Name: Test CAM-Delam w celu oceny właściwości przerzutowych poprzez ilościowe określenie zdolności delaminacji i inwazji komórek nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T14:40:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: Poznaj metodę CAM-Delam do oceny zdolności przerzutowych komórek nowotworowych poprzez ilościowe określenie ich zdolności do delaminacji i inwazji. Technika ta umożliwia szybkie i ekonomiczne badanie mechanizmów metastazy oraz testowanie leków przeciwnowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy następującym badaczom z Uniwersytetu w Umeå za pomoc w opracowaniu odpowiednich linii komórek nowotworowych i przeciwciał: L. Carlsson (przeciwciało czynnika von Willebranda), J. Gilthorpe (U251) i M. Landström (PC-3U). Dziękujemy również firmie Hauke Holthusen z laboratorium Gilthorpe za stworzenie stabilnej linii komórkowej HEK293-TLR-AAVS1. Prace w laboratorium Gunhaga były wspierane przez Szwedzką Fundację Walki z Rakiem (18 0463), Inkubator Biotechnologiczny w Umeå, Norrlands Cancerforskningsfond, Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych (2017-01430) oraz Wydział Medyczny Uniwersytetu w Umeå.

W skrócie, Rysunek 1 podsumowuje ogólne etapy testu CAM-Delam. Poniższy protokół opiera się na 30 hodowanych zapłodnionych jajach kurzych i wykorzystaniu dwóch różnych linii komórek rakowych wysianych oddzielnie w trzech pierścieniach / jajo i analizowanych w czterech punktach czasowych.
1. Inkubacja jaj
<ol>
	<li>Używaj zapłodnionych jaj piskląt z lokalnej wylęgarni, które gwarantują ponad 90% zapłodnienia 
	UWAGA: Jaja nie powinny być przechowywane dłużej niż 4 dni w temperaturze pokojowej (RT). W Szwecji etyczna zgoda na eksperymentalne wykorzystanie zarodków kurcząt jest wymagana dopiero od 14 dnia embrionalnego (E) i później.</li>
	<li>W razie potrzeby ostrożnie zetrzyj mechanicznie wszelkie zabrudzenia lub pióra z jaj za pomocą suchego ręcznika papierowego lub zwilżonego w wodzie.</li>
	<li>Przed użyciem wyczyść i wysterylizuj inkubator jaj 70% etanolem (za każdym razem).</li>
	<li>Umieść żądaną liczbę jaj w tackach na jajka i wysiaduj jaja piskląt poziomo w inkubatorze do jaj w temperaturze 37,5-38 °C przy wilgotności 70%. Potraktuj to jako dzień inkubacji 0 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
</ol>
2. Przygotowanie łodzi do ważenia, plastikowych pudełek i narzędzi do preparacji
<ol>
	<li>Użyj 70% etanolu do sterylizacji 30 łódek wagowych i 30 małych plastikowych pudełek (~0,4 l) z przezroczystymi nakrętkami.</li>
	<li>Wysuszyć łódki wagowe i pudełka w okapie laminarnym przez noc (ON) i przechowywać w zamkniętym plastikowym pudełku do czasu dalszego użycia w 3. dniu inkubacji.</li>
	<li>Wysterylizuj 2 l destylowanego lub dejonizowanegoH2Ona 30 inkubowanych jaj.</li>
	<li>Wysterylizuj dwie pary nożyczek i trzy pary kleszczy, rozpylając 70% etanolu. Wysuszyć narzędzia na powietrzu, a następnie przechowywać je w wysterylizowanym pudełku do dnia inkubacji 3, 
	UWAGA: Te czynności (kroki 2.1-2.4) można wykonać dowolny dzień przed 3. dniem inkubacji. Używaj rękawiczek, aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
</ol>
3. Otwieranie jaj i przenoszenie do wewnętrznej komory nawilżania
UWAGA: Używaj rękawiczek i maski na twarz, aby uniknąć zakażenia.
<ol>
	<li>Dodaj około 50 ml wysterylizowanegoH2Odo wysterylizowanych plastikowych pudełek. Pudełka wypełnione wodą należy przechowywać z zamkniętymi pokrywkami, aby uniknąć zanieczyszczenia, w temperaturze pokojowej do czasu użycia.</li>
	<li>W 3 dniu inkubacji rozbij skorupkę jajka za pomocą ostrej części nożyczek i wytnij prosty otwór w skorupce.</li>
	<li>Ręcznie rozbij skorupkę jajka nad łodzią do ważenia i zbierz białko jaja, żółtko i dołączony do niego zdrowy zarodek w łodzi do ważenia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Poszukaj nienaruszonego zarodka z bijącym sercem, nienaruszonym żółtkiem i rozwiniętymi naczyniami krwionośnymi do eksperymentu (>95% inkubowanych jaj). Wyrzuć jaja ze zniekształconym zarodkiem, zarodkiem bez bijącego serca, pękniętym żółtkiem jaja lub uszkodzonymi naczyniami krwionośnymi żółtka.</li>
	<li>Delikatnie przenieść łódkę ważącą do wewnętrznej komory nawilżanej. 
	UWAGA: W przypadku kroków 3.2.-3.4. pracuj tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć zanieczyszczenia, a jeśli to możliwe, użyj okapu laminarnego.</li>
	<li>Inkubuj wewnętrzną wilgotną komorę w inkubatorze do jaj (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Jaja bez skorupek należy hodować od 3 do 10 dnia w inkubatorze przed użyciem (patrz krok 3.6), a w razie potrzeby dodać wodę do inkubatora, aby utrzymać wilgotność 70%.</li>
	<li>Codziennie sprawdzaj wewnętrzne wilgotne komory przez przezroczystą plastikową pokrywę pod kątem martwych zarodków lub zanieczyszczonych jaj bez skorupek i wyjmij je z inkubatora.</li>
</ol>
4. Przygotowanie pierścieni silikonowych
<ol>
	<li>Aby przygotować silikonowe pierścienie, należy wyciąć silikonową rurkę o średnicy wewnętrznej i zewnętrznej odpowiednio 4 mm i 5 mm o grubości ~1 mm, najlepiej za pomocą gilotyny do papieru (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Przenieś silikonowe pierścienie do małych szklanych butelek (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1D), przykryj folią metalową i wysterylizuj je za pomocą autoklawu lub podobnego. 
	UWAGA: Unikaj wielokrotnego autoklawowania nieużywanych pierścieni silikonowych, które mogą być zanieczyszczone, ponieważ takie traktowanie zmniejsza zdolność silikonowych pierścieni do przyczepiania się do membrany, a następnie wycieku roztworu komórki rakowej/kolagenu/RPMI na zewnątrz pierścieni.</li>
	<li>Przechowuj sterylne silikonowe pierścienie w RT. 
	UWAGA: Ten krok można wykonać dowolny dzień przed 10 dniem inkubacji.</li>
</ol>
5. Przygotowanie komórek rakowych
UWAGA: Roztwory takie jak pożywka do hodowli komórkowych, trypsyna i 1x PBS są przechowywane w temperaturze 4 °C i powinny być podgrzane do 37 °C w łaźni wodnej przed dodaniem do komórek. Po podgrzaniu wypłucz butelki w 70% etanolu i wysusz przed użyciem.
<ol>
	<li>Hodowlę interesujących linii komórek nowotworowych w odpowiedniej pożywce hodowlanej w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C w obecności 5% (v/v) CO2, 
	UWAGA: W tym przypadku glejaka U251-GFP i komórki raka prostaty PC-3U-GFP hodowano w kompletnym pożywce RPMI z dodatkiem 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% (v/v) penicyliny-streptomycyny (PS).</li>
	<li>Zaplanuj hodowlę komórek nowotworowych tak, aby około 50 × 106 komórek rakowych było gotowych do pobrania w 10. dniu inkubacji testu CAM-Delam.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę do hodowli komórkowych co 2-3 dni lub gdy kolor podłoża zmieni się z różowego na pomarańczowy/żółty.</li>
	<li>Opcjonalnie: Wywołaj niedotlenienie, traktując komórki rakowe CoCl2 w celu zbadania mechanistycznego wpływu molekularnego na delaminację 1 dzień przed pobraniem komórek. 
	UWAGA: CoCl2 ma umiarkowaną toksyczność. Z wyciągiem należy obchodzić się ostrożnie i postępować zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Przygotować świeży roztwór podstawowy 20 mM CoCl2, rozpuszczając 0,0258 g w 10 ml sterylizowanego destylowanego H20 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml owiniętej folią aluminiową w celu ochrony przed światłem.</li>
		<li>W stożkowej probówce o pojemności 50 ml wymieszaj 250 μl roztworu podstawowego 20 mM CoCl2 w 25 ml pożywki RPMI uzupełnionej 1% (v/v) PS (ale bez FBS) na naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 15 cm. Wiruj delikatnie.</li>
		<li>Usuń całą pożywkę RPMI z naczyń do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Umyj komórki wysterylizowanym 1x PBS 2x.</li>
		<li>Dodać 25 ml pożywki RPMI z 200 μM trypsynizacjąkomórek CoCl 2 (patrz krok 5.6).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W 10 dniu inkubacji jaj przygotuj 1 ml mieszanki kolagen/RPMI (stosunek 1:3), zawierającej 250 μl kolagenu typu I (5 mg/ml) i 750 μl pożywki RPMI do hodowli komórkowych uzupełnionej 10% FBS i 1% (v/v) PS. Trzymaj mieszankę kolagenu/RPMI na lodzie.</li>
	<li>Trypsynizuj komórki rakowe, aby wyizolować komórki, najpierw usuwając pożywkę do hodowli komórkowych i przemyj 2x 1x PBS.</li>
	<li>Dodać 3 ml roztworu trypsyny (0,05%) na naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 15 cm i inkubować przez 2-3 minuty w inkubatorze do hodowli komórkowych, aż komórki się odłączą. Użyj stołowego, odwróconego mikroskopu, aby zobaczyć oderwane komórki. W razie potrzeby delikatnie postukać w bok kolby, aby usunąć pozostałe skupione lub przyczepione komórki.</li>
	<li>Dezaktywuj trypsynę, dodając 5 ml kompletnej pożywki RPMI do każdej szalki do hodowli komórkowej i zbierz zawiesinę komórkową ze wszystkich szalek do hodowli komórkowych do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Policz komórki rakowe metodą wykluczenia błękitu trypanowego, aby odróżnić żywe komórki od martwych za pomocą licznika komórek. Dodać 10 μl zawiesiny komórkowej do 10 μl 0,4% barwienia błękitem trypanowym. Wymieszać próbkę, pipetując kilka razy w górę i w dół, a następnie załadować 10 μl mieszaniny komórek na komorę do szkiełka próbki w liczniku celi. Powtórz liczenie komórek 3 razy, aby zweryfikować numer komórki/ml.</li>
	<li>Obliczyć i odwirować zawiesinę do hodowli komórek o odpowiedniej objętości zawierającą 50 x10 6 żywych komórek rakowych w probówce o pojemności 50 ml przy 500 × g przez 5 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i wymieszać osad komórkowy z 1 ml mieszanki kolagen/RPMI. Ponieważ kolagen jest materiałem galaretowate, należy bardzo powoli i ostrożnie mieszać komórki za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aby uniknąć utraty komórek w tworzeniu pęcherzyków.</li>
	<li>Przygotowaną zawiesinę komórkową należy przechowywać na lodzie i przenieść do miejsca pracy z jajami. 
	UWAGA: Unikaj zbyt długiego trzymania przygotowanych komórek rakowych na lodzie. Przygotowane komórki nowotworowe należy umieścić na CAM w ciągu 15-25 minut.</li>
</ol>
6. Wysiewanie komórek rakowych na CAM
UWAGA: Używaj rękawiczek i maski na twarz, aby uniknąć zakażenia.
<ol>
	<li>W 10 dniu inkubacji wyjmij z inkubatora wewnętrzne wilgotne komory z inkubowanymi jajami bez skorupek. 
	UWAGA: Można wykorzystać około 90% początkowej liczby jaj z inkubacji; zobacz Rysunek 2.</li>
	<li>Otwórz wewnętrzną komorę nawilżania i umieść do sześciu silikonowych pierścieni na CAM za pomocą wysterylizowanych kleszczy. 
	UWAGA: Unikaj umieszczania silikonowych pierścieni blisko siebie lub w pobliżu większych naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Wymieszaj zawiesinę komórek rakowych przez pipetowanie, aby uzyskać równomierny rozkład komórek rakowych, i dodaj 20 μl (1 × 106 komórek) przygotowanej zawiesiny komórek rakowych do silikonowego pierścienia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1E). Podczas dodawania komórek trzymaj końcówkę pipety nad CAM, aby upewnić się, że membrana nie została uszkodzona. 
	UWAGA: Zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami7, różne komórki rakowe mogą być rozsiewane w oddzielnych pierścieniach na tym samym CAM.</li>
	<li>Zamknij wewnętrzną wilgotną komorę i umieść ją w inkubatorze do jaj.</li>
</ol>
7. Izolacja CAM wraz z powiązanymi komórkami nowotworowymi
<ol>
	<li>Po 14 godzinach, 1,5 dnia, 2,5 dnia i 3,5 dniu inkubacji wyjmij około siedmiu wewnętrznych nawilżonych komór i otwieraj pokrywy pojedynczo.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek wypreparuj wyhodowane komórki rakowe przyczepione do CAM (tzw. próbki CAM-Delam), wycinając na zewnątrz silikonowy pierścień (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1F).</li>
	<li>Natychmiast przenieść wyizolowaną próbkę CAM-Delam za pomocą kleszczy do 4% paraformaldehydu (PFA) w 0,1 M buforze fosforanowym (PB) na szalce Petriego w celu utrwalenia tkanki. Przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C przez 1 h. 
