Test CAM-Delam w celu oceny właściwości przerzutowych poprzez ilościowe określenie zdolności delaminacji i inwazji komórek nowotworowych

Metoda wizualizuje i określa ilościowo zdolność komórek nowotworowych do rozwarstwiania się i inwazji, dzięki czemu jest w stanie ocenić ich agresywność przerzutową przed powstaniem działania lub przerzutami. Punktacja opiera się na procesie delaminacji jako warunku wstępnym tworzenia przerzutów, uzyskując w ten sposób informacje dotyczące agresywności przerzutów w stosunkowo szybki, łatwy i tani sposób. Przećwicz najpierw poszczególne kroki przed rozpoczęciem właściwego eksperymentu.

Test CAM-Delam obejmuje kilka etapów technicznych, które są trudne do wyjaśnienia na piśmie i znacznie łatwiejsze do zrozumienia i nauczenia się poprzez demonstrację wizualną. Na początek umieść żądaną liczbę jaj w tackach na jajka i wysiaduj jaja piskląt poziomo w inkubatorze do jaj. Następnie wysterylizuj 30 łódek wagowych i 30 małych plastikowych pudełek z przezroczystymi nakrętkami, rozpylając 70% etanolu.

Następnie wysusz łodzie i pudełka wagowe w okapie laminarnym przez noc i przechowuj w zamkniętym plastikowym pudełku do dalszego użycia w trzecim dniu inkubacji. Wysterylizuj dwa litry wody destylowanej lub dejonizowanej na 30 inkubowanych jaj, dwie pary nożyczek i trzy pary kleszczy. Najpierw dodaj około 50 mililitrów wysterylizowanej wody do wysterylizowanych plastikowych pudełek i zamknij pokrywki.

W trzecim dniu inkubacji rozbij skorupkę jajka za pomocą ostrej części nożyczek i wytnij prosty otwór w skorupce. Po ręcznym otwarciu skorupki jajka nad łodzią wagową, zbierz białko jaja, żółtko i zdrowy zarodek dołączony do łodzi wagowej. Następnie poszukaj nienaruszonego zarodka z bijącym sercem, nienaruszonym żółtkiem i rozwiniętymi naczyniami krwionośnymi do eksperymentu.

Następnie delikatnie przenieś łódź wagową do wewnętrznej wilgotnej komory i inkubuj wewnętrzną wilgotną komorę w inkubatorze jaj. Aby przygotować silikonowe pierścienie, wytnij silikonową rurkę o średnicy wewnętrznej i zewnętrznej odpowiednio czterech milimetrów i pięciu milimetrów o grubości około jednego milimetra, najlepiej za pomocą noża do papieru. Następnie przenieś silikonowe pierścienie do małych szklanych butelek.

Przykryj je folią metalową i sterylizuj za pomocą autoklawu lub podobnego urządzenia. Przechowuj sterylne silikonowe pierścienie w temperaturze pokojowej. Hodowla interesujących linii komórek nowotworowych w odpowiedniej pożywce w hodowli komórkowej.

Następnie przygotuj jeden mililitr mieszanki kolagenowej RPMI i trzymaj ją na lodzie. Następnie trypsynizuj komórki rakowe, aby wyizolować komórki, najpierw usuwając pożywkę do hodowli komórkowej i przemywając. Następnie dodaj trzy mililitry roztworu trypsyny na naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 15 centymetrów i inkubuj przez dwie do trzech minut w inkubatorze do hodowli komórkowych, aż komórki się odłączą.

Używając odwróconego mikroskopu stołowego, zobacz odłączone komórki. Następnie dezaktywuj trypsynę, dodając pięć mililitrów kompletnej pożywki RPMI do każdej płytki do hodowli komórkowej i zbierz zawiesinę komórek ze wszystkich szalek do hodowli komórkowych do 50-mililitrowej probówki. Aby policzyć komórki rakowe, dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do 10 mikrolitrów 0,4% niebieskiego barwnika trypanowego.

Po wymieszaniu próbki przez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół, załadować 10 mikrolitrów mieszaniny komórek na komorę do szkiełka próbki w liczniku celi. Następnie odwiruj zawiesinę do hodowli komórkowych o odpowiedniej objętości w probówce o pojemności 50 mililitrów przy 500 razy G przez pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu wymieszaj osad komórkowy z jednym mililitrem mieszanki kolagenu RPMI.

Po wymieszaniu komórek za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra, przygotowaną zawiesinę komórek należy przechowywać na lodzie. W 10 dniu inkubacji wyjmij z inkubatora wewnętrzne wilgotne komory z inkubowanymi jajami bez skorupek. Po otwarciu wewnętrznej komory nawilżanej umieść do sześciu silikonowych pierścieni na CAM za pomocą wysterylizowanych kleszczyków.

Po wymieszaniu zawiesiny komórek rakowych przez pipetowanie w celu uzyskania równomiernego rozmieszczenia komórek rakowych, dodaj 20 mikrolitrów przygotowanej zawiesiny komórek rakowych do silikonowego pierścienia. Po zamknięciu wewnętrznej wilgotnej komory umieść ją w inkubatorze do jaj. Po 14 godzinach, 1,5 dnia, 2,5 dnia i 3,5 dniu inkubacji wyjmij około siedmiu wewnętrznych nawilżonych komór, otwierając ich pokrywy pojedynczo.

