Name: Mikrotransplantacja błon synaptycznych w celu reaktywacji ludzkich receptorów synaptycznych do badań funkcjonalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Poznaj mikrotransplantację błon synaptycznych do oocytów Xenopus laevis w celu reaktywacji ludzkich receptorów synaptycznych. Ta metoda umożliwia badanie funkcji natywnych receptorów mózgowych związanych z chorobami neurodegeneracyjnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIA/NIH R01AG070255 i R01AG073133 dla AL. Dziękujemy również Centrum Badań nad Chorobą Alzheimera Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine (UCI-ADRC) za dostarczenie ludzkiej tkanki pokazanej w tym manuskrypcie. UCI-ADRC jest finansowany z grantu NIH/NIA P30 AG066519.

Wszystkie badania są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine (IACUC-1998-1388) oraz Oddział Medyczny Uniwersytetu Teksańskiego (IACUC-1803024). Kora skroniowa mózgu bez choroby Alzheimera (AD) (kobieta, 74 lata, interwał pośmiertny 2,8 godziny) i mózg AD (kobieta, 74 lata, interwał pośmiertny 4,5 godziny) zostały dostarczone przez centrum badań nad chorobą Alzheimera Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine (UCI-ADRC). Świadoma zgoda na dawstwo mózgu została uzyskana przez UCI-ADRC.
UWAGA: Nieutrwalona ludzka tkanka mózgowa powinna być traktowana jako źródło patogenów przenoszonych przez krew (BBP). W związku z tym przed rozpoczęciem eksperymentów konieczne jest szkolenie BBP. Protokół ten jest wykonywany w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) zgodnie z wymaganiami BSL2. Wytyczne i środki ostrożności w laboratorium obejmują: zakaz spożywania posiłków i napojów w laboratorium, przestrzeganie dobrych praktyk laboratoryjnych, wymagany jest sprzęt ochrony osobistej (rękawice, fartuch, buty z odkrytymi palcami), a drzwi muszą być zawsze zamknięte.
1. Preparat do mikroiniekcji oocytów Xenopus
<ol>
	<li>Aby wykonać igły iniekcyjne, należy wyciągnąć rurki borokrzemianowe o średnicy 3,5 cala za pomocą ściągacza do mikropipet. Po wyciągnięciu igieł do mikroiniekcji użyj mikroskopu i żyletki, aby odciąć wystarczającą ilość końcówki igły, aby można było wykonać mikroiniekcję (zwykle między 2-3 mm). 
	UWAGA: Długość końcówki igły do cięcia może się różnić.</li>
	<li>Przygotuj 1x roztwór Bartha, dodając 200 ml roztworu podstawowego Bartha (5x) do 800 ml wody destylowanej. Napełnij 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej z płaskim dnem 1x roztworem Bartha o temperaturze 18 °C.
	<ol>
		<li>Przygotuj 5x roztwór podstawowy Bartha w następujący sposób. W 1 l wody destylowanej dodać 25,71 g NaCl (chlorek sodu), 0,372 g KCl (chlorek potasu), 0,301 g CaCl2 (dichlorek wapnia), 0,389 g Ca(NO3)2(4H2O) (czterowodny azotan wapnia), 1,01 gMgSO4(7H2O) (siarczan magnezu siedmiowodny), 1,008 gNaHCO3 (wodorowęglan sodu), i 11,91 g kwasu HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyizoluj oocyty Xenopus za pomocą protokołów opisanych w18,19 i używając stereoskopu z 2-krotnym powiększeniem, wybierając zdrowo wyglądające oocyty w stadium V-VI. Umieść około 10 oocytów w każdym dołku i użyj jednego z dołków do przechowywania niewstrzykniętych oocytów, które mają być używane jako komórki kontrolne podczas wykonywania nagrań.</li>
	<li>Wyjmij małą szalkę Petriego o wysokości 1 cm i średnicy 6 cm i umieść w niej nylonową siatkę tak, aby zakrywała dno naczynia. Następnie wlej 15 ml 1x roztworu Bartha, który ma być użyty do wykonania mikroiniekcji oocytów.</li>
	<li>Umieść nanowstrzykiwacz wzdłuż linii środkowej platformy mikroskopu. Przekręć magnes do pozycji wyłączonej i powoli przesuń nanowtryskiwacz do żądanej pozycji, ostrożnie go podtrzymując. Gdy nanowtryskiwacz jest prawidłowo ustawiony, obróć magnes z powrotem do pozycji całkowicie włączonej i upewnij się, że jest dobrze ustawiony.</li>
	<li>W przypadku próbki o wielkości 50,6 nl należy zastosować następujące ustawienia z boku nanowtryskiwacza: 1 to D (w dół), 2 to D, 3 to U (w górę), 4 to D i 5 to U. Umieść kawałek samouszczelniającego się tworzywa termoplastycznego lub nasadkę probówki do mikrowirówki na statywie mikroskopu, wyrównując ją z trajektorią nanowtryskiwacza. 
	UWAGA: 50 nL to bliska maksymalna ilość wstrzykniętego materiału, jaką cytoplazma może wytrzymać21.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę insulinową olejem mineralnym (około 0,5 ml/cm3) około połowy jej objętości. Za pomocą tej strzykawki napełnić igłę do mikroiniekcji olejem mineralnym. Upewnij się, że na końcu igły widoczna jest kropla oleju.</li>
	<li>Wystawić tłok nanoiniektora na co najmniej 1-2 cm. W tym celu należy przytrzymać wciśnięty przycisk EMPTY, aż tłok będzie widoczny na żądanej długości. Po odsłonięciu tłoka powoli i ostrożnie umieść szklaną igłę do mikroiniekcji wypełnioną olejem mineralnym na tłoku nanowtryskiwacza i upewnij się, że dobrze pasuje do czarnego O-ringu oporowego i zatrzymuje się na białym pierścieniu oporowym. Upewnij się, że nie zginasz tłoka nanowtryskiwacza w tym procesie.</li>
	<li>Gdy szklana igła do mikroiniekcji jest już zabezpieczona i umieszczona na miejscu, naciśnij przycisk EMPTY, aby usunąć potencjalne pęcherzyki powietrza. Delikatnie, chusteczką papierową, usuń nadmiar oleju mineralnego.</li>
</ol>
2. Wczytywanie próbki
<ol>
	<li>Przygotuj preparaty (próbki) wzbogacone w synaptosomal z obszaru zainteresowania ludzkiego mózgu, jak opisano w10,11,12,13,14,15, i przechowuj je w porcjach po około 5 μl w temperaturze -80 °C do momentu wstrzyknięcia.</li>
	<li>Przed wstrzyknięciem należy przenieść podwielokrotność na mokry lód i trzymać ją na lodzie przez cały czas, z wyjątkiem sonikacji i pobierania. Liczba i rodzaje próbek zostaną określone na podstawie projektu doświadczalnego.</li>
	<li>Sonizuj wybrane próbki 3x w kąpieli z pływającym mokrym lodem, aby uniknąć rozgrzania próbki. Za każdym razem używaj cykli 5 s, czekając 1 minutę na mokrym lodzie między cyklami.</li>
	<li>Umieścić 1 μl próbki na tworzywie termoplastycznym. W razie potrzeby przed umieszczeniem próbki należy wykonać wgłębienie w powierzchni, aby zapobiec przemieszczaniu się próbki.</li>