	UWAGA: Przechowywać 4% roztwór PFA w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 5 dni. UWAGA: PFA jest toksyczny. Podczas obchodzenia się z proszkiem PFA i roztworami PFA należy używać dygestorium oraz nosić maskę na twarz i rękawiczki. Unikaj wdychania oparów proszku lub roztworu. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Odetnij głowę zarodkom kurczaka i wyrzuć je jako odpady biologiczne do specjalnych pojemników.</li>
	<li>Usunąć 4% roztwór PFA i dodać 30% sacharozy w 0,1 M PB do próbek CAM-Delam i równoważyć w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie zdejmij silikonowy pierścień za pomocą kleszczy. Za pomocą nożyczek wytnij próbkę CAM-Delam w kształcie prostokąta z komórkami rakowymi pośrodku (<silna klasa="xfig">Ryc. 1G).</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przenieść próbki CAM-Delam na zamrożoną pożywkę sekcyjną na szalce Petriego w celu usunięcia nadmiaru sacharozy, a następnie do zatopienia form w zamrożonym podłożu sekcyjnym.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym umieść próbkę CAM-Delam w kształcie litery U w kierunku pionowym w formach do osadzania za pomocą dowolnego instrumentu przypominającego igłę (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1G).</li>
	<li>Próbki CAM-Delam należy zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
8. Cięcie próbek CAM-Delam
<ol>
	<li>Zamrożone próbki CAM-Delam należy podzielić na 10 μm na 5-6 kolejnych szkiełkach za pomocą kriosekcji.</li>
	<li>Szkiełka z sekcjami należy przechowywać w temperaturze -80 °C lub stosować bezpośrednio do barwienia immunohistochemicznego.</li>
</ol>
9. Barwienie immunohistochemiczne
<ol>
	<li>Doprowadzić szkiełka z temperatury −80 °C do RT przez 5 minut przed rozpoczęciem immunoprotokołu.</li>
	<li>Wykonaj linię markerem hydrofobowym na slajdach w miejscu, w którym kończą się sekcje. Pozostaw je do wyschnięcia na kilka minut.</li>
	<li>Umieścić szkiełka w nawilżonej (H2O) komorze i przykryć skrawki ~200-500 μL roztworu blokującego (10% płodowej surowicy cielęcej i 0,1% azydku sodu w soli fizjologicznej buforowanej Tris z 0,1% Triton X-100 [TBST]) i inkubować przez 15-30 min. 
	UWAGA: Począwszy od tego kroku, nigdy nie pozwól, aby szkiełka wyschły.</li>
	<li>Odlać roztwór blokujący i zastąpić go 100-150 μl pierwszorzędowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania, rozcieńczonego w roztworze blokującym i inkubować ON w temperaturze 4 °C. Najlepiej użyć króliczego przeciwciała anty-lamininy-111 do zdefiniowania blaszki podstawowej wraz z markerem komórek rakowych, jeśli nie używa się GFP lub innych znakowanych fluorescencyjnie linii komórek rakowych. 
	UWAGA: W tym przypadku króliczy czynnik anty-von Willebranda został również użyty do wykrywania naczyń krwionośnych w CAM.</li>
	<li>Przygotuj trzy szklane kuwety wypełnione buforem TBST.</li>
	<li>Odlewać roztwór przeciwciała pierwotnego, przenosić szkiełka do szklanych kuwet i myć co najmniej 3 razy przez 5 minut każda w TBST.</li>
	<li>Usuń nadmiar TBST ze szkiełka i z obszaru bariery hydrofobowej za pomocą miękkiej chusteczki papierowej.</li>
	<li>Przykryć szkiełko 100-150 μl odpowiedniego drugorzędowego przeciwciała fluorescencyjnego rozcieńczonego w roztworze blokującym w połączeniu z dichlorowodorkiem 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Odlewać roztwór przeciwciał wtórnych, przenosić szkiełka do szklanych kuwet i myć co najmniej 3x przez 5 minut każda w TBST.</li>
	<li>Usuń nadmiar TBST ze szkiełka i z obszaru bariery hydrofobowej za pomocą miękkiej chusteczki papierowej.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka, umieszczając na szkiełku 1-2 krople fluorescencyjnego medium montażowego i delikatnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe, unikając pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Pozostawić szkiełka do wyschnięcia przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 4 °C przed analizą i przechowywać je w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
10. Obrazowanie mikroskopowe i ocena delaminacji
<ol>
	<li>Sfotografuj przekroje za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w aparat cyfrowy, najlepiej w 10-krotnym powiększeniu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1H).</li>
	<li>Przeanalizuj sekcje przy użyciu następujących kategorii punktacji CAM-Delam (<silna klasa="xfig">Rysunek 3):
	<ol>
		<li>Poszukaj nienaruszonej blaszki podstawy bez widocznych zmian.</li>
		<li>Poszukaj zmienionej, ale nieuszkodzonej blaszki podstawnej.</li>
		<li>Poszukaj uszkodzonej blaszki podstawnej bez inwazji komórek.</li>
		<li>Poszukaj uszkodzonej blaszki podstawnej z inwazją komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Vasantharajan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epigenetic+landscape+of+circulating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">The epigenetic landscape of circulating tumour cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1875 (2), 188514(2021).</li>
<li>Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transitions%3A+the+importance+of+changing+cell+state+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 119 (6), 1438-1449 (2009).</li>
<li>Itoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-type+matrix+metalloproteinases%3A+their+functions+and+regulations%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane-type matrix metalloproteinases: their functions and regulations.</a> Matrix Biology. 44-46, 207-223 (2015).</li>
<li>Przemyslaw, L., Boguslaw, H. A., Elzbieta, S., Malgorzata, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAM+and+ADAMTS+family+proteins+and+their+role+in+the+colorectal+cancer+etiopathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">ADAM and ADAMTS family proteins and their role in the colorectal cancer etiopathogenesis.</a> BMB Reports. 46 (3), 139-150 (2013).</li>
<li>Chu, P. Y., Koh, A. P., Antony, J., Huang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+the+chick+chorioallantoic+membrane+as+an+alternative+model+for+cancer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Applications of the chick chorioallantoic membrane as an alternative model for cancer studies.</a> Cells Tissues Organs. 211 (2), 222-237 (2021).</li>
<li>MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+spread+and+micrometastasis+development%3A+quantitative+approaches+for+in+vivo+models%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models.</a> Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).</li>
<li>Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Jonasson, A. K., Gilthorpe, J., Gunhaga, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAM-Delam%3A+an+in+vivo+approach+to+visualize+and+quantify+the+delamination+and+invasion+capacity+of+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CAM-Delam: an in vivo approach to visualize and quantify the delamination and invasion capacity of human cancer cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10472(2020).</li>
<li>Carrillo, M., Kim, S., Rajpurohit, S. K., Kulkarni, V., Jagadeeswaran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells%2C+Molecules+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zebrafish von Willebrand factor.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (4), 326-333 (2010).</li>
<li>Leupold, J. H., Patil, N., Allgayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+egg+chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+model+as+an+in+vivo+method+for+the+investigation+of+the+invasion+and+metastasis+cascade+of+malignant+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The chicken egg chorioallantoic membrane (CAM) model as an in vivo method for the investigation of the invasion and metastasis cascade of malignant tumor cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2294, 17-26 (2021).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+human+endostatin+endostar+inhibits+tumor+growth+and+metastasis+in+a+mouse+xenograft+model+of+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+and+Oncology+Research%22%5BJournal%5D)">Recombinant human endostatin endostar inhibits tumor growth and metastasis in a mouse xenograft model of colon cancer.</a> Pathology and Oncology Research. 18 (2), 315-323 (2012).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+inhibition+of+presenilin+2+inhibits+glioma+cell+growth+and+invasion+and+is+involved+in+the+regulation+of+Nrg1%2FErbB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated inhibition of presenilin 2 inhibits glioma cell growth and invasion and is involved in the regulation of Nrg1/ErbB signaling.</a> Neuro-Oncology. 14 (8), 994-1006 (2012).</li>
<li>Qin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+superfamily+15+promotes+lymphatic+metastasis+via+upregulation+of+vascular+endothelial+growth+factor-C+in+a+mouse+model+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor superfamily 15 promotes lymphatic metastasis via upregulation of vascular endothelial growth factor-C in a mouse model of lung cancer.</a> Cancer Science. 109 (8), 2469-2478 (2018).</li>
<li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+metastatic+phenotype+of+a+panel+of+established+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells.</a> Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).</li>
<li>Zang, G., Mu, Y., Gao, L., Bergh, A., Landstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKCzeta+facilitates+lymphatic+metastatic+spread+of+prostate+cancer+cells+in+a+mice+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">PKCzeta facilitates lymphatic metastatic spread of prostate cancer cells in a mice xenograft model.</a> Oncogene. 38 (22), 4215-4231 (2019).</li>
<li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).</li>
<li>Jung, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tumor+xenograft+models+for+preclinical+assessment+of+anticancer+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Research%22%5BJournal%5D)">Human tumor xenograft models for preclinical assessment of anticancer drug development.</a> Toxicology Research. 30 (1), 1-5 (2014).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferase+EZH2+mediates+tumor+progression+on+the+chick+chorioallantoic+membrane+assay%2C+a+novel+model+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferase EZH2 mediates tumor progression on the chick chorioallantoic membrane assay, a novel model of head and neck squamous cell carcinoma.</a> Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).</li>
<li>Steinmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAPK1+loss+triggers+tumor+invasion+in+colorectal+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">DAPK1 loss triggers tumor invasion in colorectal tumor cells.</a> Cell Death & Disease. 10 (12), 895(2019).</li>
<li>Andrieu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP14+is+required+for+delamination+of+chick+neural+crest+cells+independently+of+its+catalytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MMP14 is required for delamination of chick neural crest cells independently of its catalytic activity.</a> Development. 147 (7), (2020).</li>
<li>Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Gunhaga, L., Patthey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+apoptosis+during+the+formation+of+the+terminal+nerve+ganglion+by+olfactory+placode-derived+cells+with+distinct+molecular+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Extensive apoptosis during the formation of the terminal nerve ganglion by olfactory placode-derived cells with distinct molecular markers.</a> Differentiation. 110, 8-16 (2019).</li>
<li>Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transitions+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.</a> Cell. 139 (5), 871-890 (2009).</li>
<li>Pineros, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+TNM%3A+a+registry+tool+to+reduce+gaps+in+cancer+staging+information%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Essential TNM: a registry tool to reduce gaps in cancer staging information.</a> The Lancet Oncology. 20 (2), 103-111 (2019).</li>
<li>Walsh, A. J., Cook, R. S., Sanders, M. E., Arteaga, C. L., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+response+in+organoids+generated+from+frozen+primary+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues.</a> Scientific Reports. 6, 18889(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

