Zastosowanie podwójnej pęsety optycznej i mikrofluidyki do badań pojedynczych cząsteczek

Mocowanie portów do łączenia ze strzykawkami z rurkami ma kluczowe znaczenie, ponieważ, gdy jest to wykonane prawidłowo, nie ma wycieków, nie ma pęcherzyków w komorze przepływowej, a eksperymenty można przeprowadzać wielokrotnie przy użyciu tej samej komory przepływowej przez okres jednego roku przy ostrożnym użytkowaniu. W tym miejscu zostaną przedstawione dwie proste metody mocowania łączników do komórek przepływowych. Są one łatwe, powtarzalne i pozwalają badaczowi łatwo dostosować komórkę przepływową do swoich potrzeb bez większych problemów.

Wykorzystanie tych komórek przepływowych zostało przeprowadzone z myślą o eksperymentach z pojedynczymi cząsteczkami. W szczególności to, co nazywamy biochemią wizualną, ale mogą być stosowane w każdym badaniu, w którym wymagana jest mikrofluidyka oraz w sytuacjach, w których ma być stosowany przepływ płynu blaszki. Tak więc, aby uniknąć błędów, zamiast używać cennych komórek przepływowych do ustalenia technik, sugerowałbym najpierw poćwiczenie na szkiełku podstawowym lub szkiełku nakrywkowym.

Umożliwi to wyczucie szkła lub materiałów PDMS, aby wiedzieć, jak się z nimi obchodzić i jaką siłę należy przyłożyć podczas wkładania rurki lub łączenia złączy. Będzie to wymagało poświęcenia niektórych złączy, ale są one znacznie tańsze niż ogniwa przepływowe. Zacznij od umieszczenia komory przepływowej na czystej, płaskiej powierzchni.

Przytrzymaj rurkę PTFE trzy milimetry od wolnego końca za pomocą kleszczy i wepchnij rurkę do portu. Powtórz tę procedurę dla każdego z pozostałych portów. Podłączyć porty wlotowe do pompy strzykawkowej, a wylot do butelki na odpady.

Napełnij każdą szklaną strzykawkę jednym mililitrem spektrofotometrycznego metanolu i podłącz je do zaworu przełączającego. Upewnij się, że zawór ma wylot skierowany na odpady i oczyść każdy przewód 50 mikrolitrami metanolu. Zmień pozycję wylotową na komorę przepływową i przepompuj 800 mikrolitrów metanolu przez komórkę przepływową z natężeniem przepływu 100 mikrolitrów na godzinę, aby zwilżyć powierzchnie i wyeliminować pęcherzyki.

Następnego dnia powtórz ten proces, używając 800 mikrolitrów ultraczystej wody. Komora przepływowa jest teraz gotowa do użycia. Jeśli mają być używane złącza rurek wciskane, ostrożnie usuń taśmę samoprzylepną z jednej strony złącza i umieść ją nad otworem w szkiełku mikroskopu.

Naciśnij i przytrzymaj przez kilka sekund. Powtórz ten proces dla pozostałych łączników. Następnie umieść komórkę przepływową na czystej, płaskiej powierzchni.

Przytrzymaj rurkę PTFE trzy milimetry od wolnego końca i wepchnij rurkę do otworu w porcie. Powtórz tę procedurę dla każdego z pozostałych portów. Podłącz rurki od wlotów do zaworów przełączających.

Umieść nasadkę na czystej, płaskiej powierzchni lub na specjalnie zbudowanym kolektorze, aby utrzymać komórkę przepływową i złącza na miejscu podczas łączenia. Umieść komórkę przepływową we wgłębionej części kolektora, a następnie umieść niewielką ilość kleju szklanego na spodzie zespołu i włóż uszczelkę. Umieść port nano nad jednym z otworów wejściowych w szkiełku mikroskopu.

Delikatnie dociśnij i przytrzymaj w miejscu, bez ruchu bocznego. Powtórz ten proces dla pozostałych portów. Pozostawić do wyschnięcia lub clamp na miejscu w kolektorze.

Delikatnie wyjmij celę przepływową z kolektora i upewnij się, że zespoły są dobrze wyrównane z otworami wejściowymi w komorze przepływowej. Umieść celę przepływową na stoliku mikroskopu i przymocuj rurkę za pomocą szczelnych złączy palcowych. Napełnij każdą szklaną strzykawkę jednym mililitrem spektrofotometrycznego metanolu.

Podłączyć każdą strzykawkę do zaworu przełączającego. Upewnij się, że zawór ma wylot skierowany na odpady i oczyść każdy przewód 50 mikrolitrami metanolu. Przełącz pozycję wylotową na celę przepływową i przepompuj 800 mikrolitrów metanolu przez komorę przepływową z natężeniem przepływu 100 mikrolitrów na godzinę.

Następnego dnia powtórz ten proces, używając 800 mikrolitrów ultraczystej wody. Pomiar mocy wyjściowej jest pokazany tutaj. Moc wyjściowa lasera jest mierzona przed zainstalowaniem głowicy laserowej w układzie optymalnym.

Po wyrównaniu pułapki moc wiązki jest mierzona po 100 x obiektywie dla każdej pułapki. Obrazy pokazują stabilne pułapkowanie optyczne kulek fluorescencyjnych o długości jednego mikrometra. Tutaj F jest pułapką stałą, a M jest pułapką ruchomą.

Gdy pułapka ruchoma w trybie skanowania porusza się po małym lub dużym okręgu z częstotliwością 30 Hz. Przepływ płynu w komorze przepływowej jest laminarny. Schemat przedstawia komórkę przepływową od góry, aby zademonstrować, że dyfuzja międzykanałowa jest głównym źródłem mieszania się między sąsiednimi strumieniami płynu.

Niebieskie strzałki wskazują kierunek przepływu, a poszczególne strumienie są kolorowe, białe, jasnoszare i białe. Poszerzające się obszary dyfuzji poprzecznej między kanałami są oznaczone kolorem czerwonym. Wstawka pokazuje fluorescencyjny obraz sąsiednich strumieni płynu w 10-krotnym powiększeniu z fluorescencyjnie znakowanymi kompleksami kulek DNA w dolnym strumieniu i tylko w górnym strumieniu.

Białe plamy w górnym strumieniu to szum wystrzeliwany z kamery CCD. Profil przepływu i komórki przepływu laminarnego są paraboliczne. Komórka przepływu jest oglądana z boku, a kierunek przepływu jest wskazywany nad każdą komórką.

Na prędkość liniową kulki ma wpływ prędkość pompy i stężenie sacharozy. Na przeciwstawną siłę działającą na ścieg ma wpływ lepkość roztworu. Średnica ściegu wpływa na siłę działającą na koraliki pod przepływem.

Próbując wykonać tę procedurę, upewnij się, że obszar, w którym pracujesz, jest czysty i że wyczyściłeś szklane powierzchnie metanolem lub acetonem klasy spektrometrycznej. Na tym etapie powinieneś mieć komórkę przepływową, która jest dostarczana do pompy strzykawkowej i jesteś teraz gotowy do wprowadzenia swoich rozwiązań i rozpoczęcia eksperymentów z pęsetą optyczną. Zastosowanie komórek przepływowych, które mogą być używane przez dłuższy czas, umożliwiło naukowcom zbadanie różnych reakcji pojedynczych cząsteczek, w których mierzone są siły, reakcje są wizualizowane za pomocą fluorescencji lub kombinacji obu.