	<li>Użyj pokręteł manipulatora przytrzymującego nanowtryskiwacz, aby ustawić igłę i przesunąć ją w kierunku próbki, która ma być napełniona. Gdy końcówka igły znajdzie się w próbce, naciśnij i przytrzymaj przycisk FILL, aż zostanie pobrana wystarczająca ilość próbki. Na 10 oocytów potrzeba około 0,5 μl. Za pomocą pokręteł przesuń igłę nanowtryskiwacza z powrotem do najwyższej pozycji.</li>
</ol>
3. Wstrzykiwanie oocytów
UWAGA: Standaryzowane błony synaptosomalne kory szczurów są również wstrzykiwane we wszystkich eksperymentach do zestawu oocytów w celu zmierzenia zmian w zdolności fuzji między różnymi partiami oocytów.
<ol>
	<li>Umieść wybrane oocyty na małej szalce Petriego, która ma dopasowaną nylonową siatkę i roztwór Bartha (około 10 oocytów). Ułóż oocyty tak, aby nie znajdowały się jeden na drugim; Będzie to pomocne podczas procesu wstrzykiwania.</li>
	<li>Za pomocą pokręteł na manipulatorze przytrzymującym nanowstrzykiwacz przesuń igłę w kierunku oocytów. Po zanurzeniu igły w roztworze Bartha, użyj pedału nożnego do nanowtryskiwacza, aby upewnić się, że igła do mikroiniekcji uwalnia próbkę. Jeśli próbka jest uwalniana, będzie widoczna z mikroskopu.</li>
	<li>Po ustaleniu z pewnością, że próbka jest uwalniana, przejdź do mikroiniekcji oocytu. Jeśli próbka nie jest uwalniana, powtórz proces napełniania igły.</li>
	<li>Wniknij igłą w oocyt tuż pod powierzchnią, nie głębiej i użyj pedału nożnego, aby wstrzyknąć próbkę. Pedał nożny wyda sygnał dźwiękowy, gdy sample zostanie zwolnione. Poczekaj około 2-3 s. Jeśli wstrzyknięcie się powiodło, komórka rozszerzy się. Gdy to nastąpi, użyj pokręteł na manipulatorze, aby wyjść z komórki. 
	UWAGA: Fuzja błon w oocycie jest procesem spolaryzowanym; Dlatego oocyt powinien być wstrzykiwany po zwierzęcej stronie komórki, najlepiej powyżej równika, pod kątem igły w kierunku strony zwierzęcej, aby zmaksymalizować fuzję błony.</li>
	<li>Przesuń szalkę Petriego tak, aby następny oocyt zrównał się z igłą i powtarzaj proces, aż wszystkie oocyty w szalce zostaną wstrzyknięte. Powtarzaj ten proces, aż do wstrzyknięcia żądanej liczby oocytów. Upewnij się, że jedna studzienka oocytów nie została wstrzyknięta do użycia jako kontrola.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu wszystkich oocytów wycofaj nanowstrzykiwacz do jego pierwotnej pozycji i wyjmij igłę.</li>
</ol>
4. Rejestracja prądów jonowych za pomocą dwuelektrodowego zacisku napięciowego
<ol>
	<li>Aby wykonać dwie igły elektrod z zaciskiem napięcia elektrody (TEVC), należy wyciągnąć 15 cm polerowane ogniowo rurki ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do mikropipet. Po zakończeniu ciągnięcia napełnij 3 M KCl za pomocą długich igieł kapilarnych lub alternatywnie zanurz i gotuj igły w roztworze 3 M KCl przez 15 minut w ciągłym próżni. Wysoka temperatura pomaga w napełnianiu elektrod i usuwaniu pęcherzyków powietrza.
	<ol>
		<li>Przygotować 3 M roztwór do napełniania elektrodą KCl, używając KCl w postaci krystalicznej i wody dejonizowanej, postępując dokładnie zgodnie z tymi krokami, aby potencjał odniesienia elektrod nie uległ zmianie. Ostrożnie wysuszyć KCl w piekarniku przez 2-3 godziny. Za pomocą wagi analitycznej ostrożnie odważ 223,68 g KCl. Przenieś KCl do szklanej butelki o pojemności 1 l. Użyj tego roztworu do chlorowania drutów elektrod srebrnych. 
		UWAGA: Do wyciągania szklanych elektrod książkę kucharską pipet można pobrać tutaj: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włącz wszystkie urządzenia używane do rejestrowania prądów jonowych: systemy główne, zawory roztworu, światło mikroskopu, systemy zaworów, zacisk oocytów i system próżniowy. Włącz komputer stacjonarny, zaloguj się do programu WinEDR 3.9.1 i upewnij się, że program jest uruchomiony i że wartości konfiguracji są poprawne w następujący sposób: nagraj na dysk, ustaw czas nagrywania i wyczyść opcję symulatora.
	<ol>
		<li>Podaj następujące początkowe wartości ustawień dla amplifier: dla sekcji elektrody napięciowej (Vm) wyłącz ujemną kompensację pojemności (-C); dla sekcji elektrod kąpielowych (Im) ustaw przełącznik wyboru wzmocnienia (zakres od 0.1 do 10) na 10, a trzypozycyjny przełącznik, który wybiera mnożnik wzmocnienia (x0.1, x1.0 i x10), na x1.0. Diody LED wskażą wybór mnożnika wzmocnienia; dla sekcji clamp wyłącz selektor trybu clamp, ustaw regulator wzmocnienia DC na IN, a kontrolę wzmocnienia w pełnej pętli otwartej (zakres od 0 do 2000) na około 1200; dla poleceń ustaw na 40mV i ustaw ujemne elementy sterujące przytrzymaniem i mnożnik skali na x2; w przypadku elektrody prądowej użyj przesunięcia Ve, aby ustalić zerowe odniesienie przed wbiciem oocytu.</li>
		<li>Aby nagrać, otwórz oprogramowanie WinEDR V3.9.1, przejdź do górnego menu i wybierz Plik > Otwórz nowy plik. Utwórz własny folder i zapisz plik.</li>
		<li>Następnie w menu głównym wybierz opcję Nagraj > Nagraj na dysk. Gdy dwie elektrody znajdą się wewnątrz ooctytu, włącz dzwonek w sterowniku zaworu VC-8 i przekręć zacisk na Slow w OC-725C amplifier. Następnie wróć do oprogramowania WinEDR i wybierz opcję Nagraj w lewym górnym rogu ekranu.</li>
		<li>W tabeli znaków w lewym dolnym rogu zapisz swój początkowy potencjał błonowy i naciśnij Enter. W miarę trwania eksperymentu możesz zapisać nazwy stosowanych leków. Po zakończeniu eksperymentu wybierz opcję Zatrzymaj w lewym górnym rogu ekranu. 
		UWAGA: Do wykonywania TEVC używamy oprogramowania WinEDR lub WinWCP, ponieważ są one bezpłatne i dobrze nadają się do eksperymentów, ale można użyć dowolnego innego dostępnego oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzupełnij wszystkie roztwory leków potrzebne do przeprowadzenia eksperymentu (np. GABA, Kainate) i potwierdź, że zawory roztworu działają prawidłowo, włączając je i wyłączając oraz obserwując przemieszczenie zaworów zaciskowych.</li>
	<li>Napełnij probówki, wlewając odpowiedni roztwór do pojemnika strzykawki podłączonego do probówki i oznacz sterownik zaworu tak, aby był skorelowany z probówkami z roztworem. Upewnij się, że przepływ roztworu jest stały, nie ma pęcherzyków i że system próżniowy działa prawidłowo.</li>