W artykule opisano test CAM-Delam do oceny agresywności przerzutowej komórek nowotworowych, określonej przez ocenę modulacji blaszki podstawowej i potencjalnej inwazji komórek do mezenchymy w ciągu kilku godzin do kilku dni. Wcześniejszym problemem technicznym dla różnych testów CAM była niska przeżywalność zarodków piskląt. Problem ten został rozwiązany poprzez wprowadzenie stosowania wewnętrznej wilgotnościowej komory podczas inkubacji zarodków, co zwiększyło przeżywalność zarodków z 10%-50% do 80%-90%7. Zastosowanie wewnętrznej komory nawilżanej może być zatem cenne w testach CAM w ogóle, jak również w innych eksperymentach ex ovo na pisklętach.
Przedstawione punkty czasowe punktacji po 14 godzinach, 1,5 dnia, 2,5 dnia i 3,5 dnia po wysianiu 1 x 106 komórek nowotworowych na CAM opierają się na rygorystycznym opracowaniu metody z wykorzystaniem sześciu różnych linii komórek nowotworowych i są wystarczające do rozróżnienia zakresu od zdolności nierozwarstwiających się do rozwarstwiających z inwazją linii komórek rakowych. Sugeruje się użycie co najmniej czterech jaj z trzema pierścieniami w każdym punkcie czasowym i na linię komórkową, przy czym należy to powtórzyć co najmniej raz lub zgodnie z planami doświadczalnymi i wymogami statystycznymi. Jedną z zalet testu CAM-Delam jest uzyskanie w ciągu kilku dni pouczających wyników dotyczących zdolności komórek nowotworowych do delaminacji w celu oszacowania agresywności komórek nowotworowych i potencjalnego ryzyka powstania przerzutów. Szybkie dostarczanie wyników jest ułatwione dzięki monitorowaniu degradacji blaszki podstawnej spowodowanej inwazją komórek rakowych i późniejszymi mikroguzami/zawiązkami nowotworowymi i przerzutami do narządów. Tradycyjnie, modele CAM były wykorzystywane do analizy powstawania przerzutów do narządów, których określenie trwa około 2 tygodni9. Używając siedmiu różnych linii komórek rakowych, wcześniej zweryfikowaliśmy7, że ocena delaminacji jest związana ze zdolnością komórek rakowych do tworzenia przerzutów w modelach gryzoni 10,11,12,13,14, co potwierdza wartość predykcyjną testu CAM-Delam. Co więcej, modele mysie wymagają jeszcze dłuższego czasu, od kilku tygodni do miesięcy, zanim będzie można zbadać przerzuty15,16. Krótko mówiąc, ten opracowany test CAM-Delam, skoncentrowany na ocenie zdolności delaminacji, a nie na badaniu późniejszego powstawania guza w zarodku pisklęcia, jest zatem dobrym uzupełnieniem istniejących modeli inwazji CAM kurczaków i nowotworów myszy.
Ograniczeniem w teście CAM-Delam może być niejasna wizualizacja blaszki podstawnej, jeśli same komórki rakowe wyrażają lamininę. Jeśli tak,można użyć innych markerów wskazujących blaszkę podstawną, takich jak E-kadheryna7. Inne badania inwazji CAM wykorzystywały kolagen typu IV do wizualizacji CAM oraz pan-cytokeratyny i wimentyny w celu identyfikacji atakujących komórek rakowych i tworzenia mikroguzów / pąków nowotworowych17,18.
Delaminacja jest normalnym procesem komórkowym, zarówno podczas rozwoju, jak i w późniejszym życiu, który umożliwia komórkom opuszczenie nabłonka i migrację do innych tkanek. Przykładami rozwarstwiających się komórek podczas rozwoju są pionierskie neurony grzebienia nerwowego i węchu19,20; W późniejszym życiu gojenie się ran zależy od rozwarstwienia21. Podczas raka proces ten jest regulowany w górę w niewłaściwych komórkach i/lub w niewłaściwym czasie. W związku z tym metoda CAM-Delam może być przydatna do rozwikłania mechanizmów molekularnych regulujących delaminację, co miałoby znaczenie zarówno dla podstawowej wiedzy biologicznej, jak i chorobowej. Takie badania delaminacji obejmowałyby dodawanie interesujących czynników do komórek rakowych wysiewanych na CAM lub badanie genetycznie zmodyfikowanych komórek rakowych. Jednym z przedstawionych tutaj przykładów jest wstępne traktowanie CoCl2 nieprzerzutowej linii komórkowej U251 w celu wywołania niedotlenienia, co prowadzi do indukcji agresywnej zdolności przerzutowej, która może zostać stłumiona przez inhibitor MMP o szerokim spektrum działania. Tak więc znalezienie kluczowych cząsteczek kontrolujących delaminację zwiększa możliwość zaprojektowania inhibitorów hamujących ten proces. W związku z tym, innym potencjalnym zastosowaniem protokołu CAM-Delam jest badanie przesiewowe leków w celu zahamowania delaminacji i inwazji komórek. Ponadto w klinice ocena ciężkości raka jest kluczowym elementem diagnozy, planowania leczenia i opieki. Obecnie system oceny stopnia zaawansowania TNM (T, wielkość guza; N, węzeł - czy rak rozprzestrzenił się na węzły chłonne; M, przerzuty odległe) służy do oceny ciężkości nowotworu22. Test CAM-Delam definiuje innowacyjne podejście do oceny agresywności komórek nowotworowych i potencjalnego ryzyka powstawania przerzutów i może być użytecznym uzupełnieniem systemu oceny stopnia zaawansowania TNM. Warto zauważyć, że ocena stopnia zaawansowania TNM opiera się na analizach utrwalonych próbek tkanek, podczas gdy potencjalne kliniczne podejście CAM-Delam badałoby świeże lub świeżo zamrożone tkanki w połączeniu z technikami ożywiania zamrożonych komórek23.

