego lasera, z 0,2% zanikiem SS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz Sampling pressure z tego samego menu w dół, aby zmniejszyć ciśnienie w układzie.</li>
	<li>Ustaw ciśnienie automatycznego próbkowania na 1,0 kPa, aby utrzymać stałe ciśnienie.</li>
	<li>Zainicjuj 1-minutową analizę, wybierając pozycję Czas do nagrania z kontrolek pozyskiwania. Dane zostaną wykreślone na wykresie kropkowym przedstawiającym skalę logarytmiczną intensywności SS i wybranej intensywności FL.</li>
	<li>Wstaw nazwę pliku i rozcieńczenie próbki przed zapisaniem pliku.</li>
	<li>Wybierz opcję rozładunku, aby wyjąć rurę z doku załadunkowego. Zastąp roztworem czyszczącym 150 μl i czyść przez >30 s, wybierając opcję Boosting, a następnie wyjmij roztwór czyszczący, wybierając opcję Rozładunek.
	<ol>
		<li>Usuń nadmiar roztworu czyszczącego z końcówki kapilarnej za pomocą probówki zawierającej 150 μl wody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć kulki o standardowym rozmiarze 1:100 w wodzie i załadować 100 μl do doku załadowczego, przed zwiększaniem próbki przez 45 s.</li>
	<li>Ustaw moc lasera na wstępnie ustawiony szablon "S16 exo 68-155 nm". To ustawienie dotyczy zarówno wzorca rozmiaru, jak i próbek zawierających EV < 200 nm. Na przykład 15/40 mW dla niebieskiego lasera, 20/50 mW dla czerwonego lasera, z 0,2% zanikiem SS.</li>
	<li>Wybierz opcję Sampling (Próbkowanie) i kontynuuj nagrywanie próbki przez 1 minutę, tak jak poprzednio.</li>
	<li>Wykonaj trzeci pomiar za pomocą próbki wody lub PBS, aby utworzyć ślepy pomiar eluentu, identyfikując fałszywe alarmy do usunięcia przez oprogramowanie. Wprowadzanie pomiarów wzorcowych opisano w poniższym rozdziale.</li>
</ol>
2. Określanie stężenia cząstek w nieoznakowanej próbce i generowanie raportu PDF
<ol>
	<li>Rozcieńczyć nieznakowaną próbkę EV w PBS do odpowiedniego zakresu stężeń cząstek do analizy nFCM, 1 x 108-5 x 108 cząstek/ml. Załadować 10-100 μl rozcieńczonej próbki do doku załadowczego.</li>
	<li>Gdy stężenie cząstek nie jest znane, należy rozpocząć od rozcieńczenia próbki EV w stosunku 1:100. Stężenie próbki można szybko przybliżyć na podstawie rozmiaru plamki lasera w kamerze CCD podczas wzmacniania lub na podstawie obserwacji śladu impulsu zdarzenia podczas próbkowania.</li>
	<li>Zwiększ załadowaną próbkę na 45 s przed wybraniem opcji Sampling i nagrywaj przez 1 minutę, oszczędzając zgodnie z wcześniejszym opisem.</li>
	<li>Aby rozpocząć analizę tych danych, należy przejść z zakładki Akwizycja na kartę Analiza. Otwórz zapisane pliki nfa.</li>
	<li>Aby umożliwić dokładny pomiar próbki, należy użyć dwóch standardowych pomiarów wykonanych przed pomiarem próbki, aby ustawić wartości do porównania próbki, a także ślepej próby.</li>
	<li>Utwórz krzywą standardową rozmiaru do konwersji SS na średnicę, najpierw wybierając plik standardu rozmiaru i używając narzędzia do ustawiania progu (znanego również jako automatyczne progowanie). Próg, widoczny w śladzie serii zdarzenia, określa minimalne natężenie sygnału wymagane do uznania zdarzenia za znaczące.</li>
	<li>Po ustawieniu progu sprawdź, czy parametry x i y wykresu kropkowego to SS-H lub SS-A na osi x i FITC-A na osi y.</li>
	<li>Otwórz narzędzie do generowania krzywej standardowej i wybierz S16 exo 68-155 nm jako szablon rozmiaru. Kliknij Znajdź szczyty, aby zidentyfikować szczytowe intensywności SS jako cząstki o średnicy 68, 91, 113 lub 155 nm.</li>
	<li>Przed zamknięciem okna sprawdź, czy krzywa SS do średnicy została wygenerowana z wartością r bliską 1.</li>
	<li>Ustaw normę stężenia, wybierając zapisany plik i klikając Policz choroby przenoszone drogą płciową. Wprowadź stężenie cząstek w wzorcu.</li>
	<li>Po ustawieniu standardowych informacji wybierz przykładowy plik EV i ustaw próg.</li>
	<li>Wybierz pusty plik i kliknij przycisk Ustaw puste, aby określić liczbę wyników fałszywie dodatnich do usunięcia z liczby próbek. Należy to zrobić przy tym samym progu, co próbka. Wróć do przykładowego pliku EV.</li>
	<li>Otwórz narzędzie do generowania plików PDF i wybierz opcję Rozmiar i koncentracja. Wprowadzić rozcieńczenia próbki. Pokazane jest stężenie próbki i rozkład wielkości cząstek.</li>
</ol>
3. Przykładowe etykietowanie
UWAGA: Dwie strategie barwienia mogą być stosowane jednocześnie do kompleksowej analizy cząstek w zawiesinie. Protokoły znakowania często wymagają optymalizacji pod kątem nowych przeciwciał lub źródeł próbek.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć część próbki EV do stężenia 1,25 x10 10 cząstek/ml w PBS. Inkubować 8 μl rozcieńczonej próbki EV z 1 μl przeciwciała i 1 μl barwnika dla stężenia cząstek 1 x10 10 cząstek/ml (całkowite cząstki będą 1 x 108 zawieszone w 10 μl). W tym przypadku stosunek inkubacji przeciwciała wynosi 1:50 (1 μl przeciwciała 1:5).
	<ol>
		<li>Podczas optymalizacji należy użyć więcej niż trzech różnych stężeń przeciwciała lub barwnika, aby uzyskać dane wskazujące, że protokół pozwala na maksymalne wiązanie epitopów bez nadmiernego nasycenia wybranej etykiety, co może utrudnić identyfikację zdarzeń fluorescencyjnych o niskiej intensywności. Stężenie inkubacyjne barwnika membranowego wynosi 40 nM (1 μl z 400 nM).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymieszać 10 μl próbki, wirując przez 5 s i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności. 
	UWAGA: W dyskusji znajdują się zalecenia dotyczące kontroli.</li>
	<li>Po inkubacji pobrać 1 μl znakowanej próbki i rozcieńczyć w stosunku 1:50 w PBS w probówce o pojemności 0,6 ml.</li>
	<li>Załaduj próbkę do stanowiska załadowczego i stosuj ciśnienie doładowania przez 45 s. Upewnij się, że ustawienia lasera są prawidłowe i załadowane są odpowiednie soczewki.</li>
	<li>Przełącz się na ciśnienie próbkowania i wybierz Czas nagrywania. Po upływie 1 minuty pobierania nazwij plik danych i zapisz.</li>
	<li>Rozładować próbkę i zastąpić ją roztworem czyszczącym. Zwiększ to na >30 s przed załadowaniem następnej oznaczonej próbki.</li>
</ol>
4. Analiza nFCM-Generowanie PDF do analizy subpopulacji
<ol>
	<li>W przypadku generowania plików PDF zastosuj te same standardy, co poprzednio; tylko pusty pomiar zostanie ustawiony inaczej.</li>
	<li>Wybierz przykładowy plik i ustaw próg. Na wykresie kropkowym zmień oś y, aby pokazać pomiary FL z kanału zielonego lub czerwonego.</li>
	<li>Wybierz narzędzie do bramkowania kwadratowego i użyj lewego przycisku myszy, aby narysować kwadrat wokół populacji FL+.</li>
	<li>Otwórz pusty plik pomiarowy i kliknij Ustaw puste przed powrotem do przykładowego pliku.</li>
	<li>Otwórz narzędzie do generowania plików PDF jak poprzednio, a rozkład rozmiaru, stężenie i procent (w porównaniu ze wszystkimi zdarzeniami SS+) zostaną zidentyfikowane dla subpopulacji FL+.
	<ol>
		<li>Powtórz te czynności dla każdej subpopulacji będącej przedmiotem zainteresowania oznaczonej jako "Ogółem, P1, P2 itd."</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Couch, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+nearly+EV-erything+-+The+rise+and+rise+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A brief history of nearly EV-erything - The rise and rise of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (14), 12144(2021).</li>
<li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+extracellular+vesicles%2C+their+origin%2C+composition%2C+purpose%2C+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727(2019).</li>
<li>Grant, L. R., Milic, I., Devitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell-derived+extracellular+vesicles%3A+structure-function+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell-derived extracellular vesicles: structure-function relationships.</a> Biochemical Society Transactions. 47 (2), 509-516 (2019).</li>
<li>Rontogianni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+extracellular+vesicles+allows+for+human+breast+cancer+subtyping%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping.</a> Communications Biology. 2, 325(2019).</li>
<li>Sahoo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+and+diagnostic+translation+of+extracellular+vesicles+in+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Therapeutic and diagnostic translation of extracellular vesicles in cardiovascular diseases.</a> Circulation. 143 (14), 1426-1449 (2021).</li>
<li>Chiang, C. -Y., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+characterizing+extracellular+vesicles+at+a+single-particle+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Toward characterizing extracellular vesicles at a single-particle level.</a> Journal of Biomedical Science. 26 (1), 9(2019).</li>
<li>Karimi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+the+plasma+extracellular+vesicle+proteome+after+separation+from+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2873-2886 (2018).</li>
<li>Akers, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+technologies+for+quantifying+Extracellular+Vesicles+%28EVs%29+in+Clinical+Cerebrospinal+Fluids+%28CSF%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF).</a> PLOS ONE. 11 (2), 0149866(2016).</li>
<li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis+-+An+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016(2019).</li>