	<li>Ustaw obszar mikroskopu i komory nagraniowej. Umieść mostki agarowe (patrz poniżej) w odpowiednich okrągłych otworach za komorą zapisu (dystalnie od obszaru obsługi), łącząc studzienki dla elektrod używanych jako odniesienie do uziemienia i komory rejestracyjnej. Dodać roztwór roboczy Ringera (1x) do studzienek elektrody rejestracyjnej i uziemienia elektrody odniesienia.
	<ol>
		<li>Mostki agarowe to probówki borokrzemianowe w kształcie litery U o długości 2-3 cm, wypełnione 3% agarem w roztworze Ringera. Wykonaj rurki w kształcie litery U, przecinając rurki o długości 15 cm, zginając je na otwartym ogniu, a następnie wypełniając je gorącym 3% agarem za pomocą strzykawki insulinowej. Wypełnione mostki agarowe w roztworze Ringera przechowuj w lodówce do czasu użycia.</li>
		<li>Przygotować 20x roztwór podstawowy Ringera w następujący sposób: W 1 l wody destylowanej dodać 134,4 g NaCl, 2,982 g KCl, 5,29 g CaCl2 i 23,83 g kwasu HEPES (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego). Dla 1x roztworu roboczego Ringera, w kolbie miarowej, dodaj 200 ml roztworu podstawowego Ringera (20x) do 3,800 ml wody destylowanej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj elektrody z chlorowanego srebra przed każdym eksperymentem przez elektrolizę, umieszczając srebrne druty w 3 M roztworze KCl i podłączając srebrną elektrodę do dodatniego bieguna akumulatora 9 V. Po około 3 minutach do elektrody osadza się stała brązowa warstwa AgCl. Umieść druty elektrody z chlorowanego srebra w obudowie elektrody. 
	UWAGA: Uziemiające elektrody referencyjne i rejestrujące chlorowane to elektrody srebro/chlorek srebra (Ag/AgCl).</li>
	<li>Usunąć igły borokrzemianowe z roztworu KCl. Za pomocą strzykawki pobrać niewielką ilość roztworu KCl z otwartego końca igły elektrody i zastąpić roztwór KCl olejem mineralnym; pozwoli to uniknąć parowania wody i zmian stężenia KCl w igle. Nasuń szklaną igłę na drut elektrody z chlorowanego srebra i dokręć je na miejscu.</li>
	<li>Za pomocą prawego i lewego manipulatora przytrzymującego elektrody, wprowadź igły elektrod do komory nagrywającej, która jest wypełniona roztworem Ringera.</li>
	<li>Sprawdź rezystancję każdej elektrody, zerując pokrętła przesunięcia Vm i Ve, a następnie naciskając przyciski testu elektrody. Rezystancja powinna mieścić się w przedziale 0,5-3 MΩ (bezpośrednio odczytywana na ekranie jako 5-30 mV). Jeśli rezystancja jest poza zakresem, wymień na nowe mikroelektrody.</li>
	<li>Napełnij komorę nagraniową świeżym roztworem Ringera. Za pomocą szklanej pipety umieść oocyt bez iniekcji lub z mikroprzeszczepem na środku komory nagraniowej. Upewnij się, że oocyt jest wyraźnie widoczny pod mikroskopem, zwierzęcą stroną do góry (patrz UWAGA w kroku 3.4).</li>
	<li>Wprowadzić elektrodę do roztworu Ringera, aż dotkną błony oocytu. Delikatnie przekłuć błonę oocytów po stronie zwierzęcia (patrz UWAGA w kroku 3.4) obiema elektrodami i zapisać spoczynkowy potencjał błony. Włącz przepływ roztworu Ringera.</li>
	<li>Za pomocą wzmacniacza klamry oocytów zmień tryb na Voltage Clamp i ustaw napięcie podtrzymania na -80 mV. Prąd na monitorze powinien być ujemny, zwykle od 0 do 0,4 mikroampera.</li>
	<li>Utwórz nowy plik, aby zapisać nagranie jako Plik > Nowy > Zapisz nagranie w oprogramowaniu. Rozpocznij nagrywanie, naciśnij przycisk Nagraj > Nagraj na dysk. Dodaj odpowiednie informacje do pliku za pomocą okna dialogowego pola oznaczania (nazwa testu, użyte leki itp.).</li>
	<li>Zastosuj agonistów (np. GABA, glutaminian lub kainian) do stymulacji chemicznej, otwierając zawory i wprowadzając je do komory zapisu przez 15 sekund. Zwykle użyj wzmocnienia 10x, aby wykreślić maksymalną liczbę punktów i zrekonstruować odpowiedź. Jeśli prądy są bardzo małe, zwiększ wzmocnienie lub wzmocnienie, aby można je było ocenić i zobaczyć. Zawsze zwracaj uwagę na te zmiany. 
	UWAGA: Czas trwania perfuzji zależy od paradygmatu eksperymentalnego. Jeśli głównym celem jest zmierzenie maksymalnej amplitudy, 15 s wystarczy, aby osiągnąć szczyt dla GABA lub plateau dla kainianu.</li>
	<li>Zawsze monitoruj poziomy rozwiązań. Roztwór Ringera będzie musiał być często uzupełniany, ponieważ jest używany między wszystkimi zastosowaniami roztworu. Po zakończeniu nagrywania przekręć voltage clamp do pozycji OFF i wyłącz zawór roztworu Ringera. Usuń oocyt. Zatrzymaj nagrywanie i zapisz plik. Powtórz te czynności dla wszystkich wstrzykniętych komórek jajowych.</li>
</ol>
5. Analiza nagrań TEVC
<ol>
	<li>Zapisz kopię nagrań na dysku USB. Stamtąd otwórz żądany plik do analizy. W pliku, który zostanie otwarty, nagranie można wyświetlić, oznaczyć i zmierzyć. Najczęstsza analiza obejmuje pomiar maksymalnej amplitudy, czasu aktywacji, odczulania i wyczerpania powtarzających się aplikacji.</li>
	<li>Zmierz maksymalną odpowiedź AMPA i szczytową odpowiedź GABA. Aby uzyskać te pomiary, najpierw ustal poziom zerowy lub linię bazową, znajdując czerwoną linię kursorem i przeciągając ją do prądu generowanego przez aplikację Ringer lub linię bazową.</li>
	<li>Po ustaleniu poziomu zerowego określ pomiary odpowiedzi, przeciągając za pomocą myszy zielony, pionowy kursor odczytu do żądanej części śledzenia wykresu. W razie potrzeby wyeksportuj ślady do analizy w dowolnym innym preferowanym oprogramowaniu 
	UWAGA: Jeśli nie można zdefiniować poziomu zerowego lub na znaczniku jest zbyt dużo szumu, wyeksportuj plik WinEDR do oprogramowania analitycznego offline, które pozwoli na modyfikacje w celu zapewnienia linii bazowej poziomu i dodanie filtrów w celu redukcji szumów.</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Analiza natywnych kompleksów białkowych z ludzkiego mózgu jest potrzebna, aby zrozumieć procesy homeostatyczne i patologiczne w zaburzeniach mózgu oraz opracować strategie terapeutyczne w celu zapobiegania chorobom lub ich leczenia. W związku z tym banki mózgów zawierające zamrożone próbki są nieocenionym źródłem dużego i w większości niewykorzystanego bogactwa informacji fizjologicznych29,30. Początkową obawą związaną z wykorzystaniem tkanek pośmiertnych jest wy...