Około 90% śmiertelności u pacjentów z rakiem jest spowodowane konsekwencjami przerzutów nowotworowych, które są powstawaniem wtórnych guzów w innych częściach ciała, z których rak pierwotnie pochodził1. Dlatego tak ważne jest zidentyfikowanie mechanizmów związanych z przerzutami, aby znaleźć potencjalne cele hamujące powstawanie przerzutów nowotworowych. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na systemy modelowe, w których można ocenić proces przerzutowy. 
Podczas przerzutów, komórki rakowe przechodzą przejście z nabłonka do mezenchymalnego (EMT), normalny proces komórkowy, w którym komórki nabłonkowe tracą swoje właściwości przylegania i polaryzacji, a zamiast tego nabierają inwazyjnego charakteru mezenchymalnego2. Delaminacja jest częścią procesu EMT i polega na degradacji lamininy w błonie podstawnej, co jest warunkiem wstępnym, aby komórki rakowe opuściły guz pierwotny i zaatakowały inne tkanki. Główne czynniki, które są regulowane w górę podczas tworzenia przerzutów, obejmują metaloproteinazy macierzy (MMP), ADAM (disinterginę i metaloproteinazę), ADAMTS (ADAM z motywami trombospondyny) i MMP typu błonowego (MT-MMPs) 3,4. Czynniki te degradują cząsteczki, takie jak laminina, która ulega ekspresji we wszystkich błonach podstawnych, aby ułatwić migrację i inwazję komórek.
Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) zapłodnionego jaja pisklęcia jest rodzajem błony podstawnej. Zapłodnione jaja piskląt zostały wykorzystane jako modele przerzutowe, w których komórki rakowe zostały wysiane na pozaembrionalnym CAM, a następnie zaobserwowano przerzuty w zarodkach piskląt5. Ponadto często stosuje się mysie modele przerzutowe in vivo, w których komórki rakowe są wszczepiane myszom i analizowane są przerzuty w różnych narządach6. Takie podejście jest czasochłonne, kosztowne i może powodować dyskomfort u zwierząt. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy test CAM-Delam, szybszy i tańszy model do oceny agresywności przerzutowej komórek nowotworowych. W tym modelu zdolność komórek rakowych do degradacji CAM pisklęcia (np. zdolność delaminacji) jest łączona z potencjalną inwazją komórek rakowych do mezenchymy i wykorzystywana jako miara agresywności przerzutów. 
Obecny artykuł, oparty na poprzedniej publikacji7, szczegółowo opisuje test CAM-Delam, od obchodzenia się z zapłodnionymi jajami piskląt, hodowli i wysiewu komórek rakowych, sekcji i analiz próbek CAM, aż po ocenę zdolności delaminacji komórek rakowych do czterech kategorii: nienaruszone, zmienione, uszkodzone i inwazjowane. Podajemy również przykłady, w jaki sposób można wykorzystać ten test do określenia mechanizmów molekularnych regulujących proces delaminacji.