<li>Vogel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+particle+concentration+of+multimodal+synthetic+reference+materials+and+extracellular+vesicles+with+orthogonal+techniques%3A+Who+is+up+to+the+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Measuring particle concentration of multimodal synthetic reference materials and extracellular vesicles with orthogonal techniques: Who is up to the challenge.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12052(2021).</li>
<li>Van Der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy%2C+flow+cytometry%2C+nanoparticle+tracking+analysis%2C+and+resistive+pulse+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).</li>
<li>Hartjes, T. A., Mytnyk, S., Jenster, G. W., Van Steijn, V., Van Royen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+quantification+and+characterization%3A+Common+methods+and+emerging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches.</a> Bioengineering. 6 (1), 7(2019).</li>
<li>Zhao, Z., Wijerathne, H., Godwin, A. K., Soper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+methods+of+extracellular+vesicles+%28EVs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Extracellular+Vesicles+and+Circulating+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis methods of extracellular vesicles (EVs).</a> Extracellular Vesicles and Circulating Nucleic Acids. 2, 80-103 (2021).</li>
<li>Johnsen, K. B., Gudbergsson, J. M., Andresen, T. L., Simonsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+blood+concentration+of+extracellular+vesicles%3F+Implications+for+the+use+of+extracellular+vesicles+as+blood-borne+biomarkers+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">What is the blood concentration of extracellular vesicles? Implications for the use of extracellular vesicles as blood-borne biomarkers of cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1871 (1), 109-116 (2019).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-scattering+detection+below+the+level+of+single+fluorescent+molecules+for+high-resolution+characterization+of+functional+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Light-scattering detection below the level of single fluorescent molecules for high-resolution characterization of functional nanoparticles.</a> ACS Nano. 8 (10), 10998-11006 (2014).</li>
<li>Van Der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+extracellular+vesicle+measurements+by+flow+cytometry+through+vesicle+diameter+approximation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Standardization of extracellular vesicle measurements by flow cytometry through vesicle diameter approximation.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1236-1245 (2018).</li>
<li>Lucchetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+extracellular+vesicles+by+conventional+flow+cytometry%3A+dream+or+reality%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Measuring extracellular vesicles by conventional flow cytometry: dream or reality.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6257(2020).</li>
<li>Suárez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11271(2017).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+profiling+and+sizing+of+extracellular+vesicles+from+colorectal+cancer+patients+via+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Protein profiling and sizing of extracellular vesicles from colorectal cancer patients via flow cytometry.</a> ACS Nano. 12 (1), 671-680 (2018).</li>
<li>Silva, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+protein+cargo+loading+into+engineered+extracellular+vesicles+at+single-vesicle+and+single-molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (10), 12130(2021).</li>
<li>Dragovic, R. A., Southcombe, J. H., Tannetta, D. S., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+flow+cytometry+and+nanoparticle+tracking+analysis+of+extracellular+vesicles+in+the+plasma+of+normal+pregnant+and+pre-eclamptic+women%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Multicolor flow cytometry and nanoparticle tracking analysis of extracellular vesicles in the plasma of normal pregnant and pre-eclamptic women.</a> Biology of Reproduction. 89 (6), 151(2013).</li>
<li>Teng, F., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+extracellular+vesicle+biogenesis+and+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Shedding light on extracellular vesicle biogenesis and bioengineering.</a> Advanced Science. 8 (1), 2003505(2021).</li>
<li>Laulagnier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell-+and+dendritic+cell-derived+exosomes+display+a+specific+lipid+composition+and+an+unusual+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mast cell- and dendritic cell-derived exosomes display a specific lipid composition and an unusual membrane organization.</a> Biochemical Journal. 380, 161-171 (2004).</li>
<li>Simonsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitfalls+associated+with+lipophilic+fluorophore+staining+of+extracellular+vesicles+for+uptake+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Pitfalls associated with lipophilic fluorophore staining of extracellular vesicles for uptake studies.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1582237(2019).</li>
<li>Collot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MemBright%3A+A+family+of+fluorescent+membrane+probes+for+advanced+cellular+imaging+and+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">MemBright: A family of fluorescent membrane probes for advanced cellular imaging and neuroscience.</a> Cell Chemical Biology. 26 (4), 600-614 (2019).</li>
<li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+and+efficiency+assessment+of+six+extracellular+vesicle+isolation+methods+by+nano-flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Quality and efficiency assessment of six extracellular vesicle isolation methods by nano-flow cytometry.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1697028(2020).</li>
<li>Mondal, A., Ashiq, K. A., Phulpagar, P., Singh, D. K., Shiras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+visualization+and+easy+tracking+of+extracellular+vesicles+in+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Effective visualization and easy tracking of extracellular vesicles in glioma cells.</a> Biological Procedures Online. 21, 4(2019).</li>
<li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles%3A+A+systematic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162(2022).</li>
<li>Jayachandran, M., Miller, V. M., Heit, J. A., Owen, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+isolation%2C+identification+and+characterization+of+microvesicles+in+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodology for isolation, identification and characterization of microvesicles in peripheral blood.</a> Journal of Immunological Methods. 375 (1-2), 207-214 (2012).</li>
<li>Mizenko, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraspanins+are+unevenly+distributed+across+single+extracellular+vesicles+and+bias+sensitivity+to+multiplexed+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Tetraspanins are unevenly distributed across single extracellular vesicles and bias sensitivity to multiplexed cancer biomarkers.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 250(2021).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).</li>
<li>Laulagnier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+products+concentrate+in+a+subset+of+exosomes+specifically+endocytosed+by+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein products concentrate in a subset of exosomes specifically endocytosed by neurons.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (4), 757-773 (2018).</li>
<li>Simonsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+we+looking+at%3F+Extracellular+vesicles%2C+lipoproteins%2C+or+both%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both.</a> Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).</li>
<li>Sódar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Scientific Reports. 6, 24316(2016).</li>
<li>Brennan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+for+the+isolation+and+separation+of+extracellular+vesicles+from+protein+and+lipid+particles+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum.</a> Scientific Reports. 10 (1), 103(2020).</li>
<li>Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. -A., Jones, M., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ready-made+chromatography+columns+for+extracellular+vesicle+isolation+from+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27269(2015).</li>
<li>Peruzzotti-Jametti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+traffic+functional+mitochondria+via+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells traffic functional mitochondria via extracellular vesicles.</a> PLOS Biology. 19 (4), 3001166(2021).</li>
<li>Arab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+extracellular+vesicles+and+synthetic+nanoparticles+with+four+orthogonal+single-particle+analysis+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (6), 12079(2021).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
</ol>