Zaburzenia neurodegeneracyjne dotykają dużego procentu populacji. Chociaż ich niszczycielskie konsekwencje są dobrze znane, związek między funkcjonalnymi zmianami receptorów neuroprzekaźników, które są krytyczne dla funkcjonowania mózgu, a ich symptomatologią jest nadal słabo poznany. Zmienność międzyosobnicza, przewlekły charakter choroby i podstępny początek objawów to tylko niektóre z powodów, które opóźniły zrozumienie wielu zaburzeń mózgu, w przypadku których brak równowagi chemicznej jest dobrze udokumentowany1,2. Modele zwierzęce dostarczyły bezcennych informacji i poszerzyły naszą wiedzę na temat mechanizmów leżących u podstaw fizjologii i patofizjologii w ewolucyjnie zachowanych systemach; Jednak kilka różnic międzygatunkowych między gryzoniami a ludźmi wyklucza bezpośrednią ekstrapolację funkcji receptora z modeli zwierzęcych na ludzki mózg3. W związku z tym wstępne wysiłki mające na celu zbadanie rodzimych ludzkich receptorów zostały opracowane przez laboratorium Ricardo Milediego przy użyciu chirurgicznie usuniętych tkanek i zamrożonych próbek. W tych początkowych eksperymentach wykorzystano całe błony, które obejmują neuronalne receptory synaptyczne i pozasynaptyczne, a także nieneuronalne receptory neuroprzekaźników, i chociaż dostarczają ważnych informacji o stanach chorobowych, istnieje obawa, że mieszanka receptorów komplikuje interpretację danych4,5,6,7. Co ważne, synapsy są głównym celem w wielu zaburzeniach neurodegeneracyjnych8,9; Dlatego testy mające na celu zbadanie właściwości funkcjonalnych dotkniętych synaps mają zasadnicze znaczenie dla uzyskania informacji o istotnych dla choroby zmianach wpływających na komunikację synaptyczną. W tym miejscu opisano modyfikację oryginalnej metody: mikrotransplantację błon synaptycznych (MSM), która koncentruje się na fizjologicznej charakterystyce wzbogaconych preparatów białek synaptycznych i została z powodzeniem zastosowana do badania synaptosomów szczurzych i ludzkich10,11,12,13,14,15. Dzięki tej metodologii możliwe jest przeszczepienie receptorów synaptycznych, które kiedyś działały w ludzkim mózgu, osadzonych we własnych natywnych lipidach i z własną kohortą powiązanych białek. Co więcej, ponieważ dane MSM są ilościowe, możliwe jest wykorzystanie tych danych do integracji z dużymi zestawami danych proteomicznych lub sekwencjonowania10.
Ważne jest, aby zauważyć, że wiele analiz farmakologicznych i biofizycznych receptorów synaptycznych przeprowadza się na białkach rekombinowanych16,17. Chociaż podejście to zapewnia lepszy wgląd w relacje struktura-funkcja receptorów, nie może dostarczyć informacji o złożonych kompleksach receptorów multimerycznych znajdujących się w neuronach i ich zmianach w chorobie. Dlatego połączenie białek natywnych i rekombinowanych powinno zapewnić bardziej kompleksową analizę receptorów synaptycznych.
Istnieje wiele metod przygotowania synaptosomów10,11,12,13,14,15, które można dostosować do wymagań laboratorium. Protokół rozpoczyna się od założenia, że preparaty wzbogacone synaptosomalnie zostały wyizolowane i są gotowe do przetworzenia do eksperymentów mikrotransplantacyjnych. W laboratorium stosuje się metodę Syn-Per zgodnie z instrukcjami producenta. Dzieje się tak ze względu na wysoką powtarzalność w eksperymentach elektrofizjologicznych10,11. Istnieje również obszerna literatura wyjaśniająca, jak wyizolować oocyty Xenopus18,19, które można również kupić w stanie gotowym do wstrzyknięcia20.