<table><tbody><tr><td><mocny>SPRZĘT</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Rotanta 480 R, Hettich zentrifugen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Automatyczny licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>HM 505 E, Microm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>Nikon DS-Ri1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica M10</td><td></td><td>Do rozwarstwiania próbek CAM i umieszczania ich w formach</td></tr><tr><td>Inkubator do jaj</td><td>Fiem</td><td></td><td>Dostępnych jest wiele innych źródeł. Przed każdym użyciem należy go oczyścić i wysterylizować 70% etanolem</td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Nikon Eclipse, E800</td><td></td><td>Wyposażony w aparat cyfrowy, do oceny rozwarstwienia i inwazji komórek.</td></tr><tr><td>Drobne kleszcze</td> Dostępnych <td></td><td>jest wiele źródeł</td><td>Należy wysterylizować przed użyciem</td></tr><tr><td>Zamrażarka -80 & deg; C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8600 Series</td><td>Model 817CV</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon Eclipse TS100</td><td></td><td>Do prac z hodowlą komórkową</td></tr><tr><td>Nożyczki (małe)</td><td>Dostępnych</td><td></td> jest wiele źródeł <td>Przed użyciem należy wysterylizować</td></tr> <tr><td>MATERIAŁY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-Laminin-111</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td>Primary przeciwciało anty-królicze (1:400)</td></tr><tr><td>anty-królik Cy3</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>111-165-003</td><td>Przeciwciało drugorzędowe (1:400)</td></tr><tr><td>czynnik anty-von Willebranda</td><td>DAKO</td><td>P0226</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe (1:100)</td></tr><tr><td> Chlorek kobaltu(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>232696-5G</td><td>UWAGA: substancja chemiczna o umiarkowanej toksyczności. Z urządzeniem należy obchodzić się ostrożnie tylko w dygestorium. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td>4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek (1:400)</td></tr><tr><td>Zapłodnione jaja kurze</td><td>Str&ouml; mb&auml; cks & Auml; gg, V&auml; nn&auml; s, Szwecja</td><td></td><td>Każdy lokalny dostawca jaj</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> płodu <td>Life Technologies</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjne medium montażowe</td><td>Allent Technologie</td><td>S302380-2</td><td>Unikaj tworzenia się pęcherzyków podczas montażu. Pozostawić do wyschnięcia w temperaturze +4 stopni; C</td></tr><tr><td>Szklane komory na pierścienie silikonowe</td> Dostępnych <td></td><td>jest wiele źródeł</td><td>Użyliśmy szklanych komór o pojemności 15 ml. W jednej komorze mieści się około 20 silikonowych pierścieni. Unikaj stłoczenia, ponieważ pierścienie mogą się sklejać i utrudniać pracę.</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane</td><td>VWR International</td><td>631-0165</td><td></td></tr><tr><td>GM6001 Inhibitor MMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CC1010</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe do immunohistochemii</td><td>Fisher Scientific</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>NEG-50 podłoże mrożone</td><td>Cellab</td><td>6506</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>UWAGA: silnie toksyczny. Z wyciągiem należy obchodzić się ostrożnie, postępować zgodnie z instrukcjami producenta. Używaj całej odzieży ochronnej.</td></tr><tr><td> Formy do osadzania Peel-A-Way</td><td>Polysciences</td><td>18985</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina&ndash; streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>Sarstedt</td><td>83.3903</td><td>Średnica 15 cm do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Plastikowe pudełko</td><td>Esclain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PureCol EZ Gel</td><td>Collagen Cellsystems</td><td>5074-35ML</td><td>5 mg / mL. Galaretowaty materiał. Pipetować bardzo powoli i ostrożnie, aby uniknąć utraty komórek w formacjach pęcherzykowych.</td></tr><tr><td>RPMI medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>Pierścienie silikonowe</td><td>VWR International</td><td>228-1580</td><td>Średnica wewnętrzna/zewnętrzna: 4/5 mm. Przed użyciem należy je wysterylizować. Unikaj wielokrotnego autoklawowania nieużywanych pierścieni.</td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologi</td><td></td><td>15400054 0,50%</td></tr><tr><td>Łodzie wagowe</td><td>VWR International</td><td>611-0094</td><td></td></tr><tr><td>SOLUTIONS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagen-RPMI mieszanina pożywek (1 ml)</td><td></td><td></td><td>Compelete RPMI Media 750 &micro; L</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>PureCol EZ Żel Kolagen 250 &mikro; L</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Wymieszaj i natychmiast użyj</td></tr><tr><td>Kompletne nośniki RPMI (500 ml)</td><td></td><td></td><td>Nośniki RPMI 445 ml</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>FBS 50 ml</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Penicylina&ndash; streptomycyna 5mL</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C</td></tr><tr><td>PB (0,2 M; 1 000 mL)</td><td></td><td></td><td>Na2HPO4 (MW 141,76) 21,9 g</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>NaH2PO4 (MW 137,99) 6,4 g</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Dodaj wodę dejonizowaną do końcowej objętości 1000 ml</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Przechowuj w RT</td></tr><tr><td>PFA (4 %) w 0,1 M PB (100 ml)</td><td></td><td></td><td>Woda dejonizowana 50 ml</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0,2 mln PB 50 ml</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Paraformaldehyd (PFA) 4g</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>podgrzać do 60 stopni Celsjusza; C w kąpieli wodnej</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>dodać 5 M NaOH 25 &mikro; L</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Wymieszaj, aby rozpuścić proszek PFA</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C</td></tr><tr><td>TBST (1 000 mL)</td><td></td><td></td><td>50mM Tris pH 7,4 50 mL</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>150 mM NaCI 30 ml</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0,1% Triton X-100 10 ml</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>H2O (MQ) 900 ml</td></tr><tr><td>Trypsyna (0,05 %; 10 ml)</td><td></td><td></td><td>1x PBS 9 mL</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>10x Trypsyna (0,5 %) 1 ml</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Łącznie 10 ml, przechowywać w temperaturze 4 stopni; Z</td></tr></tbody></table>

test cam-delam w celu oceny właściwości przerzutowych poprzez ilościowe określenie zdolności delaminacji i inwazji komórek nowotworowych

CAM-Delam Assay to Score Metastatic Properties by Quantifying Delamination and Invasion Capacity of Cancer Cells

Główną przyczyną zgonów związanych z rakiem jest tworzenie przerzutów (tj. gdy komórki rakowe rozprzestrzeniają się z guza pierwotnego do odległych organów i tworzą guzy wtórne). Delaminacja, zdefiniowana jako degradacja blaszki podstawnej i błony podstawnej, jest początkowym procesem, który ułatwia transmigrację i rozprzestrzenianie się komórek rakowych do innych tkanek i narządów. Ocena zdolności delaminacyjnej komórek nowotworowych wskazywałaby na potencjał przerzutowy tych komórek.
Opracowaliśmy ustandaryzowaną metodę, test ex ovo CAM-Delam, do wizualizacji i ilościowego określenia zdolności komórek rakowych do rozwarstwiania i inwazji, dzięki czemu jesteśmy w stanie ocenić agresywność przerzutów. Krótko mówiąc, metoda CAM-Delam obejmuje wysiewanie komórek rakowych w silikonowych pierścieniach na błonie kosmówkowo-omoczniowej (CAM) piskląt w 10. dniu embrionalnym, a następnie inkubację trwającą od kilku godzin do kilku dni. Test CAM-Delam obejmuje użycie wewnętrznej wilgotnej komory podczas inkubacji zarodków piskląt. To nowatorskie podejście zwiększyło przeżywalność zarodków z 10%-50% do 80%-90%, co rozwiązało wcześniejsze problemy techniczne związane z niskimi wskaźnikami przeżywalności zarodków w różnych testach CAM.
Następnie, próbki CAM z powiązanymi klastrami komórek rakowych zostały odizolowane, naprawione i zamrożone. Na koniec próbki wycięte kriostatem zwizualizowano i przeanalizowano pod kątem uszkodzenia błony podstawnej i inwazji komórek rakowych przy użyciu immunohistochemii. Oceniając różne znane linie komórek nowotworowych z przerzutami i bez przerzutów, zaprojektowane do ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP), wyniki ilościowe CAM-Delam wykazały, że wzorce zdolności delaminacji odzwierciedlają agresywność przerzutów i można je podzielić na cztery kategorie. Przyszłe zastosowanie tego testu, oprócz ilościowego określenia zdolności delaminacji jako wskaźnika agresywności przerzutowej, ma na celu rozwikłanie mechanizmów molekularnych kontrolujących delaminację, inwazję, tworzenie mikroprzerzutów i zmiany w mikrośrodowisku guza.

