Nieniszcząca ocena regionalnej gęstości komórek w agregatach nowotworowych po leczeniu farmakologicznym

Protokół ten dostarcza informacji na temat progresji modelu guza w sposób nieniszczący. Daje również wskazówki dotyczące odpowiedzi terapeutycznej poprzez całe schematy leczenia w pojedynczych agregatach, zamiast polegać na próbkach dopasowanych do wieku. Konwencjonalne metody uzyskiwania gęstości i żywotności komórek w agregatach wymagają utrwalania i dzielenia próbek, podczas gdy nasze dostarczają danych w sposób nieniszczący.

W związku z tym zmiany można śledzić w ramach jednego agregatu w czasie. Oczekuje się, że technika ta poprawi naszą wiedzę na temat reakcji leków w dyskretnych regionach modeli zagregowanych, co będzie miało wpływ na to, jak dobrze modele te odzwierciedlają reakcje in vivo i zastosowania badań przesiewowych leków. Na początek przygotuj od 70 do 90% konfluencyjnych kultur komórkowych pożądanych linii komórkowych w standardowych warunkach.

Oderwać monowarstwy komórek od kolb hodowlanych zgodnie ze standardową metodą trypsynizacji i dodać zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej. Dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do hemocytometru i policz pod mikroskopem, aby określić liczbę komórek w zawiesinie. Komórki peletowe poprzez odwirowanie i ponowne zawieszenie komórek w pożywce o pożądanym stężeniu 2,5 razy 10 do piątych komórek na mililitr.

W przypadku zawiesin przygotowanych z matrycą błony podstawnej, należy wyjąć fiolkę z matrycą z miejsca przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i umieścić w lodówce do rozmrożenia przez noc. Przygotuj pojemnik z podłożem wzrostowym i wstaw do lodówki na 10 minut, aby się schłodził. Za pomocą zamrożonej końcówki pipety dodać matrycę do schłodzonego roztworu tak, aby końcowe stężenie tego roztworu wynosiło 5%. Dodać 50 mikrolitrów tej pożywki do każdej studzienki okrągłego dna, nieprzylegającej 96-dołkowej płytki, tak aby końcowe stężenie matrycy w tych studzienkach wynosiło 2,5% po dodaniu zawiesiny komórek.

W przypadku zawiesin przygotowanych bez matrycy dodaj 50 mikrolitrów zwykłej pożywki wzrostowej do każdej studzienki. Dozować 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki. Odwirować płytki o stężeniu 123 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej natychmiast po wysianiu, aby zapewnić zebranie osadu komórkowego na dnie każdej studzienki.

Wykorzystaj system OCT do obrazowania strukturalnego. Ustaw szybkość skanowania A na 5,5 kiloherca, aby zbierać obrazy w wysokiej rozdzielczości. Ustaw współczynnik załamania światła na 1,33 dla próbek w ciekłym ośrodku.

W oknie parametrów obrazu po prawej stronie ekranu ustaw pole widzenia, wprowadzając wartości X, Y i Z tak, aby próbka obejmowała ten obszar zainteresowania. Kliknij Tryb akwizycji 3D, a następnie kliknij Nagraj, aby pobrać skan objętości 3D próbki. Aby utworzyć rekonstrukcję woluminu, otwórz Imaris i przejdź do przekonwertowanego pliku TIF w ich arenie.

Przejdź do edycji, a następnie kliknij Właściwości obrazu i wprowadź rozmiar woksela z obrazu OCT w odpowiednich polach XYZ. Następnie kliknij OK. Kliknij Dodaj nowe powierzchnie nad drzewem obiektów. W menu pod drzewem kliknij Pomiń automatyczne tworzenie i edytuj ręcznie.

W oknie regulacji wyświetlacza ręcznie przesuń czerwoną i czarną strzałkę, aby zwiększyć kontrast między próbką a tłem i poprawić wizualizację próbki. Dostosuj położenie plasterka do wycinka na jednej krawędzi próbki. Użyj Escape, aby zmienić mysz z trybu nawigacji na tryb wyboru, a następnie kliknij Rysuj.

Ręcznie prześledź kontur obszaru, w którym wyświetlany jest sygnał. Zwiększ pozycję wycinka, wprowadzając następną pozycję w polu wprowadzania. Ta następna pozycja powinna być mniejsza lub równa 100 plasterkom dalej w próbce niż poprzednia.

Ręcznie prześledź region, w którym wyświetlany jest sygnał. Powtórzyć ten krok przez grubość próbki, aż do osiągnięcia przeciwległej krawędzi próbki. Następnie kliknij Utwórz powierzchnię i lewe menu, aby zszyć te plasterki razem.

Na koniec kliknij Edytuj, następnie kliknij Wybór maski, a następnie kliknij OK, aby zakończyć rekonstrukcję woluminu. Aby uzyskać całkowitą gęstość komórek próbki, wybierz opcję Dodaj nowe miejsca. W menu ustawień algorytmu odznacz wszystkie pola.

Kliknij niebieską strzałkę, aby przejść do ekranu kanału źródłowego. Z wyświetlonego menu rozwijanego wybierz Zamaskowany kanał. Wprowadzić średnią średnicę kuwety dla próbki w polu o średnicy XY.

Upewnij się, że odejmowanie tła jest zaznaczone. Kliknij niebieską strzałkę, aby przejść do ekranu miejsca klasyfikacji. Na wykresie u dołu menu kliknij i przeciągnij lewą krawędź żółtego progu do lewej krawędzi wykresu, tak aby wszystkie obiekty znalazły się w progu cieniowanym na żółto.