<table><tbody><tr><td><mocny>Do mikroiniekcji</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,5" Kapilary szklane</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa, płaska płytka do hodowli tkankowych</td><td>Thermofisher</td><td>FB012929</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet typu płomieniowego/brązowego Naczynie</td> iniekcyjne <td>Sutter</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermofisher</td><td>08-772B</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Thermofisher</td><td>02-682-002</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Thermofisher</td><td>O121-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Siatka nylonowa</td><td>Siatka przemysłowa</td><td>WN0800</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Thermofisher</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-000-037</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Thermofisher</td><td>14-841-31</td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwiękowa kąpiel</td><td>czyszcząca Thermofisher</td><td>FS20D</td><td></td></tr><tr><td>Xenopus laevis żaby</td><td>Xenopus 1</td><td>4217</td><td></td></tr><tr><td><mocne>Dla dwóch elektrod Zacisk napięciowy</mocny></td>15 cm o długości polerowany ogniopolerowany <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>Sutter</td><td>B200-116-15</td><td></td></tr><tr><td>Dowolny komputer PC lub laptop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dolnoprzepustowy filtr Bessela</td><td>Warner Instruments</td><td>LPF-8</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-000-037</td><td></td></tr><tr><td>Stacja robocza z dwuelektrodowymi cęgami napięciowymi</td><td>Warner Instruments</td><td>TEV-700</td><td></td></tr><tr><td>ValveLink 8.2 Kontroler perfuzji</td><td>Automate Scientific SKU</td><td>:01-18</td><td></td></tr><tr><td>WInEDR Darmowe oprogramowanie</td><td>University of Strathclyde Glasgow</td><td>https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td></tr><tr><td>X Series Wielofunkcyjny DAQ</td><td>National Instruments</td><td>NI USB-6341</td><td></td></tr><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium</td><td>Thermofisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Wapń Tetrahydrat azotanu</td><td>Thermofisher</td><td>C109</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy)Thermofisher</td><td></td> <td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>Kwas Kainowy</td><td>Tocris</td><td>0222</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Thermofisher</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Thermofisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Thermofisher</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Thermofisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-0,1 i mikro; m Filtr MC,</td> <td>Amicon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikrotransplantacja błon synaptycznych w celu reaktywacji ludzkich receptorów synaptycznych do badań funkcjonalnych

Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies

Pobudzające i hamujące receptory jonotropowe są głównymi bramami strumieni jonów, które determinują aktywność synaps podczas fizjologicznej komunikacji neuronalnej. W związku z tym zaobserwowano zmiany w ich obfitości, funkcji i związkach z innymi elementami synaptycznymi jako główny korelat zmian w funkcjonowaniu mózgu i upośledzenia funkcji poznawczych w chorobach neurodegeneracyjnych i zaburzeniach psychicznych. Zrozumienie, w jaki sposób funkcja pobudzających i hamujących receptorów synaptycznych jest zmieniana przez chorobę, ma kluczowe znaczenie dla opracowania skutecznych terapii. Aby uzyskać informacje istotne dla choroby, ważne jest rejestrowanie aktywności elektrycznej receptorów neuroprzekaźników, które pozostają funkcjonalne w chorym ludzkim mózgu. Jak dotąd jest to najbliższe podejście do oceny patologicznych zmian w funkcjonowaniu receptorów. W niniejszej pracy przedstawiono metodykę wykonywania mikrotransplantacji błon synaptycznych, która polega na reaktywacji błon synaptycznych z zatrzaskowo zamrożonej ludzkiej tkanki mózgowej zawierającej ludzkie receptory, poprzez jej wstrzyknięcie i tylne zespolenie do błony oocytów Xenopus laevis. Protokół zawiera również strategię metodologiczną mającą na celu uzyskanie spójnych i wiarygodnych odpowiedzi receptorów kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazopropionowego (AMPA) i kwasu γ-aminomasłowego (GABA), a także nowatorskie szczegółowe metody, które są stosowane do normalizacji i rygorystycznej analizy danych.

W ciągu kilku godzin po wstrzyknięciu membrany synaptyczne, zawierające receptory neurotransmiterów i kanały jonowe, zaczynają łączyć się z błoną plazmatyczną oocyta. Rysunek 1 przedstawia rejestracje receptorów AMPA i GABAA mikroprzeszczepionych do oocytów Xenopus. W większości analiz mierzono odpowiedzi z dwóch lub trzech oocytów na próbkę, wykorzystując dwie lub trzy partie oocytów od różnych żab, co łącznie dawało od sześciu do dziewięciu oocytów na próbkę. Procedurę ...

Protokół pokazuje, że przeprowadzając mikroprzeszczepy błon synaptycznych do oocytów Xenopus laevis, można rejestrować spójne i niezawodne odpowiedzi receptorów kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazopropionowego i kwasu γ-aminomasłowego.

Mikrotransplantacja błon synaptycznych w celu reaktywacji ludzkich receptorów synaptycznych do badań funkcjonalnych

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal ...