Rycina 1 przedstawia kluczowe etapy testu CAM-Delam7. Zastosowanie wewnętrznych komór nawilżających (Rycina 1C) znacząco poprawiło przeżywalność zarodków kurzych z poziomu &lt;50% do 90% w 10. dniu inkubacji oraz z ~15% do 80% w 13. dniu inkubacji (Rycina 2).
<img alt="Inkubacja hodowli zarodków, sekcja i analiza tkankowa z wykorzystaniem mikroskopii i obrazowania fluorescencyjnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Kluczowe etapy testu CAM-Delam. (A) Inkubuj zapłodnione jaja kurze w pozycji poziomej bez obracania. (B,C) W 3. dniu inkubacji rozbij jaja i umieść je w sterylnych łódkach wagowych (B), a następnie ustaw łódki w wewnętrznej komorze nawilżonej do dalszej inkubacji (C). (D) Przygotuj pierścienie silikonowe. (E) W 10. dniu inkubacji umieść pierścienie silikonowe na błonie CAM i za pomocą pipety nanieś 1 x 106 komórek nowotworowych do wnętrza pierścieni. (F,G) W różnych punktach czasowych (od godzin do dni) wykonaj sekcję CAM z przytwierdzonymi komórkami nowotworowymi, (F) utrwal w PFA, poddaj działaniu sacharozy, umieść w medium do mrożenia sekcji, (G) i zamroź w −80 °C. (H) Przykład przekroju CAM z powiązanymi komórkami nowotworowymi GFP+ (kolor zielony) i barwieniem immunohistochemicznym lamininy (kolor czerwony). Paski skali = 2 mm (E,F), 1 mm (G) i 100 µm (H). Rysunek pochodzi z pracy Palaniappan et al.7. Skróty: CAM = błona chorioallantoiczna; PFA = paraformaldehyd; GFP = zielone fluorescencyjne białko. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie przeżywalności zarodków na wykresach słupkowych; analiza statystyczna z poziomami istotności, E10-E13." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przeżywalność zarodków kurzych w zależności od metody inkubacji. (A,B) W 10. dniu inkubacji przeżywalność zarodków kurzych w wewnętrznych HC była dwukrotnie wyższa (wartość średnia 89,33; N = 105) w porównaniu z inkubacją w szalkach Petriego (A; wartość średnia 40; N = 64) i w komorach niewilgotnionych (B; wartość średnia 48,67; N = 46). (C,D) W 13. dniu inkubacji nadal obserwowano wysoką przeżywalność przy użyciu HC (wartość średnia 81,67; N = 105), podczas gdy znaczny spadek przeżywalności zarodków odnotowano przy użyciu PD (C; wartość średnia 11,33; N = 64) oraz N-HC (D; wartość średnia 18,33; N = 46). Istotność statystyczną badano za pomocą nieparzystego dwustronnego testu t. Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001. Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Palaniappan i wsp.7. Skróty: HC = komora wilgotniona; PD = szalki Petriego; N-HC = komora niewilgotniona; E X = dzień inkubacji X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Analizy różnych linii komórek nowotworowych wykazujących ekspresję GFP (glioblastoma U251, prostaty PC-3U, jelita grubego SW620 i płuc A549) z wykorzystaniem tego protokołu zostały opisane wcześniej przez Palaniappana i wsp.7. Wyniki testu CAM-Delam obejmują różnice w morfologii błony podstawnej, wykryte za pomocą lamininy, oraz inwazję komórek nowotworowych, definiowaną jako komórki, które przeniknęły przez warstwę błony podstawnej kurczaka do warstwy mezo-dermalnej kurczaka (Rycina 3). Wyniki te pokazują, że zdolność komórek nowotworowych do degradacji błony podstawnej i inwazji w tkankę mezenchymalną można zakwalifikować do jednej z czterech kategorii: 1) nienaruszona błona podstawna bez widocznych zmian (Rycina 3B), 2) zmieniona, ale nieuszkodzona błona podstawna (Rycina 3C), 3) uszkodzona błona podstawna bez inwazji komórkowej (Rycina 3D) oraz 4) uszkodzona błona podstawna z inwazją komórkową (Rycina 3E). Inną obserwacją było to, że w przypadku, gdy komórki nowotworowe powodowały zmianę lub uszkodzenie błony podstawnej, błona CAM ulegała również pogrubieniu wraz ze zwiększeniem formowania naczyń krwionośnych, co określono za pomocą barwienia przeciwciałami przeciwko czynnikowi von Willebranda, który jest syntetyzowany w naczyniach krwionośnych8 (Rycina 4C-H). Te dwa fenotypy, pogrubiona błona CAM i zwiększone formowanie naczyń krwionośnych, nie były obserwowane, gdy błona CAM była nienaruszona (Rycina 4A,B).
<img alt="Seria obrazów z mikroskopii konfokalnej lamininy/GFP pokazująca stadia tkanki: kontrolna, nienaruszona, zmieniona, uszkodzona, inwazja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Punktacja CAM-Delam. (A-E) Przykład punktacji CAM-Delam w oparciu o integralność błony podstawnej błony chorioallantoicznej (CAM), wizualizowaną za pomocą przeciwciał anty-laminina (czerwony), oraz potencjalną inwazję komórek nowotworowych wykazujących ekspresję GFP (zielony). (A) Kontrolna błona CAM bez komórek nowotworowych. (B-E) W odpowiedziach na komórki nowotworowe można ocenić cztery kategorie opisujące morfologię błony podstawnej: (B) nienaruszona laminina, (C) zmieniona, ale nieuszkodzona laminina (oznaczona gwiazdką), (D) uszkodzona laminina, ale bez inwazji komórek nowotworowych (strzałki), uszkodzona laminina z inwazją komórkową (groty strzałek). Pasek skali = 100 µm (A-E). Rysunek pochodzi z pracy Palaniappan et al.7. Skróty: CAM = błona chorioallantoiczna; GFP = zielone białko fluorescencyjne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza histologiczna, Laminina/DAPI i vWF, stany tkanek, obrazy mikroskopii fluorescencyjnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Ocena pogrubienia błony CAM i formowania naczyń krwionośnych. (A-H) Przykład wizualizacji pogrubienia CAM i formowania naczyń krwionośnych, wykrytego za pomocą przeciwciał przeciwko czynnikowi Von Willebranda (kolor czerwony), w odpowiedzi na blaszkę z różnymi typami komórek nowotworowych. (A,B) Kontrolna błona CAM bez komórek nowotworowych. (C,D) W odpowiedzi na linię komórek nowotworowych niemetastatycznych (sklasyfikowaną jako Intact) nie stwierdzono wyraźnego pogrubienia mezenchymy ani zwiększonego formowania naczyń krwionośnych. (E-H) W odpowiedzi na metastatyczne komórki nowotworowe, prowadzące do zmienionej lub uszkodzonej lamininy, zaobserwowano pogrubienie mezenchymy (oznaczone podwójnymi grotami strzałek) oraz zwiększone formowanie naczyń krwionośnych (oznaczone strzałkami). Pasek skali = 100 µm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Palaniappan i wsp.7. Skróty: CAM = błona chorioallantoiczna; GFP = zielone białko fluorescencyjne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Komórki glejaka U251 i komórki raka prostaty PC-3U są dwoma przykładami linii komórkowych raka o całkowicie różnych zdolnościach do delaminacji (Rysunek 5). Komórki PC-3U wywołały uszkodzenie lamininy po 1,5 dniach, a wyraźna inwazja wystąpiła po 2,5 dniach (Rysunek 5A). W przeciwieństwie do nich, komórki U251 wywołały jedynie niewielkie zmiany lamininy po 1,5–3,5 dniach, lecz nigdy nie spowodowały żadnych widocznych uszkodzeń lamininy (Rysunek 5B).
<img alt="Mikroskopia inwazji lamininy/GFP pokazująca wzrost komórek PC-3U/U251 w czasie wraz z analizą wykresu danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Wizualizacja zdolności do delaminacji komórek raka prostaty (PC-3U) i glejaka (U251). (A) Komórki PC-3U wywołały niewielkie zmiany lamininy po 14 h, uszkodzenie lamininy po 1,5 dnia (strzałka) oraz początek inwazji po 2,5 dnia, która nasiliła się po 3,5 dniach (groty strzałek). (B) Komórki U251 spowodowały niewielkie zmiany lamininy po 1,5-3,5 dniach. Prawe panele przedstawiają wykresy obrazujące ocenę CAM-Delam. Oś y wskazuje liczbę próbek, a oś x wskazuje punkty czasowe hodowli. Pasek skali = 100 µm (A,B). Ta rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Palaniappan i wsp.7. Skróty: CAM = błona chorioallantoiczna; GFP = zielone białko fluorescencyjne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Test CAM-Delam może być wykorzystany do określenia mechanizmów molekularnych regulujących proces delaminacji. Przykładem jest zastosowanie CoCl2 w celu indukcji hipoksji, z jednoczesnym lub bez inhibitowania metaloproteinaz macierzy (MMP) przy użyciu nieswoistego inhibitora MMP GM6001 (Rysunek 6). Po traktowaniu CoCl2 niemetastatyczne komórki nowotworowe U251 nabyły zdolności do indukowania delaminacji i tworzenia komórek inwazyjnych, co zostało zahamowane, gdy traktowanie CoCl2 połączono z inhibitorem MMP GM6001 (Rysunek 6). Zatem test CAM-Delam może być przydatny przy określaniu cząsteczek i szlaków molekularnych wpływających na proces delaminacji.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna lamininy/GFP komórek U251 po traktowaniu CoCl2, 3,5 dnia, analiza komórkowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Wzorce delaminacji w odpowiedzi na ekspozycję komórek U251 na sam CoCl2 lub w połączeniu z inhibitorem MMP. (A-C) Komórki U251 hodowane przez 3,5 dnia na CAM w różnych warunkach. (A) Hodowane osobno komórki U251 nie wywołały żadnych uszkodzeń lamininy. (B) Hodowane komórki U251 poddane uprzedniej ekspozycji na CoCl2 (24 h) przed przemyciem i wysianiem komórek na CAM wywołały uszkodzenie lamininy i inwazję komórek. (C) Wstępne traktowanie inhibitorem MMP o szerokim spektrum GM6001 (przez 1 h), a następnie ekspozycja na CoCl2 (24 h) przed przemyciem i wysianiem komórek U251 na CAM, zahamowało efekt traktowania CoCl2; nie stwierdzono wyraźnych uszkodzeń lamininy ani inwazji komórek nowotworowych. Pasek skali = 100 µm (A-C). Panele (B) i (C) pochodzą z pracy Palaniappan et al.7. Skróty: CAM = błona chorioallantoiczna; GFP = zielone białko fluorescencyjne; CoCl2 = chlorek kobaltu; MMP = metaloproteinaza macierzy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Test CAM-Delam do oceny zdolności przerzutowej komórek nowotworowych jest stosunkowo szybki, łatwy i tani. Metoda ta może być stosowana do odkrywania mechanizmów molekularnych regulujących powstawanie przerzutów oraz do badań przesiewowych leków. Zoptymalizowany test do analizy próbek ludzkich nowotworów może być metodą kliniczną spersonalizowanego leczenia raka.

