Mikrotransplantacja błon synaptycznych w celu reaktywacji ludzkich receptorów synaptycznych do badań funkcjonalnych

Zaburzenia neurodegeneracyjne i zaburzenia zdrowia psychicznego wynikają ze zmian w komunikacji synaptycznej. Zdarzenia wieloczynnikowe zmieniają receptory synaptyczne w sposób, którego nie do końca rozumiemy. Mikrotransplantacja błon synaptycznych zapewnia wgląd w te zmiany.

Główną zaletą tej techniki jest możliwość rejestrowania aktywności natywnych receptorów mózgowych pracujących w ludzkim mózgu, a więc reprezentujących badane przez nas choroby. Receptory synaptyczne są głównymi celami dla medycyny regulującej aktywność elektryczną mózgu, ale zrozumienie, w jaki sposób te receptory się zmieniają, może pomóc w opracowaniu lepszych terapii przywracających ich funkcjonalność. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do różnych gatunków, od owadów, ryb, ssaków, ale może być również stosowana do receptorów błonowych poza mózgiem, na przykład mięśni i guzów.

Możliwości są szerokie. Przycinanie igieł iniekcyjnych jest trudne. Zbyt mały może zapobiec wstrzyknięciu białka, a dwa duże mogą zabić komórkę.

Pomaga w użyciu spójnego pomiaru, takiego jak krawędź żyletki. Rozpocznij od trzykrotnej sonikacji wybranych próbek przygotowanych z obszaru ludzkiego mózgu w kąpieli z pływającym mokrym lodem. Za każdym razem używaj pięciu sekundowych cykli i odczekaj minutę na mokrym lodzie pomiędzy cyklami.

Umieścić jeden mikrolitr próbki na tworzywie termoplastycznym i w razie potrzeby wykonać wgłębienie na powierzchni przed umieszczeniem próbki, aby zapobiec przemieszczaniu się próbki. Użyj pokręteł manipulatora przytrzymującego nanowtryskiwacz, aby ustawić igłę i przesuń ją w kierunku próbki, która ma zostać napełniona. Gdy końcówka igły znajdzie się w próbce, naciśnij i przytrzymaj przycisk napełniania, aż zostanie pobrana wystarczająca ilość próbki.

Na 10 oocytów potrzeba około 0,5 mikrolitra próbki. Użyj pokręteł, aby przesunąć igłę nanowtryskiwacza z powrotem do najwyższej pozycji. Wniknij w oocyt tuż pod powierzchnią za pomocą igły, nie głębiej i użyj pedału nożnego, aby wstrzyknąć próbkę.

Poczekaj około dwóch do trzech sekund. Po udanym wstrzyknięciu komórka rozszerzy się. Użyj pokręteł na manipulatorze, aby wyjść z komórki.

Przesuń szalkę Petriego tak, aby następny oocyt znalazł się w jednej linii z igłą. Powtarzaj proces, aż pożądana liczba oocytów w naczyniu zostanie wstrzyknięta, a następnie wycofaj nanowstrzykiwacz do pierwotnej pozycji i wyjmij igłę. Upewnij się, że jedna studzienka oocytów nie została wstrzyknięta do wykorzystania jako kontrola.

Włącz wszystkie urządzenia używane do rejestrowania prądów jonowych, a następnie włącz komputer stacjonarny i zaloguj się do WinEDR w wersji 3.9.1. Upewnij się, że program jest uruchomiony, a rekord jest ustawiony na Dysk. Następnie ustaw czas nagrywania i wyczyść opcję Symulator.

W przypadku sekcji elektrody napięcia wyłącz kompensację ujemnej pojemności. Ustaw przełącznik wyboru wzmocnienia w pozycji 10 dla sekcji elektrody kąpieli, a następnie ustaw trzypozycyjny przełącznik, który wybiera mnożnik wzmocnienia, na x1. Diody LED wskażą wybór mnożnika wzmocnienia.

Wyłącz selektor trybu clamp, ustaw regulator wzmocnienia DC w pozycji in i ustaw regulator wzmocnienia na około połowę pełnej otwartej pętli pasma. Ustaw polecenia na 40 miliwoltów, kontrolki przytrzymania na ujemne, a mnożnik skali na x2. W przypadku elektrody prądowej użyj przesunięcia VE, aby ustalić zerowe odniesienie, przed wbiciem komórki jajowej.

Następnie otwórz oprogramowanie WinEDR w wersji 3.9.1, przejdź do górnego menu i wybierz Plik, a następnie Nowy. Utwórz własny folder i zapisz plik. W menu głównym wybierz Nagraj, a następnie Nagraj na dysk.

Umieść mostki agarowe w odpowiednich okrągłych otworach za komorą zapisu, łącząc studzienki dla elektrod używanych jako odniesienie do uziemienia w komorze nagrywania. Dodaj 1x roztwór roboczy Ringera do odpowiedniego zaworu perfuzyjnego. Otwórz zawór, aż komora nagrywająca zostanie napełniona roztworem Ringera.

Za pomocą prawego i lewego manipulatora przytrzymującego elektrody, wprowadź igły elektrod do komory nagrywającej, która jest wypełniona roztworem Ringera. Sprawdź rezystancję każdej elektrody, zerując pokrętła przesunięcia VM i VE, a następnie naciskając przyciski testu elektrody. Rezystancja powinna wynosić od 0,5 do trzech megaomów.