Zaburzenia neurodegeneracyjne i zaburzenia zdrowia psychicznego wynikają ze zmian w komunikacji synaptycznej. Zdarzenia wieloczynnikowe zmieniają receptory synaptyczne w sposób, którego nie do końca rozumiemy. Mikrotransplantacja błon synaptycznych zapewnia wgląd w te zmiany.Główną zaletą tej techniki jest możliwość rejestrowania aktywności natywnych receptorów mózgowych pracujących w ludzkim mózgu, a więc reprezentujących badane przez nas choroby. Receptory synaptyczne są głównymi celami dla medycyny regulującej aktywność elektryczną mózgu, ale zrozumienie, w jaki sposób te receptory się zmieniają, może pomóc w opracowaniu lepszych terapii przywracających ich funkcjonalność. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do różnych gatunków, od owadów, ryb, ssaków, ale może być również stosowana do receptorów błonowych poza mózgiem, na przykład mięśni i guzów.Możliwości są szerokie. Przycinanie igieł iniekcyjnych jest trudne. Zbyt mały może zapobiec wstrzyknięciu białka, a dwa duże mogą zabić komórkę.Pomaga w użyciu spójnego pomiaru, takiego jak krawędź żyletki. Rozpocznij od trzykrotnej sonikacji wybranych próbek przygotowanych z obszaru ludzkiego mózgu w kąpieli z pływającym mokrym lodem. Za każdym razem używaj pięciu sekundowych cykli i odczekaj minutę na mokrym lodzie pomiędzy cyklami.Umieścić jeden mikrolitr próbki na tworzywie termoplastycznym i w razie potrzeby wykonać wgłębienie na powierzchni przed umieszczeniem próbki, aby zapobiec przemieszczaniu się próbki. Użyj pokręteł manipulatora przytrzymującego nanowtryskiwacz, aby ustawić igłę i przesuń ją w kierunku próbki, która ma zostać napełniona. Gdy końcówka igły znajdzie się w próbce, naciśnij i przytrzymaj przycisk napełniania, aż zostanie pobrana wystarczająca ilość próbki.Na 10 oocytów potrzeba około 0,5 mikrolitra próbki. Użyj pokręteł, aby przesunąć igłę nanowtryskiwacza z powrotem do najwyższej pozycji. Wniknij w oocyt tuż pod powierzchnią za pomocą igły, nie głębiej i użyj pedału nożnego, aby wstrzyknąć próbkę.Poczekaj około dwóch do trzech sekund. Po udanym wstrzyknięciu komórka rozszerzy się. Użyj pokręteł na manipulatorze, aby wyjść z komórki.Przesuń szalkę Petriego tak, aby następny oocyt znalazł się w jednej linii z igłą. Powtarzaj proces, aż pożądana liczba oocytów w naczyniu zostanie wstrzyknięta, a następnie wycofaj nanowstrzykiwacz do pierwotnej pozycji i wyjmij igłę. Upewnij się, że jedna studzienka oocytów nie została wstrzyknięta do wykorzystania jako kontrola.Włącz wszystkie urządzenia używane do rejestrowania prądów jonowych, a następnie włącz komputer stacjonarny i zaloguj się do WinEDR w wersji 3.9.1. Upewnij się, że program jest uruchomiony, a rekord jest ustawiony na Dysk. Następnie ustaw czas nagrywania i wyczyść opcję Symulator.W przypadku sekcji elektrody napięcia wyłącz kompensację ujemnej pojemności. Ustaw przełącznik wyboru wzmocnienia w pozycji 10 dla sekcji elektrody kąpieli, a następnie ustaw trzypozycyjny przełącznik, który wybiera mnożnik wzmocnienia, na x1. Diody LED wskażą wybór mnożnika wzmocnienia.Wyłącz selektor trybu clamp, ustaw regulator wzmocnienia DC w pozycji in i ustaw regulator wzmocnienia na około połowę pełnej otwartej pętli pasma. Ustaw polecenia na 40 miliwoltów, kontrolki przytrzymania na ujemne, a mnożnik skali na x2. W przypadku elektrody prądowej użyj przesunięcia VE, aby ustalić zerowe odniesienie, przed wbiciem komórki jajowej.Następnie otwórz oprogramowanie WinEDR w wersji 3.9.1, przejdź do górnego menu i wybierz Plik, a następnie Nowy. Utwórz własny folder i zapisz plik. W menu głównym wybierz Nagraj, a następnie Nagraj na dysk.Umieść mostki agarowe w odpowiednich okrągłych otworach za komorą zapisu, łącząc studzienki dla elektrod używanych jako odniesienie do uziemienia w komorze nagrywania. Dodaj 1x roztwór roboczy Ringera do odpowiedniego zaworu perfuzyjnego. Otwórz zawór, aż komora nagrywająca zostanie napełniona roztworem Ringera.Za pomocą prawego i lewego manipulatora przytrzymującego elektrody, wprowadź igły elektrod do komory nagrywającej, która jest wypełniona roztworem Ringera. Sprawdź rezystancję każdej elektrody, zerując pokrętła przesunięcia VM i VE, a następnie naciskając przyciski testu elektrody. Rezystancja powinna wynosić od 0,5 do trzech megaomów.Jeśli rezystancja jest poza zakresem, wymień ją na nowe mikroelektrody. Następnie napełnij komorę nagraniową świeżym roztworem Ringera. Za pomocą szklanej pipety umieść niewstrzyknięty lub mikroprzeszczepiony oocyt na środku komory nagraniowej.Upewnij się, że oocyt jest wyraźnie widoczny pod mikroskopem zwierzęcą stroną do góry. Wprowadzić elektrodę do roztworu Ringera, aż dotkną błony oocytu. Delikatnie przebij błonę oocytów po stronie zwierzęcia obiema elektrodami i zapisz spoczynkowy potencjał błony.Włącz przepływ rozwiązania dzwonka. Za pomocą wzmacniacza zaciskowego oocytów zmień tryb na voltage clamp wolno i ustaw napięcie podtrzymania na 80 miliwoltów. Prąd na monitorze powinien być ujemny, zwykle od 0 do 0,4 mikroampera.Przejdź do Plik, Nowy, a następnie zapisz nagranie w oprogramowaniu, aby utworzyć nowy plik i zapisać nagranie. Naciśnij przycisk Nagraj, a następnie przycisk Nagraj na płytę, aby rozpocząć nagrywanie. Dodaj odpowiednie informacje do pliku za pomocą okna dialogowego Zaznacz wykres.Zastosuj agonistów do stymulacji chemicznej, otwierając zawory i wprowadzając je do komory rejestracyjnej przez 15 sekund. Po zakończeniu nagrywania przekręć voltage clamp do pozycji wyłączonej i wyłącz zawór Ringer's Solution. Usuń oocyt i odrzuć zgodnie z polityką instytucjonalną dotyczącą próbek ludzkiego mózgu, a następnie zatrzymaj nagrywanie i zapisz plik.Zapisz kopię nagrań na dysku USB. Stamtąd otwórz żądany plik do analizy. Aby zmierzyć maksymalną odpowiedź AMPA i szczytową odpowiedź GABA A, najpierw ustal poziom 0 lub linię bazową, znajdując czerwoną linię, a następnie przeciągnij ją do prądu generowanego przez aplikację Ringer lub linię bazową.Po ustaleniu poziomu 0 określ pomiary odpowiedzi, przeciągając zielony pionowy kursor odczytu do żądanej części znacznika wykresu. Rejestrowano prądy jonowe z oocytów wstrzykiwanych wraz z błonami z ludzkich receptorów synaptycznych. Receptory AMPA były aktywowane za pomocą 100 mikromolowych kainianów, a receptory GABA A za pomocą jednego milimolowego GABA.Jednoczesna iniekcja przefiltrowanych błon z narządu elektrycznego torpedy, bogatego w receptory acetylocholiny, oraz kodowanie cDNA dla receptora GABA rzędu pierwszego do bieguna zwierzęcego wytworzyły głównie dwie grupy oocytów, w oparciu o ich odpowiedzi. Jedna grupa oocytów miała dużą odpowiedź na acetylocholinę, ale nie miała odpowiedzi na jeden mikromolowy GABA. Oocyty w innej grupie miały zerową lub niską odpowiedź na acetylocholinę, ale dużą odpowiedź na GABA.Obraz graficzny przedstawia średni plus minus błąd standardowy średniej prądu szczytowego w grupie pierwszej i grupie drugiej. Jeden oocyt w grupie drugiej miał duże odpowiedzi GABA i acetylocholiny, co sugeruje pęknięcie jądra. W związku z tym rozkład odpowiedzi był zniekształcony do niskich wartości, na co zwraca uwagę różnica między średnią a medianą rozkładu prądu membranowego.Jedną z przyczyn niskiej odpowiedzi oocytów jest to, że błony są wstrzykiwane i uwięzione w jądrze oocytu. Przedstawiono tutaj odpowiedzi GABA i kainianów oocytów wstrzykniętych do biegunów zwierzęcych lub roślinnych z niefiltrowanymi błonami uzyskanymi z mózgu innego niż AD oraz mózgu z AD. Oocyty wstrzyknięte w pobliżu bieguna zwierzęcego bez celowania w jądro dawały większe odpowiedzi niż oocyty wstrzyknięte do bieguna roślinnego, co umożliwiło badanie próbek tkanek o bardzo małej liczbie receptorów.Próbując wykonać tę procedurę, zawsze monitoruj poziom dzwonka. Zawsze podczas ważnych nagrań zabraknie Ci danych, a potem wykorzysta Twój wynik, śmierć oocytu i utratę bardzo cennych danych. Po tej procedurze możemy wykonać obciążenia zachodnie, aby potwierdzić obecność receptorów synaptycznych lub białek będących przedmiotem zainteresowania.Pozwala na pomiar globalnych proporcji synaptycznych pobudzenia do inhibicji w różnych obszarach mózgu i różnych zaburzeniach mózgu, co pozwala na bezpośrednie przetestowanie teoretycznych przewidywań dotyczących przyczyn choroby.