Test CAM-Delam w celu oceny właściwości przerzutowych poprzez ilościowe określenie zdolności delaminacji i inwazji komórek nowotworowych

The major cause of cancer-related deaths is metastasis formation (i.e., when cancer cells spread from the primary tumor to distant organs and form ...

Metoda wizualizuje i określa ilościowo zdolność komórek nowotworowych do rozwarstwiania się i inwazji, dzięki czemu jest w stanie ocenić ich agresywność przerzutową przed powstaniem działania lub przerzutami. Punktacja opiera się na procesie delaminacji jako warunku wstępnym tworzenia przerzutów, uzyskując w ten sposób informacje dotyczące agresywności przerzutów w stosunkowo szybki, łatwy i tani sposób. Przećwicz najpierw poszczególne kroki przed rozpoczęciem właściwego eksperymentu.Test CAM-Delam obejmuje kilka etapów technicznych, które są trudne do wyjaśnienia na piśmie i znacznie łatwiejsze do zrozumienia i nauczenia się poprzez demonstrację wizualną. Na początek umieść żądaną liczbę jaj w tackach na jajka i wysiaduj jaja piskląt poziomo w inkubatorze do jaj. Następnie wysterylizuj 30 łódek wagowych i 30 małych plastikowych pudełek z przezroczystymi nakrętkami, rozpylając 70% etanolu.Następnie wysusz łodzie i pudełka wagowe w okapie laminarnym przez noc i przechowuj w zamkniętym plastikowym pudełku do dalszego użycia w trzecim dniu inkubacji. Wysterylizuj dwa litry wody destylowanej lub dejonizowanej na 30 inkubowanych jaj, dwie pary nożyczek i trzy pary kleszczy. Najpierw dodaj około 50 mililitrów wysterylizowanej wody do wysterylizowanych plastikowych pudełek i zamknij pokrywki.W trzecim dniu inkubacji rozbij skorupkę jajka za pomocą ostrej części nożyczek i wytnij prosty otwór w skorupce. Po ręcznym otwarciu skorupki jajka nad łodzią wagową, zbierz białko jaja, żółtko i zdrowy zarodek dołączony do łodzi wagowej. Następnie poszukaj nienaruszonego zarodka z bijącym sercem, nienaruszonym żółtkiem i rozwiniętymi naczyniami krwionośnymi do eksperymentu.Następnie delikatnie przenieś łódź wagową do wewnętrznej wilgotnej komory i inkubuj wewnętrzną wilgotną komorę w inkubatorze jaj. Aby przygotować silikonowe pierścienie, wytnij silikonową rurkę o średnicy wewnętrznej i zewnętrznej odpowiednio czterech milimetrów i pięciu milimetrów o grubości około jednego milimetra, najlepiej za pomocą noża do papieru. Następnie przenieś silikonowe pierścienie do małych szklanych butelek.Przykryj je folią metalową i sterylizuj za pomocą autoklawu lub podobnego urządzenia. Przechowuj sterylne silikonowe pierścienie w temperaturze pokojowej. Hodowla interesujących linii komórek nowotworowych w odpowiedniej pożywce w hodowli komórkowej.Następnie przygotuj jeden mililitr mieszanki kolagenowej RPMI i trzymaj ją na lodzie. Następnie trypsynizuj komórki rakowe, aby wyizolować komórki, najpierw usuwając pożywkę do hodowli komórkowej i przemywając. Następnie dodaj trzy mililitry roztworu trypsyny na naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 15 centymetrów i inkubuj przez dwie do trzech minut w inkubatorze do hodowli komórkowych, aż komórki się odłączą.Używając odwróconego mikroskopu stołowego, zobacz odłączone komórki. Następnie dezaktywuj trypsynę, dodając pięć mililitrów kompletnej pożywki RPMI do każdej płytki do hodowli komórkowej i zbierz zawiesinę komórek ze wszystkich szalek do hodowli komórkowych do 50-mililitrowej probówki. Aby policzyć komórki rakowe, dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do 10 mikrolitrów 0,4% niebieskiego barwnika trypanowego.Po wymieszaniu próbki przez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół, załadować 10 mikrolitrów mieszaniny komórek na komorę do szkiełka próbki w liczniku celi. Następnie odwiruj zawiesinę do hodowli komórkowych o odpowiedniej objętości w probówce o pojemności 50 mililitrów przy 500 razy G przez pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu wymieszaj osad komórkowy z jednym mililitrem mieszanki kolagenu RPMI.Po wymieszaniu komórek za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra, przygotowaną zawiesinę komórek należy przechowywać na lodzie. W 10 dniu inkubacji wyjmij z inkubatora wewnętrzne wilgotne komory z inkubowanymi jajami bez skorupek. Po otwarciu wewnętrznej komory nawilżanej umieść do sześciu silikonowych pierścieni na CAM za pomocą wysterylizowanych kleszczyków.Po wymieszaniu zawiesiny komórek rakowych przez pipetowanie w celu uzyskania równomiernego rozmieszczenia komórek rakowych, dodaj 20 mikrolitrów przygotowanej zawiesiny komórek rakowych do silikonowego pierścienia. Po zamknięciu wewnętrznej wilgotnej komory umieść ją w inkubatorze do jaj. Po 14 godzinach, 1,5 dnia, 2,5 dnia i 3,5 dniu inkubacji wyjmij około siedmiu wewnętrznych nawilżonych komór, otwierając ich pokrywy pojedynczo.Za pomocą nożyczek wypreparuj hodowane komórki rakowe przyczepione do CAM, wycinając na zewnątrz silikonowy pierścień. Następnie natychmiast przenieść wyizolowaną próbkę CAM-Delam za pomocą kleszczy do 4% paraformaldehydu w 0,1-molowym buforze fosforanowym na szalce Petriego w celu utrwalenia tkanki i przechowywać na lodzie lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie usuń 4% roztwór paraformaldehydu i dodaj 30% sacharozy w 0,1-molowym buforze fosforanowym do próbek CAM-Delam i zrównoważ w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę.Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie zdejmij silikonowy pierścień za pomocą kleszczy. Następnie wytnij próbkę CAM-Delam w kształcie prostokąta z komórkami rakowymi pośrodku za pomocą nożyczek. Następnie przenieść próbki CAM-Delam do zamrożonego podłoża sekcyjnego na szalce Petriego w celu usunięcia nadmiaru sacharozy, a następnie do zatapiania form w zamrożonym podłożu sekcyjnym za pomocą kleszczy.Pod mikroskopem preparacyjnym umieść próbkę CAM-Delam w kształcie litery U w reakcji pionowej w formach do zatapiania za pomocą dowolnego przyrządu przypominającego igłę i przechowuj próbki CAM-Delam w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Następnie przekrój zamrożonych próbek CAM-Delam na 10 mikrometrów na pięć do sześciu kolejnych szkiełek za pomocą kriosekcji. Najpierw wykonaj linię za pomocą markera hydrofobowego na szkiełkach, gdzie kończą się sekcje i pozostaw je do wyschnięcia na kilka minut.Następnie umieść szkiełka w wilgotnej komorze i przykryj skrawki około 200 do 500 mikrolitrami roztworu blokującego i inkubuj przez 15 do 30 minut. Po wylaniu roztworu blokującego zastąp go 100 do 150 mikrolitrami podstawowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania, rozcieńczonego w roztworze blokującym i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Podobnie, po wylaniu roztworu przeciwciała pierwotnego, przenieść szkiełka do szklanych kuwet i przemyć co najmniej trzy razy przez pięć minut każda w TBST.Następnie usunąć nadmiar TBST ze szkiełka i z obszaru bariery hydrofobowej miękką chusteczką papierową i przykryć szkiełko 100 do 150 mikrolitrami odpowiedniego wtórnego przeciwciała fluorescencyjnego rozcieńczonego w roztworze blokującym połączonym z DAPI. Inkubować szkiełko w ciemności w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po wylaniu roztworu przeciwciał wtórnych przenieść szkiełka do szklanych kuwet i przemyć co najmniej trzy razy przez pięć minut każda w TBST.Następnie usuń nadmiar TBST ze szkiełka i z obszaru bariery hydrofobowej za pomocą miękkiej chusteczki papierowej. Następnie zamontuj szkiełka, umieszczając na szkiełku jedną lub dwie krople fluorescencyjnego medium montażowego i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe, unikając pęcherzyków powietrza. Sfotografować skrawki za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w aparat cyfrowy, najlepiej w powiększeniu 10 x i przeanalizować skrawki przy użyciu następujących kategorii punktacji CAM-Delam, jak opisano w manuskrypcie.Zastosowanie wewnętrznych komór nawilżanych znacznie poprawiło przeżywalność zarodków piskląt z mniej niż 50% do 90% w 10. dniu inkubacji i z około 15% do 80% w 13. dniu inkubacji. Wyniki pokazują, że zdolność komórek rakowych do degradacji blaszki podstawnej i inwazji mezenchymy można podzielić na cztery kategorie, w tym nienaruszoną blaszkę podstawną bez widocznych zmian, zmienioną, ale nieuszkodzoną blaszkę podstawną, uszkodzoną blaszkę podstawną bez inwazji komórek i uszkodzoną blaszkę podstawy z inwazją komórek. Barwienie przeciwciałami przeciwko czynnikowi von Willebranda pokazuje, że CAM był również pogrubiony wraz ze wzrostem tworzenia naczyń krwionośnych, gdy komórki rakowe powodowały zmienioną lub uszkodzoną blaszkę podstawną.Jednak żadnego z tych dwóch fenotypów nie zaobserwowano, gdy CAM był nienaruszony. Komórki PC-3U indukowały uszkodzoną lamininę po 1,5 dnia z wyraźną inwazją po 2,5 dnia. W przeciwieństwie do tego, komórki U251 indukowały tylko niewielkie zmiany lamininy po 1,5 do 3,5 dnia, ale nigdy nie spowodowały żadnych widocznych uszkodzeń lamininy.Po leczeniu chlorkiem kobaltu nieprzerzutowe komórki rakowe U251 uzyskały zdolność do indukowania delaminacji i komórek inwazyjnych, które zostały stłumione w połączeniu z inhibitorem MMP, GM6001. Nie należy uszkadzać CAM końcówką pipety podczas wysiewu komórek rakowych, ponieważ takie uszkodzenie błony zniszczy odczyty testu. Przyszłościową możliwością jest optymalizacja metody CAM-Delam w celu określenia właściwości przerzutowych w klinicznych próbkach guza, co może w przyszłości uzupełnić obecnie stosowane metody oceny stopnia zaawansowania przerzutów do węzłów nowotworowych.