Jeśli rezystancja jest poza zakresem, wymień ją na nowe mikroelektrody. Następnie napełnij komorę nagraniową świeżym roztworem Ringera. Za pomocą szklanej pipety umieść niewstrzyknięty lub mikroprzeszczepiony oocyt na środku komory nagraniowej.

Upewnij się, że oocyt jest wyraźnie widoczny pod mikroskopem zwierzęcą stroną do góry. Wprowadzić elektrodę do roztworu Ringera, aż dotkną błony oocytu. Delikatnie przebij błonę oocytów po stronie zwierzęcia obiema elektrodami i zapisz spoczynkowy potencjał błony.

Włącz przepływ rozwiązania dzwonka. Za pomocą wzmacniacza zaciskowego oocytów zmień tryb na voltage clamp wolno i ustaw napięcie podtrzymania na 80 miliwoltów. Prąd na monitorze powinien być ujemny, zwykle od 0 do 0,4 mikroampera.

Przejdź do Plik, Nowy, a następnie zapisz nagranie w oprogramowaniu, aby utworzyć nowy plik i zapisać nagranie. Naciśnij przycisk Nagraj, a następnie przycisk Nagraj na płytę, aby rozpocząć nagrywanie. Dodaj odpowiednie informacje do pliku za pomocą okna dialogowego Zaznacz wykres.

Zastosuj agonistów do stymulacji chemicznej, otwierając zawory i wprowadzając je do komory rejestracyjnej przez 15 sekund. Po zakończeniu nagrywania przekręć voltage clamp do pozycji wyłączonej i wyłącz zawór Ringer's Solution. Usuń oocyt i odrzuć zgodnie z polityką instytucjonalną dotyczącą próbek ludzkiego mózgu, a następnie zatrzymaj nagrywanie i zapisz plik.

Zapisz kopię nagrań na dysku USB. Stamtąd otwórz żądany plik do analizy. Aby zmierzyć maksymalną odpowiedź AMPA i szczytową odpowiedź GABA A, najpierw ustal poziom 0 lub linię bazową, znajdując czerwoną linię, a następnie przeciągnij ją do prądu generowanego przez aplikację Ringer lub linię bazową.

Po ustaleniu poziomu 0 określ pomiary odpowiedzi, przeciągając zielony pionowy kursor odczytu do żądanej części znacznika wykresu. Rejestrowano prądy jonowe z oocytów wstrzykiwanych wraz z błonami z ludzkich receptorów synaptycznych. Receptory AMPA były aktywowane za pomocą 100 mikromolowych kainianów, a receptory GABA A za pomocą jednego milimolowego GABA.

Jednoczesna iniekcja przefiltrowanych błon z narządu elektrycznego torpedy, bogatego w receptory acetylocholiny, oraz kodowanie cDNA dla receptora GABA rzędu pierwszego do bieguna zwierzęcego wytworzyły głównie dwie grupy oocytów, w oparciu o ich odpowiedzi. Jedna grupa oocytów miała dużą odpowiedź na acetylocholinę, ale nie miała odpowiedzi na jeden mikromolowy GABA. Oocyty w innej grupie miały zerową lub niską odpowiedź na acetylocholinę, ale dużą odpowiedź na GABA.

Obraz graficzny przedstawia średni plus minus błąd standardowy średniej prądu szczytowego w grupie pierwszej i grupie drugiej. Jeden oocyt w grupie drugiej miał duże odpowiedzi GABA i acetylocholiny, co sugeruje pęknięcie jądra. W związku z tym rozkład odpowiedzi był zniekształcony do niskich wartości, na co zwraca uwagę różnica między średnią a medianą rozkładu prądu membranowego.

Jedną z przyczyn niskiej odpowiedzi oocytów jest to, że błony są wstrzykiwane i uwięzione w jądrze oocytu. Przedstawiono tutaj odpowiedzi GABA i kainianów oocytów wstrzykniętych do biegunów zwierzęcych lub roślinnych z niefiltrowanymi błonami uzyskanymi z mózgu innego niż AD oraz mózgu z AD. Oocyty wstrzyknięte w pobliżu bieguna zwierzęcego bez celowania w jądro dawały większe odpowiedzi niż oocyty wstrzyknięte do bieguna roślinnego, co umożliwiło badanie próbek tkanek o bardzo małej liczbie receptorów.

Próbując wykonać tę procedurę, zawsze monitoruj poziom dzwonka. Zawsze podczas ważnych nagrań zabraknie Ci danych, a potem wykorzysta Twój wynik, śmierć oocytu i utratę bardzo cennych danych. Po tej procedurze możemy wykonać obciążenia zachodnie, aby potwierdzić obecność receptorów synaptycznych lub białek będących przedmiotem zainteresowania.

Pozwala na pomiar globalnych proporcji synaptycznych pobudzenia do inhibicji w różnych obszarach mózgu i różnych zaburzeniach mózgu, co pozwala na bezpośrednie przetestowanie teoretycznych przewidywań dotyczących przyczyn choroby.