A.L., B.P., D.A., R.L, R.T są pracownikami NanoFCM, a ich wkład w ten artykuł został wniesiony w ramach ich zatrudnienia.

Szczegóły dotyczące próbki i odczynnika Wybrano dwa izolaty EV z oddzielnych linii komórkowych do demonstracji znakowania fluorescencyjnego i późniejszej analizy nFCM. Oba zestawy EV zawieszono w PBS i przechowywano w temperaturze -80 °C przez <3 miesiące, ale większość innych warunków różniła się między izolatami. Mysia linia komórkowa mioblastów C2C12 stanowi embrionalny prekursor komórek mięśni szkieletowych i była hodowana w hodowli 2D, kondycjonując pożywkę wzrostową przez 72 godziny przed izolacją EV przez ultrawirowanie. SW620 to ludzka linia komórkowa gruczolakoraka jelita grubego i była hodowana w podstawowym bioreaktorze, wzbogacając pożywkę przez 7 tygodni, z izolacją EV przeprowadzoną metodą chromatografii wykluczającej wielkość (SEC) i frakcjami 7-9 eluowanymi z sefarozy kolumn CL-2B połączonych w jedną próbkę.
Podczas gdy EV wyizolowane i skoncentrowane z CCM są najłatwiejszymi typami próbek w obróbce, nFCM ma zastosowanie do większości izolatów EV, w tym płynów biologicznych, takich jak surowica, osocze, mocz i płyn mózgowo-rdzeniowy. Te analizy próbek korzystają z detekcji nFCM SS wszystkich cząstek, co pozwala na potwierdzenie z NTA, TRPS i innymi analizami cząstek, jednocześnie opisując fluorescencyjnie znakowane subpopulacje EV pod względem ilościowym, a także proporcji całości, w celu bezstronnego podejścia do wieloparametrowej analizy cząstek. Możliwa jest również analiza próbek o niskiej przetworzonej jakości, takich jak nieoczyszczony mocz i CCM wzbogacony w EV, z zastrzeżeniem, że wymaga białka o niskiej zawartości zanieczyszczeń.
Zastosowany tutaj barwnik błonowy ma na celu integrację z dwuwarstwą lipidową, z ugrupowaniem lipofilowym do obciążenia błony i barwnikiem hydrofilowym do pozostawania w błonie plazmatycznej25. Obecnie nie ma idealnego barwnika do etykietowania EV i przy wyborze należy wziąć pod uwagę kilka kryteriów, w tym specyficzność dla EV, przydatność do utrwalania lub przepuszczalności oraz skuteczność etykietowania EV26.
Fluorescencyjne znakowanie przeciwciałami sprzężonymi epitopów eksponowanych powierzchniowo okazało się skuteczną metodą identyfikacji subpopulacji EV27. Kluczowym aspektem optymalizacji protokołu jest spełnienie, a nie przekroczenie, punktu nasycenia znakowania, aby związać się ze wszystkimi dostępnymi epitopami bez hamowania wykrywania cząstek o niskiej fluorescencji poprzez umożliwienie wypełnienia otaczającego buforu fluorescencyjnym niezwiązanym przeciwciałem28. Ponadto na dostępność odsłoniętych miejsc wiązania do znakowania przeciwciał może mieć wpływ kilka czynników. Wykazano, że warunki przechowywania EV wpływają na profile koncentracji i wielkości EV29 , przy czym obserwacje wskazują również na wpływ na znakowanie przeciwciał30. Obecność powierzchniowych białek koronowych, modyfikacje białek i wpływ technik izolacji mogą również mieć wpływ na znakowanie przeciwciał w niektórych przypadkach. Ostatecznie, w miarę jak stosowanie znakowania fluorescencyjnego staje się coraz bardziej powszechne w badaniach EV, projektowanie eksperymentalne i optymalizacja dla wielu technik analitycznych staną się bardziej wyrafinowane.
Aby zwiększyć dokładność wyników, można uwzględnić kilka kontroli, takich jak (1) kontrola barwnika PBS +, w celu oceny tworzenia się miceli lub agregatów w niektórych barwnikach, które mogą pojawiać się jako cząstki SS + w analizie nFCM, (2) kontrola przeciwciał PBS +, mogą wystąpić agregaty, choć często nie na tyle duże, aby rozproszyć wystarczająco dużo światła do wykrycia SS, (3) próbka EV + kontrola przeciwciał IgG, powszechne w cytometrii przepływowej i stosowane do identyfikacji wszelkich niespecyficznych wiązań, (4) próbka cząstek niebędących EV + kontrola przeciwciał/barwnika - szczególnie ważne w przypadku konieczności identyfikacji EV w złożonych próbkach cząstek, kontrole, takie jak oczyszczone cząsteczki lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) lub próbki zubożone/ablowane EV mogą działać jako kontrola negatywna w celu walidacji selektywnego znakowania, (5) kontrole pozytywne są trudne do zaprojektowania, ale walidacja przeciwciała na komórkach jest użytecznym włączeniem.
Prezentacja tetraspanin na pojazdach elektrycznych Znakowanie przeciwciał i błon w tym eksperymencie pokazuje wysoki poziom danych ilościowych, które można uzyskać w krótkim czasie za pomocą analizy nFCM. Jednoczesny pomiar kluczowych atrybutów fizycznych średnicy/stężenia cząstek z pomiarami fenotypowymi obecności błony i/lub białka prowadzi do opisów subpopulacji na wysokim poziomie w izolacji cząstek.
Co ważne, w tych dwóch próbkach EV zidentyfikowano różne poziomy trzech "kluczowych" tetraspanin związanych z EV, CD9, CD63 i CD81. CD9 zaprezentowano w największym odsetku EV zarówno dla EV pochodzących z C2C12, jak i SW620, przy czym CD81 i CD63 były odpowiednio drugim i najrzadziej prezentowanym białkiem.
Pomimo pewnych podobieństw zaobserwowanych tutaj w profilach tetraspaniny EV z dwóch bardzo różnych źródeł komórkowych, poziomy CD9, CD63 i CD81 mogą być bardzo różne między EV pochodzącymi od linii komórkowych i pacjentów31.
Różnica w ekspresji CD63 między dwiema próbkami EV jest szczególnie istotna dla toczącej się dyskusji na temat kluczowych identyfikatorów "EV-ness". Podczas gdy prezentacja CD63 tylko w ~8% EV SW620 może być dla niektórych nieoczekiwana, CD63 został zasugerowany jako słaba identyfikacja różnych typów EV izolowanych przez rozmiar lub gęstość32, a tetraspaninowe ujemne EV zostały zidentyfikowane, nawet gdy są opisane jako egzosomypodobne 33.
Identyfikacja EV w złożonych izolacjach cząstek Niejednorodność profili tetraspaniny EV, zarówno w EV pochodzących od pacjentów, zarówno w liniach komórkowych, jak i od pacjentów, ostrzega przed poleganiem na wychwytywaniu EV na bazie tetraspaniny i podkreśla przyszłe zapotrzebowanie na nowe metody identyfikacji EV31. Znakowanie EV niezależnie od określonych białek może okazać się bardzo korzystne dla identyfikacji EV od cząstek innych niż EV o podobnych rozmiarach, jeśli można udowodnić, że swoistość EV jest bardzo wysoka. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku izolatów EV z biopłynów, ponieważ sugeruje się, że stężenie EV w ludzkim osoczu krwi mieści się w zakresie10-10 cząstek/ml, podczas gdy lipoproteiny mierzy się na poziomie 10-16 na ml14,34. Nawet po wzbogaceniu EV, badania porównujące dodatnie cząstki dla markerów tetraspaniny i / lub markera LDL ApoB sugerują ~50-100 razy większą obfitość LDL w próbkach osocza bezpłytkowego (PFP) w porównaniu z EV35.
Zastosowana technika izolacji ma ogromny wpływ na zakres współizolowanych cząstek innych niż EV, takich jak lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości (VLDL), lipoproteiny o średniej gęstości (IDL) i LDL36. Istnieją również opisy koizolatów lipoprotein związanych z EV, które, choć potencjalnie odgrywają ważną rolę biologiczną, sprawiają, że uzyskanie czystych próbek EV jest trudnym celem35.
W związku z tym można argumentować, że należy położyć większy nacisk na opis cząstek, które składają się na próbkę, a nie na osiągnięcie izolacji czystego, ale ograniczonego wyboru EV. Uzyskanie wyczerpującego opisu cząstek poprzez pomiar obfitości tetraspaniny w objętości i liczby cząstek oddzielnie może być niewystarczające do dokładnego określenia stężeń EV, szczególnie ze źródeł biopłynów36,37. Identyfikacja subpopulacji w podejściu opartym na poziomach, pokazująca całkowite cząstki, EV i EV prezentujące określone białka, jak wykazano w tym eksperymencie, może zapewnić solidne rozwiązanie w zakresie charakterystyki nanocząstek. Tak było w przypadku projektów obejmujących ładowanie pojazdów elektrycznych z projektami przyszłych zastosowań terapeutycznych20 oraz identyfikację pojazdów elektrycznych CD63+ z ładunkiem luminalnym, takim jak mitochondria38.
nFCM w repertuarze analityki EV Mocną stroną analizy nFCM EV jest sposób, w jaki dane mogą potwierdzać i opierać się na najczęstszych analizach EV oraz tworzyć pomosty między zestawami danych fizycznych i fenotypowych. Opiera się to jednak na dokładnych protokołach etykietowania, które często muszą być zoptymalizowane pod kątem unikalnych odczynników do znakowania, takich jak barwniki i przeciwciała. Kluczowym kryterium dokładnej analizy jest zawieszenie znakowanych cząstek w buforze niefluorescencyjnym, co polega albo na usunięciu nadmiaru niezwiązanego fluoroforu, albo na udoskonaleniu protokołów, aby nie przekroczyć nasycenia epitopów.
Badania porównawcze wykazały, że wymiarowanie pojazdów elektrycznych nFCM dostarcza danych zgodnych z TRPS i cryo-TEM, technikami, które są opisywane jako dokładniejsze niż NTA do analizy wielkości EV10,39. Jednak, podobnie jak w przypadku każdej metody opartej na optyce, przy interpretacji danych należy wziąć pod uwagę wpływ heterogenicznych właściwości optycznych obserwowanych dla EV oraz różnice między właściwościami optycznymi materiału odniesienia i EV10.
Western blotting jest kluczową metodą oznaczania wzbogacenia EV poprzez identyfikację markerów EV40. Jednak chęć wykazania obecności takich markerów na cząstkach doprowadziła do postępów w analizach cytometrycznych przepływowych opartych na pojazdach elektrycznych17. Jednak rozdzielczości niezbędne do dostarczenia wiarygodnych danych są obecnie najlepiej osiągane za pomocą dedykowanego oprzyrządowania zarówno w odniesieniu do światła rozproszonego, jak i fluorescencyjnego19.
nFCM zapewnia bezstronne podejście polegające na wstępnym opisie wszystkich cząstek nieistotnych dla określonych markerów, za pomocą pomiaru rozproszenia bocznego, co pozwala na potwierdzenie z najczęstszymi technikami NTA, RPS i TEM1, przy jednoczesnym dodaniu pomiaru fenotypowego podobnego do WB lub Elisa w sposób ilościowy.

