Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności w interakcjach Caenorhabditis elegans z bakteriami
July 22nd, 2022
Ten protokół opisuje 96-dołkowe zakłócenie pojedynczych bakteriologicznie skolonizowanych Caenorhabditis elegans po zimnym paraliżu i bieleniu powierzchni w celu usunięcia zewnętrznych bakterii. Otrzymaną zawiesinę umieszcza się na płytkach agarowych, aby umożliwić dokładne, średnioprzepustowe określenie ilościowe obciążenia bakteryjnego w dużej liczbie pojedynczych robaków.
Protokół ten demonstruje mechaniczne rozerwanie eleganów morskich. W formacie 96-dołkowym umożliwiającym ilościowe określenie obciążenia bakteryjnego poszczególnych robaków o średniej przepustowości. Technika ta zwiększa szybkość i jednorodność zakłóceń mechanicznych w porównaniu z metodami opartymi na Pasel, umożliwiając naukowcom łatwe tworzenie większych zestawów danych wysokiej jakości pomiarów pojedynczych robaków.
Ta technika obejmuje wiele ruchomych części i łatwo jest zgubić swoje miejsce. Przed rozpoczęciem upewnij się, że masz ustawione wszystkie materiały, oznaczone rury, zderzaki i płyty. Procedurę zademonstruje Megan Taylor, specjalistka ds. badań z mojego laboratorium.
Zacznij od ponownego zawieszenia próbki robaka w jednym mililitrze M nine TX zero one w mikroprobówce wirówkowej. Zebrać dorosłe robaki przez odwirowanie i wyrzucić supernatant. Przy użyciu tych samych parametrów wirowania.
Przepłucz robaki dwukrotnie jednym mililitrem M9TX01 i raz jednym mililitrem bufora robaków M9, aby zminimalizować bakterie zewnętrzne. Następnie ponownie zawiesić każdą próbkę w jednym mililitrze pożywki S plus dwa x zabite ciepło OP50 w probówce hodowlanej. Inkubuj probówki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut, aby usunąć z jelita bakterie, które nie przylegają do reklamy.
Po inkubacji oczyszczone robaki przepłukać dwukrotnie jednym mililitrem zimnego M9TX01 i wyrzucić super natant. Połóż rurki na lodzie na 10 minut, aby sparaliżować robaki. Następnie dodaj jeden mililitr lodowatego buforu robaków M nine z bezzapachowym wybielaczem do każdej tubki.
Inkubuj probówki na lodzie przez co najmniej 10 minut, aby zabić bakterie zewnętrzne. Wyrzuć bufor wybielacza i włóż probówki z powrotem do lodu, aby zapobiec pompowaniu robaków. Następnie dodaj jeden mililitr zimnego M9TX01 do każdej probówki i wiruj przez pięć sekund.
W mini wirówce. Umieścić probówki z powrotem w lodzie i usunąć supernatant. Powtórz ten krok raz.
Do chemicznej przepuszczalności naskórka robaka. Przenieść probówki zawierające robaki w 20 mikrolitrach buforu do stojaka na probówki o temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu SDS/DTT do każdej ciepłej próbki.
Inkubuj rurki przez maksymalnie osiem minut na ławce, aby częściowo rozbić naskórek dorosłych robaków. W tym momencie robaki umrą i osiądą na dnie rurki. Po inkubacji ostrożnie wyrzucić supernatant SDS/DTT.
Następnie dodaj jeden mililitr M9TX01 do każdej probówki i krótko odwiruj, aby otulić robaki. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś robaki w jednym mililitrowym buforze robaków M nine z 0,1% Triton x-100. Aby przygotować się do mechanicznego rozerwania robaków, zaopatrz się w sterylną płytkę z 96 dołkami o głębokości dwóch mililitrów i silikonową osłonę płytki.
Użyj sterylnej szpatułki, aby dodać niewielką ilość sterylnego węglika silikonu z siatką 36 do każdej studzienki, tak aby siatka ledwo zakrywała dno studzienki. Dodaj 180 mikrolitrów buforu robaków M nine do każdej studzienki. Oznacz kolumny i rzędy, a następnie luźno przykryj płytkę silikonową osłoną płyty.