Za pomocą nożyczek wypreparuj hodowane komórki rakowe przyczepione do CAM, wycinając na zewnątrz silikonowy pierścień. Następnie natychmiast przenieść wyizolowaną próbkę CAM-Delam za pomocą kleszczy do 4% paraformaldehydu w 0,1-molowym buforze fosforanowym na szalce Petriego w celu utrwalenia tkanki i przechowywać na lodzie lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie usuń 4% roztwór paraformaldehydu i dodaj 30% sacharozy w 0,1-molowym buforze fosforanowym do próbek CAM-Delam i zrównoważ w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę.

Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie zdejmij silikonowy pierścień za pomocą kleszczy. Następnie wytnij próbkę CAM-Delam w kształcie prostokąta z komórkami rakowymi pośrodku za pomocą nożyczek. Następnie przenieść próbki CAM-Delam do zamrożonego podłoża sekcyjnego na szalce Petriego w celu usunięcia nadmiaru sacharozy, a następnie do zatapiania form w zamrożonym podłożu sekcyjnym za pomocą kleszczy.

Pod mikroskopem preparacyjnym umieść próbkę CAM-Delam w kształcie litery U w reakcji pionowej w formach do zatapiania za pomocą dowolnego przyrządu przypominającego igłę i przechowuj próbki CAM-Delam w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Następnie przekrój zamrożonych próbek CAM-Delam na 10 mikrometrów na pięć do sześciu kolejnych szkiełek za pomocą kriosekcji. Najpierw wykonaj linię za pomocą markera hydrofobowego na szkiełkach, gdzie kończą się sekcje i pozostaw je do wyschnięcia na kilka minut.

Następnie umieść szkiełka w wilgotnej komorze i przykryj skrawki około 200 do 500 mikrolitrami roztworu blokującego i inkubuj przez 15 do 30 minut. Po wylaniu roztworu blokującego zastąp go 100 do 150 mikrolitrami podstawowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania, rozcieńczonego w roztworze blokującym i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Podobnie, po wylaniu roztworu przeciwciała pierwotnego, przenieść szkiełka do szklanych kuwet i przemyć co najmniej trzy razy przez pięć minut każda w TBST.

Następnie usunąć nadmiar TBST ze szkiełka i z obszaru bariery hydrofobowej miękką chusteczką papierową i przykryć szkiełko 100 do 150 mikrolitrami odpowiedniego wtórnego przeciwciała fluorescencyjnego rozcieńczonego w roztworze blokującym połączonym z DAPI. Inkubować szkiełko w ciemności w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po wylaniu roztworu przeciwciał wtórnych przenieść szkiełka do szklanych kuwet i przemyć co najmniej trzy razy przez pięć minut każda w TBST.

Następnie usuń nadmiar TBST ze szkiełka i z obszaru bariery hydrofobowej za pomocą miękkiej chusteczki papierowej. Następnie zamontuj szkiełka, umieszczając na szkiełku jedną lub dwie krople fluorescencyjnego medium montażowego i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe, unikając pęcherzyków powietrza. Sfotografować skrawki za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w aparat cyfrowy, najlepiej w powiększeniu 10 x i przeanalizować skrawki przy użyciu następujących kategorii punktacji CAM-Delam, jak opisano w manuskrypcie.

Zastosowanie wewnętrznych komór nawilżanych znacznie poprawiło przeżywalność zarodków piskląt z mniej niż 50% do 90% w 10. dniu inkubacji i z około 15% do 80% w 13. dniu inkubacji. Wyniki pokazują, że zdolność komórek rakowych do degradacji blaszki podstawnej i inwazji mezenchymy można podzielić na cztery kategorie, w tym nienaruszoną blaszkę podstawną bez widocznych zmian, zmienioną, ale nieuszkodzoną blaszkę podstawną, uszkodzoną blaszkę podstawną bez inwazji komórek i uszkodzoną blaszkę podstawy z inwazją komórek. Barwienie przeciwciałami przeciwko czynnikowi von Willebranda pokazuje, że CAM był również pogrubiony wraz ze wzrostem tworzenia naczyń krwionośnych, gdy komórki rakowe powodowały zmienioną lub uszkodzoną blaszkę podstawną.

Jednak żadnego z tych dwóch fenotypów nie zaobserwowano, gdy CAM był nienaruszony. Komórki PC-3U indukowały uszkodzoną lamininę po 1,5 dnia z wyraźną inwazją po 2,5 dnia. W przeciwieństwie do tego, komórki U251 indukowały tylko niewielkie zmiany lamininy po 1,5 do 3,5 dnia, ale nigdy nie spowodowały żadnych widocznych uszkodzeń lamininy.

Po leczeniu chlorkiem kobaltu nieprzerzutowe komórki rakowe U251 uzyskały zdolność do indukowania delaminacji i komórek inwazyjnych, które zostały stłumione w połączeniu z inhibitorem MMP, GM6001. Nie należy uszkadzać CAM końcówką pipety podczas wysiewu komórek rakowych, ponieważ takie uszkodzenie błony zniszczy odczyty testu. Przyszłościową możliwością jest optymalizacja metody CAM-Delam w celu określenia właściwości przerzutowych w klinicznych próbkach guza, co może w przyszłości uzupełnić obecnie stosowane metody oceny stopnia zaawansowania przerzutów do węzłów nowotworowych.