Co to są pojazdy elektryczne? 
Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to zbiorcze określenie szeregu błoniastych cząstek pochodzących z komórek, integralnych z wieloma normalnymi czynnościami komórkowymi i tkankowymi. Ich wpływ na szeroki zakres dziedzin nauki i ich potencjalne znaczenie kliniczne przyczyniły się do wzrostu badań nad pojazdami elektrycznymi i zainteresowania przemysłem1. Badania nad małymi EV (sEV) koncentrują się przede wszystkim na egzosomach, cząstkach o długości 40-100 nm, które zaczynają tworzyć się we wczesnych endosomach przed dojrzewaniem i uwalnianiem poprzez fuzję ciał wielopęcherzykowych (MVB) z błoną plazmatyczną, a także na mikropęcherzykach, które pączkują bezpośrednio z błony plazmatycznej, tworząc cząstki o długości 80-1000 nm<klasa sup="xref">2. Trzecia populacja EV to ciała apoptotyczne, cząstki o długości 50-1500 nm powstałe podczas śmierci komórki, co oznacza, że ich względna proporcja do innych EV może być bardzo zmienna3.
Ponieważ charakterystyka EV może reprezentować zmiany zachodzące w komórce/tkance, z której pochodzą, istnieje potencjał do ich wykorzystania w diagnostyce. Rozpoczęto różne analizy "omiczne" w celu zidentyfikowania markerów pochodzenia komórek i stanu choroby, co może pozwolić na nieinwazyjną ocenę pacjentów przy użyciu źródeł EV, takich jak osocze krwi/surowica, mocz, ślina i płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF)4,5. Siłą napędową tych innowacji związanych z pojazdami elektrycznymi są nowe techniki charakteryzacji, które przezwyciężają wcześniejsze ograniczenia.
Potrzeba i wyzwania związane z charakteryzacją pojedynczego pojazdu elektrycznego 
Charakterystyka pojedynczego EV staje się coraz ważniejsza zarówno dla walidacji, jak i opisu izolatów EV, a także dla wyjaśnienia kluczowych cech tych nanocząstek dla postępu terapii i diagnostyki opartej na EV6. W zależności od źródła EV i zamierzonego zastosowania, analiza czystości, często opisywana jako stosunek cząstek EV do cząstek innych niż EV lub jako EV do wolnego białka, może wymagać znacznych ilości danych z wielu analiz<sup class="xref">7.
Pomiary zliczania i wymiarowania cząstek w publikacjach EV wcześniej opierały się głównie na śledzeniu nanocząstek (NTA), rezystancyjnym wykrywaniu impulsów (RPS) i mikroskopii elektronowej (EM)2. Standardowe NTA i RPS nie są w stanie odróżnić EV od cząstek innych niż EV i mają swoje własne zastrzeżenia, takie jak niska przepustowość8 i nieodpowiednia dolna granica wykrywalności widoczna przy NTA9,10,11.
Tetraspaniny CD9, CD63 i CD81 były historycznie ważnymi identyfikatorami obecności EV w izolacjach/preparatach EV. Powszechnie stosuje się techniki western blotting (WB) i dot blotting w celu pokazania wzbogacenia tych białek w izolaty EV w porównaniu z lizatem komórkowym12. Jednak brak kwantyfikacji tych metod i niejednorodność tych markerów EV, zarówno w odniesieniu do wyświetlania w subpopulacjach EV, jak i zmienności związanej z komórkami, tkankami lub pacjentami, zachęca do zaawansowanych technik analitycznych, które ujednolicają charakterystykę fizyczną i fenotypową13.
Cytometria nanoprzepływowa jako kompleksowa technika analizy EV 
Określenie rzeczywistych stężeń EV wymaga identyfikacji nienaruszonych cząstek i uniwersalnego markera, szczególnie w złożonych izolatach cząstek, z rozdzielczością zdolną do wykrycia wszystkich EV przy jednoczesnym odróżnieniu ich od cząstek innych niż EV14.
Nano-flow cytometry (nFCM) to technika, która pozwala na nieznakowaną analizę cząstek o rozmiarach od 45 do 1000 nm, jednocześnie wykorzystując fluorescencyjne znakowanie i detekcję do identyfikacji subpopulacji cząstek. Kluczową różnicą w stosunku do konwencjonalnej cytometrii przepływowej jest zastosowanie sprzętu dedykowanego do analizy nanocząstek, pozwalającego na uzyskanie najwyższej rozdzielczości15. Analiza EV, która wykorzystuje konwencjonalne oprzyrządowanie przepływowe przeznaczone do analizy małych cząstek, poprawia się, ale nadal ma trudności z osiągnięciem rozdzielczości umożliwiającej wykrywanie i analizowanie <100 nm EVs16,17. Cytometria przepływowa oparta na kulkach jest kolejną adaptacją często stosowaną do analizy EV, ale eliminuje to możliwość wykrywania pojedynczych cząstek i wprowadza odchylenia oparte na wychwytywaniu18.
Korzystając z dolnego limitu wykrywania ~45 nm w kanale bocznego rozproszenia (SS) do analizy EV, nFCM wykorzystuje wyzwalanie SS. Można to nazwać analizą "najpierw cząstka", ponieważ oznacza, że zdarzenia muszą dostarczyć sygnał SS, przekraczając ustalony próg przed analizą intensywności fluorescencji. Eliminuje to wyniki fałszywie dodatnie, takie jak zdegradowane agregacje membran i fluoroforów, i koncentruje analizę na nienaruszonych EVs15. Pomiary SS są również wykorzystywane do wymiarowania pojedynczych cząstek przez porównanie z czteromodalną nanosferą krzemionki standard<sup class="xref">19. Pomiary fluorescencji są wykonywane na dwóch kolejnych detektorach, co pozwala na trzy jednoczesne pomiary dla każdej cząstki w celu opisania stężenia cząstek, rozmiarów i obecności markerów lub innych celów zainteresowania w celu identyfikacji subpopulacji EVs20.
W poniższym eksperymencie, pomiary SS i fluorescencji (FL) są używane do pomiaru cząstek >45 nm, pokazują podzbiór dodatnich EV membranowych i identyfikują prezentację CD9, CD63, CD81 w subpopulacjach EV. Opisano zarówno stężenie tych subpopulacji, jak i ich stosunek do całkowitej liczby cząstek mierzonych za pomocą SS, a także ich profile wielkości.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało APC anty-CD81 (M38)</td><td>abcam</td><td>ab233259</td><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD81 Przeciwciało skoniugowane APC </td></tr><tr><td>Przeciwciało APC anty-CD9 (EM-04)</td><td>Abcam</td><td>ab82392</td><td>Przeciwciało skoniugowane APC APC</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD9 (MEM-61), wstępnie rozcieńczone</td><td>abcam</td><td>ab82389</td><td>Przeciwciało skoniugowane anty-ludzkie CD9 APC </td></tr> Przeciwciało przeciw <tr><td>mysim CD63 APC</td><td>biolegend</td><td>143905</td> Przeciwciało <td>koniugowane anty-mysie CD63 APC Przeciwciało sprzężone</td></tr><tr><td>APC przeciwko myszy/szczurowi Przeciwciało</td><td>biolegend</td><td>104909</td><td>Anti-Mouse CD81 Przeciwciało sprzężone APC </td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD63 (MEM-259), APC</td><td>invitrogen Via Fisherscientific</td><td>A15712</td><td>Przeciwciało sprzężone Anti-Human CD63 APC </td></tr><tr><td>Bioreaktor Celline AD1000</td><td>Merck</td><td>Z688037-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór czyszczący</td><td>NanoFCM</td><td>17159</td><td>Roztwór do czyszczenia w domu dla nanoanalizatorów</td></tr><tr><td>EV od C2C12</td><td>Gifted</td><td></td><td>Mouse line</td></tr><tr><td>EVs od SW620</td><td>Gifted</td><td></td><td>Human line</td></tr><tr><td>Memglow - Fluorogenic Membrane Probe</td><td>Cytoszkielet</td><td>MG01</td><td>nietoksyczny barwnik błony komórkowej</td></tr><tr><td>NanoAnalyzer NanoFCM</td><td></td><td></td><td>Cytometr nanoprzepływowy do pomiaru pojedynczych cząstek</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,2</td><td>Gibco Via Fisherscientific</td><td>12549079</td><td>Roztwór soli do rozcieńczania próbek i przeciwciał</td></tr><tr><td>Mikroprobówki Snaplock, 0,60 ml</td><td>Axygen Via Fisherscientific</td><td>11371944</td><td>Probówki wymagane do załadowania próbki do nanoanalizatora</td></tr></tbody></table>