Następnie przenieś przepuszczalne robaki na małą szalkę Petriego z M9TX01 wypełnioną na głębokość jednego centymetra. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego odpipetować pojedyncze robaki w objętości 20 mikrolitrów i przenieść je do indywidualnych dołków na płytce 96-dołkowej, aby wyrzucić wszelkie robaki przyklejone do pipety, odessać 20 mikrolitrów M9TX01 z czystego obszaru szalki Petriego i uwolnić go z powrotem do naczynia. Po przeniesieniu wszystkich robaków przykryj płytkę 96-dołkową arkuszem elastycznej folii sufitowej stroną z papierem skierowaną w dół na dołki na próbki.
Umieść silikonową matę sufitową delikatnie na elastycznej folii sufitowej, nie wciskając osłony w studzienki. Umieść talerz w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 30 do 60 minut, aby zapobiec przegrzaniu podczas zakłóceń. Po schłodzeniu płyty mocno dociśnij silikonową matę sufitową do dołków, aby je uszczelnić.
Następnie zabezpiecz płytki w urządzeniu zaburzającym tkankę. Potrząsaj talerzami przez minutę z częstotliwością 30 herców. Następnie obróć płytki o 180 stopni i powtarzaj potrząsanie przez minutę.
Postukaj mocno płytami o ławkę dwa lub trzy razy, aby usunąć piasek z elastycznej folii sufitowej. Odwirować zestaw płytek 2, 400 razy G przez dwie minuty, aby zebrać próbki na dnie studzienek. Następnie zdejmij silikonową pokrywę i zdejmij folię sufitową.
Aby przygotować dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenie trawień robaków, należy napełnić 180 mikrolitrów jednego X PBS w rzędach od B do D płytki 96-dołkowej. Używając pipetera wielodołkowego o pojemności 200 mikrolitrów, powoli wymieszaj trawienie ślimakowe przez pipetowanie. Przenieść maksymalną ilość płynu do rzędu A 96-dołkowej płytki zawierającej PBS.
Za pomocą pipety wielokanałowej usuń 20 mikrolitrów z górnego rzędu i dozuj do rzędu B. Następnie wymieszaj. Powtórz ten krok dla rzędów od B do C, a następnie od C do D, aby uzyskać 1000-krotne rozcieńczenie W celu określenia ilościowego bakterii monokolonizowanych robaków. Umieścić 10 do 20 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na stałych płytkach agarowych.
W przypadku kolonizacji wielogatunkowej umieść 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na 10-centymetrowych płytkach agarowych. Korzystając z tego protokołu, zaobserwowano skuteczną dezynfekcję zewnętrzną po wybieleniu powierzchni sparaliżowanych zimnem robaków, co widać po spadku liczby bakterii zewnętrznych w buforze. Bez wpływu na bakterie związane z jelitami.
Ręczne zakłócanie działania robaków skutkowało większą różnorodnością. Ziarno z węglika krzemu było idealne do rozbijania z Tri Andex lub bez niego. W metodzie 96 dołków duże szklane kulki nie były odpowiednie dla techniki 96 dołków.
Małe szklane kulki dawały spójne wyniki, ale zatkały rurę na końcu. Robaki skolonizowane w tej samej puli bakterii wykazywały dużą zmienność obciążenia jelit, gdy obserwowano je dla poszczególnych bakterii i wielogatunkowych społeczności bakteryjnych. Robaki skolonizowane bakteriami wykazującymi ekspresję GFP wykazywały niejednorodność w pomiarach poszczególnych robaków.
Dla tego GFP szczep bakteryjny eksprymujący porównujący kolonizację dzikiego typu Bristol Len dwóch robaków. Dla DAF dwa mutanty IGF wykazały, że mutant DAF 16 wspiera większe populacje bakterii, podczas gdy DAF dwa jest odporny na kolonizację. Ta niejednorodność była charakterystyczna i spójna w różnych seriach tego samego eksperymentu.