cam-delam-assay-to-score-metastatic-properties-quantifying

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy artykuł opisuje procedury eksperymentalnego testu przerzutowania, który jest wykorzystywany do określania potencjału metastatycznego ludzkich linii komórkowych raka.

Test eksperymentalny przerzutowania

Wykorzystując ilościową PCR, demonstrujemy, w jaki sposób uznany model CAM kurczaka może być użyty do ilościowej analizy przerzutowania ludzkich komórek nowotworowych do odległych narządów.

Ilościowa analiza przerzutów nowotworowych z wykorzystaniem modelu zarodka ptaka

W tym filmie opisujemy izolację przerzutowych kolonii komórek rakowych z błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) kurczaka przy użyciu hodowli jaj bez skorupy. Ta metoda pomaga w badaniach przesiewowych pod kątem czynników, które mogą być odpowiedzialne za przerzuty raka.

Izolacja kolonii komórek rakowych z kurczaka CAM: procedura izolowania komórek rakowych z kultur jaj bez skorupek

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) in ovo jest przeszczepiona świeżymi tkankami nowotworowymi pochodzącymi z mięsaka, ich pojedynczymi zawieszeniami komórkowymi oraz stałymi i przejściowymi fluorescencyjnie znakowanymi liniami komórkowymi mięsaka. Model służy do badania zachowań przeszczepu (żywotność, wskaźnik proliferacji Ki67, martwica, infiltracja) i gospodarza (naciekanie fibroblastów, wrastanie naczyń).

Test CAM in ovo jako model ksenoprzeszczepu mięsaka

Ten manuskrypt opisuje metodę ilościowego określania akumulacji komórek nowotworowych w płucach w zwierzęcym modelu przerzutów nowotworowych.

Test rekrutacji komórek nowotworowych płuc

Komórki rakowe są umieszczane w żelu kolagenowym, a następnie umieszczane w bezkomórkowym żelu fibrynowym w celu wygenerowania systemu hodowli 3D, w którym można monitorować inwazyjność i powstawanie nowotworów satelitarnych.

Trójwymiarowy test hodowli w celu zbadania inwazyjności komórek rakowych i tworzenia guzów satelitarnych

To badanie przedstawia dwie różne metody analizy inwazji i migracji komórek: test komory Boydena i test gojenia ran oparty na mikroskopie in vitro. Opisano protokoły tych dwóch eksperymentów oraz porównano ich zalety i wady.

Ocena procesu inwazji i migracji komórek: porównanie testu ran drapanych opartego na mikroskopie wideo i testu z komorą Boydena

Opisujemy dwie metody oceny przejściowej przepuszczalności naczyń krwionośnych związanych z funkcją wejścia do mikrośrodowiska guza (TMEM) i wewnątrznaczynieniem komórek rakowych za pomocą dożylnego wstrzyknięcia dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej (155 kDa) u myszy. Metody te obejmują obrazowanie przyżyciowe u żywych zwierząt oraz analizę tkanek utrwalonych za pomocą immunofluorescencji.

Ocena mikrośrodowiska guza przepuszczalności naczyniowej za pośrednictwem drzwi z przerzutami związanych z rozsiewaniem komórek rakowych za pomocą obrazowania przyżyciowego i analizy tkanek stałych

Test inwazji komórkowej in vitro służy do pomiaru potencjału przerzutów raka poprzez ilościowe określenie potencjału komórkowego do inwazji i migracji za pomocą wkładek do hodowli komórkowych zawierających matrycę białkową. Komórki są zmuszane do migracji przez matrycę białkową i porowatą błonę w kierunku chemoatraktantu, a następnie określane ilościowo za pomocą mikroskopii świetlnej.

Zastosowanie mysich komórek nowotworowych sutka w teście inwazji in vitro jako miary zachowania komórek onkogennych

Opisane podejście łączy eksperymentalne testy przerzutów do żył ogonowych z obrazowaniem żywych zwierząt in vivo, aby umożliwić monitorowanie w czasie rzeczywistym powstawania i wzrostu przerzutów raka piersi, a także ilościowe określenie liczby i wielkości przerzutów w płucach.

Łączne wykorzystanie testów przerzutów do żył ogonowych i obrazowania in vivo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia kolonizacji przerzutowej raka piersi i obciążenia płuc

To jest skuteczna metoda do wykrywania supresorów lub czynników powodujących przerzuty raka. Komórki, transdukowane biblioteką ekspresji, są wstrzykiwane do układu naczyniowego błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w celu utworzenia kolonii przerzutowych. Kolonie o zmniejszonej lub zwiększonej inwazyjności są wycinane, namnażane, ponownie wstrzykiwane w celu potwierdzenia ich fenotypu, a na koniec analizowane przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.

Odkrycie regulatorów przerzutów przy użyciu szybkiego i ilościowego modelu błony nazębiowej przyżyciowej kurcząt

Poznaj metodę CAM-Delam do oceny zdolności przerzutowych komórek nowotworowych poprzez ilościowe określenie ich zdolności do delaminacji i inwazji. Technika ta umożliwia szybkie i ekonomiczne badanie mechanizmów metastazy oraz testowanie leków przeciwnowotworowych.

Test CAM-Delam w celu oceny właściwości przerzutowych poprzez ilościowe określenie zdolności delaminacji i inwazji komórek nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal

Test CAM-Delam w celu oceny właściwości przerzutowych poprzez ilościowe określenie zdolności delaminacji i inwazji komórek nowotworowych

Przeglądaj więcej filmów