charakterystyka białka transbłonowego pojedynczego pęcherzyka zewnątrzkomórkowego za pomocą cytometrii nanoprzepływowej

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Charakterystyka pojedynczych cząstek staje się coraz bardziej istotna dla badań nad pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi, przechodząc od technik analizy masowej i analizy cząstek pierwszej generacji do kompleksowych pomiarów wieloparametrowych, takich jak cytometria nanoprzepływowa (nFCM). nFCM to forma cytometrii przepływowej, która wykorzystuje oprzyrządowanie specjalnie zaprojektowane do analizy nanocząstek, pozwalając na scharakteryzowanie tysięcy EV na minutę zarówno z zastosowaniem, jak i bez użycia technik barwienia. Detekcja rozproszenia bocznego o wysokiej rozdzielczości (SS) pozwala na określenie wielkości i stężenia dla wszystkich cząstek biologicznych większych niż 45 nm, podczas gdy jednoczesna detekcja fluorescencji (FL) identyfikuje obecność znakowanych markerów i celów będących przedmiotem zainteresowania. Oznaczone subpopulacje można następnie opisać w jednostkach ilościowych cząstek/ml lub jako procent całkowitych cząstek zidentyfikowanych przez rozproszenie boczne.
Tutaj EV pochodzące z kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych (CCM) są znakowane zarówno barwnikiem lipidowym, aby zidentyfikować cząsteczki z błoną, jak i przeciwciała specyficzne dla CD9, CD63 i CD81 jako wspólne markery EV. Pomiary materiału porównawczego, wzorca stężenia i wzorca wielkości nanosfer krzemionki, a także znakowanego materiału próbki są analizowane w analizie 1-minutowej. Oprogramowanie jest następnie wykorzystywane do pomiaru profilu koncentracji i rozkładu wielkości wszystkich cząstek, niezależnie od etykietowania, przed określeniem cząstek, które są dodatnie dla każdej z etykiet.
Jednoczesne wykrywanie SS i FL może być elastycznie wykorzystywane z wieloma różnymi źródłami EV i celami etykietowania, zarówno zewnętrznymi, jak i wewnętrznymi, opisując próbki EV w sposób kompleksowy i ilościowy.