Stwierdzono, że ponowne próbkowanie danych w celu symulacji podsumowań partii zmieniło rozkład w porównaniu z danymi dotyczącymi poszczególnych robaków. Ekstrapolowana partia CFU na robaka była skoncentrowana wokół średniej arytmetycznej poszczególnych danych, co prowadziło do utraty zmienności biologicznej. Zamiast przystępować do trawienia żywej powierzchni, wybielacza i płukania, do dalszych eksperymentów można użyć robaków.
Ruch zostanie szybko wznowiony, gdy robaki zostaną usunięte z zimna.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę średniego przepływu do ilościowego określania ładunku bakterii u pojedynczych Caenorhabditis elegans. Po serii kroków przygotowawczych, w tym paraliżu na zimno i bieleniu powierzchni, technika ta stosuje rozdrobnienie mechaniczne w formacie 96-dołkowym, umożliwiając efektywne zbieranie danych z dużej liczby robaków.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Mikrobiologia
- Modele systemów bezkręgowców
- Analiza ilościowa
Tło
- Znaczenie badania kolonizacji mikrobiologiczne w C. elegans
- Wyzwania w tradycyjnych metodach rozdrobnienia
- Potrzeba technik wysoko-przepustowych w badaniach biologicznych
Zastosowane metody
- Rozdrabnianiem mechanicznym w płytce 96-dołkowej
- Caenorhabditis elegans jako model biologiczny
- Wykorzystanie węglika krzemu do efektywnego homogenizowania
Główne wyniki
- Skuteczna eliminacja zewnętrznych bakterii przy zachowaniu bakterii związanych z jelitami
- Demonstracja heterogeniczności ładunku bakterii wśród pojedynczych robaków
- Porównanie efektywności kolonizacji między różnymi wariantami genetycznymi robaków
Wnioski
- To badanie udowadnia niezawodną i efektywną metodę analizy kolonizacji bakterii w C. elegans.
- Wyniki podkreślają znaczenie wykorzystywania wysoko-przepustowych testów w badaniach mikrobiologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying inter-individual heterogeneity in Caenorhabditis elegans-bacterial interactions provides critical insight into host-microbe variability, informing early discovery and target validation in microbiome-related R&D. The single-worm, 96-well plate protocol enables medium-throughput, quantitative measurement of bacterial load, supporting robust hypothesis testing and reducing biological ambiguity. This approach enhances predictive confidence for translational research and portfolio triage in host-microbe therapeutic discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of host-microbe interaction hypotheses at single-organism resolution.
- Supports biological de-risking by revealing true inter-individual variability in colonization.
- Improves predictive confidence for target validation by quantifying heterogeneity lost in batch methods.
- Facilitates portfolio triage by distinguishing robust biological effects from stochastic variation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, quantitative single-worm assays for downstream screening workflows.
- Standardizes mechanical disruption and quantification, improving reproducibility across experiments.
- Enables scalable, medium-throughput data generation for reliable compound or strain evaluation.
- Supports assay readiness for both mono-colonized and multi-species bacterial communities.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by capturing individual host response variability.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation through quantitative, reproducible outputs.
- De-risks translational advancement by preserving biological variation critical for biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-content, quantitative analysis of host-microbe interactions at the single-organism level.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying individual-level colonization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay development and screening campaigns.
- Analytics: Provides colony-forming unit (CFU) measurements and distributional data for robust statistical comparison.
- Translational Research: Maintains biological heterogeneity essential for preclinical model alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable protocol adaptable to diverse host-microbe systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in host-microbe studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in quantifying bacterial load.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by preserving critical biological variation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of microbiome-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nematode handling and quantitative microbiology.
- Needs access to 96-well plate disruptors, centrifuges, and colony plating infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample preparation and data analysis.
- Adaptable to other small model organisms with protocol optimization.
- Throughput is limited by manual worm transfer and plating steps.