Następnie kliknij zieloną strzałkę, aby zakończyć tworzenie miejsca. Uzyskaj liczbę zidentyfikowanych obiektów, klikając Statystyki. Następnie kliknij Ogółem, a na końcu kliknij Całkowita liczba miejsc.

Kliknij utworzoną powierzchnię i przejdź do zakładki jakości stylu powierzchni. Zmień zaznaczenie na Punkt środkowy i zmień szerokość pikseli na mniejszą niż równą 20, aby uzyskać najlepszą widoczność. Przejdź do sekcji Statystyki.

Następnie kliknij Szczegółowe, a następnie Pozycja i zapisz lokalizację w centralnym punkcie. Wybierz opcję Dodaj nową ramkę odniesienia z menu znajdującego się nad drzewem obiektów. Zaznacz widoczne i stałe pola obok X, Y w menu.

Kliknij i przeciągnij ikonę ramki odniesienia w taki sposób, aby znalazła się w jednej linii z punktem środkowym. Usuń zaznaczenie pól XY visible i fix i zaznacz je dla XZ. Ponownie kliknij i przeciągnij środek ikony ramki odniesienia tak, aby znalazła się w jednej linii z punktem środkowym. Na koniec powtórz to dla płaszczyzny YZ, naprzemiennie między tymi trzema stałymi płaszczyznami, aż układ odniesienia idealnie wyrówna się z punktem środkowym.

Kliknij dwukrotnie ramkę odniesienia w drzewie obiektów i zmień jej nazwę na center lub podobną. Kliknij na utworzone spoty i przejdź do Statystyk. Następnie kliknij Szczegółowe, a następnie Położenie układu odniesienia.

Kliknij ramkę odniesienia pozycji X, aż zostanie posortowana od najwyższej do najniższej wartości. Zapisz najwyższą wartość, aby uzyskać promień agregatów. Wykonaj obliczenia ręczne, aby określić dodatkowe interesujące lokalizacje.

Aby to zrobić, dodaj 100 mikrometrów do wartości środka X, a następnie użyj wartości Y i Z punktu środkowego, aby zdefiniować pierwsze położenie wzdłuż osi środkowej. Wybierz opcję Dodaj nowe miejsca. Następnie wybierz opcję Pomiń automatyczne tworzenie Edytuj ręcznie.

Przytrzymaj przycisk Shift na klawiaturze i kliknij w dowolnym miejscu na ekranie, aby umieścić nowe miejsce. Wprowadź wartości pozycji XYZ dla pierwszej interesującej lokalizacji. Następnie wybierz opcję Dodaj nową ramkę odniesienia i wyrównaj ją względem miejsca.

Dodaj 100 mikrometrów do każdej sekwencyjnej lokalizacji X. Umieścić ostatni układ odniesienia w odległości mniejszej niż 50 mikrometrów od zewnętrznego promienia próbki. Kliknij na utworzone spoty i przejdź do Statystyk.

W prawym dolnym rogu menu kliknij Eksportuj wszystkie statystyki do pliku i zapisz dane w arkuszu kalkulacyjnym. Otwórz arkusz kalkulacyjny. Przejdź do zakładki Odległość od układu odniesienia początku.

Użyj funkcji mod, aby numerycznie przypisać każdą odległość do odpowiadającego jej układu odniesienia. Przefiltruj wartości w tej kolumnie, aby pracować z odległościami w każdym układzie odniesienia. Dla każdego z układów odniesienia oblicz liczbę obiektów w promieniu 50 mikrometrów od układu za pomocą funkcji LICZ.JEŻELI.

Wynikowa wartość odpowiada liczbie komórek w tej wtyczce regionalnej. Podziel tę wartość przez objętość korka o średnicy 100 mikrometrów, aby uzyskać gęstość komórek. Testy T Studenta wykazały znacznie większą gęstość komórek w rdzeniu sferoidalnym niż w warstwach przejściowych i zewnętrznych dla modeli sferoidalnych MDA-MB-231.

Wynik wskazuje na zagęszczenie w tym sferoidalnym rdzeniu po czterech dniach. Zarówno w modelach agregacji AU565, jak i MDA-MB-231 dodanie matrycy nie wydaje się wpływać na objętość lub liczbę komórek, a zatem wydaje się mieć znikomy wpływ na proliferację komórek. Wydaje się raczej, że dodanie matrycy redystrybuuje gęstość komórek, sprzyjając znacznemu zagęszczeniu rdzenia i zmniejszając gęstość komórek w warstwach zewnętrznych.

Odkrycia te dostarczają cennych informacji na temat fizycznych mechanizmów, za pomocą których matryca umożliwia agregację komórek w różnych liniach komórkowych raka piersi. Patrząc następnie na guzy sferoidalne AU565 przygotowane za pomocą matrycy, dojrzałe agregaty leczono trastuzumabem, a regionalną gęstość komórek oceniano za pomocą pięciodniowego schematu leczenia. Korki ustawiano co 100 mikrometrów na całej grubości kruszyw.

Niewielkie wahania gęstości komórek zaobserwowano w czasie w obrębie wewnętrznych 500 mikrometrów każdego agregatu, co wskazuje na minimalną śmierć komórki. Wizualizacja śmierci komórki jako orientacyjnej odpowiedzi na lek, głównie w zewnętrznych warstwach sferoid guza, jest zgodna z problemami z przenikaniem leku przez trastuzumab. Możemy teraz nieniszcząco mierzyć żywotność komórek w agregatach bez poświęcania struktury.

Umożliwia to ocenę podłużnej odpowiedzi na lek w pojedynczych agregatach nowotworowych w celu określenia właściwości czasowych i penetracyjnych potencjalnych leków przeciwnowotworowych.