Prezentacja tetraspanin na pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EVs) pochodzących z linii SW620 oraz pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EVs) pochodzących z linii C2C12 
Współczesne analizy obfitości kluczowych tetraspanin CD9, CD63 i CD81 na EVs pochodzących z różnych źródeł wykazały ekstremalną zmienność ich występowania, zarówno w analizach zbiorczych, jak i podczas badania ich prezentacji w subpopulacjach EVs21. Jest to prawdopodobnie związane z dostępnością różnych szlaków biogenezy, takich jak szlaki zależne i niezależne od kompleksu ESCRT22.
CD9 wykazano na największym odsetku pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) linii C2C12, wynoszącym ~50%, podczas gdy obecność CD63 odnotowano jedynie w ~30%, co przedstawiono na Rysunku 1. W przypadku przeprowadzenia znakowania wszystkimi trzema przeciwciałami anty-tetraspanynami podczas jednej inkubacji, wykazano, że ~70% cząsteczek posiada co najmniej jeden z markerów EV. Pomiarowe powtórzenia wykazały najniższe odchylenie standardowe dla znakowania CD9/63/81 pęcherzyków EV linii C2C12, wynoszące ~3,8%, podczas gdy dla pęcherzyków EV linii C2C12 znakowanych CD81 wartość ta wynosiła ~8,1%.
EV pochodzące z linii SW620 wykazały inny profil tetraspanin, z znacznie większą różnicą między najliczniej reprezentowanym CD9 (ok. 40%) a najrzadziej reprezentowanym CD63 (ok. 7%). Podobnie jak w przypadku EV z linii C2C12, CD9 występował w większości populacji wykazującej pozytywny wynik dla tetraspanin, ponieważ wspólne znakowanie CD9/63/81 zidentyfikowało ok. 42% cząstek posiadających co najmniej jeden z trzech markerów.
Większość cząsteczek pochodzących z linii C2C12, czyli całkowita populacja SS+, miała rozmiar od 45-120 nm, z medianą średnicy wynoszącą ~65 nm. Profile wielkości dla każdej z subpopulacji EV znakowanych pojedynczą tetraspanniną, przedstawione na Rysunku 1, są do siebie zbliżone, wykazując większą medianę wielkości ~75-85 nm oraz mniejszą liczbę EV &lt;65 nm w porównaniu z całkowitą populacją cząsteczek.
Cząsteczki pochodzące z linii SW620 miały rozmiary od 45-160 nm, przy czym średnia wielkość wynosiła ~65 nm, wykazując rozkład skośny. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) znakowane tetraspanynami wykazują bardziej zbliżony do normalnego rozkład i większą średnią średnicę w zakresie 90-110 nm, przy podobnym rozkładzie pomiędzy poszczególnymi subpopulacjami dodatnimi pod kątem tetraspanyn.
Choć najczęściej i najrzadziej występujące tetraspanyny są takie same dla obu linii komórkowych, ich reprezentacja proporcjonalna znacznie się różni, a interesująca różnica występuje między potencjalną ko-prezentacją tetraspanyn, którą można zaobserwować na podstawie różnicy w pozytywności CD9 oraz pozytywności CD9/63/81.
Łączenie znakowania błony EV ze znakowaniem przeciwciałami 
Błonowy układ dwuwarstwowy EV stanowi bardziej ogólny cel znakowania, co może pozwolić na odróżnienie ich od cząsteczek o podobnej wielkości, które nie są EV, takich jak agregaty białkowe i niektóre formy LDL z lipidowymi monowarstwami23. Specyficzność tego typu znakowania musi zostać zwalidowana, ponieważ wykazano, że niektóre powszechnie stosowane barwniki błonowe w badaniach nad EV wiążą się również z cząsteczkami niebędącymi EV24.
Znakowanie błony wielokrotnie wykazywało ~80% pozytywność pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) pochodzących z linii C2C12 oraz EVs z linii SW620. Natężenie rozproszenia bocznego (SS-H) wykazuje dobrą korelację z natężeniem FITC na wykresach kropkowych dla wyników zarówno C2C12, jak i SW620, przedstawionych na Rysunku 2. Jest to rezultat spodziewany, ponieważ natężenie SS jest zależne od wielkości cząsteczki, a tym samym od powierzchni jej błony.
Większość pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) znakowanych przeciwciałami była również dodatnia pod kątem znakowania błony, wykazując odsetek podwójnie dodatnich (FITC+ oraz APC+) bardzo zbliżony do odsetka dodatnich dla tetraspanin. Wykresy kropkowe FITC względem APC wykazują niewielką korelację między znakowaniem błony a tetraspanin, przy czym znakowanie CD63 wydaje się wykazywać najsłabszą korelację ze znakowaniem błony. Wykryto niewiele zdarzeń, które były dodatnie pod kątem znakowania przeciwciałami, ale ujemne pod kątem znakowania błony.
Powtarzalność, wydajność podwójnego znakowania i alternatywne wyniki danych 
Ważnym aspektem przy projektowaniu eksperymentów nFCM jest interaktywność fluoroforów lub znaczników. Rysunek 3a pokazuje, że powtórzenie znakowania przeciwciałami z dodatkowym znakowaniem błony oraz bez niego prowadzi do bardzo podobnych pomiarów % pozytywności. W szczególności znakowanie SW620 wykazuje bardzo małą zmienność między dwoma zestawami pomiarowymi. Świadczy to o ograniczonej interferencji między barwnikiem a wiązaniem przeciwciał, a także podkreśla dobrą powtarzalność podczas powtarzania znakowania EV.
Pomiary intensywności, zarówno dla rozproszenia bocznego, jak i fluorescencji, mogą zostać wyeksportowane do programu Excel dla każdej zmierzonej pojedynczej cząsteczki. Na tej podstawie możemy wygenerować pomiary średniej intensywności fluorescencji (MFI), aby uzyskać porównawcze przybliżenia zawartości naszego znakowanego celu. MFI dla populacji fluorescencyjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) pochodzących z linii C2C12 sugerują nieco niższą prezentację CD63 i CD81, z pomiarami MFI wynoszącymi odpowiednio ~550 i ~600, w porównaniu do MFI na poziomie ~850 obserwowanego dla EVs CD9+. Jednostkami pomiaru MFI w tym przypadku są FL-A i nie zostały one zestandaryzowane względem kalibracji fluorescencyjnej. Zastosowanie wszystkich trzech przeciwciał nie wywołuje znacznie silniejszej fluorescencji niż samo znakowanie CD9. Jest to bardzo odmienne od pomiarów MFI dla linii SW620, które sugerują, że zastosowanie koktajlu wszystkich trzech przeciwciał zapewnia silniejszy sygnał fluorescencyjny dla znakowanych EVs niż zastosowanie któregokolwiek z przeciwciał z osobna.
Histogramy rozkładu wielkości generowane przez oprogramowanie NanoFCM mogą być również eksportowane do programu Excel, co umożliwia nałożenie na siebie zestawów danych z trzech powtórzeń. Profile rozkładu wielkości na Ryc. 3 są podobne do tych z Ryc. 1, lecz zawierają słupki błędów. Mediana wielkości EV w subpopulacjach dodatnich pod kątem tetraspanin w EV pochodzących z komórek C2C12 wynosi około 70 nm, co jest wartością nieco większą niż średnia 60 nm dla całkowitej populacji cząstek. EV z komórek SW620 dodatnie pod kątem markerów tetraspanin są większe, wykazując piki przy ~100 nm.
<img alt="Wykres słupkowy znakowania przeciwciałami APC i histogramy rozkładu wielkości dla CD9, CD63, CD81 w komórkach C2C12, SW620." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64020/64020fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Subpopulacje EV wykazujące pozytywny wynik dla CD9, CD63 i CD81 zidentyfikowane poprzez znakowanie przeciwciałami. (A) Wykres słupkowy przedstawiający procent znakowanych EV w stosunku do całkowitej liczby cząstek zaobserwowanych metodą SS dla EV pochodzących z linii C2C12. (B) Wykres słupkowy przedstawiający procent znakowanych EV w stosunku do całkowitej liczby cząstek zaobserwowanych metodą SS dla EV pochodzących z linii SW620. (C) Reprezentatywne profile rozkładu wielkości dla EV pochodzących z linii C2C12. Każdy histogram został pobrany z plików PDF wygenerowanych dla pierwszego pomiaru z zestawów powtórzonych trzykrotnie. (D) Reprezentatywne profile rozkładu wielkości dla EV pochodzących z linii SW620. Każdy histogram został pobrany z plików PDF wygenerowanych dla pierwszego pomiaru z zestawów powtórzonych trzykrotnie. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe z pomiarów trzykrotnych tych samych znakowanych próbek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64020/64020fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy słupkowe i wykresy punktowe znakowania przeciwciałami pęcherzyków EV z linii C2C12 i SW620; wyniki cytometrii przepływowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64020/64020fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Znakowanie błony oraz znakowanie przeciwciałami subpopulacji EV prezentujących CD9, CD63, CD81. (A) Wykres słupkowy przedstawiający Membrane+ %, tetraspanin+ % oraz double+ % dla EV z linii C2C12. (B) Wykres słupkowy przedstawiający Membrane+ %, tetraspanin+ % oraz double+ % dla EV z linii SW620. (C) Reprezentatywne wykresy punktowe SS vs FITC przedstawiające bramkowanie dla populacji Membrane pozytywnej. (D) Reprezentatywne wykresy punktowe FITC vs APC przedstawiające bramkowanie dla populacji double pozytywnej EV z linii C2C12. (E) Reprezentatywne wykresy punktowe FITC vs APC przedstawiające bramkowanie dla populacji double pozytywnej EV z linii SW620. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe z pomiarów trójpowtórzonych tych samych znakowanych próbek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64020/64020fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schematy powtarzalności znakowania przeciwciałami z histogramami analizującymi wielkość cząstek dla C2C12, SW620." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64020/64020fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Ocena zmienności w pomiarach powtórzonych. (A) Wykresy słupkowe przedstawiające procent dodatnich wyników znakowania przeciwciałami z dodatkowym znakowaniem błony i bez niego. (B) Pomiary średniej intensywności fluorescencji dla bramowanych podgrup EV. (C) Uśrednione histogramy rozkładu wielkości dla trzech powtórzeń zestawów danych dla EV z linii C2C12. (D) Uśrednione histogramy rozkładu wielkości dla trzech powtórzeń zestawów danych dla EV z linii SW620. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe pomiarów w trzech powtórzeniach dla tych samych znakowanych próbek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64020/64020fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Najnowsza generacja narzędzi do charakteryzacji EV jest w stanie przeprowadzić pojedynczą analizę EV dla wielu parametrów jednocześnie. Cytometria nanoprzepływowa mierzy wszystkie cząstki biologiczne większe niż 45 nm bez znakowania i identyfikuje specyficzne cechy subpopulacji za pomocą różnych technik znakowania fluorescencyjnego.