microtransplantation-synaptic-membranes-to-reactivate-human-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Synapsy glutaminergiczne mogą przełączać się z trybu aktywnego w tryb cichy. Wykazujemy, że status aktywności presynaptycznej w dysocjowanej kulturze neuronów gryzoni można zwizualizować, wykorzystując utrwalalną formę barwnika FM1-43 do obrazowania synaps aktywnych oraz immunobarwienie przeciwciałami przeciwko vGluT-1 w celu wizualizacji wszystkich synaps glutaminergicznych.

Badanie presynaptycznie cichych synaps z wykorzystaniem mikroskopii świetlnej

Niniejszy raport demonstruje technikę mechanicznej izolacji pojedynczych żywych neuronów z zachowaniem przytwierdzonych boutonów presynaptycznych. Neurony poddane wibrodysocjacji charakteryzują się zaletami takimi jak szybki czas przygotowania, doskonała kontrola farmakologiczna oraz usprawniona stabilizacja potencjału błonowego (space-clamp) bez wpływu komórek sąsiednich. Metoda ta może być wykorzystywana do obrazowania elementów synaptycznych oraz rejestracji metodą patch-clamp.

Wibrodysocjacja neuronów z plastrów mózgu gryzoni w celu badania transmisji synaptycznej i obrazowania terminali presynaptycznych

Ten protokół opisuje nowatorską metodę badania formy chemicznej neurostymulacji całych siatkówek szczurów in vitro za pomocą neuroprzekaźnika glutaminianu. Neurostymulacja chemiczna jest obiecującą alternatywą dla konwencjonalnej neurostymulacji elektrycznej neuronów siatkówki w leczeniu nieodwracalnej ślepoty spowodowanej chorobami zwyrodnieniowymi fotoreceptorów.

Metodologia biomimetycznej neuromodulacji chemicznej siatkówki szczura za pomocą neuroprzekaźnika glutaminianu in vitro

W tym protokole staramy się opisać powtarzalną metodę łączenia zdysocjowanych ludzkich neuronów i astrocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w kokultury sfer 3D, utrzymywania tych sfer w warunkach swobodnego pływania, a następnie mierzenia aktywności obwodów synaptycznych kul za pomocą immunoanalizy i zapisów z matrycy wieloelektrodowej.

Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Opisujemy optyczny test do recyklingu pęcherzyków synaptycznych (SV) w hodowanych neuronach. Połączenie tego protokołu z podwójną transfekcją w celu ekspresji markera presynaptycznego i białka będącego przedmiotem zainteresowania pozwala nam zlokalizować miejsca presynaptyczne, ich zdolność do recyklingu pęcherzyków synaptycznych i określić rolę białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Test optyczny do recyklingu pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach z nadekspresją białek presynaptycznych

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę ponownego zawieszania i hodowli neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych, które wcześniej były odróżniane od progenitorów nerwowych in vitro przez wiele tygodni. Procedura ułatwia oparte na obrazowaniu testy neurytów, synaps i markerów neuronalnych o późnej ekspresji w formacie zgodnym z mikroskopią świetlną i badaniami przesiewowymi o wysokiej zawartości.

Powtórzenie po różnicowaniu ludzkich neuronów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu przeprowadzenia badań przesiewowych neurytogenezy i dojrzewania synaps o wysokiej zawartości

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Przedstawiony tutaj protokół pozwala na przeszczepienie indukowanego pluripotencjalnego ludzkiego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych (iPSMG) do mózgu drogą przeznosową u myszy immunokompetentnych. Przedstawiono metodę przygotowania i przeznosowego przeszczepienia komórek oraz podawania mieszaniny cytokin w celu utrzymania iPSMG.

Przeszczepienie indukowanego przez człowieka pluripotencjalnego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych w mózgu myszy immunokompetentnych drogą przeznosową

Przeszczepienie ludzkich pluripotencjalnych neuronów GABA-ergicznych pochodzących z komórek macierzystych, generowanych przez programowanie neuronalne, może być potencjalnym podejściem do leczenia zaburzeń neurorozwojowych. Protokół ten opisuje wytwarzanie i przeszczepianie prekursorów neuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do mózgów nowonarodzonych myszy, umożliwiając długoterminowe badanie przeszczepionych neuronów i ocenę ich potencjału terapeutycznego.

Przeszczep ludzkich neuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do wczesnopourodzeniowego hipokampa myszy w celu złagodzenia zaburzeń neurorozwojowych

Tutaj opisujemy protokół inżynierii chemicznie przeprogramowanych komórek macierzystych w celu osiągnięcia precyzyjnej modulacji neuronalnej poprzez różnicowanie tych komórek w dopaminergiczne komórki prekursorowe, przeszczepianie ich do mysich modeli choroby Parkinsona oraz ocenę wyników behawioralnych i elektrofizjologicznych w celu potwierdzenia udanej integracji i funkcjonalnej skuteczności przeszczepionych komórek.

Regulacja chemogenetyczna w przeprogramowanych komórkach prekursorowych pochodzących z komórek macierzystych w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych

Poznaj mikrotransplantację błon synaptycznych do oocytów Xenopus laevis w celu reaktywacji ludzkich receptorów synaptycznych. Ta metoda umożliwia badanie funkcji natywnych receptorów mózgowych związanych z chorobami neurodegeneracyjnymi.

Mikrotransplantacja błon synaptycznych w celu reaktywacji ludzkich receptorów synaptycznych do badań funkcjonalnych

Przeglądaj więcej filmów