Charakterystyka białka transbłonowego pojedynczego pęcherzyka zewnątrzkomórkowego za pomocą cytometrii nanoprzepływowej

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...

Dogłębna charakterystyka pojazdów elektrycznych może być trudna, ponieważ wymaga wielu instrumentów do opisania poszczególnych parametrów. Pomiar tych kluczowych kryteriów za pomocą jednej techniki, takiej jak cytometria nanoprzepływowa, opisuje jednocześnie wiele subpopulacji EVs. Tak więc każdy EV jest mierzony indywidualnie, identyfikując cząstki o średnicy większej niż 14 nanometrów bez etykietowania przed określeniem ich fluorescencji.Zapewnia to solidny zestaw danych, usuwając fałszywe alarmy. Cytometria nanoprzepływowa może być stosowana do EV z różnych źródeł, w tym wzbogaconych z osocza, płynu mózgowo-rdzeniowego i pożywki hodowlanej. Technika ta jest również wykorzystywana do analizy wirusów, nanocząstek lipidowych i nanomateriałów.Ważne jest, aby zoptymalizować protokół etykietowania. Maksymalizuje to fluorescencję związaną z cząstką w porównaniu z resztkową fluorescencją pozostawioną w buforze. Aby rozpocząć, włącz instrument, załaduj Nano-Flow Profession i wybierz Start Up z menu rozwijanego Sjacket Flow, załaduj wodę do doku załadowczego i wybierz Boosting z menu rozwijanego Sheath Flow.Rozcieńczyć kulki QC od 1 do 100 w wodzie destylowanej w probówce o pojemności 0,6 mikrolitra i umieścić je w doku załadowczym, aby wprowadzić próbkę do systemu. Następnie zwiększ próbkę przez 45 sekund, jak pokazano wcześniej, aby całkowicie zastąpić poprzednią próbkę, wodę lub roztwór czyszczący. Podczas zwiększania ustaw moc lasera na wstępnie ustawiony szablon dla koralików QC na 250 nanometrów FL QC standard.Później, aby zmniejszyć ciśnienie w układzie, wybierz ciśnienie próbkowania z tego samego menu rozwijanego i ustaw ciśnienie automatycznego próbkowania na jeden kilogram paskala, aby utrzymać stałe ciśnienie. Następnie zainicjuj jednominutową analizę, wybierając opcję Czas do nagrania z kontrolek pozyskiwania. Dane zostaną wykreślone na wykresie punktowym przedstawiającym skalę logarytmiczną intensywności rozproszenia bocznego i wybraną intensywność fluorescencji.Przed zapisaniem pliku należy wstawić nazwę pliku i rozcieńczenie próbki. Następnie wybierz rozładunek, aby wyjąć rurę z doku załadunkowego. Zastąp kulki QC 150 mikrolitrami roztworu czyszczącego i czyść przez ponad 30 sekund, wybierając opcję Boosting.Używając probówki zawierającej 150 mikrolitrów wody, usuń nadmiar roztworu czyszczącego z końcówki kapilarnej, zanurzając końcówkę w wodzie. Następnie rozcieńczyć standardowe kulki od jednego do 100 w wodzie i załadować 100 mikrolitrów do doku załadunkowego. Teraz ustaw moc lasera na wstępnie ustawiony szablon, S16 EXO 68 na 155 nanometrów.To ustawienie dotyczy zarówno wzorca rozmiaru, jak i próbek zawierających EV mniejsze niż 200 nanometrów. Wybierz pobieranie próbek i kontynuuj rejestrowanie próbki przez jedną minutę. Wykonaj trzeci pomiar z próbką wody lub PBS, aby utworzyć ślepą próbkę dewaluującą pomiar, identyfikując wyniki fałszywie dodatnie do usunięcia przez oprogramowanie.Rozcieńczyć nieznakowane próbki EV w PBS do odpowiedniego zakresu stężeń cząstek od jednego razy 10 do ósmego do pięciu razy 10 do ósmych cząstek na mililitr do analizy nFCM. I załadować od 10 do 100 mikrolitrów rozcieńczonej próbki do doku załadowczego. Jeżeli stężenie cząstek nie jest znane, należy rozpocząć od rozcieńczenia próbki EV w stosunku 1 do 100.Stężenie próbki można szybko przybliżyć na podstawie rozmiaru plamki lasera na kamerze CCD podczas wzmacniania lub na podstawie obserwacji śladu rozbłysku podczas próbkowania. Gdy załadowana próbka zostanie wzmocniona przez 45 sekund, nagrywaj przez jedną minutę i zapisz plik, jak pokazano wcześniej. Po nagraniu rozpocznij analizę tych danych, przełączając się z zakładki Akwizycja na zakładkę Analiza i otwierając zapisane pliki NFA.Aby uzyskać dokładny pomiar próbki, należy użyć dwóch standardowych pomiarów wykonanych przed pomiarem próbki, aby ustawić wartości do porównania próbki, a także ślepej próby. Utwórz krzywą standardową rozmiaru do konwersji rozrzutu bocznego na średnicę, wybierając plik standardu rozmiaru i używając narzędzia do ustawiania progu. Próg, widoczny w śladzie serii zdarzenia, określa minimalne natężenie sygnału wymagane do uznania zdarzenia za znaczące.Po ustawieniu progu sprawdź parametry wykresu kropkowego, SS-H lub SS-A na osi X i FITC-A na osi Y. Otwórz narzędzie Generowanie krzywej standardowej i wybierz S16 EXO od 68 do 155 nanometrów jako szablon rozmiaru. Kliknij przycisk Znajdź szczyty, aby zidentyfikować intensywność piku rozpraszania bocznego jako cząstki o średnicy 68, 91, 113 lub 155 nanometrów.Przed zamknięciem okna należy sprawdzić, czy została wygenerowana krzywa rozrzutu boku do średnicy z wartością R bliską jedności. Ustaw normę stężenia. Wybierz zapisany plik, kliknij zlicz wzorzec i wprowadź stężenie cząstek wzorca.Ustaw standardowe informacje. Wybierz przykładowy plik EV i ustaw próg. Wybierz pusty plik i kliknij ustaw pusty, aby zidentyfikować liczbę wyników fałszywie dodatnich do usunięcia z liczby próbek.Po otwarciu narzędzia do generowania plików PDF sprawdź rozmiar, stężenie i rozcieńczenia próbki. Następnie pokaż stężenie próbki i rozkład wielkości cząstek. Po oznaczeniu próbek EV zgodnie z opisem w manuskrypcie, weź jeden mikrolitr oznakowanej próbki i rozcieńcz jeden do 50 w PBS w probówce o pojemności 0,6 mililitra.Załadować próbkę do stanowiska załadowczego i stosować ciśnienie doładowania przez 45 sekund. Upewnij się również, że ustawienia lasera są prawidłowe i załadowane są odpowiednie soczewki. Teraz przełącz się na ciśnienie próbkowania i wybierz czas nagrywania.Po jednominutowym akwizycji nazwij plik danych i zapisz. Rozładuj próbkę, zastąp ją roztworem czyszczącym i zwiększ roztwór czyszczący przez ponad 30 sekund przed załadowaniem następnej oznaczonej próbki, jak pokazano wcześniej. W przypadku generowania plików PDF należy zastosować te same standardy, co opisano powyżej.Tylko ślepy pomiar zostanie ustawiony inaczej. Wybierz przykładowy plik i ustaw próg. Wybierz narzędzie do bramkowania i użyj lewego przycisku myszy, aby narysować linię oddzielającą populację fluorescencyjnie dodatnią.Ustaw nazwy i kolory reprezentacji. Ustaw pusty plik i kliknij ustaw pusty, aby zidentyfikować liczbę wyników fałszywie dodatnich do usunięcia z każdej innej populacji. Otwórz narzędzie do generowania plików PDF i zidentyfikuj rozkład wielkości, stężenie i procent subpopulacji fluorescencyjnie dodatniej.Na wykresie punktowym zmień oś Y, aby pokazać pomiary fluorescencji z kanału zielonego lub czerwonego. Ustaw puste miejsce i wygeneruj plik PDF, jak pokazano wcześniej. Na wykresie kropkowym ustaw oś X na FITC, a oś Y na APC.Wykorzystaj narzędzie kwadrantowe, aby zidentyfikować populacje podwójnie fluorescencyjnie dodatnie. Ustaw nazwy i kolory tak, aby były reprezentatywne, a następnie otwórz plik PDF i wybierz subpopulacje fluorescencyjne. EV pochodzące z C2C12 wykazały około 50% prezentacji CD9, 30% CD63, a 70% populacji prezentowało co najmniej jeden z trzech markerów EV.Profile wielkości dla pojedynczych subpopulacji EV znakowanych tetraspaniną wykazały większą medianę wielkości wynoszącą około 75 do 85 nanometrów i mniej niż 65 nanometrów EV w porównaniu z całkowitą populacją cząstek. EV pochodzące z SW620 wykazały około 40% prezentacji CD9, 7% CD63 i 42% cząstek jako posiadających co najmniej jeden z trzech markerów. EV pochodzące z SW620, znakowane tetraspaniną wykazywały bardziej normalny rozkład i większą średnicę mediany między 90 a 110 nanometrów z podobnymi rozkładami między poszczególnymi subpopulacjami tetraspaniny.Znakowanie membranowe wielokrotnie wykazało 80% pozytywność EV pochodzących z C2C12 i SW620. Intensywność rozproszenia bocznego korelowała z intensywnością FITC na wykresach punktowych zarówno C2C12, jak i SW620. Dwudodatnie wartości procentowe są bardzo podobne do dodatnich wartości procentowych tetraspaniny.A znakowanie CD63 wydaje się wykazywać najsłabszą korelację z etykietowaniem membranowym. Procentowe pomiary dodatniości były podobne między znakowaniem przeciwciał z dodatkowym znakowaniem błonowym i bez niego. Średnia intensywność fluorescencji dla fluorescencyjnych populacji EV pochodzących z C2C12 sugerowała niższą prezentację CD63 i CD81 w porównaniu z EV CD9, podczas gdy SW620 wykazał, że użycie wszystkich trzech przeciwciał zapewnia większy sygnał fluorescencyjny niż jakakolwiek pojedyncza etykieta przeciwciała W tym protokole powszechne markery EV zostały znakowane fluorescencyjnie, ale wiele celów przeciwciał można wybrać, aby pokazać pochodzenie EV, funkcję EV lub stan chorobowy.

single-extracellular-vesicle-transmembrane-protein-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje immunologiczne wychwytywanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą znakowanych fluorescencyjnie koniugatów przeciwciało-magnetyczne nanocząstki wychwytywane. Proces obejmuje tworzenie kompleksów, barwienie fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami wykrywającymi, separację magnetyczną i analizę cytometryczną przepływową w celu charakterystyki antygenowej.

Wychwytywanie immunologiczne i cytometria przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu charakterystyki antygenowej

Istnieje wiele różnych metod pomiaru pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą cytometrii przepływowej (FCM). Przy określaniu najodpowiedniejszej metody należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Przedstawiono dwa protokoły pomiaru EV, wykorzystujące albo indywidualną detekcję, albo podejście oparte na kulkach.

Techniki analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą cytometrii przepływowej

Wirusy lub pęcherzyki zewnątrzkomórkowe były wychwytywane immunologicznie za pomocą nanocząsteczek magnetycznych 15 nm sprzężonych z przeciwciałami rozpoznającymi antygeny powierzchniowe. Uchwycone wiriony lub pęcherzyki znakowano fluorescencyjnymi przeciwciałami przeciwko innym antygenom powierzchniowym. Powstałe kompleksy rozdzielono w silnym polu magnetycznym i przeanalizowano za pomocą konwencjonalnych cytometrów przepływowych wyzwalanych fluorescencją.

Wirometria przepływowa do analizy widm antygenowych wirionów i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe obecne we krwi zostały zasugerowane jako nowe biomarkery różnych chorób. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji dużych mikropęcherzyków pochodzących z błony plazmatycznej z próbek krwi obwodowej i ich późniejszej analizy za pomocą konwencjonalnej cytometrii przepływowej i Western Blotting.

Izolacja i charakterystyka mikropęcherzyków z krwi obwodowej

W tym protokole opisujemy kompletny proces szybkiej izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od ludzkiej krwi pełnej i charakteryzacji specyficznych markerów za pomocą analizy nanocząstek opartej na fluorescencji. Przedstawione wyniki wykazują wysoki poziom odtwarzalności i mogą być dostosowane do supernatantów z hodowli komórkowych.

Szybka charakterystyka oparta na fluorescencji pojedynczych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w ludzkiej krwi z analizą śledzenia nanocząstek

Protokół opisuje powtarzalną metodę przeznaczoną do użycia z supernatantami do hodowli komórkowych do wykrywania epitopów powierzchniowych na małych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EV). Wykorzystuje specyficzną immunoprecypitację EV za pomocą kulek sprzężonych z przeciwciałami, które rozpoznają antygen powierzchniowy CD9, CD63 i CD81. Metoda jest zoptymalizowana pod kątem analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza cytometryczna przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek kondycjonowanych komórkowo

Ten protokół zapewnia szybką i dostosowaną do wielkości metodę izolacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych poprzez optymalizację wielkości dyszy rozpylającej powietrze, ciśnienia płynu w osłonie, ciśnienia przepływu próbki, napięcia, wzmocnienia i parametrów progu wyzwalania.

Optymalizacja parametrów sortowania metodą cytometrii przepływowej w celu wysokoprzepustowej izolacji i oczyszczania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Tutaj opisujemy prosty protokół, który umożliwia in vitro ocenę obfitości znakowanych fluorescencyjnie mikroRNA w celu zbadania dynamiki pakowania mikroRNA i eksportu do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV).

Śledzenie uwalniania miRNA do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą cytometrii przepływowej

Ten protokół zawiera szczegółowy opis sortowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) uwalnianych przez mezenchymalne komórki zrębu. W szczególności koncentruje się na ustawieniu urządzeń i optymalizacji warunków sortowania. Celem jest sortowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy jednoczesnym zachowaniu ich cech.

Ustawianie udanego sortowania w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Tutaj demonstrujemy metodę charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pobranych z płynów biologicznych, takich jak łzy i ślina, ludzi. Skaner stosowany w tej metodzie jest w stanie wykryć fenotyp, wielkość i całkowitą liczbę cząstek EV z 1 μl próbki.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z płynów biologicznych

Poznaj metodę Nano-Flow Cytometry do analizy pojedynczych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) większych niż 14 nm. Technika ta umożliwia bezetykietowe pomiary fluorescencji, eliminując fałszywe wyniki i zapewniając dokładną charakterystykę subpopulacji białek transbłonowych.

Charakterystyka białka transbłonowego pojedynczego pęcherzyka zewnątrzkomórkowego za pomocą cytometrii nanoprzepływowej

Przeglądaj więcej filmów